IMMUNO

INMUNOCITOQUÍMICA
Material necesario. Placas multiwell 6 pocillos, cubre-objetos, porta-objetos, prolongo o
glicerol, PBS o PDF, BSA, paraformaldehído, metanol, anticuerpo 1º y 2º.
1. Recoger 3-5 millones de células en crecimiento exponencial.
2. Depositar las células en medio HL5 sobre un cubre que previamente hemos
depositado en el multiwell de 6 pocillos.
3. Dejar que se peguen durante 1hora.
4. Lavar dos veces con PDF o PBS 1X.
5. Añadir 1,5ml de paraformaldehído al 3%(nunca más del 4%, también puede ser
2%) en PDF o PBS y dejar fijar durante 30 minutos.
6. Lavar dos veces con PBS o PDF.
7. Añadir metanol a -20ºC durante 2 minutos para permeabilizar.
8. Lavar dos veces con PBS-BSA(0,1%).
9. Dejar bloqueando con PBS-BSA(0,1%) durante al menos 20 minutos, puedes
dejarlo horas sin ningún problema.
10. Recoger el cubre de la multiwell y ponerlo sobre un trocito de parafilm donde
hemos puesto previamente el anticuerpo a la dilución deseada(diluir siempre el
anticuerpo en PBS-BSA 0,1%). Dejar el tiempo dependiendo del anticuerpo.
11. Recoger el cubre y volver a introducirlo en el mutiwell(cuidado de ponerlo
siempre con las células hacia arriba, en el parafilm hemos puesto el anticuerpo
en contacto con las células hacia abajo, ahora lo cambiamos hacia arriba).
12. Lavamos 5 veces con PBS-BSA 0,1%, 5 minutos cada lavado.
13. De nuevo llevamos el cubre a un fragmento de parafilm donde hemos
depositado el anticuerpo secundario, tiempo y dilución de anticuerpo
dependiendo del tipo de anticuerpo.
14. Recoger de nuevo y poner el anticuerpo en la multiwell donde lavamos 3 veces
con PBS-BSA 0,1%.
15. Montamos el cubre sobre el porta depositando una gota de prolong(15ul) o de
glicerol(15ul), al dejar el cubre previamente tratar de secarlo poniendo un
extremo en contacto con papel por donde difundirá los restos de medio.
16. Aplicar laca de uñas por los extremos en el caso del glicerol, para el prolong no
es necesario.
17. Dejar O/N con prolong en oscuridad para que seque y unos minutos en glicerol
para que lo haga la laca de uñas.
18. Finalizado el proceso testar en el microscopio del lab para localizar las células
más fácilmente y de ese modo ser más rápido en el confocal.
La preparación del paraformaldehido puede resultar aburrida y costosa inicialmente sin
embargo con un pequeño ayudante como es el hidróxido sódico o sosa(NaOH) nos será
más facil. Si preparamos 10-15ml ponemos 5ul de NaOH 1M en la disolución con
paraformaldehído, esto aumenta el ph y hace que se disuelva el paraformaldehído más
fácilmente (ojo con no pasarse y mirar con un papel de ph que tras la disolución el ph
queda alrededor de 7-8) . También ayudaremos con agitación y 60-65ª de T, nunca debe
superarse está temperatura. Ojo con los vapores. Hacerlo en la cámara de gases y
taparlo con papel de aluminio.