EDUCACIÓN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLÍNICO Ed Cont Lab Clin 2005;8:49-62 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA José María Hernández Pérez Servicio de Bioquímica, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona INTRODUCCIÓN La cromatografía es una antigua técnica instrumental (Milhail Tswett, 1906) que ha evolucionado enormemente en los últimos años, principalmente a partir de la década de los setenta, con lo que, inicialmente concebida como método de separación, ha llegado a convertirse en una fuente inagotable de métodos de análisis. Pocos métodos de análisis químico son tan específicos para un analito en particular, ya que tanto las fases previas de extracción como los procedimientos cromatográficos son llevados a cabo en función del tipo de molécula. El proceso cromatográfico contempla la separación de los componentes de una mezcla, para ello, una muestra de la mezcla (o el extracto de una muestra) será disuelta en una fase móvil (en este caso un líquido). La fase móvil es impulsada a través de una fase inmóvil, que debe ser inmiscible con ella, a la que se conoce como fase estacionaria, y que puede ser sólida o líquida (cromatografía líquido-sólido o cromatografía líquido-líquido –el líquido puede estar embebido o unido a partículas sólidas-). Las fases son escogidas de tal forma que los componentes de las muestras presenten diferencias en cuanto a sus propiedades físicoquímicas (solubilidad, tamaño, fuerza iónica, polaridad, afinidad, etc.) para cada fase. Las interacciones químicas entre la fase móvil y la muestra, y entre la muestra y la fase estacionaria, determinan el grado de migración y separación de los compuestos contenidos en la muestra. Un componente que interactúe más con la fase estacionaria realizará un "viaje" más largo a través de ella que otro componente que tenga más interacción con la fase móvil. Como resultado de estas diferencias en la movilidad de los componentes de una muestra estos se separarán uno de otro. En la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) la muestra es inyectada en el seno de la fase móvil, donde es soluble, y es transportada a través de una columna por el flujo continuo de fase móvil a alta presión. La fase estacionaria está formada por partículas de pequeño diámetro, por tanto, con una gran superficie de interacción, contenidas en la columna. Este proceso cinético es conocido con el nombre de elución. La velocidad a la que un analito se mueve a través de la columna, con respecto a los demás presentes en la mezcla, está determinada por el tiempo que permanece en la fase móvil. Aplicaciones La HPLC se puede utilizar como técnica preparativa y como técnica analítica, permitiendo la purificación, identificación y cuantificación del analito deseado. La elección de la fase estacionaria y la fase móvil, del flujo al que se va a impulsar la fase móvil a través de la fase estacionaria e incluso de la temperatura a la que se va a realizar la cromatografía, permitirán una correcta separación del analito de otros compuestos. Cada componente de una solución tiene unas características determinadas bajo ciertas condiciones cromatográficas, y debe conseguirse que la migración del componente y de los contaminantes a través de la columna sea lo suficientemente distinta para que dicho compuesto sea separado de los demás del extracto, para permitir su posterior identificación y cuantificación. A este proceso se le denomina purificación. La identificación de compuestos es la parte más importante de muchos trabajos en HPLC. Para identificar compuestos se debe seleccionar un sistema de detección que mida diferentes propiedades físico-químicas de la molécula. Entra en juego el tipo de separación y la naturaleza de la detección, sea absorbancia, conductividad, fluorescencia, relación masa/carga, etc. En la cromatografía líquida, la fase móvil eluye de la columna durante un tiempo determinado conteniendo cantidades muy diferentes de solutos que pasan a través de un sistema de detección. El instrumento detecta la presencia del soluto que es convertida en una señal eléctrica y ésta puede ser tratada por un procesador de datos. Se representa la señal obtenida frente al tiempo o al volumen de elución, y al gráfico obtenido se le conoce como cromatograma. Los solutos se representan gráficamente como una serie de picos que pueden JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 50 identificarse por su anchura, altura o área. Para la cuantificación de compuestos se utiliza la señal del detector haciendo que sea proporcional a la cantidad o a la concentración inyectada de analito. Es preciso confeccionar previamente una curva de calibración para establecer el factor de respuesta como la pendiente de la medida del detector frente a las concentraciones de los calibradores. Para ello se realiza la inyección de una serie de soluciones del compuesto con concentraciones conocidas para su detección. Los cromatogramas obtenidos muestran una serie de picos cuyas áreas se correlacionan con la concentración del compuesto inyectado. Se puede también trabajar con estandarización interna donde, tanto a los compuestos con concentraciones conocidas como a las muestras a cuantificar, se les añade una cantidad conocida de un segundo compuesto conocido como estándar interno. El área del estándar interno sirve para estandarizar puesto que las pérdidas sufridas durante todo el proceso analítico (extracción, cromatografía, etc.) son constantes para todos los compuestos. La representación de la relación del área o la