Fuerzas iónicas

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Sistemas cromatográficos
Sistemas a desarrollar
FM
FE
• L convencional/fase ligada
• sólida
Líquida • resina intercambiadora
• gel poroso
• soporte con ligando unido
MÉTODO
reparto
adsorción
intercambio iónico
tamizado
reacción específica
Fuerzas interactivas relacionadas con
cromatografía líquida
- Fuerzas iónicas
- Fuerzas polares
- Fuerzas dispersivas
- Enlace de hidrógeno
es un ejemplo de fuerzas polares muy fuertes
Fuerzas interactivas relacionadas con
cromatografía líquida
Fuerzas iónicas
Surgen de cargas eléctricas permanentes (netas) de las
moléculas. Se usan en cromatografía de intercambio
iónico.
Fuerzas polares (van der Waals)
Surgen de dipolos permanentes o inducidos en moléculas
sin carga neta. La proximidad de una molécula con dipolo
permanente a otra molécula polarizable produce un par de
cargas opuestas en dicha molécula (polariza) resultando
una interacción eléctrica entre cargas inducidas y
permanentes. La sílica exhibe fuertes interacciones polares
con solutos y solventes debido a su superficie altamente
polar con grupos silanol que tienen dipolos permanentes
muy fuertes.
Fuerzas interactivas relacionadas con
cromatografía líquida
Fuerzas dispersivas (fuerzas de London)
Son las más débiles. Ocurre atracción entre
dipolos instantáneos en una molécula. Resultan de
fluctuaciones de carga (Ej. fuerzas moleculares
que ocurren entre moléculas de hidrocarburos).
Las interacciones de solutos y solventes con una
fase reversa (considerando ausencia de grupos
silanol)
son exclusivamente de naturaleza
dispersiva.
Cromatografía de reparto
Fase estacionaria LÍQUIDA
Fundamento de separación: diferente
solubilidad del analito en FM y FE
Cromatografía de partición o reparto
CL convencional
Fase ligada
El líquido (FE) está
adsorbido sobre un
soporte sólido inerte
Las cadenas carbonadas (FE)
están unidas covalentemente
al soporte sólido inerte
Fase inversa
Fase móvil polar/ Fase estacionaria no polar
Fase normal
Fase móvil no polar/ Fase estacionaria polar
Cromatografía L-L convencional
FE (líquida)
soporte inerte
Fase unida o ligada
La mayoría de las fases ligadas se forman a partir
de partículas de sílicagel, a las que se les une
covalentemente cadenas carbonadas que actúan
como FE
Representación esquemática de partícula de silicagel
OH
OH
Si
Si
O
Si
HO
O
OH
O
O
Si
OH
grupo silanol
O
OH
Si
OH
OH
Empaques de siloxanos: las fases ligadas más
frecuentes (cepillo, oligomérica y voluminosa) son
producidas por monocloro, dicloro y triclorosilanos,
respectivamente.
unión siloxano
grupo silanol reactivo
Si OH
O
unión
siloxano
+
Si OH
CH3
ClSi R
CH3
alquil clorosilano
- HCl
Si
O
O
Si OH
C6H13
C8H17
C18H37
C4H6N
C8H9SO
etc
CH3
Si R
CH3
Fase unida tipo “cepillo” (brush)
Los grupos están en posición perpendicular a la superficie
generando una estructura de cepillo o brocha
Estructura A
Estructura B
impedimento estérico (grupos
metilos unidos al silicio)
más aceptada
Fase unida tipo “oligomérica”
Etapa 1
Alquil diclorosilano
Fase unida tipo “oligomérica”
Etapa 2
Etapa 3
Se trata la sílica
en forma
alternada con
agua y
diclorosilano. Se
va formando el
oligómero que
constituye la FE
Fase unida tipo “oligomérica”
Etapa final
CH3
Cuando se une la
última cadena, se
hace reaccionar al
grupo silanol
remanente con
trimetil clorosilano.
