Extracción y análisis de analgésicos por cromatografía en capa delgada Extracción Ácido-Base Fundamentos teóricos El método de extracción ácido-base es muy utilizado cuando alguna de las sustancias a recuperar presenta características ácidas o básicas. Los compuestos orgánicos con carácter ácido o básico que estén disueltos en un solvente orgánico pueden llevarse a una fase acuosa aprovechando sus propiedades ácido-base. Por lo tanto, este método permite separar mezclas de compuestos que difieran en sus características de acidez o basicidad. El procedimiento de extracción consiste en transformarlos secuencialmente en su sal correspondiente haciéndolos reaccionar con una solución acuosa ácida o básica. Hay pocos grupos funcionales orgánicos suficientemente ácidos o básicos para poder interactuar con bases o ácidos inorgánicos. Los ácidos carboxílicos y los fenoles reaccionan con bases fuertes para dar las sales correspondientes, según representamos con las siguientes ecuaciones: R–COOH + NaOH → R–COO– Na+ + H2O Ph–OH + NaOH → Ph–O– Na+ + H2O donde "Ph" representa al grupo fenilo (C6H5). Los ácidos carboxílicos, más ácidos que los fenoles, también reaccionan con bicarbonato de sodio mientras que los fenoles no lo hacen. R–COOH + NaHCO3 → R–COO– Na+ + H2O + CO2 Ph–OH + NaHCO3 → NO HAY REACCIÓN Las aminas reaccionan con ácidos inorgánicos fuertes para dar también sales solubles en agua: R–NH2 + HCl → R–NH3+ Cl– El método de separación de mezclas por extracción ácido-base consiste en: 1) Disolver la mezcla orgánica a separar en un solvente con las siguientes características: i. ii. iii. iv. todos los componentes deben ser solubles en él debe ser inerte (no debe reaccionar con ninguno de los componentes de la mezcla) debe ser inmiscible con el agua debe tener un punto de ebullición lo suficientemente bajo como para permitir recuperar las sustancias disueltas en él por evaporación 1 2) Agregar una solución ácida o básica para extraer a la fase acuosa el componente deseado (como una de sus sales). 3) Neutralizar la fase acuosa. 4) Extraer nuevamente con solvente orgánico. 5) Evaporar en forma separada las fracciones orgánicas hasta sequedad para poder recuperar los compuestos Los fundamentos de este procedimiento se resumen en la siguiente tabla: Categoría Funcionalidad Se extrae con Reacción ácido-base Ácidos orgánicos fuertes Ácido carboxílico Base débil (5% NaHCO3) RCOOH → RCOO-Na+ Ácidos orgánicos débiles Fenol Base fuerte (5% NaOH) ArOH → ArO-Na+ Bases orgánicas Amina Ácido fuerte (5% HCl) RNH2 → RNH3+Cl- Neutros Otros No extraíble No hay reacción 2 Cromatografía Fundamentos teóricos La cromatografía es una técnica que permite separar los componentes de una mezcla mediante su distribución diferencial entre una fase fija y una fase móvil. Cada uno de los componentes puede ser separado de los demás; y también puede determinarse la cantidad de cada uno en la mezcla. La cromatografía puede utilizarse con fines analíticos (cuali o cuantitativos) y preparativos. La fase fija puede ser un sólido poroso, finamente dividido como por ejemplo en la cromatografía de adsorción, o un líquido depositado como película delgada sobre un material poroso inerte como en la cromatografía de partición. La fase móvil puede ser un líquido puro o una mezcla homogénea o puede ser un gas como en la cromatografía gaseosa. De acuerdo con sus características estructurales los compuestos pasarán distintas fracciones de tiempo en la fase fija. El que pase más tiempo en la fase fija se moverá más lentamente y podrá ser separado de los otros. Existen varios tipos de cromatografía. Cromatografía de adsorción Cromatografía de partición Cromatografía de filtración por geles (o tamices moleculares o exclusión) Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de afinidad Existen también varias técnicas que se aplican a algunos de los tipos mencionados, por ejemplo: Cromatografía en capa delgada (CCD o TLC) Cromatografía en columna Cromatografía en papel Cromatografía gaseosa Según la técnica empleada hay consideraciones especiales para los distintos pasos en el proceso cromatográfico. Pero se puede decir que dicho proceso consta de cinco etapas principales: 1) Armado de la placa o columna: implica la disposición espacial que adopta la fase estacionaria. 2) Siembra: se refiere al contacto inicial de la mezcla a separar con la fase estacionaria, para su posterior desarrollo. 3) Desarrollo: es el pasaje de la fase móvil a través de la fase estacionaria. 4) Detección/Revelado: implica la visualización de cada compuesto. 