ACTIVIDAD 5. FINAL

UADY
FACULTAD DE
QUÍMICA
Campus Ciencias
De la Salud
MÉTODOS ÓPTICOS, ELECTROQUÍMICOS Y
CROMATOGRÁFICOS
ALFREDO ARAUJO LEÓN
ACTIVIDAD 5:
“Reconocimiento de la instrumentación de un HPLC-DAD
Agilent Technologies 1200 series”
INTEGRANTES:
KARLA ACEVEDO COOX
CAROLINA SÓLIS CONDE
MÓNICA GONZÁLEZ DÍAZ
ALMA BASTO MOO
4to SEMESTRE
FECHA DE ENTREGA: 22 DE MAYO DE 2014
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
 La cromatografía.
Según la IUPAC, la cromatografía es un método, usado principalmente para la
separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se
distribuyen en dos fases, la estacionaria y la fase móvil. La fase estacionaria
puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un gel. Esta fase puede
estar extendida como una capa o distribuida como una película, etc. La fase móvil
puede ser líquida o gaseosa. En un principio las siglas HPLC se debieron a High
Pressure Liquid Chroatography, fueron cambiadas cuando los cromatografistas se
dieron cuenta de que la presión sólo constituía una herramienta que forzaba a la
fase móvil a atravesar la columna, sin constituirse por sí en una variable del
sistema. Así, HPLC resulto High Performance Liquid Chromatography.
 Modalidades de la cromatografía.
Se clasifican las modalidades cromatográficas en función de varios parámetros:
La naturaleza de la fase móvil: si la fase móvil es un gas, se denimina
cromatografía gaseosa (CG) y si es un líquido, cromatografía líquida (CL).
Al último grupo pertenecen la cromatografía en capa delgada (TLC), la
cromatografía líquida en columna abierta, y la cromatografía de ala
performance (HPLC).
La cromatografía gaseosa se emplea para separar mezclas que contienen
compuestos orgánicos volátiles, pero presenta dificultades si las sustancias
a analizar no son volátiles, si descomponen a altas temperaturas o poseen
alto peso molecular.
En CG la fase móvil es un carrier del soluto y no influye en la separación. El
tipo de gas a utilizar se selecciona en función del detector a emplear. Por el
contrario, en HPLC la fase móvil es el parámetro fundamental que gobierna
la separación. En HPLC con una sola columna es posible separar
sustancias polares, iónicas, ionizables y no polares simplemente
modificando la composición de la fase móvil.
La resolución puede ser mayor en HPLC, pero la eficiencia global es mayor
en CG dado que la menor viscosidad de la fase móvil, un gas, permite usar
columnas más largas. La selectividad aportada por la amplia variedad de
solventes aptos para ser empleados como fase móvil en HPLC le otorgan
mucho mayor versatilidad.
La naturaleza de la fase estacionaria: si la fase estacionaria es un sólido y
la fase móvil un líquido se denomina cromatografía líquido-sólido (LSC).
Existirán una cromatografía líquido-líquido (LLC), gas-líquido (GLC) y gassólido (GC).
El fenómeno que ocurre dentro de la columna: en la cromatografía de
modalidad por afinidad se encuentran la cromatografía en fase normal, en
fase líquida y en la modalidad de intercambio iónico. En la cromatografía
por tamaño molecular se encuentran la GPC y la GFC. En la primera
modalidad el analito interactúa directa e indirectamente, a través del
solvente, con la fase estacionaria. En la segunda modalidad no existe
ninguna interacción con la fase estacionaria.
 La cantidad de muestra aplicada: si la cromatografía seleccionada para
una separación no destruye la muestra es posible recuperar el analito
separado de su matriz a la salida de la columna. Aumentando la
cantidad de muestra es posible obtener desde microgramos hasta
kilogramos de una pura en una sola corrida.
 Formas de cromatografía líquida.
Cromatografía líquido-sólido (LSC) o de adsorción: emplea una fase
estacionaria polar, mayormente silicagel, y una fase móvil no polar, como
hexano, con el agregado de un aditivo que provee selectividad.
