Las técnicas de unión para medir hormonas.

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Rev Biomed 1995; 6:33-46.
Las técnicas de unión para medir
hormonas.
Rubén C. Montes-Pérez.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Yucatán.Mérida, Yucatán,
México.
RESUMEN.
En la actualidad, mediante las técnicas de
unión se realizan cotidianamente la detección de
hormonas así como también de otro tipo de
biomoléculas que se encuentran en cantidades muy
pequeñas en fluídos biológicos. Son varias las
técnicas de unión, algunas de éstas son: los
inmunoanálisis, el ensayo de enlace competitivo
con proteína transportadora y el ensayo de unión
con receptor. La técnica que frecuentemente se ha
utilizado es el radioinmunoanálisis. A partir de 1960,
año en que Yalow y Berson dieron a conocer
esta técnica, otros grupos de investigación la han
desarrollado aún más. Sin embargo los principios
teóricos sobre los que se fundamenta han
permitido el avance de técnicas derivadas de la
misma como el enzimoinmunoanálisis,
fluoroinmunoanálisis y viroinmunoanálisis. En el
presente documento se revisan las características
de los ensayos de unión, en especial de los
inmunoanálisis, los tipos que existen y algunas
aplicaciones que tienen.
Palabras clave: ensayos de unión, hormonas,
inmunoanálisis, radioinmunoanálisis, RIA.
SUMMARY.
THE BINDING ASSAYS FOR MEASURING
HORMONES. Today the binding assays are used
to measure hormones and other biomolecules which
exist in low quantities in biological fluids. There
are several binding assays including: immunoassays,
competitive protein binding assay and receptor
binding assay. The technique most commonly used
is the radioimmunoassay (RIA). In 1960 Yalow
and Berson first reported the immunoassay
technique, and since then other investigators have
further developed RIA. However, the theoretical
principles of binding assays have been the basis to
produce new RIA-derived techniques; for example
enzymoimmunoassay (EIA), fluoroimmunoassay
(FIA) and viroimmunoassay (VIA). This report
reviews the characteristics, types and applications
of binding assays, especially immunoassays in animal
Solicitud de sobretiros: Rubén C. Montes-Pérez. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Apartado
Postal 4-116. Itzimná. C.P. 97100, Mérida, Yucatán, México.
Recibido el 14/Abril/94. Aceptado para publicación el 17/Nov./94.
Vol. 6/No. 1/Enero-Marzo, 1995.
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RC Montes-Pérez .
reproduction.
Key words: binding assays, hormones,
enzymoimmunoassay, RIA, radioimmunoassay.
INTRODUCCION.
Los análisis básicos para detectar
compuestos químicos en materiales biológicos
son tres: biológicos, fisicoquímicos y de unión. Los
análisis o técnicas de unión se han definido como
aquellos que utilizan moléculas que se enlazan
específica y reversiblemente a las sustancias que
interesen detectar o cuantificar (1). Estas técnicas
se utilizan frecuentemente para cuantificar moléculas
que están presentes en fluidos biológicos, en
concentración de nanogramos por mililitro (10-9 g/
mL) o de picogramos por mililitro (10-12 g/mL). Se
consideran como ensayos estructuralmente
específicos, es decir miden la cantidad de masa de
la sustancia de interés, independientemente de su
efecto fisiológico. Por esta situación este tipo de
análisis
permite cuantificar moléculas
biológicamente activas en cantidades sumamente
pequeñas, procedimiento que todavía a mediados
de siglo era complicado (2). En la actualidad existen
junto con esta tecnología otras más como la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
(3) o la cromatografía de gas-líquido (4), que son
capaces de medir cantidades de masa a estas
concentraciones o aún menores, pero que todavía
no han logrado ser ampliamente disponibles para
uso cotidiano como es el radioinmunoanálisis (RIA)
(5).
LOS ENSAYOS DE UNION.