altura del analito respecto a la del estándar interno frente a la concentración del analito proporciona una curva de calibración que corrige las pérdidas analíticas. CONCEPTOS CROMATOGRÁFICOS Dentro del proceso de elución se pueden distinguir procesos termodinámicos, relacionados con la capacidad de retención o la diferente migración de los componentes de la mezcla, y procesos cinéticos, relacionados con la anchura de banda cromatográfica y, por tanto, de pico cromatográfico producido por el sistema de procesamiento del detector. Factor de retención Considerando un solo analito que se encuentra en equilibrio entre la fase estacionaria y la fase móvil, se define el llamado coeficiente de reparto o constante de distribución (KD) como la concentración molar de analito en la fase estacionaria (Cs) dividida por la concentración molar del analito en la fase móvil (Cm): KD = Cs Cm sustituyendo (C) por el número de moléculas por unidad de volumen: KD = Ns Vm ⋅ Nm Vs KD = k´β k´= KD β donde (k') es el factor de retención o factor de capacidad, que define la velocidad de migración de un analito en una columna determinada, y (β) es la relación de fases. El tiempo que tarda la fase móvil en pasar a través de la columna se le conoce como (t0) y equivale al tiempo para una sustancia no retenida. k' = t R − t 0 VR − V0 = t0 V0 El volumen de elución de la fase móvil en el que sale el compuesto de interés se conoce como volumen de retención (VR), y el tiempo transcurrido desde que el compuesto es inyectado hasta que alcanza el detector es conocido como tiempo de retención (tR). El volumen de retención es característico de cada compuesto y está relacionado con la constante de distribución. Al volumen de fase móvil requerido para eluir una sustancia no retenida se le conoce como (Vm o Vo). V R = Vm ⋅ (1 + k´) Cuando el factor de retención del analito es inferior a 1, la elución es tan rápida que la determinación del tiempo de retención es muy difícil. Factores de retención muy grandes (superiores a 20) significan que la elución transcurre durante mucho tiempo. Se considera que un factor de retención ideal está entre 2 y 6. Para llegar a una separación óptima entre compuestos, deben obtenerse picos agudos y simétricos. En general, picos con bajo factor de retención son mejores porque se evita su ensanchamiento cumpliendo mejor las características deseables (Figura 1). Si se observa la Figura 2, puede verse que para un pico perfectamente simétrico, los segmentos A y B medidos al 10 % de la altura del pico son iguales, por tanto el valor de asimetría (Af) según la fórmula sería de 1: Af = B(10%⋅h ) A(10%⋅h ) Para la no existencia de colas, la suma de los segmentos A y B partido por el doble de uno de ellos debería ser 1, siendo (Tf) el factor de cola. Tf (10%⋅h ) = A+ B 2A JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 51 Figura 1. Ensanchamiento de los picos de una cromatografía en función del factor de capacidad. Figura 2. Elementos de un pico cromatográfico (tR: tiempo de retención, h: altura del pico, w: anchura del pico, t0: tiempo de un compuesto no retenido). Eficiencia El modelo del plato teórico supone que la columna cromatográfica contiene gran número de capas separadas, llamadas platos teóricos. Los equilibrios para la separación de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil tienen lugar en estos supuestos platos. El analito se mueve en la columna por transferencia de fase equilibrada desde un plato hasta otro. móvil Los platos son un concepto imaginario que ayuda a entender como funcionan los procesos de separación en la columna. El modelo proporciona una medida de la eficiencia de la columna, que se puede expresar como el número de platos teóricos JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 52 de una columna (N), cuántos más platos la columna será más eficiente. O como lo que mide cada plato (HEPT, altura equivalente del plato teórico), cuánto más pequeño mayor eficiencia. Siendo (L) la longitud de la columna, estos conceptos quedan relacionados de la siguiente forma: 2 sigma (inflexión del pico) (menos sensible para colas o frentes). Hay que escoger el método que mejor se ajuste a los requerimientos del trabajo y siempre debe utilizarse el mismo a fin de conseguir la mejor reproducibilidad en las medidas para que sean comparables. - HEPT = L / N N= t R2 s2 donde (s) es la desviación estándar del tiempo de retención. El cálculo se realiza sobre la representación gráfica del pico prolongando las tangentes a las curvas descendentes del pico gausiano hasta llegar a cortar el eje de las x en dos puntos (Figura 3). Estadísticamente, la distancia entre los puntos donde las tangentes cortan la línea de base corresponde a 4 desviaciones estándar (s o sigma). Teóricamente, la anchura de un pico gausiano (Wh) a la mitad de su altura corresponde a 2,354 desviaciones estándar y, por tanto, s2 = [w1/2 / 2,354] 2 que conducirá a la fórmula más conocida para calcular (N) a la mitad de la altura del pico: 5,54 ⋅ t R2 N= w12/ 2 donde (w1/2) es la anchura del pico a la mitad de su altura. Hay una serie de métodos usados para la medida y el cálculo de la eficiencia de una columna mediante la medida de la anchura y la simetría del pico a diferentes niveles. Referimos en orden de sensibilidad son (Figura 3): - Medida basada en la asimetría (más sensible para colas o frentes), 5 sigma (altura al 4,4 % de la columna), 4 sigma (altura al 13,4 % de la columna), tangente del pico respeto a la línea base, 3 sigma (altura al 32,4 % de la columna), 1/2 altura, Altura del pico (%) El