El Radioinmunoanálisis
(RIA) y sus aplicaciones
clínicas
Lic. Olivia Brathwaite, T.M.
Centro de Investigación en
Reproducción Humana –
Laboratorio de Andrología y
Hormonas.
1.GENERALIDADES
RIA: Descubierto en 1956 por Berson y
Yalow.
Definición: Inhibición competitiva de S por
acción de T para unirse a R, donde:
La sustancia a ser medida: S
Molécula purificada de la misma especie que S
(Trazador): T
Molécula receptora o fijadora saturable:
Sigue la ley de acción de las masas.
R
Principios del RIA
Paso
a paso:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Muestra con concentración desconocida de Hormona(S)
Hormona marcada radioactivamente, cantidad conocida(T)
Incubación con concentración constante de antisuero(R)
Competencia o Saturación
Equilibrio
Separación de las fracciones libre y unida
Lectura de radioactividad vs. Curva estándar
SR
S
Curva patrón
T T
R R R
TR
S
T T
RRR
TR SR TR
S
T T
R R
SR TR TR
S
TTT
R
S
S ST TR
S S
T
R
+
S
+
2.DEFINICIONES
1.
2.
3.
Becquerel (Bq): Unidad de
radioactividad correspondiente a la rata
de decaimiento de 1 x seg. (1Bq= 1 seg-1
= 2.7 x 10-9 Ci)
Curie (Ci): Unidad de radioactividad , la
actividad de decaimiento de una muestra
a una rata de 2.7 x 1010 desintegraciones
por seg.
Vida media (t1/2): Tiempo requerido para
que un dado número de radionúclidos
en la muestra haya disminuído a la mitad
de su valor original.
2.DEFINICIONES (cont)
1.
2.
Isótopo: Núclido con el mismo número
atómico, pero diferente número de masa
atómica.
Núclido: Un núcleo con un particular
número atómico y número de masa
atómica.
3. Problemas para la
estandarización del RIA
Reacción
Cruzada
Tipo de antisuero usado
Composición del tracer
Composición y pureza del estándar
Composición de la muestra
Condiciones del ensayo.
3a. Reacción cruzada
Las moléculas tienen formas parecidas,
Ej: LH y la hCG , Testosterona y
dihydrotestosterona
Las hormonas generalmente no tienen
una única estructura química, ejemplo,
las hormonas peptídicas (hCG, FSH, LH,
TSH) pueden ser separadas en moléculas
con estructuras algo diferentes y
biológicamente activas.
3b. Tipo de antisuero usado
Es
un anticuerpo IgG, capaz de
reaccionar con gran afinidad y
especificidad con el antígeno a ser
medido.
Especificidad (Unión exclusiva)
Afinidad (Fuerza de atracción)
Título (Concentración óptima)
3c. Composición del Tracer
Glicoproteínas:
Gama emisores = 125I o
131I
Hormonas
esteroidales: Beta emisores
= 14C o 3H
Se marcan por oxidación
Deben conservarse la actividad
biológica e inmunológica
3d. Composición del
Estándar
Debe
tener la misma inmunoreactividad
que la molécula desconocida.
Es aislado y purificado .
Se debe tratar exactamente igual que el
desconocido.
3e. Composición de la
muestra
Debe
tener antigenicidad
Cuando son moléculas pequeñas,
actúan como haptenos, unidos a
moléculas más grandes
3f. Condiciones del ensayo
FUNDAMENTAL:
Método capaz de
separar rápida, completa y fácilmente el
antígeno libre
Separación neta
Sencillez
Reproducibilidad
Libre de interferencias
Poco tiempo
FORMAS DE SEPARACIÓN
Por
segundo anticuerpo
Muestra, Std o T
+
Primer anticuerpo
Fracción Libre
Segundo anticuerpo
ºC
Fracción Unida
FORMAS DE SEPARACIÓN
INMUNOADSORCIÓN
RIA DE FASE SÓLIDA
El anticuerpo está pegado al tubo
+
Muestra, Std o T
ºC
Decantas
Lectura
Formas de separación
ADSORCIÓN
+
La fracción libre se
adsorbe físicamente,
pero no
Inmunológicamente a
un sólido inerte.
Carbón-dextran, talco,
sílice, Resinas, etc...
Formas de separación
Inmunoadsorción
y doble anticuerpo
MUESTRA, STD o T
+
Ac. Policlonal
Incubación
Decantado
Lavado
Ac Monoclonal pegado
al tubo
Sandwich
EQUIPO NECESARIO
3H
Beta = 14C
Contador Gamma = 125I 131I
Vidrería
Puntas
Micropipetas y Pipetas
Agua
Tubos
LIBRES DE CONTAMINACIÓN!!!!
Contador
CONTROL DE CALIDAD EN
RIA
EXACTITUD
PRECISION
CV
BIAS
DRIFT
DUPLICADOS
CONTROL DE CALIDAD
ERRORES
Mal
INTRA-ENSAYO
pipeteo (Calibración, uso adecuado,
mantenimiento,casarla con el usuario,
usar la misma)
Baja separación
Error de conteo (Decaimiento del
isótopo, NSB)
Manejo de la muestra(Dilución,
extracción, baja concentración del
analito)
CONTROL DE CALIDAD RIA
ERRORES
Mal
INTER-ENSAYO
estándar
Muestras de control inapropiadas
Deterioro del Tracer
Daño del Sistema de Incubación
Daño en el contador
Cálculos
PRECAUCIONES
Conteo
bajo
Se manejan igual que un ácido
cáustico o un carcinógeno
Evitar contacto con la piel, ingestión
No contaminar el equipo o vidrería
GRACIAS
0
