Radioinmunoanálisis y sus aplicaciones

El Radioinmunoanálisis
(RIA) y sus aplicaciones
clínicas
Lic. Olivia Brathwaite, T.M.
Centro de Investigación en
Reproducción Humana –
Laboratorio de Andrología y
Hormonas.
1.GENERALIDADES

RIA: Descubierto en 1956 por Berson y
Yalow.
 Definición: Inhibición competitiva de S por
acción de T para unirse a R, donde:




La sustancia a ser medida: S
Molécula purificada de la misma especie que S
(Trazador): T
Molécula receptora o fijadora saturable:
Sigue la ley de acción de las masas.
R
Principios del RIA
 Paso
a paso:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Muestra con concentración desconocida de Hormona(S)
Hormona marcada radioactivamente, cantidad conocida(T)
Incubación con concentración constante de antisuero(R)
Competencia o Saturación
Equilibrio
Separación de las fracciones libre y unida
Lectura de radioactividad vs. Curva estándar
SR
S
Curva patrón
T T
R R R
TR
S
T T
RRR
TR SR TR
S
T T
R R
SR TR TR
S
TTT
R
S
S ST TR
S S
T
R
+
S
+
2.DEFINICIONES
1.
2.
3.
Becquerel (Bq): Unidad de
radioactividad correspondiente a la rata
de decaimiento de 1 x seg. (1Bq= 1 seg-1
= 2.7 x 10-9 Ci)
Curie (Ci): Unidad de radioactividad , la
actividad de decaimiento de una muestra
a una rata de 2.7 x 1010 desintegraciones
por seg.
Vida media (t1/2): Tiempo requerido para
que un dado número de radionúclidos
en la muestra haya disminuído a la mitad
de su valor original.
2.DEFINICIONES (cont)
1.
2.
Isótopo: Núclido con el mismo número
atómico, pero diferente número de masa
atómica.
Núclido: Un núcleo con un particular
número atómico y número de masa
atómica.
3. Problemas para la
estandarización del RIA
 Reacción
Cruzada
 Tipo de antisuero usado
 Composición del tracer
 Composición y pureza del estándar
 Composición de la muestra
 Condiciones del ensayo.
3a. Reacción cruzada

Las moléculas tienen formas parecidas,
Ej: LH y la hCG , Testosterona y
dihydrotestosterona
 Las hormonas generalmente no tienen
una única estructura química, ejemplo,
las hormonas peptídicas (hCG, FSH, LH,
TSH) pueden ser separadas en moléculas
con estructuras algo diferentes y
biológicamente activas.
3b. Tipo de antisuero usado
 Es
un anticuerpo IgG, capaz de
reaccionar con gran afinidad y
especificidad con el antígeno a ser
medido.
 Especificidad (Unión exclusiva)
 Afinidad (Fuerza de atracción)
 Título (Concentración óptima)
3c. Composición del Tracer
 Glicoproteínas:
Gama emisores = 125I o
131I
 Hormonas
esteroidales: Beta emisores
= 14C o 3H
 Se marcan por oxidación
 Deben conservarse la actividad
biológica e inmunológica
3d. Composición del
Estándar
 Debe
tener la misma inmunoreactividad
que la molécula desconocida.
 Es aislado y purificado .
 Se debe tratar exactamente igual que el
desconocido.
3e. Composición de la
muestra
 Debe
tener antigenicidad
 Cuando son moléculas pequeñas,
actúan como haptenos, unidos a
moléculas más grandes
3f. Condiciones del ensayo
 FUNDAMENTAL:
Método capaz de
separar rápida, completa y fácilmente el
antígeno libre
 Separación neta
 Sencillez
 Reproducibilidad
 Libre de interferencias
 Poco tiempo
FORMAS DE SEPARACIÓN
 Por
segundo anticuerpo
Muestra, Std o T
+
Primer anticuerpo
Fracción Libre
Segundo anticuerpo
ºC
Fracción Unida
FORMAS DE SEPARACIÓN
 INMUNOADSORCIÓN
RIA DE FASE SÓLIDA
El anticuerpo está pegado al tubo
+
Muestra, Std o T
ºC
Decantas
Lectura
Formas de separación
 ADSORCIÓN
+
La fracción libre se
adsorbe físicamente,
pero no
Inmunológicamente a
un sólido inerte.
Carbón-dextran, talco,
sílice, Resinas, etc...
Formas de separación
 Inmunoadsorción
y doble anticuerpo
MUESTRA, STD o T
+
Ac. Policlonal
Incubación
Decantado
Lavado
Ac Monoclonal pegado
al tubo
Sandwich
EQUIPO NECESARIO
3H
Beta = 14C
 Contador Gamma = 125I 131I
 Vidrería
 Puntas
 Micropipetas y Pipetas
 Agua
 Tubos
 LIBRES DE CONTAMINACIÓN!!!!
 Contador
CONTROL DE CALIDAD EN
RIA
EXACTITUD
PRECISION
CV
BIAS
DRIFT
DUPLICADOS
CONTROL DE CALIDAD
 ERRORES
 Mal
INTRA-ENSAYO
pipeteo (Calibración, uso adecuado,
mantenimiento,casarla con el usuario,
usar la misma)
 Baja separación
 Error de conteo (Decaimiento del
isótopo, NSB)
 Manejo de la muestra(Dilución,
extracción, baja concentración del
analito)
CONTROL DE CALIDAD RIA
 ERRORES
 Mal
INTER-ENSAYO
estándar
 Muestras de control inapropiadas
 Deterioro del Tracer
 Daño del Sistema de Incubación
 Daño en el contador
 Cálculos
PRECAUCIONES
 Conteo
bajo
 Se manejan igual que un ácido
cáustico o un carcinógeno
 Evitar contacto con la piel, ingestión
 No contaminar el equipo o vidrería
GRACIAS