El RIA, como un ejemplo de los ensayos de
unión, también se le ha denominado ensayo de
saturación, análisis de desplazamiento, análisis de
enlace insaturado, análisis de fracción no enlazada,
radioensayo de dilución, análisis competitivo,
radioensayo de enlace competitivo y ensayo
Revista Biomédica
inmunoradiométrico. La naturaleza de esta
metodología ha permitido que se le asignen tales
nombres (2). Todos los ensayos de unión, se
caracterizan por estar constituidos por tres
componentes básicos, la molécula enlazadora
(ligador o unidor), la molécula que se desea
enlazar (analito o ligando) y otro ligando
marcado (trazador). En la actualidad algunas
técnicas de unión marcan al ligador en vez del
ligando; en cualquier caso siempre está presente
el trazador ya sea como ligando o ligador.
La molécula ligadora debe ser capaz de unirse
únicamente con aquella que interesa medir. Es decir
debe ser específica. Además la unión tiene que ser
suficientemente estable, propiedad que se le
denomina afinidad (6). Esto permite al unidor
enlazarse con un tipo de molécula a pesar de
existir varias moléculas estereoquímicamente
semejantes.
Cuando se utilizan anticuerpos como
ligadores, el análisis recibe el nombre de
“inmunoanálisis”; si es un receptor se llama “ensayo
receptor” o si es una proteína transportadora, se
denomina “ensayo de proteína de enlace
competitivo” (CPBA) (7). Se han diseñado análisis
de unión que emplean en cada caso uno de estos
unidores, sin embargo, el principal obstáculo para
hacer práctico estos ensayos es la carencia de altas
cantidades del unidor que presenten elevada
afinidad y especificidad (1). Por esta razón se
utilizan principalmente anticuerpos policlonales o
monoclonales. Los primeros se producen en altas
cantidades a través de la inmunización activa de
conejos, cuyos, borregos, caballos o gallinas (8,9).
Los anticuerpos monoclonales se obtienen por la
fusión de plasmacitoma con linfocitos B de algún
animal inmunizado previamente. Los hibridomas
resultantes forman clonas que producen un tipo de
inmunoglobulinas dirigidas hacia un específico
determinante antigénico (10). Una ventaja
adicional que tiene la utilización de estos
anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por
35
Técnicas de unión.
la afinidad y especificidad hacia cada uno de los
determinantes antigénicos y no contra todos
aquellos que constituyen el inmunógeno (1).
Cuando la sustancia que interesa medir es
una hormona, droga o metabolito presente en el
fluido biológico, recibe el nombre de ligando y es la
molécula que no está marcada. A ésta se le llama
ligando “frío”. El trazador es el mismo ligando,
pero marcado, ya sea con radioisótopo, enzima,
virus o compuesto fluorescente (1). La marca
sirve para detectar el complejo de unión formado
entre el ligando de la muestra biológica con el
ligador. Originalmente se usó como marca al yodo
radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3). Sin embargo
la baja eficiencia del conteo de la radiación emitida
y el efecto de la extinción del centelleo ha
originado que se sustituyan por yodo-125, que
no presenta las desventajas anteriores (11). Las
técnicas de unión que utilizan como componentes
a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA.
Por otro lado, si la marca es una enzima que
mediante la reacción con el sustrato específico
produce color, el cual se detecta por absorción
de luz, entonces se llama enzimoinmunoanálisis
(EIA). Los viroanálisis utilizan a virus como marca
y los fluoroinmunoanálisis (FIA) compuestos
Figura 1.- Desplazamiento de la unión del anticuerpo con el
trazador por diferentes cantidades de analito.
fluorescentes (12-14).
CINETICA DEL INMUNOANALISIS.
Se tomará como modelo de la cinética de los
ensayos de unión al RIA que utiliza anticuerpos
que se comportan como si presentaran un sitio de
unión (6,15-17). El análisis consiste en colocar
conjuntamente el anticuerpo (Ac), el antígeno
(Ag) y trazador (Ag*) en tubos de ensayo bajo
condiciones fisicoquímicas controladas, como son:
temperatura, volumen, acidez y concentración, para
que el Ac se una con el Ag y con el Ag*. Se forma
así el complejo de unión Ag:Ac, como se muestra a
continuación:
Ag + 2 Ac + Ag* <
> Ag:Ac + Ag*:Ac
Formado el complejo, se procede a mantener
constantes la cantidad de Ac y Ag*, pero variará
la cantidad de Ag de la manera que se describe en
la figura 1.
