Diapositiva 1

Señal
CROMATOGRAFÍA
Tiempo
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un conjunto de técnicas que
permiten la separación de compuestos
estrechamente relacionados.
Método separativo por excelencia
selectividad
Método de análisis para separar,
identificar y cuantificar
Origen
A principios del siglo XX, el botánico ruso
Tswett separó pigmentos vegetales
pasando soluciones de estos pigmentos
por una columna de vidrio empaquetada
con CaCO3.
Las especies separadas (clorofilas,
carotenos y xantofilas) aparecían como
bandas de colores (verde, anaranjado y
amarillo, respectivamente) lo que dio
origen al nombre del método
khroma, khromatos = color
graphos = escrito, grabado
Breve historia
Martin y Synge
realizan trabajos de
cromatografía de
reparto
1900
1940
1903
Tswett
Archer
Martin
1968: se comercializa el
primer HPLC como un
"Analizador de ácido
nucleico."
1969: 1er simposio
internacional sobre
HPLC.
Se obtienen partículas
peliculares de porosidad
controlada.
Cromatografía en
papel, de
partición en fase
inversa. Primeros
geles de
dextranos.
Cromatografía de
gases.
CG-masa
1950
1960
1952: Martin y
Synge ganan
Premio Nobel de
Química por sus
trabajos en
cromatografía de
reparto.
1970
Geles de
poliacrilamida
y agarosa.
Nace HPLC
1980
1990
Columnas
monolíticas
HPLCespectrometría
de masas
Richard
Synge
2000
Cromatografía
líquida-ultra
alta presión
(UHPLC).
Gran avance
instrumental.
Miniaturización
Cromatografía actual
Un sistema cromatográfico consta de dos
fases
Fase móvil (líquida o gaseosa): contiene los
componentes a separar y fluye a través de la fase
estacionaria
Fase estacionaria (líquida o sólida): a través
de la cual fluye la fase móvil y donde quedan
momentáneamente retenidos los componentes
de la muestra
Definición de la IUPAC
Cromatografía
Método físico de separación en el cual los
componentes a ser separados se
distribuyen entre 2 fases, una de las
cuales es fija (fase estacionaria) y la otra
se mueve en una determinada dirección
(fase móvil).
Definición de la IUPAC
Cromatografía
La distribución entre fases está
determinada por la diferente afinidad de
cada analito hacia dichas fases. La
separación se produce por las distintas
velocidades de migración de los
analitos, determinadas por el tiempo que
permanecen en cada fase
Clasificación
FM
FE e interacción
• líquida convencional y fase ligada (reparto)
• sólida (adsorción)
Líquida
(cromatografía • resina intercambiadora (intercambio iónico)
líquida)
• gel poroso (tamizado)
• afinidad (reacción específica)
Gaseosa
• líquida convencional y fase ligada (reparto G-L)
(cromatografía • sólida (adsorción)
gaseosa)
Fluido supercrítico
(cromatografía de fluidos
supercríticos)
Fluido calentado a T superior a la
crítica. Tiene algunas propiedades
de gas y algunas de líquido. La FE
puede ser líquida o sólida
Clasificación
Según disposición física de la FE y dirección de elución
Planar
Papel
radial
Capa fina
ascendente
descendente
ascendente
Clasificación
Según disposición física de la FE y dirección de elución
Columna
descendente
Desarrollos cromatográficos
Desarrollo por elución (el más frecuente)
La muestra se introduce en el extremo superior de
una columna y al pasar la FM los componentes se
separan en zonas, por distintas afinidades entre
analitos y fases.
Desarrollos cromatográficos
Desarrollo por desplazamiento: La FM es más afín
a la FE que los analitos y los desplaza.
El analito menos retenido se recupera en forma pura,
seguido por una mezcla, y seguido del otro analito en
forma pura. Es una técnica preparativa.
Análisis frontal: Aplicación continua de la muestra en
el origen. El analito menos retenido fluye, y el más
retenido se acumula cerca del origen. Al alcanzarse la
capacidad máxima del adsorbente, el analito más
adsorbido empieza a desplazarse. Las primeras
fracciones contienen el material menos adsorbido y
luego aparece una mezcla de ambos componentes. Es
una técnica preparativa.
Cromatografía de elución
La cromatografía de elución es un
procedimiento en el cual la FM pasa en forma
continua a través del lecho cromatográfico
(FE) y la muestra se introduce en una
siembra.
Cromatografía en columna: elución
FM
Muestra
FM
FM
FM
A+ B
B
A
B
A
B
A
t0
t1
Análisis cualitativo y
cuantitativo
t2
t3
B
Detector
t4
Objetivo de la cromatografía
resolver los componentes de una muestra
Cromatograma con
picos no resueltos
Mejora por aumento
en la separación de
bandas
Mejora por
disminución del ancho
de bandas
Teorías del proceso cromatográfico
La teoría del proceso cromatográfico debe
explicar las variables que influyen en la velocidad
de migración de los analitos y en el
ensanchamiento de las bandas
Teoría de los platos: concepto de N y H (similitud
con columna de destilación fraccionada). Explica la
forma gaussiana de las bandas pero no su
ensanchamiento durante el proceso cromatográfico.
