Cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel)

Cromatografía de exclusión molecular
(filtración en gel)
K av
K av =
Ve - Vo
Vt -Vo
log MW
Purificación de la HDC de rata recombinante
Actividad
(µg CO2 / h )
Prot. total
(mg)
Actividad
específica
(pmol CO2 /h·µg pr)
Extracto crudo
4,6
1488
3,11
1
100
Precip. + Phenyl-seph.
1,7
243,2
7,16
2,3
36,7
DEAE-sephadex
0,87
3,45
254
81
18,9
Hidrixiapa. + filtr.
0,31
0,55
577,8
185
6,7
Etapa
1 2 3
HDC
Figura 2P. Etapas de purificación de
HDC recombinante.
1: Phenyl-Sepharose; 2: Macro-prep
DEAE; 3: Hidroxiapatito.
Purificación
(veces)
Rendimiento
(%)
Secuenciación de la ribonucleasa A
Digestión con tripsina
(14 fragmentos)
1. K
2. SR
3. DR
4. FER
5. NLTK
6. NVACK
7. ATGSSK
8. TTQANK
9. ETAAAK
10. YPNCAYK
11. NGQTNCYQSYSTMSITDCR
12. HIIVACEGNPYVPVHFDASV
13. QHMDSSTSAASSSNYCNEMMK
14. CKPVNTFVHESLADVQAVCSQK
Digestión con CNBr
(5 fragmentos)
1. M
2. KETAAAKFERQHM
3. DSSTSASSSNYCNEM
4. SITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIV
ACEGNPYVPVHFADASV
5. KSRNLTKDRCKPVNTFVLIESLADVQAVC
SQKNVACKNGQTNCYQSYSTM
6, 11, 13
y
10, 12, 14
Tripina
CNBr
........10........20........30........40
..........QHMDSSTSAASSSNYCNEMMK.........
KETAAAKFERQHM.................KSRNLTKDRC
KETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYCNEMMKSRNLTKDRC
Tripina
CNBr
........50........60........70........80
...........................NGQTNCYQSYSTM
KPVNTFVLIESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTM
KPVNTFVLIESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTM
Tripina
CNBr
........90.......100.......110.......120
SITDCR...................HIIVACEGNPYVPVH
SITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVH
SITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVH
Tripina
CNBr
..125
FDASV
FDASV
FDASV
Dependencia de la solubilidad del pH
Influencia de los pequeños iones sobre las interacciones entre
los macroiones
Especificidades de varias endopeptidasas
punto de corte
O
O
NH
CH
Rn-1
C
NH
CH
C
Rn
Enzima
Tripsina
fuente
Pancreas bovino
especificidad
Rn-1 = R o K; Rn ≠ P
quimiotripsina
Pancreas bovino
Rn-1 = F, W o Y; Rn ≠ P
Elastasa
Pancreas bovino
Rn-1 = A, G, S o V; Rn ≠ P
Termolisina
B. thermoproteolyticus
Rn = I, M, F, W, Y, V;
Rn-1 ≠ P
ocasionalmente rompe cuando Rn
= A, D, H, T; es termoestable
Pepsina
mucosa gastrica bovina
Rn = L, F, W o Y; Rn-1 ≠ P
es bastante inespecífica,
pH óptimo = 2
S. aureus
Rn-1 = E
Endopeptidasa V8
Comentario
Altamente específico
rompe más lentamente para
R n-1 = N, H, M o L
Degradación de Edman
O
O
..
H2N CH
+
N C S
C
NH
CH
-OH-
..
NH CH
S
CH
C
R3
O
C
NH
CH
C
O
NH
R2
R1
Feniltiocarbanil-polipéptido
(PTC-polipéptido)
NH
Polipéptido
O
N C
C
R2
R1
Fenilisotiocianato
(PITC)
O
CH
C
R3
F3CCOOH
anhidro
O
R1
O
N
S
+
H3N
+
CH
R2
N
H
C
O
NH
CH
C
R3
Polipéptido sin el extremo N-terminal
Derivado Tiazolina
H+
O
R1
N
S
N
H
Feniltiohidantona-aminoácido
(PTH-aminoácido)
Dominio
de unión
al antígeno
Cadenas pesadas
Cadenas ligeras
Dominio Fab
Bisagra
Carbohidrato
Dominio Fc
Zona de corte
con papaina
Antígeno
-S
-S
-S
Bisagra
Dominio Fc
Dominio de unión
al antígeno
-S-S-S-S-
-S
-
Dominio
Fab
Zona de corte
con pepsina
Inmunodifusión en gel
(Ouchternoly)
A
A
B
B
α-A
Los antígenos A y B son
inmunológicamente identicos
Los antígenos A y B están
estrechamente relacionados
A
A
B
α-A
B
α-A
Ambos antígenos son reactivos
pero con una relación lejana
α-A
A es reactivo, pero B no lo es
Inmunoelectroforesis
A
+
B
En primer lugar las muestras A y B se somoten a una electroforesis
antisuero
El antisuero se coloca en el gel entre las dos muestras y se deja
difundir. Se formaran arcos de precipitación con las bandas de cada
mezcla que reaccionen con el antisuero
Transferencia “Western”
Separación de proteínas
en SDS-PAGE
NGF
PC12
+
Transferencia a
membrana
N17
- +
Incubación con anticuerpos
y revelado de la proteína
marcadora
PC12 N17
ERK1
ERK2
blot: α-PY
p75NTR
blot: α-p75
Inmunoprecipitación
Incubación con
el anticuerpo
Incubación con
Proteína A
Precipitación del complejo
antígeno-anticuerpo-proteína A
Análisis de los
complejos en SDSPAGE
NGF
PC12
+
N17
- +
IP: 203
blot: α-PY
PC12 N17
p140Trk
p140Trk
p110Trk
p110Trk
blot: RTA
Obtención de anticuerpos monoclonales
ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Ensayos de captura de anticuerpos
Unión del antígeno
a la fase sólida
Unión del anticuerpo
marcado al antígeno
Cuantificación del
anticuerpo
Ensayos con dos anticuerpos
Unión del anticuerpo
a la fase sólida
Unión del antígeno
al anticuerpo
Unión del anticuerpo
secundario marcado
Cuantificación del
anticuerpo
secundario
Ensayos de captura de antígeno
Unión del anticuerpo
a la fase sólida
Unión del antígeno
marcado al anticuerpo
Cuantificación del
antígeno
Radioinmunoanálisis
Control
Muestra desconacida
Cantidad fija de antigeno A
radiactivo
Se añade una cantidad
desconocida de antigeno A
sin marcar
Se añade una cantidad fija
de anticuerpos anti-A
Se añade un agente
precipitante (anticuerpo
anti-inmunoglobulina)
cpm control
Se determina la
radiactividad en los
precipitados
cpm desconocido
cpm control
cpm desconocido
X 100% = % Ag* unido