número de platos teóricos que posee una columna real se puede calcular a través del pico cromatográfico de un compuesto dado después de su elución. El compuesto es, generalmente, un compuesto de prueba con buena separación que producirá un buen pico cromatográfico. (N) se definido como: Figura 3. Métodos basados en la simetría gausiana para la medida y el cálculo de la eficiencia de una columna. Teoría cromatográfica de las relaciones Una descripción más real del proceso dentro de la columna debe tener en cuenta el tiempo transcurrido para equilibrar el soluto entre la fase estacionaria y la fase móvil (en contra del modelo del plato, que asume que el equilibrio es infinitamente rápido). La forma resultante de un pico cromatográfico se ve afectada por la velocidad de elución, que es consecuencia de las posibles diferentes vías que las moléculas de soluto toman en su camino entre las partículas de la fase estacionaria. Si se consideran los distintos mecanismos que contribuyen al ensanchamiento de los picos, se llega a la ecuación de Van Deemter para la altura del plato: H = ( A + B) /(u + Cu ) JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia Donde (u) es la media de la velocidad de la fase móvil, y (A), (B) y (C) son distintos factores que contribuyen al ensanchamiento de la banda: - - - Difusión de Eddy (A). Las moléculas de soluto (fase móvil) toman diferentes caminos al azar a través de la fase estacionaria. Esto puede causar el ensanchamiento del pico porque los diferentes caminos son de longitudes distintas. Difusión longitudinal (B). La concentración de analito es menor en los extremos de la columna que en el centro. Esto causa un cierto ensanchamiento del pico. Si la velocidad de la fase móvil es alta entonces el analito pasa menos tiempo en la columna, lo que disminuye el efecto de la difusión longitudinal. Resistencia a la transferencia de masa (C). El analito requiere una determinada cantidad de tiempo para conseguir el equilibrio entre la fase estacionaria y la fase móvil. Si la velocidad de la fase móvil es alta, y el analito tiene una gran afinidad por la fase estacionaria, entonces el analito en la fase móvil se moverá por delante del analito que queda en la fase estacionaria. El pico del analito se ensanchará. Cuánto mayor sea la velocidad de la fase móvil, mayor será el ensanchamiento producido. En la Figura 4 se representa gráficamente la ecuación de Van Deemter. La expresión de la relación entre la velocidad de la fase móvil y la altura del plato es útil para establecer el flujo óptimo de la fase móvil. Para calcular la eficiencia de la columna también puede usarse la ecuación de Knox: h= 2 1/ 3 v +v + 10 v donde (h) es la altura reducida del plato y es igual a (H / dp), siendo (H) la altura del plato teórico y (dp) el diámetro medio de las partículas, y (v) velocidad reducida de la fase móvil. Selectividad y resolución Se define como selectividad (α) a la capacidad de separación de dos analitos en la columna, considerando el tiempo de retención (o volumen de retención) de los máximos de los picos para cada analito. α= k´2 t 2 − t 0 V2 − V0 = = k´1 t1 − t 0 V1 − V0 53 Normalmente, se puede controlar la selectividad variando las características del sistema, tales como la composición de la fase móvil (pH, fuerza iónica, solvente orgánico modificador), la forma de elución (constante o en gradiente) o el tipo de columna. La resolución (RS) es el parámetro que indica la calidad de una separación, como una medida numérica de la separación entre dos compuestos, y se define como: RS = V2 − V1 1 2(W1 + W2 ) Donde (Vi) es el volumen de retención de cada compuesto y (Wi) la anchura de cada pico (Figura 5). Hay tres parámetros fundamentales que influyen en la resolución de una separación cromatográfica: la eficiencia de la columna (expresada en número de platos teóricos), la selectividad y el factor de retención: ⎛ N ⎞ ⎛ α −1⎞ ⎛ k' ⎞ ⎟⋅⎜ RS = ⎜⎜ ⎟⋅⎜ ⎟ ⎟ ⎝ 4 ⎠ ⎝ α ⎠ ⎝1+ k' ⎠ En general, es recomendable intentar maximizar estos tres parámetros, existiendo varias estrategias para ello: - - - Aumentar el número de platos teóricos reduciendo el tamaño de las partículas de la fase estacionaria. Los picos se estrecharán (menor ancho de banda) y los tiempos de retención no variarán pero se resolverán. Aumentar el factor de retención modificando la composición de la fase móvil o la superficie de interacción de la fase estacionaria o la temperatura de elución. Los tiempos de retención cambiarán y los picos serán también más anchos. Aumentar la selectividad modificando la fase móvil o la fase estacionaria, modificando la temperatura de la columna, o añadiendo sustancias químicas que se unen con alguno de los solutos en la fase estacionaria. La selectividad puede ser manipulada de modo muy similar al factor de retención porque depende de él, la diferencia es que mientras éste contempla las características termodinámicas de un pico la selectividad lo hace de los dos a separar. JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 54 Figura 4. Representación de Van Deemter para establecer el flujo óptimo de la fase móvil. Figura 5. Definición de la resolución de una separación entre dos picos cromatográficos. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA El tipo de cromatografía en HPLC viene determinado por la fase móvil y, fundamentalmente, por la fase estacionaria. Existen diferentes tipos de fase estacionaria disponibles en forma de soportes de distintos materiales (polímeros, carbón, hidroxiapatita, agarosa o sílica) contenidos en una columna. Pueden ser de diferentes tamaños, diámetros, tamaños de poro, o que tengan unidos diferentes compuestos activos (antígenos, grupos químicos, grupos polares). anticuerpos, Líquido-Sólido, se basa en la polaridad. Los compuestos que poseen grupos funcionales capaces de producir enlaces fuertes de hidrógeno se unirán más fuertemente a la fase estacionaria que los compuestos menos polares. Así, los compuestos menos polares eluirán de la columna más rápidamente que los altamente polares. JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia Líquido-Líquido, también se basa en la polaridad. Sin embargo, esta técnica es más apropiada para muestras de mediana polaridad que son solubles en disolventes de débil polaridad a polares orgánicos. La separación de noelectrolitos se consigue teniendo en cuenta las polaridades de muestra y fase estacionaria y usando una fase móvil que posea una polaridad marcadamente diferente. Filtración en gel, se basa en el tamaño molecular de los compuestos que van a ser analizados. La fase estacionaria está formada por partículas porosas (sílica, no-sílica). Los componentes de mayor tamaño serán excluidos del interior de las bolas y así eluirán primero. Los compuestos más pequeños podrán entrar en las partículas y eluirán de acuerdo con su capacidad para salir de los poros en los que fueron internados. Fase normal, se basa en la hidrofilia y la lipofilia usando una fase estacionaria polar y una fase móvil menos polar. Así, los compuestos hidrofóbicos eluyen más rápidamente que los hidrofílicos. La fase está constituida por una matriz de sílica a la que se unen grupos silanol, amino y nitrilo que le confieren polaridad relativa respecto a la fase móvil. 55 Intercambio iónico, se basa en el intercambio selectivo de iones de la muestra por sus diferencias en signo y magnitud de carga iónica frente a los contraiones de la fase estacionaria. Se trata de columnas que contienen grupos funcionales que soportan cargas unidos a una matriz polimérica. Los iones funcionales están permanentemente unidos a la columna y cada uno tiene su contraión unido. La muestra es retenida porque reemplaza los contraiones de la fase estacionaria con sus propios iones. La muestra es eluida de la columna por cambio en las propiedades (pH, fuerza iónica) de la fase móvil, haciendo que esta desplace los iones de la muestra de la fase estacionaria. Afinidad, usa biomoléculas inmovilizadas que tienen una afinidad específica hacia el compuesto de interés. La separación ocurre cuando la fase móvil y la muestra pasan a través de la fase estacionaria. El compuesto o compuestos de interés de la muestra son retenidos mientras el resto de las impurezas y la fase móvil pasa a través. Los compuestos son luego eluidos cambiando las condiciones de la fase móvil (fuerza iónica, pH, sustanciás caotrópicas). ELUCIÓN Fase reversa, también se basa en la hidrofilia y la lipofilia. La fase estacionaria consiste en una matriz de sílica empacada que lleva unida covalentemente una cadena alquílica de ncarbonos (por ejemplo, C-8 significa que se incorpora una cadena octil y C-18 una octadecil). La más hidrofóbica es, en este caso, la fase estacionaria, eluyendo los compuestos hidrofílicos más rápidamente que los hidrofóbicos, que interaccionan con la fase estacionaria. También hay empaquetamientos poliméricos alternativos a la sílice que ofrecen similares características con mayor resistencia dinámica y más amplio rango de estabilidad de pH. Existen dos variantes de la cromatografía en fase reversa: - - Supresión iónica, se utiliza modificando el pH de la fase móvil para ácidos y bases débiles, de forma que el analito pasa a ser más lipófilo y se mejora la separación porque se establece más interacción con la columna. Formación de pares iónicos, se utiliza para compuestos que tienen grupos funcionales biológicos que serán unidos a un contraión. El contraión se asocia al analito y lo desplaza del par iónico normal (corrientemente Na+ o Cl-) mejorando su hidrofobicidad. Para analitos catiónicos se utilizan grupos alquil o aril sulfonatos y para analitos aniónicos aminas cuaternarias. En función de la composición de la fase móvil inyectada a la columna, la elución de moléculas puede ser de dos tipos: isocrática y en gradiente. También existen casos en los que se cambia totalmente la fase móvil en el transcurso de la cromatografía y se conoce como elución politíptica. Elución isocrática Los compuestos eluyen usando una fase móvil de composición constante durante toda la cromatografía. Todos los compuestos acaban migrando a través de la columna hasta el final. Sin embargo, cada uno migra con una velocidad diferente, resultando en una relación de elución más rápida o más lenta. Este tipo de elución es bastante simple y barato, pero la resolución de algunos compuestos es cuestionable y el eluido puede no ser obtenido en un plazo de tiempo adecuado. JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 56 La separación de los compuestos mediante elución isocrática puede describirse utilizando las siguientes ecuaciones: Tiempo de retención Factor de capacidad [ t R = t 0 ⋅ k '+t 0 k ' = (t R − t 0 ) / t 0 ] Resolución Rs = (1 / 4) ⋅ ((α − 1) α )N 1 / 2 ⋅ [k ' / (1 + k ')] Elución en gradiente Los diferentes compuestos son eluidos modificando gradualmente la composición de la fase móvil durante el transcurso de la cromatografía (aumentando la fuerza iónica, modificando la polaridad, etc.). El resultado sobre la elución es un acortamiento de los tiempos de retención, el factor de retención disminuye conforme aumenta la variación