Cromatografía líquido-líquido (LLC) o de partición: las moléculas de soluto
se distribuyen entre dos líquidos: una fase móvil y una fase estacionaria,
que se encuentra homogéneamente dispersa en un soporte sólido,
finamente dividido.
Cromatografía de fase ligada (BPC): prácticamente el 90% de las
separaciones cromatográficas modernas se efectúa sobre material
químicamente modificado, el cual permite optar, según el reactivo empleado
para su fabricación, entre materiales altamente hidrofóbicos o altamente
hidrofílicos, con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo,
octilo, hexilo, butilo, etilo, etc.
Cromatografía de intercambio iónico (IEC): se emplean rellenos en los
cuales la partícula está constituida por un polímero o por silicagel, unida a
un grupo funcional aniónico o catiónico. La elección del tipo de grupo
funcional permite escoger entre intercambiadores débiles y fuertes.
Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC): emplea materiales de
porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las
moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular.
Si se dispone de estándares apropiados, de peso molecular adecuado,
puede evaluarse el peso molecular de un compuesto desconocido, o bien la
distribución de pesos moleculares de un polímero sintético.
CAPÍTULO 2
INSTRUMENTAL
Equipo de HPLC
Los equipos de HPLC pueden clasificarse en
integrales y modulados. En los integrales cada
una de sus partes (reservorio de solventes,
bomba, inyector y detector) están reunidas en
un gabinete y su intercambio o conexión con
otros componentes de la misma o diferente
marca
es difícil.
Permiten
un mejor
aprovechamiento de espacio, menos cables,
tuberías y conexiones expuestas. En los
segundos los módulos son instrumentos
individuales que permiten no solo armar el equipo según la necesidad del analista
sino aumentar su complejidad según esa necesidad varíe.
PARTES DEL EQUIPO DE HPLC
Reservorio de la fase móvil: Es el recipiente que contiene la fase móvil, puede
ubicarse dentro de la caja negra de un equipo integrado o externamente en un
equipo modular y algunos centímetros sobre el nivel de la bomba para que la
fuerza de gravedad dirija el solvente hacia está manteniendo llenas las
conexiones.
Tuberías: Conectan el reservorio de solvente con la bomba, la bomba con el
inyector, este con uno o más detectores conectados en serie y eventualmente con
un colector de fracciones o válvulas de distribución. Estas tuberías deberán ser
inertes y de acuerdo a su ubicación en el sistema cromatográfico resistentes a
altas presiones. Se emplean tubos de acero inoxidable o poliméricas (polipropileno
o teflón).
Uniones: Permiten conectar las tuberías y ellas con los distintos componentes del
sistema cromatográfico. Existen dos tipos d uniones: convencionales y
universales. Las uniones universales son mucho más cómodas que las
convencionales sin embargo pueden estar limitadas por la menor presión de
trabajo. Las uniones debes ser inertes a fases móviles y muestras, deben cerrar
herméticamente y no deben contribuir en forma notable al ensanchamiento de
banda extracolumnar por la presión de volúmenes muertos.
Bomba: Impulsan la fase móvil proveniente del reservorio de solvente hacia el
inyector y desde allí hacia la columna. Su caudal puede ser muy variable según la
escala de trabajo que se escoja. Existen dos tipos de bomba: las de presión
(bombas reciprocantes) y las de desplazamiento continuo (bombas jeringa). Las
de presión son muy versátil y fáciles de adaptar. Están construidas de materiales
muy resistentes tanto al ataque químico como al desgaste mecánico. Las bombas
tiene las siguientes características: Los caudales son entre 0.1 y 10.0 ml/min y
trabajan a presiones de hasta 6000 psi., la exactitud del caudal reside en la
determinación de los tiempos de retención del analito a analizar y puede
determinarse midiendo el volumen del líquido entregado en un intervalo de tiempo
preestablecido, el ruido se refiere a las variaciones denominadas pulsaciones que
presentan las bombas del tipo recíprocamente y que conducen a variaciones en el
caudal sobre el solvente entregad intervalos cortos de tiempo. La deriva es un
cambio continuo (positivo o negativo) en la entrega de solvente que se produce en
intervalos de tiempo muy largos. El sistema de corte de caudal, es conveniente
que la bomba cuente con esta característica cuando se superan los valores límites
de presión tanto superior como inferior.