En el caso (a) la cantidad de Ag (ligando
frío) es cero, porque no está presente. Entonces
todo el complejo contendrá únicamente al
trazador. La emisión de radiación del complejo
será alta. En (b) la presencia de 3 moléculas de
Ag frente a 6 de Ag* produce competencia
entre Ag y Ag* para unirse con el Ac y por
consecuencia el desplazamiento de dos moléculas
de Ag* por Ag al formarse los complejos.
Entonces la cantidad de radiación emitida por
el complejo disminuye.
En (c) y (d) el desplazamiento del Ag* por
Ag es mayor ya que el Ag está en mayor proporción
y en cada caso disminuirá gradualmente la radiación
que emitan los complejos formados.
La figura 2 representa el proceso arriba
descrito.
La formación de los complejos se realiza de
acuerdo a la Ley de Acción de Masas (18) que
describe cuantitativamente las velocidades de
asociación y disociación de los complejos hasta
alcanzar el equilibrio. Partiendo de que los ligadores contienen sólo un sitio de unión, entonces
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las velocidades de asociación (V1) y disociación
(V2) son:
V1
Ac + Ag <
> Ac : Ag
V2
[1] V1 = K1 [Ac][Ag]
V2 = K2 [Ac:Ag]
Donde [ ] es la concentración molar del
producto o del reactivo. K1 y K2 son las constantes
de proporcionalidad de la reacción de formación
y disociación del complejo, Keq es la constante de
equilibrio o constante de afinidad del anticuerpo.
Cuando se alcanza el equilibrio en la reacción para
la formación del complejo, entonces ambas
velocidades son iguales, por lo tanto, se obtiene la
siguiente igualdad:
V1 = V2
[2] K1 [ Ac ][ Ag] = K2 [ Ag:Ac ]
Reordenando la igualdad para colocar
constantes y variables de cada lado, se obtendrá la
siguiente ecuación:
[ Ac:Ag ]
[3]
Keq =
[ Ac ][ Ag ]
En este momento se puede medir la fuerza
que mantiene la unión entre el ligador y el
ligando. Para conseguirlo es preciso transformar
los resultados mediante un tratamiento
matemático, que consiste en estimar el cociente
unido/libre, que representa el término [Ag:Ag]/
[Ac] [Ag] ó (B/F), y la expresión molar del Ag
unido. Para obtener los resultados se deben
separar las moléculas radioactivas que no están
unidas al anticuerpo. Esta se llama “fracción
libre” (F), ya que la fracción unida (B) es la
considerada en el complejo. Una de tantas
formas de eliminar la fracción libre es añadiendo
carbón activado finamente granulado al tubo de
ensayo donde se realizó la reacción. Las
partículas de carbón fijan sobre su propia
superficie moléculas pequeñas. Si el Ag* y el
Ag son también pequeñas, se adherirán
empleando la centrifugación (19) se podrán
separar ambas fracciones y se medirá la radiación
Revista Biomédica
Figura 2. Curva de desplazamiento de la unión del trazador con
el anticuerpo por cantidades crecientes de analito.
procedente de los complejos (B) o la proveniente
de los sobrenadantes (F).
La emisión radiactiva se mide en un contador
de radiación adecuado, entonces se podrá obtener
la razón B/F. Al representar B/F contra la
concentración se observará una gráfica como la
que se muestra en la figura 3.
La gráfica corresponde a una recta cuya
interpretación tiene que ser con base a la reacción
Figura 3. Gráfica de Scatchard lineal.
37
Técnicas de unión.
de Ag con Ac, la Ley de Acción de Masas y los
modelos lineales. Para conseguirlo debemos partir
de la reacción en equilibrio es decir de la ecuación
[3], donde el numerador representa la fracción unida
y el denominador la libre. Sin embargo el Ac se
haya en cantidad constante durante todo el proceso,
cantidad llamada Ac total (Act), repartido entre la
fracción libre y unida. Por lo tanto podemos definir
al Act como:
Act = Ac libre + Ac unido.
entonces: Ac libre = Ac total - Ac unido.
[Ac] = [Act-Ac:Ag]
sustituyendo en [3] se tiene entonces que:
[Ag:Ac]
Keq =
[Ag] [Act-Ag:Ac]
Después de despejar los términos, la ecuación
obtenida es:
[Ac:Ag]
[4] Keq [Act] - Keq [Ag:Ac] =
[Ag]
De esta manera se obtiene la ecuación
lineal, cuya constante de afinidad es el valor de la
pendiente y el intercepto al origen es el producto
de la constante con el total de los sitios de unión
del anticuerpo o sea la cantidad de anticuerpo en
nM.
