Cromatografia de líquidos
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Cromatografía de Líquidos Elba Rojas Escudero ERE ¿¿¿ Ab o Ad ??? Temario • Fundamentos – Definiciones básicas – Aspectos teóricos • Instrumentación – Elementos básicos – Columnas – Inyectores – Detectores y sistemas acoplados • Análisis – cualitativo y cuantitativo Cromatografía de líquidos • Método físico de separación • La muestra se distribuye entre dos fases – Fase estacionaria: sólido o líquido – Fase móvil: líquido o mezcla de líquidos Elución • La muestra se aplica al principio de la columna como una banda fina • El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos • Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase móvil • Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna Cromatografía Gas Líquido Columna CLS CLL CFE Plano CII CE CPG CFG CCF CP Tipos de CL • • • • • PM < 2000 Cromatografía de intercambio iónico Adsorción: líquido-sólido Partición: líquido-líquido – Cromatografia en fase normal – Cromatografia en fase inversa • PM > 2000 Cromatografia de exclusión por tamaño Requisitos de la muestra • Soluble en la fase móvil • “Limpia” • No debe reaccionar con ningún componente del sistema cromatográfico HPLC ideal para muestras con: • Presión de vapor baja • Compuestos iónicos • Compuestos de peso molecular elevado • Compuestos Termolábiles Instrumentación Fase móvil Bomba de alta presión Muestra Inyector Control de temperatura Gradiente de elución Columna Detector Registrador Fase móvil • • • • • • • Disolventes grado cromatográfico Agua de 18 mΩ Baja viscosidad No vólatil Miscibilidad Filtrada Sin oxígeno disuelto (degasificada) Fase móvil • Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo . Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (mL/min) H = f (v) Cromatografía FM FE Inyector Detector Proceso Cromatográfico • La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos • Los solutos se reparten entre ambas fases Fase estacionaria Muestra Fase móvil Cromatografía de líquidos • Se realiza en columna • Separación por adsorción y partición • Diversidad de técnicas en función de la muestra • Análisis cualitativo y cuantitativo • Separaciones analíticas y preparativas • Análisis de mezclas “relativamente” complejas Fase estacionaria (columna) • Tubo de acero inoxidable • Dimensiones – Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm – Diámetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm – Tamaño de partícula: 3, 5, 10 µm – Forma de la partícula: irregular o esférica Dimensiones de columna la L di dp Fase estacionaria (columna) • Empaque – Sílica gel, C8, C18, Ciano, Amino, Resinas, Polímeros • Carga de Carbón 5-20 % w/w • Intervalo de pH = f (FE) • Límite de presión de trabajo • Compatible con la fase móvil Fase estacionaria Soportes de la FE Permeación o exclusión Cuidados de la columna • • • • Instalación Introducción de muestras “limpias” Contaminación por fase móvil o muestra Almacenarla y guardarla de forma adecuada • Lavarla después de utilizarla con disoluciones reguladoras de pH Precauciones • • • • • • No exceder la presión de trabajo Cambios bruscos de presión Intervalo de pH adecuado No utilizar H+ y OH- concentrados Filtrar la muestra y la fase móvil w de la muestra=f (dimensiones de la columna) Cromatografía • Fase Normal – FE polar – FM No-polar • Fase Inversa – FE No-polar – FM polar Cromatografía de fase inversa • FE – Sílica químicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl • FM – Mezclas: agua/disolventes orgánicos H2O +(CH3OH, THF, CH3CN) Cromatografía de fase inversa • Efecto solvofóbico fuerte: – Parte apolar de la molécula del soluto es mayor – % C en la FE es mayor – Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O) Fases estacionarias • Fases impregnadas – Cubren uniformemente el soporte – Insolubles en la FM – Compatibles con el detector – El flujo de la FM no debe ser elevado NO son Estables Fases estacionarias • Fases químicamente unidas phases”) (“Bonded – Unidas al soporte por enlaces covalentes – Mayor eficiencia que las Fases impregnadas – Costo elevado – Son estables Cromatografía de fase inversa • Ventajas – Reproducibilidad en las separaciones – Estabilidad de la FE (pH ≤ 7) – Mezclas: acuosos/orgánicos +(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN) H2O Fuerza del eluyente Viscosidad del eluyente Polaridad Polaridad Detectores • • • • • • • Indice de refracción Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroquímico Radioactividad Infrarrojo Espectrómetro de masas Instrumentación Fase móvil Bomba de alta presión Muestra Inyector Control de temperatura Gradiente de elución Columna Detector Registrador Elución Problema general la elución de Gradiente de elución Gradiente de elución Elución con alta presión Elución Equipo con gradiente de elución Proceso Cromatográfico • El lecho cromatográfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna) • La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria Proceso Cromatográfico • Las móleculas de soluto en fase estacionaria se estancan • Las móleculas en fase móvil avanzan con ella Mm m m m m M M Proceso Cromatográfico • La velocidad del soluto varía inversamente con la afinidad por la fase estacionaria Separación de los solutos • Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarán Mm m m m M M M M M M Separación de los solutos H = f (v) Ensanchamiento de banda Ensanchamiento de banda Transferencia de masa en la FE la Ensanchamiento de banda Transferencia de masa en la FM “movimiento” la Ensanchamiento de banda Transferencia de masa en la FM “estancada” la H= f (ensanchamiento de la banda) HL = 2γ DM / v k´ 2 vt a HS = 2 1+k´ HF = 2λdp HD = Ωvdp2 / DM HM = HF + HD HSM = (1- θ + k´)2 dp2v 30(1-θ)(1+k´)2γDM H = f (ensanchamiento de la banda) H=L/N H = HL + HS + HM + HSM H = HS + HM + HSM Ventajas • Análisis de compuestos iónicos, de alto peso molecular • Diversidad de columnas y detectores • Formación de derivados pre-columna y post-columna • Separaciones con control de pH • Separaciones preparativas Limitantes • • • • • • • Muestras “relativamente” limpias Solubilidad de la muestra en la fase móvil Viscosidad de la fase móvil Dimensiones de la columna Presión de trabajo Intervalo de pH Utilizar un filtro (pre-columna) Cromatografía de Líquidos Formación de derivados ERE Derivados • • • • Fuera de línea En línea Pre-columna Post-columna Equipo para la formación de derivados FM FE Inyector Reactor Detector FM FE Inyector Reactor Detector Derivados Derivados Cromatografía de Líquidos Aplicaciones ERE CCF - CLAE FE = f (diámetro interno) Diferente λ Cambio de λ Aplicación Aminas Aplicación Fluorescencia Polar - No polar ¿¿¿ Qué sucedió ??? Sensibilidad Sensibilidad Peso molecular Propiedades = f (PM) Oligosacáridos Oligoglucosa Ejemplos Campo Fármacos Mezclas típicas Antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos Bioquímica Aminácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos Alimentos Edulcorantes, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Contaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB, fenoles Química Drogas, venenos, alcohol en forense sangre, narcóticos