Sistemas de gradientes: La HPLC isocrática es capaz de separar un número
limitado de picos por lo que para sistemas complejos o cuando la polaridad de los
componente a separar es muy diferente es posible que la modalidad isocrática no
sea capaz de resolverlos. En estos casos se puede optar por dos alternativas: la
corrida multidimensional o la utilización de un gradiente de solventes el cual es
comparable a la programación de temperaturas en cromatografía gaseosa, en
HPLC se varía la composición de la fase móvil comenzando la elución con un
solvente débil y aumentando progresivamente la proporción del componente
fuerte.
Inyectores: El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra en
solucion sin nterrumpir el caudal de solvente a traves del site,a. el inyector debe
reunir una serie de caracteristicas iportantes: debe ser fácil de operar, debe ser
inerte al ataque químico y capaz de soportar altar presiones, debe se preciso en
cuanto a la cantiad de muestra introducida en el sistema, no debe provocar
diluciones importamtes de la solucio inyectada y en casos especale spuede
requerirse que opere altar temperaturas. Actulmente la totalidd de los inyectores
de HPLC son válvulas que orientan el caudal hacia una columna, pasando o no
según su posicion, a través de un loop en el cuals e introduce la solición a
inyectar. Las valvulas pueden accionarse manualmente o automaticamente.
Detectores: Es la parte del equipo que permite ubicar en tiempo y espacio la
posición de cada componete de una muestra a la sallida de la columna
cromatografica. Deben reunir ciertas caracteristicas: tener un amplio rango
dinámico de respuesta, poseer una rspuesta lineal, no contribuir al
ensanchamiento de banda extracolumnar, responder a todos los solutos, tener la
sencibilidad apropiada, no afectarse por cambios de temperatura, poseer una
buena relacion señal-ruido, no destruir la muesra y tener una conste¿ante de
tiempo baja. Pueden clasificarse en generales (miden el cambio de alguna
propiedad física de la fase móvil que contiene el analito en comparacion con la
misma fase móvil pura) y selectivos (son sencibles a alguna propiedad propia del
soluto por ejemplo el detector de UV).
Sistema de toma y procesamieto de datos: El resultado del ensayo
cromatografico es la obtebcion de fracciones separadas de los componentes de la
muestra y la obtencion de un grafico o cromaotrama de cuya interpretacion
pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitatvas. Este registro se obtiene
a partir de la señal proveniente del detector por medio de un sistema y
procesamiento de datos entre los cuales se encuentran un registrador gráfico, un
integrador y una computadora.
SÍNTESIS DE LA DINÁMICA DE GRUPO Y EL RECORRIDO POR EL
LABORATORIO DE CROMATOGRAFÍA
Se realizó una visita al laboratorio de cromatografía de la facultad de química en
grupos pequeños. Se realizó una demostración de la partes del equipo de HPLC
de acuerdo con la teoría vista en clase. Se pudo observar todas las partes del
equipo y el orden en el cual están estructurados. Se observaron 2 equipos uno con
inyector manual y otro con inyector automatizado.
CAPÍTULO 3
BASES DE LA SEPARACIÓN
La cromatografía líquida es un método separativo. La columna puede considerarse
el corazón del sistema cromatográfico; el cromatógrafo líquido está constituido por:
un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la fase móvil, el inyector, la
bomba, el detector, un sistema de registro de los datos proveniente del detector, el
cromatograma que relaciona la concentración del soluto en función del tiempo, un
eluído o eluato el fluído proveniente de la columna, contiene la fase móvil y los
componentes de la muestra separados.
