cromatografía líquida ii - Sistema educativo virtual UNLP

EJEMPLOS DE FASES LIGADAS
CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL
Fuerza
Capacidad de la FM
para eluir al soluto
En NPLC la fuerza
aumenta al aumentar
la polaridad
En RPLC la fuerza de
la FM aumenta al
disminuir su polaridad
La influencia de la fuerza del
disolvente es muy
importante
CARACTERÍSTICAS DE LA FM: FUERZA Y
SELECTIVIDAD
Existen varios índices para
cuantificar la polaridad de
los solventes:
Capacidad de un solvente
para disolver
selectivamente un soluto
frente a otro, cuando las
polaridades de ambos no
son excesivamente
diferentes
Parámetro de solubilidad
de Hildebrand (δ)
Índice de polaridad de
Snyder (P´)
CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL:
POLARIDAD
La interacción total entre una molécula de FM y una
mólecula de soluto es el resultado de las siguientes
interacciones:
CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL:
POLARIDAD
Cuanto mayor se la combinación
de estas interacciones, mayor
será la atracción entre moléculas
de FM y soluto.
La “fuerza” de un solvente se
relaciona con su polaridad.
La capacidad de una molécula de
interactuar de acuerdo a estos
mecanismos, es una medida de
lo que llamamos “polaridad”.
En NPLC y en cromatografía de
adsorción, la “fuerza” del
solvente aumenta con su
“polaridad”.
Así, los solventes "polares"
disuelven preferencialmente
moléculas "polares”.
En RPLC ocurre lo contrario: la
“fuerza” del solvente disminuye a
medida que aumenta su
“polaridad”.
POLARIDAD DE SOLVENTES PUROS
La polaridad de los solventes se ha definido de varias
maneras.
En HPLC el parámetro más usado es P' , basado en datos
experimentales de solubilidad reportados por Rohrschneider.
El número de polaridad de Snyder (P´) se define como:
POLARIDAD DE SOLVENTES PUROS
A través de cada una de las constantes de reparto se mide la
tendencia a recibir protones (basicidad), a darlos (acidez) y a
generar momentos dipolares.
FUERZA Y SELECTIVIDAD DE SOLVENTES
TRIÁNGULO DE SELECTIVIDADES DE SNYDER
CLASIFICACIÓN DE LA SELECTIVIDAD DE LOS
SOLVENTES
Los mayores cambios en la selectividad de
la FM resultan cuando las propiedades de
los solventes cambian fuertemente.
Así, la sustitución de un solvente
polar B (por ej., metanol) por su
homólogo C (por ej., propanol) no
genera un cambio perceptible en
las interacciones soluto-FM y por
lo tanto en la selectividad. En
ambos casos se trata de
solventes donores de puente de
hidrógeno.
Si, en cambio, pasamos a un solvente C que se comporte como un
aceptor de puentes de hidrógeno (por ej., éter etílico) o que posea un
momento dipolar elevado (por ej., cloruro de metileno), aparecerán
cambios notables en la selectividad.
Con un solvente aceptor, las
moléculas de la muestra que se
comporten como donores de H,
permanecerán preferencialmente
en la FM (menor retención).
Con una FM de momento dipolar
elevado, las moléculas más
polares, interactuarán más
fuertemente con la FM.
En cada
caso, las
moléculas
que
desarrollen
mayor
interacción
con la FM,
disminuirán
su valor de
k´(menor
retención).
SELECTIVIDAD DE SOLVENTES
Selectividad por tipos de solventes en RPLC
(a) 50% MeOH-agua; (b) 25% THF-agua.
Compuestos: (1), p-nitrofenol; (2), p-dinitrobenceno; (3), nitrobenceno;
(4), benzoato de metilo
PARÁMETRO DE POLARIDAD P´