Es la fase ligada
más difícil de
obtener
Fase unida tipo “voluminosa” (bulk)
Consiste en una película polimérica algo abierta de FE
cubriendo la superficie de la sílica
Etapa 1
Alquil triclorosilano
Fase unida tipo “voluminosa”
Etapa 2
La cadena “octildicloro”
reacciona con agua para dar
una cadena “octildihidroxo”
Fase unida tipo “voluminosa”
Etapa 3
La cadena “octildihidroxo”
reacciona con moléculas
de triclosilanos y forma la
superficie polimérica.
Los grupos clorosilanos
tienen libertad de
movimiento para
reaccionar con silanoles de
la superficie (capa de
polímero entrecruzado)
Fases ligadas
Las fases tipo “cepillo” (brush) se sintetizan
de una manera reproducible, y por lo tanto
son generalmente recomendadas para la
mayoría de las aplicaciones.
Las fases voluminosas (bulk) tienen alta
capacidad retentiva y son adecuadas para
sistemas que operarán con mezclas de
solventes acuosos con altos contenidos de
agua.
Fase unida o fase ligada
Fase normal
Fase reversa
La FE es más
polar que la
muestra y la FM
La FE es menos
polar que la
muestra y la FM
Fase normal
FM de baja polaridad/ FE polar
Solutos poco polares eluyen primero
Incrementar la polaridad de la FM tiene el efecto
de reducir el tiempo de elución.
R-Polar: ciano, diol, amino, dimetilamino.
FM de baja polaridad: etil éter, cloroformo, hexano
Ejemplo de interacción con fase normal
---
---
H N H
NO2
enlace de
hidrógeno entre
el analito y la
ciano-superficie
Fase reversa
Más ampliamente utilizada
Las fuerzas interactivas entre FE y soluto (o solvente)
son de naturaleza dispersiva: fuerzas de dispersión de
London.
Solvente de alta polaridad-solutos de alta polaridad
eluyen primero.
R más comunes: C8 (n-octil) y C18 (n-octildecil)
Cuanto mayor es el número de átomos de carbono en
R mayor es la eficiencia.
Elución a pH>7.5 puede producir hidrólisis del siloxano
Ejemplos de fases ligadas reversas
Hexil, C6
Alquil fluorada
(reactivo = perfluorooctil
dimetil clorosilano)
Octil, C8
Octadecil, C18
fenil
Ejemplos de fases ligadas
C1
C-18
C8
Oxy-Phenyl
PFP
(pentafluorofenil)
Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia
de columna de fase reversa
1 uracilo, 2 fenol, 3 acetofenona, 4 nitrobenceno, 5 metil benzoato, 6 tolueno
R= C3
R= C8
R= C18
Índice de polaridad: describe cuantitativamente
la polaridad del solvente en el reparto
SOLVENTE
Fluoroalcanos
ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)
< -2
Ciclohexano
0.04
Tolueno
2.4
Cloroformo
4.1
Etanol
4.3
Acetato de etilo
4.4
Metanol
5.1
Nitrometano
6.0
Etilenglicol
6.9
Agua
10.2
Series eluotrópica de solventes
Fase normal
P
O
L
A
R
I
D
A
D
+
Hexano
-
Benceno
F
U
Cloroformo
E
R
Acetato de etilo Z
A
Metanol
Agua
+
Fase reversa
Agua
+
Metanol
Acetonitrilo
-
P
O
L
A
R
I
D
A
D
Orden de elución
Polaridades de los solutos: A > B > C
Aplicaciones de la cromatografía de reparto
CAMPO
MEZCLAS TÍPICAS
Fármacos
Bioquímica
Antibióticos, analgésicos, sedantes, esteroides
Alimentos
Industria química
Contaminantes
Química forense
Medicina clínica
Edulcorantes, aditivos, aflatoxinas, antioxidantes
Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
Aromáticos condensados, tensioactivos,colorantes
Pesticidas, herbicidas, fenoles, HPAs
Drogas, venenos, narcóticos, alcohol en sangre
Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos
de orina, estrógenos
Cromatografía de adsorción
Fase estacionaria sólida
Fundamento de separación: el analito interacciona
con sitios activos de la superficie de la FE.
Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de
hidrógeno, etc.
Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO3, MgCO3
Microscopía electrónica de barrido de soportes
cromatográficos porosos
partículas
esféricas de
sílica
sílica de forma irregular
polímeros orgánicos monolíticos
monolítica de sílica
Cromatografía de adsorción
Sílicagel
solvente débil
solvente fuerte
analito
analito
O
O
O
H
H
Si
O
O
Si
H
solvente
H
R
H
O
Si
O
O
Si
H
O
R
Solvente fuerte: sorción
soluto
cloroformo
n-heptano
sílica
Solvente débil: desplazamiento
cloroformo
n-heptano
soluto
soluto
sílica
Sílica cubierta con bicapa de solvente
Soluto
interactuando
con 2da capa
de solvente B
(sorción)
Soluto
interactuando con
1er capa de B
(desplazamiento)
Solvente B
desplazado
Solvente A
desplazado
sílica
Soluto interactuando
con sílica
(desplazamiento)
Soluto
interactuando
con 1er capa
de B (sorción)
Soluto interactuando
con sílica
(desplazamiento)
Soluto interactuando con
1er capa de A (sorción)
Fuerza del solvente (energía de adsorción del
solvente por unidad de área del adsorbente).
Se mide con el parámetro de Snyder (ε°).
SOLVENTE
Fluoroalcanos
Ciclohexano
Tolueno
Cloroformo
Acetato de etilo
Etanol
Metanol
Etilenglicol
Agua
εO (SiO2)
0.00
0.01
0.22
0.26
0.48
0.70
0.75
0.90
grande
εO (Al2O3)
-0.25
-0.2
0.29
0.40
0.58
0.88
0.95
1.11
grande
Elección de la fase móvil
fase móvil interactiva
fase móvil no-interactiva
participación activa
en la separación
los tiempos de retención están
fuertemente influenciados por el
tipo de FM utilizada
reparto, adsorción,
intercambio iónico
la FM solo transporta la
muestra a través de la FE
los tiempos de retención
son independientes de
la FM utilizada
CG y exclusión
molecular
Se produce un equilibrio entre fuerzas intermoleculares
de soluto, FE y FM
hidrocarburos<éteres<ésteres<cetonas<aldehídos<amidas<aminas<
<alcoholes<agua
Polaridad creciente
Se elige la polaridad de FE bastante similar a la de los analitos y para
eluir se usa FM de polaridad considerablemente distinta
Cromatografía de intercambio iónico
Fundamento
de
separación:
intercambio reversible de iones entre
el analito y la FE funcionalizada.
Intervienen fuerzas electrostáticas.
Fase estacionaria: resinas y geles de
intercambio iónico, intercambiadores iónicos
inorgánicos
Fase móvil: ácidos y bases inorgánicos y
orgánicos (KOH, NaOH, HClO4, HCl, ácidos
tartárico, dipiconílico, metanosulfónico, etc), sales
(carbonato de sodio, perclorato de sodio, etc.),
con o sin mezcla de solventes orgánicos (metanol,
acetonitrilo, etc.)
Detector: conductímetro
FE
cargada
Fases estacionarias
Resinas de intercambio iónico
Se usan para moléculas pequeñas (PM<500).
Penetran en los poros pequeños de la resina
Geles de intercambio iónico
Se usan para moléculas más grandes (proteínas y ácidos
nucleicos)
Intercambiadores iónicos inorgánicos (óxidos hidratados de
Zr, Ti, Sn y W)
Separaciones que exigen condiciones químicas fuertes (alta
temperatura, agentes oxidantes fuertes, radiación)
Cromatografía Iónica
La cromatografía iónica es una variante de la
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) para la
separación y determinación de iones, basado en el
uso de resinas de intercambio iónico.