 Bases de la separación
Las responsables de la mayor o menor afinidad de cada uno de los componentes
de la muestra por la fase móvil o la fase estacionaria son las interacciones
hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, interacciones dipolares y electrostáticas. El
componente más afín a la fase estacionaria tarda más en eluir, mientras el más
afín a la fase móvil se retiene menos y eluye antes.
 Nomenclatura y cálculos
La nomenclatura en cromatografía fue estandarizada por la American Society for
Testing and Materials, ASTM y la Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC. Es
necesario definir algunos conceptos.
 Cromatograma: es un grafico u otra representación de la respuesta del
detector, concentración del efluente u otra cantidad usada como una
medida de la concentración del efluente, versus el volumen de efluente o
tiempo. Las abscisas corresponden al tiempo durante el cual se efectúa una
medición. Las ordenadas corresponden a la señal analógica proveniente del
detector, su significado dependerá del tipo de medición efectuada. La altura
de la señal indica en cada momento la intensidad de la respuesta.
El cromatograma comienza en el momento en el que la solución en ensayo
es inyectada.
Las señales encontradas en el cromatograma se clasifican de la siguiente manera:
 Volumen de elución: es el volumen de la fase móvil eluida entre la
inyección y la elución de la concentración máxima del soluto.
 Volumen muerto: es el volumen total de solvente entre el punto de
inyección y el de detección, exceptuando el correspondiente a las
partículas de la fase estacionaria.
 Línea de base: es la porción del cromatograma donde sólo se
aprecia la elución de la fase móvil, sin señal debida al soluto.
 Tiempo de retención: es el tiempo medido entre la retención y la
elución de la concentración máxima del soluto enésimo.
 Tiempo de retención neto o relativo: es frecuente expresar el tiempo
de retención neto de un pico determinado como diferencia entre su
tiempo de retención y el tiempo muerto en lugar del tiempo de
retención absoluto.
 Velocidad lineal: la comparación de métodos que emplean columnas
de diferente diámetro interno hace preferible la expresión de la
𝑳
velocidad lineal en lugar del caudal : 𝒖 = 𝒕
𝒐
 Factor de capacidad: es el cociente entre el número de moles de
soluto en la fase estacionaria y el número de moles de soluto en la
fase móvil y está relacionado con el coeficiente de distribución entre
𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒐𝒍𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒇𝒂𝒔𝒆 𝒆𝒔𝒕𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏𝒂𝒓𝒊𝒂
ambas fases. 𝒌′ = 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒐𝒍𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒇𝒂𝒔𝒆 𝒎𝒐𝒗𝒊𝒍
El valor de k’ puede ajustarse modificando la fuerza de elución de la fase móvil:
En fase reversa, k’ disminuye al aumentar la proporción del
componente orgánico y aumenta al aumentar la proporción de
agua.
II. En fase normal, k’ disminuye al aumentar la proporción del
solvente polar y aumenta al aumentar la proporción del no
polar.
III. En cromatografía de intercambio iónico, k’ disminuye al
aumentar la concentración del contraión, o la proporción del
solvente orgánico.
 Factor de separación: es el cociente entre los factores de capacidad
𝒌′
(k’) de un par de picos: 𝜶 = 𝒌′𝟐
I.
𝟏
A diferencia de k’,  no depende de la fuerza de elución, sino de la
afinidad del soluto respecto a la fase móvil y de la columna.
 Resolución: se calcula por cada par de picos adyacentes
𝑡 𝑡
𝑅 = 1 2− 1
t2 y t1 corresponden a los tiempos de retención de los
2
( 𝑤2 + 𝑤1)
picos 2 y 1, w2 y w1 a los anchos de pico medidos en su base.
 Ancho de pico: tiene varios objetivos; para calcular la eficiencia de la
columna, la resolución, calculo manual del área de picos y en
algunos integradores electrónicos se ingresa como dato de ajuste de
integración.
 Platos teóricos: la eficiencia de una columna cromatográfica y su
poder separativo se mide en función de su número de platos
teóricos.