Un cambio de P' de dos unidades provoca
(aproximadamente) una variación de 10 veces en el
valor de k’, lo cual permite calcular su variación en
NPLC con la siguiente expresión:
Para RPLC esta expresión se transforma en:
k1 y k2 son los valores inicial y final de k' para un dado
soluto, y P1 y P2 se refieren a los valores iniciales y
finales de P´
MEZCLAS DE SOLVENTES
Tanto en RPLC como en NPLC, es usual ajustar la fuerza de la FM con mezclas de
solventes.
En general, un solvente A que resulta demasiado débil se mezcla con un solvente B
que es demasiado fuerte, y su mezcla brinda la fuerza correcta para la separación.
La polaridad P' de la mezcla de solventes se calcula como:
Donde φa y φb son las fracciones en volumen de los solventes A y B en la mezcla, y Pa y
Pb se refieren a los valores de P' de los solventes puros.
OTROS PARÁMETROS DE POLARIDAD
PROPIEDADES DE LAS FM MÁS COMUNES EN
HPLC
Modo de separación más empleado en HPLC
CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA (RPLC)
CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA (RPLC)
Es la primera opción para la mayor parte de las muestras
comúnmente analizadas por HPLC.
• Es más probable que se obtenga como resultado una separación final
satisfactoria.
Las columnas de RPLC son eficientes, estables y
reproducibles.
• La detección es más fácil en RPLC (especialmente para los detectores UV)
debido a los solventes utilizados.
Aunque muchos compuestos orgánicos tienen una
solubilidad limitada en la fase móvil (acuosa), esto no es
una limitación práctica, ya que sólo se inyectan pequeñas
cantidades (nanogramos o microgramos) de muestra.
RETENCIÓN EN CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA
Los compuestos
hidrofílicos (polar) son
menos retenidos y
eluyen primero
FM Polar
FE No Polar
Los compuestos más
hidrofóbicos (no polares)
son retenidos más
fuertemente
Hidrofóbico
(No Polar)
La separación es similar a la extracción desde agua a un disolvente orgánico: los
compuestos más hidrofóbicos (no polares) son preferentemente extraídos hacia la
fase no polar.
La columna es típicamente un soporte de sílice modificada con C8 o C18 como fases
ligadas.
EFECTOS DE LA FASE MÓVIL
La retención (valor de k´) se ajusta preferentemente cambiando la
composición de la fase móvil o la fuerza del solvente.
En RPLC, la retención es menor para las FM más fuertes, que son las menos
polares.
La polaridad del solvente se puede medir por el índice de polaridad P´.
La fuerza del solvente depende tanto de la elección del solvente orgánico
como de su concentración en la fase móvil (B%), siendo A el agua.
Un primer (y principal) objetivo en el desarrollo del método es la obtención de
la retención adecuada de todos los compuestos de la muestra.
Un intervalo de retención de 0,5 < k´<20 es aceptable para las muestras que
se separan mediante condiciones isocráticas (aunque se prefiere 1 <k´<10).
ELECCIÓN DEL % DE B.
El desarrollo del método comienza usando una fase
móvil muy fuerte (100% de ACN).
El uso inicial de una fase móvil fuerte hace que el
tiempo de análisis sea convenientemente corto, y los
todos los compuestos eluyan.
Para 100% de ACN toda la muestra eluye cerca de tM
(k´ < 0,2) por lo que se requiere una FM más débil.
Las sucesivas reducciones de ACN% hasta 80% y 60%
ACN no dan resultados aceptables en términos de
retención del primer pico (tR = 1 min, k´ < 0,5).
Una retención adecuada se logra con 50% y 40% de
ACN (0,5 < k´ < 20).
Si la fase móvil es mucho más débil (<30% ACN), la
retención para el compuesto D sería demasiado larga
(k´> 20).
ELECCIÓN DEL % DE B
Las líneas
punteadas
horizontales en k´=
0,5 y 20 definen los
valores mínimo y
máximo de %B para
obtener una
retención aceptable:
30 a 56% B (líneas
de puntos
verticales).
ELECCIÓN DEL % DE B
A partir del modelo de
partición antes visto aplicado
a fases estacionarias ligadas,
se obtiene:
kw es el valor teórico
de k´ para agua
pura como FM,
S es una
constante para
un compuesto
dado
φ es la fracción
en volumen de
solvente orgánico
en la FM.
Para compuestos
de PM<500 Da,
S = 4.
k´ aumenta por un
factor de 2 a 3 por
una disminución del
10% B.
FUERZA DE LA FASE MÓVIL
No sólo hay que tener en cuenta la fuerza del solvente
con respecto a su influencia sobre %B sino que
también tiene importancia el tipo de solvente utilizado.
Los solventes
más utilizados
son el
acetonitrilo, el
metanol y el
tetrahidrofurano
(THF).
Entre ellos la
sucesión en
función de su
fuerza es la
siguiente:
agua (el más débil) <metanol <acetonitrilo <etanol
<tetrahldrofurano <propanol <cloruro de metileno (el más
fuerte)
De todos ellos, el cloruro
de metileno no es muy
utilizado debido a que es
inmiscible en agua.
El más utilizado es el
AcN porque tiene la
suficiente fuerza y
porque cuando se
emplea como sistema
detector el
espectrofotometricoo UVV es transparente a
Iongitudes de onda
cortas.
Las mezclas de AcN son
de baja viscosidad y eso,
en cierta manera,
aumenta la eficiencia de
la columna (N) y la
presión a utilizar es
menor.
Algo menos que el AcN
se utiliza el metanol y
algo menos todavía el
THF.
DIAGRAMA DE COMPARACIÓN DE SOLVENTES
EN RPLC
Mezclas isoeluotrópicas: mezclas acuosas binarias de
composición tal que mantienen la retención global de la
mezcla de analitos
El empleo de los nomógrafos permite cambiar la selectividad
sin cambiar la retención global de la mezcla
EFECTO DE LA FE
Aparte de la fase
móvil, las
retenciones
presentan
dependencia
respecto a la fase
estacionaria.
La retención de
los analitos
depende de tres
características de
la columna: tipo
de fase enlazada,
concentración y
superficie.
Si se analiza el tipo de fase enlazada la
retención de analitos no polares y no iónicos
sigue el siguiente orden:
Sílica desnuda (débil) < < ciano < C1 (TMS)
< C3 < C4 < fenilo < C8 ≈ C18 (fuerte)
EFECTO DE LA LONGITUD DE LA CADENA EN LA
EFICIENCIA DE UNA COLUMNA DE RPLC
CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL (NPLC)
ASPECTOS GENERALES
La FE es más polar que la FM.
Por lo general, la FM es una mezcla de solventes orgánicos,
sin adición de agua (por ejemplo, isopropanol + hexano)
El relleno de la columna es un adsorbente inorgánico (sílice o
alúmina) o una fase ligada polar (ciano, diol, aminoácidos).
La retención de la muestra aumenta a medida que disminuye
la polaridad de la FM.
En NPLC, los compuestos menos polares (hidrofóbicos) eluyen
primero, mientras que los más polares (hidrofílicos) son los
más retenidos.
MECANISMO DE RETENCIÓN
La retención en NPLC se describe bien por un
proceso de desplazamiento
 Se basa en que la superficie de la sílice está
inicialmente cubierta por una monocapa de
moléculas de FM adsorbida.
 Para que una molécula de soluto pueda quedar
retenida, deberá desplazar previamente e las
moléculas de FM adsorbida.
 El equilibrio vendrá dado por:

Y(m) + nM(s) ⇔ Y(s) + nM(m)
MECANISMO DE RETENCIÓN
La figura muestra el desplazamiento de un soluto relativamente no
polar (clorobenceno) en una FM menos polar (cloruro de metileno).
Una o más moléculas pre-adsorbidas de CH2Cl2 son desplazadas de
la FE y regresan a la FM.
MECANISMO DE RETENCIÓN





Snyder obtuvo una expresión para la retención en NPLC
en función de la "fuerza del solvente":
ε° es un parámetro que refleja la polaridad de la FM.
As es el área superficial del soluto.
β es la relación de fases.
Δ2 es un parámetro de segundo orden que sirve para
corregir por falta de linealidad del modelo asumido.
PAPEL DEL SOLVENTE
En la ecuación de Snyder, las características del solvente están representadas por e°,
el “parámetro del solvente”.
El solvente debe elegirse de modo que k´ caiga en el rango óptimo (entre 1 y 10).
La “fuerza del solvente” está determinada por cuán fuertemente el solvente se adsorbe
sobre el sólido.
Para adsorbentes polares, la fuerza del solvente crecerá con su polaridad y un solvente
fuerte dará valores de k´ bajos.
Si un mismo soluto es cromatografiado sobre un mismo adsorbente empleando dos
solventes diferentes, la relación de las K´ será:
K´


solv
1


log
= As ε °
−ε °

solv
2
solv
1


K´
solv2
PAPEL DEL SOLVENTE
⊠
⊠
⊠
⊠
Se define ε° = 0 para el pentano (que es uno de los
solventes más “débiles”).
Se construye una escala de valores crecientes de ε°,
conocida como “serie eluotrópica”
Para adsorbentes polares, ε° crece con la polaridad, y
la serie eluotrópica es más o menos coincidente con la
escala de P´.
Al aumentar ε°, los K´ de todos los solutos se harán
menores, pero el efecto es mayor cuando las moléculas
tienen áreas moleculares (A s) más grandes.
SELECTIVIDAD DE LA FM
El parámetro eº para mezclas
se puede calcular a partir de
los valores de eº para los
solventes puros.
Para la obtención de FM de
diferente selectividad y
similares valores of k´ existen
nomógrafos.
A diferencia de RPLC, estos
nomógrafos dependen de la
FE.
Nomógafos para NPLC y sílice “desnuda”
como FE.
SELECTIVIDAD DE LA FE