La gráfica lineal se denomina gráfica de
Scatchard (20), la cual está interpretada mediante
la ecuación [4]. Es de gran utilidad para determinar
la cinética de la reacción inmunológica, así como la
afinidad del anticuerpo. Sin embargo tiene otra
utilidad, que consiste en estimar las cantidades de
ligando, cuando se conservan uniformes las
cantidades de trazador, unidor y afinidad, siempre
y cuando el anticuerpo tuviera un comportamiento
lineal en el sistema (1). Como esto último
frecuentemente no sucede, a causa de que se
utilizan anticuerpos policlonales en la que cada
clona tiene diferente valor de Afinidad, entonces
los diseños de los inmunoanálisis se realizan
mediante pruebas de diluciones del anticuerpo en
combinación con diferentes cantidades de masa
radiactiva y a veces con diferentes tiempos de
incubación. Con esto se buscan procesos adecuados
para la separación de la fracción unida de la libre,
hasta obtener el diseño que exhiba notorio
desplazamiento del trazador por el ligando frío,
para que se elabore posteriormente la curva
estándar y poder cuantificar el ligando en muestras
problema (21, 22).
ESTIMACION DE LA CONCENTRACION DE
LIGANDO EN LAS MUESTRAS.
Los datos obtenidos del procesamiento de las
muestras biológicas por medio de RIA son
posteriormente manejadas o transformadas para
estimar las cantidades de ligando a través de la
elaboración de curvas de calibración. Existen varios
procesos de reducción de datos para elaborar las
curvas de calibración, entre ellas se pueden nombrar
(23, 24):
1. Relación de la radiación en cuentas por minuto o
segundo (cpm o cps) emitida por la fracción unida
o libre con la concentración de ligando no marcado
(dosis) o del logaritmo de la concentración del
ligando (cpm B o F vs dosis o log dosis).
2. Porcentaje de la proporción de las cpm de la
fracción unida/cpm de la radiación total en relación
con la dosis o el logaritmo de la dosis (% B/T vs
dosis o log dosis).
3. Porcentaje de la proporción de las cpm de la
radiación de la fracción unida/fracción libre en
relación con la dosis o logaritmo de la dosis (% B/F
vs dosis o log dosis).
4. Porcentaje de la proporción de las cpm de la
fracción libre /fracción unida en relación con la
dosis o logaritmo de la dosis (% F/B vs dosis o log
dosis).
5. Porcentaje de la proporción cpm de la fracción
unida/radiación en la fracción unida al anticuerpo
en ausencia de ligando no marcado (B0) con relación
a la dosis o logaritmo de dosis (% B/B0 vs dosis o
log dosis).
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6. Transformación Logit-Log, que es la relación
entre logaritmo de % B/B0 y logaritmo de la dosis
(Logit % B/B0 vs Log dosis).
De las anteriores una de las que más
frecuentemente se utiliza es la última. Con esta
transformación, se obtiene una gráfica lineal cuyo
manejo para la estimación de dosis es
relativamente simple, puesto que se puede hacer
a partir de la misma gráfica o de la ecuación
ajustada por mínimos cuadrados. Sin embargo
Chase (25) argumenta varias inconvenientes cuando
se usa este tipo de reducción de datos, el principal
consiste en que existe curvatura en la gráfica después
de haber sido transformados los datos. Esto conlleva
un error por ajuste al cual se le debe añadir el error
experimental. En consecuencia eleva la variación
en la estimación de las cantidades de ligando. Esto
se puede descubrir a través de cambios en los valores
estimados de ligando con respecto a los reales,
tanto en niveles alto y bajo de la curva. Este
comportamiento imposibilita predecir en cual región
de la gráfica Logit-log se pueden esperar mayores
cambios para la estimación de dosis. Por tal motivo
Maciel (26) propone que la ponderación de la
regresión es el procedimiento necesario para
disminuir el error por ajuste. Por esta razón se
argumenta que la recta en gráfica logit-log no es
verdaderamente lineal y se han propuesto usar otras
transformaciones de variables como el modelo
logístico de cuatro parámetros (26), el cual evita
tres principales limitaciones de la transformación
logit-log. Primero, las cantidades más bajas y altas
de la curva están constituidas como parámetros y
no son valores que se extienden al infinito como
sucede en la transformación logit-log. Segundo, se
pueden ajustar con más exactitud los datos sin
necesidad de emplear transformaciones
complicadas en las cuales están involucrados los
valores de los extremos de la curva. Finalmente,
al no haber métodos complicados para la reducción
de datos no hay error por ajuste de variables. Este
método era anteriormente muy complicado para
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usarse rutinariamente, actualmente existen
programas en computadora que lo pueden realizar
con mayor rapidez (26).