3 Cromatografía de adsorción El proceso de cromatografía de adsorción se basa en la separación de un soluto entre una fase sólida de adsorbente y una fase móvil que es el solvente de elución El fenómeno de adsorción ocurre en la superficie del gránulo de la fase fija, y se fundamenta en la atracción entre el soluto y el adsorbente por formación de uniones dipolo-dipolo y formación de puentes de hidrógeno. El soluto es adsorbido en la superficie del adsorbente y luego desorbido por el solvente de elución. Es necesario que la fase estacionaria posea partículas que sean tan pequeñas como sea posible para que exista una superficie grande de modo que la adsorción y desorción de los solutos se verifique frecuentemente. Visualización del proceso cromatográfico Los adsorbentes presentan diferente grado de polaridad. Unos son polares, como la alúmina y la sílica gel y otros menos polares, como el carbón activado. Los solventes usados en la fase móvil deben ser de alta calidad, miscibles entre sí cuando se usan mezclas, no deben reaccionar con las sustancias a separar. La capacidad de un solvente de movilizar a una sustancia se denomina poder de elución. 4 Cromatografía en capa delgada La cromatografía en capa delgada se puede realizar con fines analíticos o preparativos, y es de adsorción o partición. En el primer caso, se extiende sobre una placa de vidrio una capa delgada y uniforme de adsorbente mezclado con una sustancia ligante, como por ejemplo sulfato de calcio, suspendido en un solvente adecuado. En una misma placa se pueden cromatografiar muestras diferentes, siempre que la siembra de las mismas se realice sobre una misma línea paralela al borde del vidrio. La placa una vez cargada se introduce en una cámara de vidrio con tapa (cuba cromatográfica), que contiene al eluyente. Esta cámara debe estar saturada con los vapores del solvente o la mezcla de desarrollo. El nivel del eluyente debe ser tal, que esté en contacto con el adsorbente pero sin tocar la línea de siembra. Para la elección del solvente de desarrollo es necesario tener en cuenta, entre otros factores, el adsorbente utilizado y la polaridad de las sustancias que se desean separar. El solvente asciende a través del adsorbente y cuando alcanza una altura conveniente se retira la placa de la cámara y se deja evaporar el solvente. Si las sustancias separadas son coloreadas se observan las manchas correspondientes a cada una de ellas a simple vista. Cuando las sustancias no son coloreadas es necesario revelar la placa una vez seca. Relación de frente Para poder medir el desplazamiento alcanzado por cada componente de la mezcla y por el patrón, con una medida tal que resulte independiente del tiempo y de las dimensiones de la placa, se utiliza el concepto de (RF) Relación de frente y se lo define como el cociente entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por el eluyente. RF = distancia recorrida por la sustancia ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ distancia recorrida por el eluyente La distancia recorrida por la sustancia se mide desde la línea de siembra hasta el centro de la mancha; y la distancia recorrida por el eluyente se mide desde la línea de siembra hasta la línea del frente del solvente. El RF depende de la sustancia y del sistema cromatográfico utilizado. Los RF son siempre menores o iguales a 1. 5 Extracción y análisis de analgésicos por cromatografía en capa delgada Los comprimidos de cafiaspirina plus® contienen como principios activos 650 mg de aspirina y 65 mg de cafeína. El resto (excipientes) está formado por almidón de maíz y celulosa en polvo. Su acción terapéutica se basa en su efecto analgésico (calma el dolor), antiinflamatorio (reduce la inflamación) y antifebril (baja la fiebre). Ácido acetilsalicílico Cafeína Trabajo experimental Extracción ácido / base Materiales Ampolla de decantación Aro metálico con nuez Soporte universal Gradilla con tubos de ensayos Erlenmeyer Probeta Embudo Papel de filtro Mortero con pistilo Cafiaspirina plus® HCl(ac) 5% Diclorometano Metanol NaOH(ac) 5% 6 Procedimiento - Pulverizar el contenido de 5 comprimidos de Cafiaspirina plus® y transferirlo a un erlenmeyer de 125 mL. - Agregar 20 mL de una solución diclorometano/metanol (1:1). Agitar durante un minuto. - Filtrar la suspensión obtenida. - Separar 1 mL de la solución en un tubo de ensayo. Fase orgánica A (FOA). - Transferir el volumen restante (19 mL) a una ampolla de decantación. - Agregar 15 mL de NaOH 5%. Agitar siguiendo la técnica de extracción. - Separar la fase acuosa (superior). Repetir con otros 15 mL de NaOH 5%. - Reunir los extractos acuosos. Reservar la fase orgánica (FOB). - Acidificar la fase acuosa con HCl diluido hasta formación de precipitado. Extraer dos veces con 15 mL de diclorometano. - Separar la fase orgánica (FOC). - NOTA: Todas las fases orgánicas deberán secarse con Na2SO4. Cromatografía en capa delgada Materiales Cuba cromatográfica Placa de sílica gel Tubos capilares Acetato de etilo Ácido acético Metanol Tolueno Procedimiento - Tomar una alícuota de las soluciones A, B y C. - Sembrar dichas alícuotas en una placa de sílica gel (adsorción). - Desarrollar con mezcla de tolueno- acetato de etilo- ácido acético- metanol (20:10:3:0,2) - Revelar con lámpara UV. - Comparar los Rf de las manchas observadas. 7