(1) 2-aminonaftaleno
(2) 2,6-dimetilquinoleína
(3) 2,4-dimetilquinoleína
(4) 4-nitrofenol
(5) quinoleína
(6) isoquinoleína

Condiciones:
Columna de 150 × 4.6-mm de
sílica (FE) (dp = 5-μm)
FM: acetato de etilo (B)-ciclohexano
(A)
Temperatura ambiente
Caudal: 2.0 mL/min.
HPLC
FASE MÓVIL EN HPLC
Los solventes más utilizados en HPLC son: agua, soluciones buffer
acuosas y solventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o
diferentes mezclas.
 La fase móvil debe microfiltrarse para evitar obstrucciones en el
sistema (conexiones muy estrechas, pistones de zafiro y columna
muy empaquetada)

Aire disuelto
en la fase
móvil
(problemas)
Bomba
(flujo
inestable)
Detector
(señales
erráticas)
HPLC: BOMBAS
Construidas con materiales inertes a los
disolventes empleados
Flujo entre 0.1 y 10 mL/min libre de pulsaciones
Generar presiones superiores a los 6000 psi (14.7
psi = 1 atm)
Las bombas pueden liberar el eluyente a una
composición fija (régimen isocrático) o a una
composición variable en el tiempo (régimen de
gradiente)
En el caso de una bomba, los solventes se mezclan previamente en una
cámara a “baja presión”
En el montaje de “alta presión” se emplean tantas bombas como solventes se
usen y luego se produce la mezcla
HPLC: INYECTORES
El inyector más empleado
es una válvula de 6 vías,
con lazos de volumen
conocido y una palanca
con dos posiciones:
llenado e inyección
En la posición de llenado,
la FM pasa directamente
a la columna y la muestra
se introduce en el lazo
mediante una
microjeringa
De este modo la varianza
en la inyección es
constante y no hay que
usar patrón interno como
en GC
Al girar la palanca a la
posición de inyección, la
FM impulsa la muestra
que estaba en el lazo
hasta la columna
Los lazos más habituales
oscilan entre 2 y 1000 mL
HPLC: COLUMNAS
Son generalmente de acero ó plástico, de una
longitud de 5-30 cm y con diámetros interiores
de 1-5 mm
Las convencionales tienen un diámetro interno
de 4.6 mm. (L=15 ó 25 cm y 5μm tamaño
partícula)
Son caras y se degradan con facilidad (polvo,
partículas de la muestra o disolventes)
La entrada de la columna se protege con una
precolumna que se reemplaza periódicamente
PRE-COLUMNAS
En cromatografía de reparto, la
FM y la FE deben seleccionarse
de forma que la solubilidad
recíproca sea mínima.
Por muy distintos que sean dos
líquidos, siempre serán algo
miscibles.
Por ello, la FM deberá
presaturarse con la FE antes de
ponerse ambas en contacto
dentro de la columna.
Esta pre-saturación se hace en
una pre-columna situada antes
del sistema de introducción de
las muestras.
La pre-columna deberá
contener un relleno de gran
área superficial, tal como gel de
sílice, recubierto con una
cantidad relativamente grande
(30-40%) de la sustancia usada
como fase estacionaria.
El problema de la solubilidad de
la fase estacionaria impide
utilizar la técnica de la elución
con gradiente.
DETECTORES


Los detectores basados en una PROPIEDAD DEL SOLUTO responden
a una propiedad física o físico-química del soluto, y que
generalmente no la presenta la fase móvil. Estos detectores suelen
ser bastante selectivos y muy sensibles.
Los detectores basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIÓN
comparan el cambio global de alguna propiedad física de la fase
móvil con y sin soluto eluido. Estos detectores responden a un
conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.
Sensibilidad
elevada.
Buena
estabilidad y
reproducibilid
ad.
No
destructivo.
Respuesta
independiente de la
composición
de la fase
móvil.
Insensible a
cambios en
la presión y
la
temperatura.
Características
de un detector
para HPLC
Amplio
margen de
respuesta
lineal.
Pequeño
tiempo de
respuesta.
Pequeño
volumen
muerto.
DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA



La modificación más
importante es diseñar
adecuadamente la celda
de flujo.
Esta deberá contener un
volumen mínimo (entre
1 y 10 μL) y ser capaz
de soportar presiones
de varias atmósferas.
Celda
diseñada
en
forma de Z.
DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA


El detector UV más sencillo
utiliza la emisión intensa a
254 nm de una lámpara de
mercurio y la detección a una
sola longitud de onda.
Se estima que casi las dos
terceras partes de los solutos
orgánicos analizados por HPLC
presentan absorción a esa λ,
especialmente los compuestos
aromáticos, los cuales tienen
absortividades molares del
orden de 104.