𝑡
 𝑁 = 16 (𝑤 𝑛 ) ^2 el número de platos teóricos puede calcularse en
𝑡𝑎𝑛
función del ancho del pico.
 Asimetría: su medición es importante puesto que puede llevar, de
acuerdo a su magnitud, a errores considerables de cuantificación, e
incluso oscurecer picos adyacentes.
 Proceso de ensanchamiento de bandas
Si en lugar de tiempos tomados frecuentemente por comodidad consideramos la
retención en función del volumen de elución, para recolectar un pico debe
fraccionarse el total del volumen entre el comienzo y la finalización de su señal.
Considerando que el número de platos teóricos es aproximadamente constante
para todos los solutos, se deduce que a mayor tiempo de retención, corresponderá
mayor ancho de pico.
 Ensanchamiento de banda intracolumnar
Según Van Deemter, las contribuciones al ensanchamiento de banda dentro de
una columna cromatográfica son cuatro a saber:
Proceso multipaso: en una columna rellena con partículas de la fase
estacionaria, el soluto encontrara diversos caminos, los cuales será impulsado a
recorrer la fase móvil. Su contribución al ensanchamiento de banda está dada por
el diámetro de partícula y por una constante que depende del relleno y de la
calidad de su empaquetamiento en la columna.
Difusión longitudinal: la contribución de este efecto al ensanchamiento es una
función inversa de la velocidad lineal de la fase móvil (u) y directa respecto del
coeficiente de difusión del soluto en el solvente (Dm) y de alguna constante que
evalúe el espacio ocupado por la fase móvil y su geometría ().
Resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil: la contribución de este
efecto al ensanchamiento de banda será mayor cuanto mayor sea la retención del
soluto. Así, será directamente proporcional a un factor dependiente de k’ (fm), a la
velocidad lineal de la fase móvil (u) y al diámetro de la particula (dp), e
inversamente proporcional al coeficiente de difusión del soluto de la fase móvil
(Dm).
Resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria: este efecto es
semejante al fenómeno de resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil
y es más pronunciado en la cromatografía de partición de líquido-líquido (LLC). El
ensanchamiento será proporcional a una función del factor de capacidad, al
espesor de la fase estacionaria en LLC o a la profundidad del poro e inversamente
proporcional al coeficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria.
De la ecuación de Van Deemter se deduce que la HEPT será menor, lo que
equivale mayor N:
- Menor viscosidad de fase móvil, menor coeficiente de difusión.
- Mayor temperatura esta resulta en una disminución de la viscosidad de la
fase móvil.
- Cuanto mejor sea el empaquetamiento del relleno, por la menor distancia
entre partículas de fase estacionaria.
Ensanchamiento de banda extracolumnar: los procesos de ensanchamiento de
banda extracolumnares pueden medirse en función de la varianza del pico y son
producidos por tres fuentes de dispersión: el volumen de inyección, la constante
del tiempo del detector, el volumen de los componentes entre el inyector y la celda
del detector, excluida la columna cromatográfica.
La influencia global de la dispersión extracolumnar depende de la dispersión
intracolumnar.
Ensanchamiento de banda producido en el detector: el detector puede
contribuir de dos formas al ensanchamiento de banda, en función de su
componente hidráulico y su componente electrónico
Ensanchamiento de bandas producido por tuberías: en HPLC se usan dos
tipos de tubuladuras, las de sección interna fina y las de sección interna gruesa.
Es recomendable utilizar la más delgada para todas las conexiones entre inyector
y detector, para disminuir su contribución al ensanchamiento de banda y las de
mayor calibre para las restantes.
Ensanchamiento de bandas producido por el volumen de inyección: la
muestra se introduce inyectando un volumen de solución. Este volumen se escoge
de modo que el analito pueda ser detectado y cuantificado, debe controlarse para
que no incida sensiblemente en el ensanchamiento de los picos. El máximo
volumen de inyección permisible dependerá de la eficiencia de la columna, su
radio y su longitud.