Se utilizan columnas de intercambio iónico
especialmente diseñadas para este tipo de
cromatografía.
Los conectores del cromatógrafo iónico son
poliméricos (en vez de ser de acero inoxidable). El
más común es el PEEK (polyether ether ketone).
Cromatografía Iónica
Se
utilizan
detectores
conductimétricos,
amperométricos, UV, etc, aunque el más común es
el conductímetro.
El resultado es un cromatograma donde la
posición de los máximos nos indica el ión presente
(carácter cualitativo) y su área nos indica que
cantidad existente de dicho ión (carácter
cuantitativo).
Hace 25 años….
SO4 -2
PO4 -3
F
NO3
-
-
-
Cl
Inject
NO2
-
-
Br
0
Minutes
Análisis de aniones en la actualidad
Resinas de intercambio iónico
Intercambiador
Grupo
Nombre comercial
catiónico
ácido fuerte
ácido sulfónico
ácido débil
ácido carboxílico
Dowex 50, Amberlite
IR120,Ionac CGC-240
Amberlite IRC 50, Ionac
CGC-270
Aniónico
base fuerte
ión amonio cuaternario Dowex 1, Amberlite IRA
base débil
grupo amina
400, Ionac AGA-542
Dowex 3, Amberlite IR45
Ionac AGA-316
Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte
Resinas de intercambio catiónico: ácido debil
Resinas de intercambio aniónico: base fuerte
Resinas de intercambio aniónico: base debil
Diferentes empaques en intercambio iónico
Resina pelicular
vidrio
película intercambiadora:
microesferas de sílica o vidrio
(1 - 2 µm) cubiertas con
intercambiador iónico
30 – 40 µm
macroporos
Resina
macroreticular
El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio
x RSO3 H+ + Mx+
sólido
solución
(RSO3 )xMx+ + x H+
sólido
solución
El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio
x RN(CH3)3+ OH- + Axsólido
solución
[RN(CH3)3+]x Ax- + x OHsólido
solución
Se aplica elución en gradiente con fuerza iónica creciente o
mediante cambios de pH
Un gradiente de fuerza iónica es semejante a gradiente de
solvente o de temperatura
Ejemplo: Separación de iones metálicos como cloro
complejos en un intercambiador aniónico fuertemente
alcalino con gradiente de elución con HCl
El Ni prácticamente no forma complejo con
el Cl- y eluye primero, sin quedar retenido.
Le sigue el Mn y así sucesivamente hasta
llegar al Zn que forma el complejo más
estable y es el más retenido
cc
12 M HCl
Mn
Ni
6M
Co
4M
Fe
Cu
Zn
2.5 M
0.5 M
0.005 M
volumen de retención
Detector
El conductímetro es el detector universal de iones
Problema: gran concentración iónica del eluyente → elevada
conductividad de FM → línea de base alta en el cromatograma
→ se reduce la señal del analito y por lo tanto la sensibilidad
Se requiere “suprimir” la señal del eluyente
Solución: columnas supresoras (colocadas inmediatamente
después de la columna), que reducen la línea de base
Contienen una segunda resina de intercambio iónico que
convierte los iones del disolvente en especies moleculares
poco ionizadas, sin alterar los iones del analito
Cromatografia de aniones con supresión iónica
muestra
KNO3/CaSO4
eluyente Na2CO3
COLUMNA DE
SEPARACIÓN
Intercambiador
aniónico fuerte
COLUMNA DE
SUPRESIÓN
Intercambiador
catiónico fuerte
Se retienen los aniones de la
muestra
Reacción del eluyente con el supresor
2Na++CO32- +2H+
2Na+ +H2CO3
Especie poco
disociada
conductímetro
desecho
Sin supresión
contraiones
NO3cc
SO42-
Tiempo de elución
Con supresión química
cc
NO3-
SO42-
Tiempo de elución
Otro ejemplo de cromatografía de aniones con supresión iónica
inyector
NaBr, NaCl, NaF, NaOH(diluyente)
bomba
NaBr
NaOH
NaCl
NaF
Eluyente
NaOH
HBr
H2O
HCl
HF
cc
detector
Tiempo
residuos
Columna separadora
Columna supresora
Cromatografia de cationes con supresión iónica
muestra
KNO3/CaSO4
eluyente HCl
COLUMNA DE
SEPARACIÓN
Intercambiador
catiónico fuerte
COLUMNA DE
SUPRESIÓN
Intercambiador
aniónico fuerte
conductímetro
desecho
H+ + Cl- + OH–
cc
K+
Cl– + H2O
Ca2+
tiempo de elución
Inconveniente de las columnas supresoras: necesidad de
regenerarlas periódicamente a fin de convertir sus rellenos a la
forma ácida o básica original.