TIPOS DE INMUNOANALISIS.
Se pueden agrupar en dos clases, de acuerdo
al proceso de unión. Cuando el ligador enlaza al
ligando o a otro ligador sin ocurrir
desplazamiento de la unión del trazador con el Ac,
entonces se denominan “inmunoanálisis no
competitivos”. Por ejemplo, los ensayos de
inmunoadsorción con enzima ligada (ELISA )
para detectar anticuerpo contra Toxoplasma gondii
(27), y contra rotavirus humanos (28). Si al unir el
ligando ocurre desplazamiento del trazador,
entonces son “inmunoanálisis competitivos”, tal
como ocurre con el RIA, EIA o FIA para cuantificar
hormonas (13, 29, 30).
Existen actualmente varias modalidades del
RIA, las cuales difieren en la manera de separar la
fracción libre (F) de la unida (B); se pueden
agrupar de acuerdo a la cinética del anticuerpo.
Cuando éste está inmovilizado se dice que el
inmunoanálisis es en fase sólida. Lo contrario indica
que se haya soluble (fase líquida). Los
anticuerpos inmovilizados se fijan covalentemente
o por adsorción a la superficie de una partícula
sólida o al fondo del tubo o al pozo si fuera EIA.
En estos casos, la fracción libre se desecha
mediante una simple decantación del volumen
en que se realizó la incubación, quedando
depositado dentro del tubo únicamente la fracción
unida. Cuando el proceso utiliza anticuerpos
solubles, entonces ambas fracciones deben separarse
por precipitación del complejo o de los ligandos
libres. Cuando ocurre la separación de los complejos,
se utilizan agentes precipitantes de proteínas,
como el polietilénglicol (PEG), sulfato de amonio o
de sodio, florisil o segundo anticuerpo (dirigido contra
el anticuerpo del complejo formado) (21,31,32);
cuando se pretende separar la fracción libre, entonces
se procede a precipitar al ligando libre y al trazador
39
Técnicas de unión.
libre también, se realiza a través de la adsorción
de éstos con partículas de carbón activado, tierra
de Fuller o talco y centrifugando para retirar la
pastilla, la cual está formada por partículas que
contienen adherida a la superficie, el trazador y
ligando no radiactivo. Este procedimiento es útil
cuando la fracción libre está constituida por
moléculas de bajo peso molecular, alrededor de
500 a 1000 d. La separación del complejo también
se realiza a través de la cromatografía de
afinidad utilizando proteína C (33).
Otro de los aspectos importantes de esta
metodología es el diseño. En la actualidad han
surgido una amplia gama de diseños que van
desde el clásico, llamado de “saturación en el
equilibrio” (figura 4), que consiste en colocar
simultáneamente en contacto al anticuerpo con el
trazador y ligando “frío” o muestra los cuales
inician en competencia la reacción inmunológica.
Otra modalidad se denomina “ensayo secuencial”
donde la reacción de unión lo realizan primero el
anticuerpo frente a la muestra o al ligando
“frío”. Posteriormente se añade el trazador que
se unirá en los sitios libres de unión del Ac,
Figura 4. Tipos de inmunoanálisis.
siguiendo la Ley de Acción de Masas (33,34). Un
diseño más es el ensayo inmunoradiométrico
(IRMA) (34) en el cual no ocurre el proceso de
desplazamiento del trazador sino que se utiliza
únicamente la unión del anticuerpo a dos sitios de
unión distintos que posee el ligando. Entonces la
marca está en el anticuerpo, una población de
anticuerpos está inmovilizado y la otra está marcada
y soluble. Cuando se une el anticuerpo inmovilizado
con el ligando, se fija el complejo al soporte y
posteriormente se une el anticuerpo marcado a
otro sitio libre, quedando el ligando unido al
complejo, en una estructura llamada “sandwich”.