de flujo del gradiente y el compuesto eluye. Este gradiente puede llevarse a cabo de forma lineal o escalonada o linealmente escalonada. La predicción mediante ecuaciones que describan la separación de componentes por elución en gradiente es muy compleja, por lo que se parte de las ecuaciones empleadas para la isocrática y se adaptan casi empíricamente. La relación del cambio de la composición de la fase móvil durante el transcurso de la elución en gradiente puede ser descrita por la pendiente del gradiente como (∆φ / tG) dónde (G) simboliza la progresión del gradiente G= ∆φ t 0 .S tG siendo (φ) el volumen de fase del modificador, (tG) el tiempo del gradiente, (S) la pendiente del (ln k') frente a (φ) (o la relación lineal de fuerza del solvente). Tiempo de retención ( tg = t 0 ⋅ k ⋅ log 2,3 ⋅ k 0 / k ) Factor de capacidad k = t G / ∆φSt 0 = t G F / ∆φSVm [ ][ ( Resolución R = (1 / 4) ⋅ (α − 1) (α ) ⋅ N 1 / 2 ⋅ k / 1 + k )] En el caso de que converjan diferentes solutos, los valores de gradientes (G) para los diferentes solutos no serán idénticos, ya que (G) es proporcional a (S). Cuando la concentración de gradiente es lineal, el gradiente (G) es constante durante toda la elución. INSTRUMENTACIÓN En la Figura 6 se representan los elementos esenciales que forman parte de un equipo de HPLC. Figura 6. Elementos de un equipo de HPLC. JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia Columna En HPLC se usan diversos tipos de columnas secundarias que se asocian a la columna de separación con otros fines específicos: - - Precolumnas: se colocan antes de la columna de separación y sirven como factor de protección que prolonga la vida y el uso de la columna separativa. Están diseñadas para filtrar y retirar: 1) partículas que obstruyan la columna de separación; 2) compuestos e iones que pudieran aumentar el ruido de fondo, disminuyendo la resolución y la sensibilidad, y creando falsos picos; 3) compuestos que podrían causar precipitación en contacto con la fase estacionaria o la fase móvil y 4) compuestos que podrían co-eluir y causar picos extraños e interferir con la detección y cuantificación. Este tipo de columnas deben ser cambiadas regularmente con el fin de optimizar sus funciones protectoras. Columnas para derivatizar (pre- o postcolumna separativa): son columnas que modifican químicamente el compuesto a una molécula con el que se van a obtener datos potencialmente tangibles que pueden complementar a otros resultados analizados anteriormente. Acetilación, sililación o hidrólisis ácida son algunas técnicas de derivatización. En las columnas analíticas es en las que realmente se lleva a cabo la separación. En la Tabla 1 se citan los distintos tipos. Columnas capilares: los avances en HPLC han llevado a estas pequeñas columnas analíticas, también conocidas como microcolumnas. Las columnas capilares tienen un diámetro menor a 1 mm, y hay de tres tipos: tubular abierto, parcialmente empacadas, y fuertemente empacadas. Estas columnas permiten trabajar con volúmenes de muestra de nL, disminuyendo el flujo y el volumen de solvente usado lo que puede llevar a una disminución de los costes. Sin embargo, la mayoría de las condiciones y la instrumentación deben ser miniaturizados, la relación de flujo puede ser difícil de reproducir, el gradiente de elución no es tan eficiente, y se debe tener mucho cuidado cuando se cargan volúmenes de muestra tan pequeños. 57 Columnas de microcalibre y de calibre estrecho: se usan para pequeños volúmenes de muestra. El diámetro típico es de 1-2 mm. Como en las columnas capilares, los instrumentos deben ser modificados para acomodarse a la pequeña capacidad de estas columnas. Sin embargo, excepto la ventaja de la pequeña cantidad de muestra y de volumen de la fase móvil, no se ha notado un incremento en la sensibilidad a la cantidad de materia inyectada sin pérdida significativa en la resolución. Columnas estándar: son las que se usan comúnmente. Su tamaño más habitual es de 2,4 mm de diámetro y 250 mm de largo, con un tamaño de partícula de 5 µm de diámetro (Figura 7-a). Las partículas pueden ser de sílica o de otros polímeros especiales que les confiere resistencia a determinadas condiciones (pH extremos) y a su vez pueden ser de forma esférica o irregular (Figura 7-a y 7-b). Las partículas son de naturaleza porosa a fin de aumentar mucho la superficie de interacción con los analitos, y dado que también influye en la separación, se tiene en cuenta el diámetro de poro. Hay variaciones, pero los poros de las partículas suelen ser de entre 100 y 300 Å (Figura 7-c). Columnas rápidas: la razón principal para usar estas columnas es aumentar el número de muestras que se pueden procesar en un tiempo dado. Para muchas columnas, incrementando el flujo o la relación de migración a través de la fase estacionaria se afectará adversamente la resolución y la separación. Así pues, las columnas rápidas se diseñan para rebajar el tiempo sin llegar a significativas desviaciones en los resultados. Estas columnas tienen el mismo diámetro interno pero son mucho más cortas que la mayoría de las columnas, y están empacadas con pequeñas partículas que son típicamente de 3 µm de diámetro. Las ventajas incluyen incremento de la sensibilidad, descenso en el tiempo de análisis, descenso en la fase móvil usada, e incremento en la reproducibilidad. Columnas preparativas: son columnas utilizadas con el objeto de permitir purificar grandes cantidades de muestra (mg). Una columna preparativa normalmente tiene un gran diámetro porque está diseñada para facilitar grandes volúmenes