Laboratorio de Química Analítica II
PRACTICA No. 1
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Objetivo: el alumno aprenderá a empacar y a utilizar una columna de
cromatografía de reparto en la separación de compuestos.
INTRODUCCIÓN:
La cromatografía abarca una gran variedad de técnicas de separación
sumamente efectivas. La característica común de todas ellas es que los
componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases, una de las
cuales es estacionaria, mientras que la otra se filtra a través de los
intersticios o sobre la superficie de la fase fija. El desplazamiento de la fase
móvil se manifiesta en la migración diferencial de los componentes de la
muestra.
No hay restricciones sobre la naturaleza de las fases, la fase estacionaria
puede ser sólida o líquida y la fase móvil, líquida o gaseosa. Igualmente, no
hay restricciones sobre el mecanismo de distribución de los componentes de
la muestra entre las dos fases. En la cromatografía líquido - sólido,
generalmente es adsorción sobre la superficie del sólido o una reacción
reversible que resulta del intercambio de iones o la formación de complejos
u otros productos.
En la cromatografía gas-sólido, normalmente es adsorción, pero puede ser
también capturada dentro de la estructura microscópica del sólido o una
reacción química reversible como el sólido. En la cromatografía líquidolíquido es por partición del soluto, definida por la solubilidad relativa en los
dos líquidos. En la cromatografía líquido-gas es partición del soluto, definida
por la presión de vapor parcial del soluto en solución.
TÉCNICA:
Limpie y desengrase correctamente la columna la columna para evitar
contaminaciones y malos corrimientos en ésta, enjuague con un poco de
acetona y deje secar.
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Dr. José Ramón Verde Calvo
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Empaque de la columna:
En el fondo de la columna se coloca un disco de vidrio poroso o un poco de
lana de vidrio o un poco de algodón para retener el empaque y la parte
superior de éste se cubre con papel filtro u otro material inerte para evitar
desniveles al agregar la muestra. Una vez empacada la columna, el nivel del
líquido nunca debe descender más allá del límite superior del empaque,
porque se formarán pequeñas burbujas de aire que causan acanalamientos
posteriores.
La velocidad de flujo del solvente debe mantenerse constante, con el objeto
de obtener datos que tengan significado y que se puedan registrar
fácilmente, la velocidad de flujo depende del tamaño de las partículas del
empaque, las dimensiones de la columna, de la viscosidad del líquido y de la
presión aplicada para forzar el descenso del líquido. Los resultados son
satisfactorios si la velocidad lineal promedio del solvente es del orden 1
cm/min.
La falta de uniformidad en el empaque de una columna trae como
consecuencia la formación de zonas irregulares que pueden provocar una
mala separación. Las columnas que se empleen en cromatografía de
líquidos, tienen en general un diámetro lo suficientemente grande como para
que se pueda aplicar vibración mecánica.
Disolventes:
Con el fin de facilitar el elución de las mezclas de compuestos que abarquen
una gran variedad de polaridades, con frecuencia se recurre a la técnica de
gradiente de elución , empleando una serie de solventes de polaridad
creciente. Es importante hacer notar que un aumento drástico de la
polaridad del solvente puede producir separaciones deficientes por lo que de
manera general se prefiere un aumento gradual en la polaridad de los
solventes seleccionados.
Formas de detección:
La mayoría de las fases estacionarias son blancas o casi incoloras, de modo
que es posible observar visualmente las bandas de los componentes
coloridos. Algunos componentes orgánicos fluorescen con la luz ultravioleta.
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Los detectores para cromatografía de líquidos son muy selectivos y caros,
además de que solo se pueden utilizar en un margen pequeño de
concentraciones, existen microceldas del flujo para muchos instrumentos,
como refractómetros o espectrofotómetros de UV e infrarrojo, fluorómetros y
contadores de centelleo de líquidos. En todo caso, se pueden recoger
automáticamente fracciones del solvente y analizarlas después por cualquier
método, o los componentes se pueden recuperar por evaporación del
disolvente.
Preparación de la muestra a correr
Macerar 5 gramos de chile ancho (previamente cortado en pequeñas
fracciones) con 10 mL de hexano en un mortero. Aplicar la muestra con
ayuda de una pipeta Pasteur.
Con la ayuda de una lista eluotrópica de solventes, se seleccionan tres
solventes uno no polar, otro de polaridad intermedia y por último uno no
polar.
Recolección de las muestras:
Las muestras se colectan en tubos de ensaye en función de los colores y del
solvente en particular utilizado.
CUESTIONARIO
1. Defina qué es la cromatografía.
2. Describa los problemas con los que se enfrentó para empacar
correctamente la columna.
3. Proponga un sistema de separación que permita estar seguro de que
cada fracción está constituida por un solo componente.
4. Explique el fundamento de la separación de los componentes de una
mezcla por cromatografía de reparto.
5. ¿Cómo selecciona los solventes en un sistema de elución por gradiente?
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