Actualmente se dispone de supresores de membrana que
operan continuamente.
El eluyente y la solución supresora fluyen en direcciones
opuestas en ambos lados de membranas permeables de
→
membranas
intercambio
iónico:
para
aniones
intercambiadoras
de
cationes
y
para
cationes
→
intercambiadoras de aniones.
Ejemplo: para eliminar los Na+ del eluyente, en la corriente
supresora fluye continuamente HCl para la regeneración. Los
Na+ migran a través de la membrana y se intercambian con los
H+ del reactivo regenerador. El dispositivo tiene una velocidad
de intercambio muy alta.
¿Con o sin supresión?
Cromatografía de exclusión molecular
FE: geles porosos
Hidrofílicos
Filtración en gel
Hidrofóbicos
Permeación en gel
Fundamento de separación: separación en base a forma y
tamaño del analito
Fase estacionaria: geles hidrofílicos (Sephadex), geles de
poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica o vidrio con
determinados tamaños de poro.
Exclusión molecular
Exclusión molecular
Exclusión molecular
PM
Exclusión total
106
Permeación
selectiva
104
VM
VS
Permeación total
102
K=
VR - VM
Volumen
VS
Rta
K=0
K = 0.2 K = 0.5 K = 1
Volumen
Cromatografía de afinidad
Utiliza la alta especificidad de las reacciones biológicas
del tipo antígeno-anticuerpo, hormona-receptor.
Un ligando se une al soporte de la FE. Cuando la
muestra atraviesa la columna solo se retiene la
sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando.
Concluida la separación, se provoca la salida de la
sustancia que dio la reacción específica.
Cromatografía de afinidad
muestra
analito
empaque
ligando unido
covalentemente
etapa de
interacción
etapa de lavado
etapa de elución
+
solución con
analito puro
columna
regenerada
Cromatografía de afinidad
Métodos de Elución
Elución bioespecífica: La FM contiene un ligando de bajo
peso molecular, capaz de desplazar a la macromolécula del
sitio activo de la FE.
Normal (interacción ligando-muestra)
Inversa (interacción ligando-ligando de afinidad)
Elución no específica: La fase móvil provoca la
desnaturalización de la muestra, del ligando de afinidad o de
los dos.
Cromatografía de afinidad
proteína de interés
ligando
mezcla de
proteínas
ligando unido a polímero
ligando
columna conteniendo
polímero unido a
ligando específico para
la proteína de interés
proteínas
no
deseadas
la proteína
de interés se
eluye con
solución de
ligando
Cromatografía de afinidad
proteína
proteína unida a
residuos de glucosa
(G) ligada a la fase
estacionaria
adición de glucosa (G)
proteína liberada
por unión a glusosa
(G) adicionada
Elección del sistema cromatográfico
Aumento de la polaridad
no polar polar no iónico iónico
PM
partición
102
fase
adsorción reversa
fase intercambio
iónico
normal
103
104
105
exclusión
permeación en
filtración en
gel
gel
106
Reacciones específicas: afinidad