de inyección. JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 58 Diámetro (mm) Relación de flujo (µL/min) Capacidad de muestra (µg) Máxima carga de muestra (mg) 0,075 0,25 0,05 - 0,15 1,0 0,2 - 0,30 5,0 1,0 - 0,50 10 2,0 - Microcalibre 1,0 25 - 50 0,05 - 10 - Calibre estrecho 2,1 100 - 300 0,2 - 50 - Analítica 4,6 500 - 1.500 1 - 200 10 Semi-preparativa 10 2.500 - 7.500 1.000 50 Preparativa 22 10.000 - 30.000 5.000 200 Tipo Capilar Tabla 1. Características de los distintos tipos de columnas. a b Figura 7. Distintos tipos de partículas de las columnas estándar (a) forma esférica, (b) forma irregular y (c) tamaño de poro entre 100 y 300 Å. Inyector El inyector para HPLC consiste normalmente en una válvula de inyección y un bucle. Un pequeño volumen de muestra (previamente disuelta) se carga en una jeringa y es inyectada en el bucle por la válvula de inyección. Un giro del rotor de la válvula cierra la válvula y pone en comunicación el bucle que contiene la muestra con la corriente de fase móvil que va de la bomba a la columna. El volumen del bucle determina la cantidad inyectada y puede ir desde 5 µL hasta 500 µL. La inyección a flujo parado es un método especial por el cual la bomba se detiene para realizar la inyección a presión atmosférica, este sistema se utiliza cuando se trabaja a muy alta presión. Bomba Bombas de pistón recíproco: constan de un pistón conducido por una leva unida a un pequeño motor que se mueve rápidamente atrás y adelante en una cámara hidráulica variando su volumen entre 35-400 µL. En la carrera atrás, la válvula de separación con la columna está cerrada, y el pistón aspira el solvente del reservorio de la fase móvil. En la carrera hacia delante, la bomba empuja el solvente hacia la columna desde el reservorio. Se puede conseguir un amplio rango de flujos alterando el volumen de la carrera del pistón durante cada ciclo, o alterando la frecuencia con que éste realiza una carrera. La presencia de dobles y triples cabezas de bomba constante en idénticas unidades de cámara de pistón que operan a 180 o 120 grados fuera de fase, permiten un bombeo significativamente suave porque se llena una bomba mientras la otra está en el ciclo de expulsión. Bombas tipo jeringa: son más adecuadas para pequeñas columnas porque expulsan solo un volumen finito de fase móvil antes de rellenarse. Estas bombas tienen un volumen de 250 a 500 mL. Operan mediante un tornillo conductor motorizado que bombea fase móvil a la columna a flujo constante. La velocidad de flujo de expulsión se controla cambiando el voltaje del motor. JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia Bombas de presión constante: la fase móvil es conducida a través de la columna mediante la presión de un cilindro de gas. Una fuente de gas a baja presión se necesita para generar altas presiones en el líquido. La disposición de las válvulas permite rellenar rápidamente la cámara del solvente cuya capacidad está sobre los 70 mL, proporcionando relaciones de flujo de fase móvil continuas. 59 - - Detector Los detectores utilizados para HPLC siempre trabajan bajo condiciones de flujo continuo, la muestra disuelta en la fase móvil atraviesa una celda de flujo en la que es detectada. Normalmente, las muestras llegan en cantidades de ng al detector, pero en análisis de trazas, esta cantidad puede llegar a ser de fg e incluso de muy pocas moléculas. La respuesta del detector al paso de la sustancia está basada en un amplio rango de características físicas y químicas de las sustancias. Es por esto que no existe un detector universal, sino que cada sustancia, en principio, debe analizarse con el detector más adecuado dependiendo de su naturaleza físico-química, del tipo de análisis que se lleve a cabo y del tipo de instrumentación de la que se disponga. Los detectores más ampliamente utilizados se basan en: - - - Índice de refracción. El índice de refracción de la fase móvil varía cuando eluye la sustancia, es en principio universal, pero de pobre sensibilidad. Viscosidad. Absorción molecular en ultravioleta y visible. Pueden ser de (a) longitud de onda fija, sólo se detectan analitos que absorban a unas determinadas longitudes de onda, en el caso de que no absorban deben derivatizarse para cambiar su espectro de absorción molecular a esas longitudes; (b) de longitud de onda variable, se puede seleccionar cualquier longitud de onda; y (c) de dispositivo de diodos (diode array), proporcionan un espectro completo por unidad de tiempo. La luz policromática pasa a través de la celda de flujo y la luz trasmitida es dispersada por una red y dirigida al dispositivo de fotodiodos. Permite la cuantificación por supresión espectral, aunque el pico de interés no este bien resuelto, y la identificación de sustancias por su espectro característico. Fluorescencia. Ocurre cuando una molécula absorbe luz excitándose y emitiéndola a otra longitud de onda mayor que puede ser detectada específicamente. Es muy sensible - pero muchas sustancias tienen que ser derivatizadas para convertirse en fluorescentes mediante modificaciones químicas. Conductividad (electroquímicos). La muestra es oxidada o reducida en la superficie de un electrodo a potencial constante, y pueden ser potenciados por coulometría. Radioactividad. Luz dispersada tras evaporación. Funciona midiendo la luz dispersada por partículas sólidas del soluto después de la nebulización y evaporación de la fase móvil. Espectrometría de masas. Se utiliza la relación masa/carga de las sustancias eluídas y es aplicable a cualquier analito. Es el detector más