Para conseguir tal estructura es necesario disponer
de anticuerpos monoclonales -cada clona identifica
sólo uno de los dos sitios de unión- y de un
soporte insoluble en medio acuoso polar. Sin
embargo estos sistemas de RIA o EIA no son
eficientes cuando el ligando corresponde a un
hapteno, ya que éstos no tienen dos o más
determinantes antigénicos. Es decir no hay dos o
más lugares donde se enlace el trazador (35).
Cada población de anticuerpos monoclonales, se
enlaza a un determinante antigénico hacia el cual
fue inducido su formación, dejando libre el otro
sitio de unión. Este último sitio será ocupado por el
trazador (anticuerpo marcado) el cual corresponde
a otro anticuerpo monoclonal. Cuando el
“sandwich” se ha formado entonces la fracción
unida será directamente proporcional a la cantidad
de radiación emitida por el complejo. Este diseño
facilita el manejo de datos porque evita la excesiva
transformación de variables, por lo tanto disminuye
el error por manipulación de datos y simplifica la
estimación de dosis (cantidad de ligando presente
en la muestra) (36).
Otro sistema de inmunoanálisis es el doble
anticuerpo en fase sólida (DASP). En este tipo
de sistema se utiliza al segundo anticuerpo
inmovilizado, de tal manera que éste es una
antigamaglobulina inducida contra la especie en
donde se produjo el primer anticuerpo. Por
ejemplo, si el primer anticuerpo es antihormona
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producido en conejo, entonces el segundo
anticuerpo es antigamaglobulina de conejo,
producido
en
oveja. El segundo anticuerpo
(antigamaglobulina de conejo) se fija a partículas
sólidas, como por ejemplo partículas de sephadex.
Luego se somete a incubación con el primer
anticuerpo, previamente se incubó el primer
anticuerpo con la mezcla de ligando “frío” con el
trazador para que ocurra el desplazamiento,
obteniéndose así un sandwich, donde el primer
anticuerpo esté en medio, este procedimiento es
relativamente simple sin embargo no se ha
popularizado (37).
Ultimamente ha surgido otra modalidad
llamada “enzimoinmunoanálisis amplificado”. El
rasgo distintivo de éste, radica en la formación de
un puente entre el complejo y la marca. En otras
palabras, el trazador esté compuesto de dos
fracciones: una que se une al ligando y otra donde
se encuentra la marca; entre ambas fracciones existe
un puente donde se amplifica la respuesta; tal
puente forma un sistema a parte de ligador y
ligando. Por ejemplo: se tiene al anticuerpo
inmovilizado a la pared del fondo del tubo, se
añade el ligando “frío” o muestra, se deja incubar
para que ocurra la reacción, se forma el
complejo luego se añade posteriormente la
fracción 1 del trazador (Ft1) luego se añade la
fracción 2 del mismo (Ft2) en donde se encuentra
la marca. Queda el complejo final de la siguiente
manera:
soporte : anticuerpo : antígeno - Ft1 : Ft2 : marca
El puente Ft1 : Ft2 normalmente lo
constituyen otro tipo de ligadores distinto al
sistema inmunológico, como
son
el
de
biotina:avidina. En este ejemplo la Ft1 estará
constituido por un conjugado de anticuerpo con
biotina y la Ft2 por otro conjugado de avidina
con marca (36). Este sistema aumenta la
sensibilidad de 20 a 100 veces. Este sistema se
utiliza en ELISA para detección de anticuerpos y
antígenos, en el caso preciso de la detección de
hormonas como esteroides. Ellis y col (38)
Revista Biomédica
desarrollaron un EIA amplificado para detectar
progesterona en leche. En este proceso el
producto obtenido por la catálisis de la enzima
contenida en la marca se usa para producir otro
sustrato que es catalizado por una segunda
enzima que desarrolla color. De este manera la
señal se puede amplificar varias veces, con esto
aumenta la sensibilidad del ensayo.