En instrumentos más versátiles
se utiliza una lámpara de
deuterio y un monocromador
para mediciones a longitud de
onda variable.
APLICACIONES



La cromatografía en FASE
NORMAL se utiliza extensamente
para el análisis de sustancias que
son solubles en disolventes no
polares.
Vitaminas, pigmentos, aceites
esenciales, aditivos no polares en
distintos productos comerciales y
formulaciones farmacéuticas.
Asimismo, uno de los usos más
importantes de esta modalidad
de cromatografía es la separación
de isómeros.




La
cromatografía
en
FASE
INVERSA, y particularmente la de
fase enlazada, es, sin duda, la más
ampliamente utilizada.
Se calcula que el 75 % de las
separaciones por HPLC se llevan a
cabo por dicha técnica.
En la industria farmacéutica sus
aplicaciones se centran, entre
otras, en el análisis de vitaminas,
β-bloqueantes,
alcaloides,
esteroides,
tetraciclinas,
prostaglandinas, etc.
Asíiismo, es utilizada para el
análisis
de
especies
biológicamente
activas,
como
aminoácidos, proteínas y ácidos
nucleicos.
CROMATOGRAFIA PLANA
Cromatografía líquida en la que la fase estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una
columna.
Existen dos técnicas de cromatografía plana: cromatografía en papel (CP) y cromatografía de capa fina (CCF o TLC).
En cromatografía plana, la muestra se aplica en forma de gota sobre una lámina o superficie plana. Después de
evaporado el disolvente, la lámina se coloca verticalmente en una cámara cerrada con su extremo sumergido en el
eluyente elegido (fase móvil), pero no la muestra.
La fase móvil percola a través de la fase estacionaria por capilaridad y desplaza los componentes de la muestra a
distinta velocidad, teniendo lugar la separación.
Una vez que el disolvente ha pasado a través de la mitad o de las dos terceras partes de la longitud de la lámina,
se saca ésta de la cámara y se seca, poniéndose de manifiesto la presencia de las especies separadas por los
procedimientos que se indicarán más adelante.
El cromatograma está constituido por un conjunto de manchas que corresponden a los componentes separados
CROMATOGRAFIA PLANA
PRINCIPIOS BASICOS

La caracterización de los componentes separados se lleva a
cabo por el denominado factor de retardo, RF, definido por:
dR
distancia recorrida por el soluto
RF =
=
distancia recorrida por el frente del solvente d M


Los valores de RF pueden variar desde 1, para los analitos
que no se retrasen, hasta valores próximos a cero.
Ayudan a la identificación de una determinada especie, si
bien, la coincidencia en los RF no deberá tomarse como
prueba inequívoca de identificación
PRINCIPIOS BASICOS

Con objeto de minimizar las diferencias entre los
valores de los RF, se ha propuesto utilizar el
parámetro Rx, definido por:
distancia recorrida por el soluto d R
RX =
=
distancia recorrida por el patrón d P

A pesar de la coincidencia en los valores de Rx, la
identificación plena de un compuesto deberá
hacerse de forma específica, con técnicas
auxiliares,
como
espectroscopia
IR,
espectrometría de masas, RMN, etc.
PRINCIPIOS BÁSICOS

Factor de retención o factor de capacidad
t´ R 1 RF
k´ =
=
t´ M
RF

Número de platos teóricos
N = 16
dR
W
2
LOCALIZACIÓN DE LAS SUSTANCIAS
SEPARADAS
Métodos
químicos.
Métodos
físicos.
•Implican una reacción química, específica o general.
•Vapor de yodo, se adsorbe sobre una gran cantidad de
sustancias, originando puntos oscuros.
•Ácido sulfúrico concentrado, el cual, pulverizado permite
visualizar las sustancias orgánicas
•Fluoresceína origina color amarillo-verdoso
•Ninhidrina se utiliza para detectar aminoácidos.
•Radiación ultravioleta, en combinación con un indicador
fluorescente.
•La placa contiene un material fluorescente cuya emisión (a 254
nm) es inhibida por la mayoría de los solutos.
•Una vez evaporado el solvente, se ilumina la placa con radiación
ultravioleta en un cuarto oscuro.
•Las manchas de soluto se ven más oscuras, mientras que el
resto de la placa es brillante.