REACCIONES Antígeno- Anticuerpo - U
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REACCIONES Antígeno- Anticuerpo Alfredo De Ioannes Inmunología Básica Facultad de Ingeniería Universidad de C hile Septiembre 2007 Características de la Interacción Antígeno - Anticuerpo 9 Específica 9 Reversible 9 Dependiente de pH 9 Sensible a la Temperatura 9 Sensible a la fuerza iónica Fuerzas implicadas en la Interacción Antígeno - Anticuerpo 9 9 9 9 Puentes de hidrógeno Fuerzas electrostáticas (enlaces iónicos) Fuerzas de van der Waals Enlaces hidrófobicos AFINIDAD Y AVIDEZ Afinidad y Avidez de un anticuerpo por un epitopo Afinidad Suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas entre un sitio de unión del anticuerpo (paratopo) y el correspondiente epitopo. Se define por una constante de equilibrio (Ka), según la ley de acción de masas. Avidez Fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une a un Antígeno multivalente. Su valor es mucho mayor que la suma de las afinidades. Cinética de la Reacción (ecuación válida solo para moléculas monovalentes) k Hapteno + Ac ( Hapteno-Ac) k’ Ka = k = (Hapteno-Ac) (Hapteno)(Ac) k’ [Ac] la concentración de sitios libres de Ac [Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de interés Ventajas 9 9 9 9 9 9 9 Especificidad Sensibilidad Estabilidad Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot, etc. Tiempo de ejecución razonable: inutos a ~ hrs Costo conveniente Infraestructura mínima Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de interés Inmunización con Carrier-hapteno Antisuero Ej. Haptenos (drogas, toxinas, hormonas, etc). Análisis de los Ac. unidos a: Hapteno libre Hapteno en otra Proteína Hapteno al mismo carrier Técnicas Inmunoanalíticas - Reacción de precipitación En medio líquido • Floculación • Nefelometría • Precipitación de complejos Inmunes En gel • • • • • • Inmunodifusión doble Inmunodifusión radial Inmunoelectroforesis Rocket electroforesis Contrainmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel - Reacción de aglutinación • Aglutinación pasiva • Aglutinación directa - Fijación y actividad hemolítica del complemento - Reacciones en fase sólida o o ELISA Western blot Reacciones de Precipitación y Floculación en solución Reacciones de sueros humanos de pacientes con Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune. o es Precipitado de proteínas (mg) c c Ex A Tiroglobulina agregada (mg) Equivalencia Ex ce Ag so Inmunodifusión Doble (o de Ouchterloni) Suero humano HIg HSA Suero humano Ej: Mezcla de antígenos y suero polivalente AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero humano HSA: Albúmina humana purificada HIg: Inmunoglobulina humana purificada Ensayo Immunoturbidimétrico 9 9 9 Suero + Ag complejos insolubles Aumenta turbidez de la solución y puede ser medida ópticamente Turbidez proporcional a la cantidad de proteínas en la muestra Sensibilidad de método se puede incrementar con los anticuerpos Unidos a látex: mayores agregados Inmunodifusión Radial Ag Anticuerpo incorporado al gel El tamaño de los halos es proporcional a la concentración del antígeno Reacciones de Aglutinación Se considera aglutinación cuando el antígeno es particulado y tiene como tamaño mínimo el bacteriano ¾Aglutinación Directa: Las partículas o células tienen un antígeno intrínseco. ¾Aglutinación Pasiva: partículas o células a las cuales se le agrega el antígeno Reacciones en fase sólida ¾ ELISA ¾ Western bots ¾ Inmunofluorescencia ¾Cromatografía de Afinidad ELISA (Enzime linked immunosorbent assay ) Detección de anticuerpos Detección de Antígeno Determinación de antígenos por ELISA Sándwich Densidad óptica Densidad óptica Competencia [ Ag ] Caso de Haptenos [ Ag ] Caso de Proteínas Western blot Precipitado producto enzimático Quimioluminiscencia Sustrato Anti-anticuerpo-Enzima Anticuerpo específico Inmunofluorescencia indirecta Anticuerpo anti-Acrosina Se puede hacer con células vivas o fijadas, con o sin permeabilizar. Anticuerpo anti-Ag de embrión de ratón Cromatografía de Afinidad 9Ej: Purificación de un anticuerpo uniendo el antígeno a una resina (sp). Sin embrago, también se puede hacer lo contrario. Anticuerpo Anticuerpo no unido Buffer de elusión Elución de Anticuerpo