Teoría cinética: La columna opera en situación de
no-equilibrio. Nuevo concepto de N y H
SEÑAL DETECTOR
Cromatograma
t´R
tR
tM
compuesto
no retenido
por FE
analito
TIEMPO
Isotermas de reparto y adsorción
Cromatografía de
reparto
Cromatografía de adsorción
mda/mte
CE
CM
CM
masa adsorbida/masa adsorbente
Constantes termodinámicas
CE Mide la distribución del
Constante de reparto K =
CM analito entre FE y FM
nE Describe la velocidad de
Factor de retención
k= n
(factor de capacidad)
M migración del analito en
la columna
kB Mide la selectividad de
Factor de separación
(factor de selectividad) a = kA la columna de un
analito respecto a otro
Relación entre las constantes termodinámicas y
el tiempo de retención
velocidad lineal del soluto
v = L/tR
velocidad lineal de la FM
u = L/tM
velocidad relativa del analito dentro de la columna
L/tR
v/u =
L/tM
v/u = tM/tR
La velocidad relativa también se puede definir a
partir de la fracción molar del soluto en la FM
v/u =
nM
nM + nE
=
1
1 + nE/nM
=
1
1+k
Relación entre las constantes termodinámicas y
el tiempo de retención
velocidad relativa
v/u = tM/tR
v/u =
1
1+k
Igualando los segundos miembros de ambas
expresiones
tM
tR
=
1
1+k
tR = tM (1 + k)
tR = tM (1 + K VE/VM)
k=
tR - tM
tM
Recordando…
Un recurso para resolver bandas superpuestas
Mejorar la separación
de bandas por
modificación de los tR
Modificar constantes
termodinámicas
Modificar FM, FE y/o temperatura
señal detector
Ancho de banda
punto
de
inflexión
t t
W= 4t
tiempo
Parámetros relacionados con el ancho de banda
Eficiencia
NyH
N = L/H
N = 16 (tR/W)2
N = 16 (tR / W)2
Demostración
H = s2 /L
s2 t2
s t
= 2
=
2
L tR
L tR
s L
=
t
tR
recordando que: W = 4t
2
H
W
=
L 16 tR2
L
tR
= 16
H
W
N
H t2
= 2
L tR
t = W/4
2
N = 16 (tR / W)2
Ecuaciones relacionadas con la eficiencia
Relacionan la altura de plato teórico con los
procesos dispersivos que ocurren dentro de la
columna (A, B y C) y la velocidad de la fase móvil
Ecuación de van Deemter
H = A + B/m + Cm
resistencia a la
difusión en
transferencia de
difusión
remolino
longitudinal masa
Otra ecuación
H = A + B/m + CEm + CMm
Difusión en remolino
3
3
2
2
1
1
A = 2  dp
constante de
empaque
diámetro
medio de
partículas
Dirección de FM
Difusión longitudinal
B = 2  DM
factor de obstrucción
coeficiente difusión del
analito en FM
Coeficiente de difusión (D)
Mide la velocidad a la cual una sustancia se mueve
azarosamente de una región de alta concentración a
una de menor concentración.
Es la constante de proporcionalidad que relaciona el
flujo J (medido en mol/m2.s) con el gradiente de
concentración (1ra ley de Fick)
concentración
dc
J = -D
dx
concentración
J
x
c
x + dx
c - dc
Coeficientes de difusión (D) a 298 K
SOLUTO
SOLVENTE D (m2/s)
Glicina
Metanol
Albúmina
H+
OHNa+
ClI2
N2
CS2 (g)
O2 (g)
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Hexano
CCl4
Aire
Aire
1.1x10-9
1.6 x10-9
0.059 x10-9
9.3 x10-9
5.3 x10-9
1.3 x10-9
2.0 x10-9
4 x10-9
3.4 x10-9
1.0 x10-5
1.8 x10-5
Resistencia a la transferencia de masa
Desde y hacia la FE: CE
FE
FM
FE
FM
dirección
de
elución
t1
t2
Resistencia a la transferencia de masa
2
FE líquida
FE sólida
qkdf
CE =
(1+ k)2DE
CE =
2tdk
(1 + k) 2
Resistencia a la transferencia de masa
Dentro de la FM: CM
soporte
soporte
2
CM =
2
m
f(dp, , dc )
DM
Cromatografía gaseosa
H = A + B/m + CEm + CMm
H (mm)
6
H mínimo
CE
CM
B
A
2
4
6
m óptimo
8
10
m (cm/s)
Cromatografía líquida
H (mm)
0.8
CE
mezclado convectivo
CM
B
1
2
3
4
m (cm/s)
Recordando…
Otro recurso para resolver bandas superpuestas
Disminuir el ancho de
bandas
Modificar variables
cinéticas y optimizar m
Modificar variables que ↓H
(incluyendo el m)
Señal del detector
Resolución
tr
1
WA
0
WB
Tiempo
2 tr
R=
(WA+ WB)
R=
N
4
a-1
a
kB
1+k
B
Concentración (CE)
Distribución de A y B dentro de la columna
t1
t2
t3
BA
B
A
Distancia de migración (L)
A medida que las bandas se separan, se ensanchan
¿es exitosa la separación?
¿es exitosa la separación?
velocidad lineal del soluto
v = L/tR
1/vA = tR(A)/L
1/vB = tR(B)/L
tR
tR(A) – tR(B)
= L
1/vA – 1/vB =
L
tR = L(1/vA – 1/vB)
La separación crece con la longitud de la columna
H = s2 /L
s = HL
La dispersión crece con la raíz cuadrada de la longitud de la
columna
El ensanchamiento de cada banda se produce a
una velocidad menor que su desplazamiento → se
logran separaciones exitosas
Optimización de la columna
aumentar la separación disminuir el ancho de
entre bandas (tR)
bandas
Modificar variables
termodinámicas (K, k
y a) modificando FM,
FE y temperatura
Modificar variables
que permiten ↓H y
↑N (ecuación tipo
van Deemter)