sensible, selectivo y universal, pero de coste todavía elevado. Para cromatografía líquida se utilizan detectores cuadrupolares o detectores híbridos con acoplamientos a presión atmosférica como son fuentes APCI (ionización química a presión atmosférica) o fuentes ESI (electroespray) Cualquiera que sea el principio de operación, un detector ideal debe ser altamente sensible, de respuesta rápida y debe asegurar un bajo nivel de ruido y suciedad (particularmente crucial en el análisis de trazas). La sensibilidad es una de las propiedades más importantes del detector de cromatografía líquida. Es una medida de su capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias en la concentración del analito y viene representado por la pendiente de la línea de calibración. También es dependiente de la imprecisión de las medidas. El aumento de la pendiente de la curva de calibración es el aumento de sensibilidad del detector para un componente en particular, pero altas fluctuaciones de las medidas rebajarán la sensibilidad. Los picos que eluyen más temprano normalmente son más agudos, mientras que los que tienen tiempos de retención más largos son más anchos y algunas veces es difícil discernirlos del ruido. La definición de respuesta del detector depende de sí es sensible a la masa o sensible a la concentración. Para los detectores sensibles a la masa, la respuesta (R) viene dada por la siguiente relación: R= h⋅w s⋅M donde (h) es la altura del pico, en mV; (w) la anchura del pico a 0,607 cm de la altura, en cm; JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 60 (s) la velocidad de registro, en cm/min; y (M) la masa de soluto inyectada, en ng (puede ir de µg a pg). Para los detectores sensibles a la concentración, la respuesta puede ser calculada usando la fórmula siguiente: R= h⋅ w⋅ F s⋅M donde (F) es el flujo, en mL/min. Se considera que la respuesta del detector es lineal cuando la diferencia en la respuesta para dos concentraciones de un determinado compuesto es proporcional a la diferencia de concentración en las dos muestras. La regresión lineal de las respuestas de los calibradores frente a las concentraciones da un buen ajuste con (r2) cercano a 1 apareciendo como una curva de calibración en línea recta. El rango dinámico del detector es la máxima respuesta lineal dividida por el ruido del detector. La mayoría de los detectores se convierten en nolineales cuando el tamaño de la muestra se incrementa y este límite de linealidad debe estar bien definido. En HPLC el proceso es dependiente del tiempo. La aparición del componente eluido de la columna en el detector es representada por el punto de inflexión en la línea de base del cromatograma. Es un problema distinguir entre el componente y artefactos causados por la fluctuación de la presión o de la composición, burbujas, etc. Si los picos son bastante grandes, no hay problema para distinguirlos. Sin embargo, para los picos más pequeños, es muy importante que la línea de base no presente altibajos, esté libre de ruido y de deriva. El ruido de la línea de base son pequeñas variaciones de la línea en tiempos muy cortos, sobre una línea de base recta, causada por fluctuaciones de la señal eléctrica, por inestabilidad de la lámpara, por fluctuaciones de temperatura u otros factores. El ruido es un factor que limita la sensibilidad del detector. En el análisis de trazas, se debe distinguir ente los picos del ruido y los picos de los componentes. Un límite práctico para ello es 3 x relación señal-ruido, pero sólo con fines cualitativos. En la práctica el límite de detección cuantitativo puede se escogido como 10 x relación señal-ruido. Esto asegura la correcta cuantificación de las cantidades de las trazas con menos de un 2 % de variación. Otro parámetro relacionado con la fluctuación de la señal es la deriva. La línea de base debería desviarse tan poco como sea posible de una línea horizontal. Se mide normalmente durante un tiempo específico (30 min o 1 h). La deriva, por lo general, esta asociada al calentamiento del detector en la primera hora después de la puesta en marcha. En la Figura 8 se ilustra un ejemplo de lo comentado, indicando el nivel de ruido de una línea de base (medida a la más alta sensibilidad del detector) y los picos más pequeños que pueden ser inequívocamente detectados, así como la deriva de la señal. El diseño de la célula de flujo también es un factor importante. Las lentes proveen un enfoque del haz de luz en el centro de la celda. Unas lentes colectoras post-celda enfocan la totalidad de la luz desde la celda en el fotodetector. También se debe considerar la resolución del detector o número de medidas por unidad de tiempo que produce, en los sistemas modernos se provee una alta resolución en un corto espacio de tiempo. Si se considera una columna con 10.000 platos teóricos y 15 cm de longitud, los componentes eluidos en 2 min (2 mL a 1 mL/min de flujo) podrían contenerse idealmente en picos de 80 µL de ancho. De esta forma, teniendo una celda de flujo de 20 µL de volumen sólo se podrían hacer 4 medidas independientes para este pico. Definitivamente, esto no es bastante para describir correctamente la forma del pico y se debería aumentar el número de medidas. Otra característica importante de la celda de flujo es compensar el efecto de la refracción. Cuando los componentes de la mezcla pasan a través de la celda de flujo pueden modificar la composición del eluyente con lo que se puede llegar a cambiar el coeficiente de refracción. Si el haz de luz no es paralelo, el cambio en la refracción cambiará la luz y contribuirá en lecturas de absorción aparentes. Si el volumen de la celda de flujo es > 1/10 del volumen del pico, o si la geometría de la celda no ha sido optimizada, se puede apreciar un ensanchamiento aparente de los picos. Como el área del pico es proporcional a la cantidad de analito inyectada, el ensanchamiento del pico causa la reducción de su altura. En caso de ensanchamiento aparente del pico por volumen de la celda excesivo, si la geometría de la celda se optimiza no se debería observar una reducción significativa de la altura. JM. Hernández. Cromatografía líquida de alta eficacia 61 Figura 8. Esquematización de los fenómeno de ruido y deriva. Regulador de contrapresión El regulador de contrapresión se sitúa inmediatamente después del detector. Se diseña para aplicar una presión constante a la salida del detector que previene la formación de burbujas de aire en el sistema. Esto mejora la estabilidad de la línea de base cromatográfica. Se proyecta para operar sin tener en cuenta el flujo, la fase móvil o la viscosidad. Colector de fracciones El colector de fracciones es un dispositivo automático que recoge uniformemente los eluídos a la salida del HPLC. Los viales o tubos son colocados en un carrusel o en una gradilla y el usuario programa el intervalo de tiempo en el que se recolecta cada fracción. Cada vial contiene fase móvil y fracciones de la muestra en el correspondiente tiempo de elución. APLICACIONES CLÍNICO EN EL 2. Afinidad. Su poder radica en su selectividad, es profusamente utilizada para separar proteínas y anticuerpos con fines preparativos. Incluso células con distinta composición en hidratos de carbono son separadas en columnas de lectinas. Lipoproteínas, como LDLs y VLDLs, también pueden separarse mediante columnas de heparina, y glicohemoglobinas mediante columnas de boronato. En general, es aplicable a cualquier aislamiento de una sustancia específica que pueda llevarse a cabo mediante una reacción antígeno-anticuerpo, enzima-substrato o metalsustancia. 3. Intercambio iónico. Separación de hemoglobinas, isoenzimas de la creatina-cinasa o la L-lactato-deshidrogenasa y análisis de aminoácidos. Otras aplicaciones van dirigidas a retirar interferencias iónicas de otras sustancias para su posterior análisis por otros métodos. Un ejemplo es el porfobilinógeno en orina que queda retenido en la columna eluyendo las sustancias interferentes, posteriormente se eluye selectivamente y se cuantifica. LABORATORIO La HPLC es utilizada en laboratorios clínicos de referencia, muchas veces como técnica definitiva. Sus aplicaciones son múltiples, algunas de ellas, clasificadas en función del tipo de separación, son: 1. Líquido-sólido. Separación de monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos, y como método preparativo para esteroides o vitaminas antes del posterior radioinmunoanálisis. 4. Filtración en gel. En la determinación de las masas molares de macromoléculas o como paso previo para evitar interferencias en algún procedimiento de medida enzimático. 5. Fase reversa (supresión iónica y formación de pares iónicos). La cromatografía líquido-líquido es la más potente en cuanto a aplicaciones clínicas y la más utilizada en el laboratorio toxicológico para drogas de abuso (cocaína, benzoilegconina, cocaetieleno), anfetaminas, metaanfetaminas y antagonistas o narcóticos (naloxona, naltrexona); y en el laboratorio clínico o alimentario para Educación Continuada en el Laboratorio Clínico vitaminas liposolubles, carotenos, licopenos, etc., y péptidos y proteínas para su posterior análisis por espectrometría de masas. Para la detección y monitorización de una amplísima variedad de fármacos: - Analgésicos (acetaminofeno), analgésicos narcóticos (oxicodona) y analgésicos antiinflamatorios (naproxeno, ibuprofeno, diclofenaco). - Antagonistas (ranitidina, omeprazol). - Antiagregantes (warfarina). - Antiarrítmicos (procainamida, propanolol ó metoprelol, oxoprenol). - Antibacterianos (sulfadiazina, sulfamerazina, trimetroprim, sulfametoxazol, tetraciclina, minocliclina, demeclociclina). - Antidepresivos tricíclicos (doxepina, nordoxepina, nortriptilina, amitriptilina, imipramina, trimipramina, verapamil, norverapamil). Casos Clínicos 2004-05 (8) - - Antirretrovirales (aciclovir, delfinavir, saquinavir). Barbitúricos (fenobarbital, butabarbital, butabital, secobarbital). Broncodilatadores (albuterol, teofilina, teobromina, paraxantina, cafeína). Fármacos glucocorticoides (prednisolona, betametasona). Hormonas (dosificación de testosteronas: acetato, propionato y benzoato de testosterona). Péptidos terapéuticos (oxitocina, angiotensinas I y II). Queratolíticos (ácido salicílico, ácido benzóico). Sedativos (nordiazepam, clordiacepóxido, oxacepam, norclordiacepóxido) y opiáceos (morfina y sus glucorónidos, metadona). BIBLIOGRAFÍA Armstrong DW. Optical isomer separation by liquid chromatography. Anal Chem 1987;59:84A91A. Bidlingmeyer BA, Warren FV. Column efficiency measurement. Anal Chem 1984;56: 1583-1596. Bright FV. Bioanalytical applications of fluorescence spectroscopy. Anal Chem 1988;60:1031A-1039A. Brown PR, Hartwick RA. High Performance Liquid Chromatography. New York: Wiley Interscience, 1989;1-688. Gelpí E. Biomedical and biochemical applications of liquid chromatography-mass spectrometry. J Chromat 1995;59:59-82. Mant CT, Hodges RS, eds. High-Performance Liquid Chromatography of peptides and proteins: Separations, analysis, and conformation. Boston: CRC Press, 1991;1-960. Synder LR, Stadalius MA, Quarry MA. 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