Como se mencionó anteriormente, los
ensayos de unión no competitivos comúnmente
se utilizan para la detección de anticuerpos, en
éstos el sistema es de fase sólida, mediante el uso
de conjugado anticuerpo:enzima. También se les
denomina ELISA. Se inicia fijando el antígeno a
la pared del fondo del pozo, posteriormente se
deja incubar con la muestra que puede o no
contener al anticuerpo dirigido hacia tal
antígeno, si lo contiene entonces los determinantes
antigénicos serán enlazados por el anticuerpo. La
cantidad de complejo formado estará en función
de la cantidad de moléculas de anticuerpo específico
hacia el antígeno presente en la muestra. Para
detectar la cantidad de complejos formados, se
añade un segundo anticuerpo dirigido contra el
anticuerpo de la especie analizada, el cual está
conjugado a la enzima. Este anticuerpo también
será una antigamaglobulina unida a peroxidasa o
beta galactosidasa, que son las enzimas más
frecuentemente usadas, el nuevo complejo estará
constituido por antígeno enlazado al anticuerpo
de la muestra -si es que existe- y el segundo
anticuerpo que está conjugado con la enzima la
cual ahora será sometido a la acción catalítica con
el sustrato específico, durante la reacción
enzimática se producen compuestos coloridos
que absorben luz cuando son iluminados a
cierta longitud de onda, de tal manera que la
absorbancia de cada pozo está en función directa
de la cantidad de conjugado. Por lo tanto, la
absorbancia también está determinada por la
cantidad de anticuerpo en estudio, presente en la
muestra. Los valores de absorción de luz de las
muestras problema serán comparadas con la
41
Técnicas de unión.
absorbencia de los sueros probados como positivos,
que contienen anticuerpos contra el antígeno, y con
respecto a sueros que contienen anticuerpos contra
el antígeno en estudio. De esta manera se califica la
positividad o negatividad de las muestras (39,40),
(figura 5).
Existe otras técnicas inmunoquímicas
relacionadas directamente con los Inmunoanálisis,
como la “inmunocitoquímica” (41) y de “radio
receptor”. En el primero el sistema está
constituido por anticuerpo marcado con algún
radionúclido o enzima
altamente específico
hacia un antígeno que puede ser cualquier
macromolécula en algún organelo celular, por
ejemplo. El análisis consiste básicamente en poner
en contacto al anticuerpo con las células donde
se pretende rastrear la presencia de una molécula
involucrada en determinada vía metabólica,
principalmente enzimas (por ejemplo el citocromo
P-450) o algún antígeno de superficie. Si tal
molécula se haya presente entonces se enlazará y
se detectará la marca (42).
El análisis de radio receptor es semejante a
RIA, pero en este caso el ligador es el receptor y
no el anticuerpo (1). Los receptores se obtienen a
partir de homogenados del tejido fresco o cortes
ultradelgados del mismo, los cuales serán
parcialmente purificados para luego utilizarse como
ligadores frente al ligando marcado y no marcado.
Con estos componentes se elabora una curva de
calibración para medir ligando en fluido biológico;
pero el receptor tiene la desventaja de que puede
baja especificidad y por lo tanto puede enlazar otros
ligandos químicamente semejantes (43).
APLICACIONES DE LOS ENSAYOS DE
UNION.
Son varios los campos de la investigación
básica donde se utilizan los ensayos de unión,
como por ejemplo para la detección de receptores,
componentes de vías metabólicas o la identificación
de componentes macromoleculares citoplásmicos,
nucleares o sobre superficies y membranas
intracelulares. Algunas técnicas utilizadas para
conseguir estos objetivos son la inmunocitoquímica
directa o indirecta (41, 42, 44) y radiorreceptor
(1, 43).
Otras técnicas
de
unión como la
cromatografía de afinidad, la inmunoelectroforesis
y la inmunotransferencia (Immunoblot) han sido de
gran valor para caracterizar macromoléculas,
como por ejemplo complejos multienzimáticos
(6,31) y formas moleculares hormonales agregadas
(45, 46). El “Southern Blot” es otro ejemplo de
análisis por unión para identificar cadenas de
polinucleótidos (47).
La técnicas más populares de los ensayos
de unión están representados por el RIA y el EIA
-también llamado ELISA-. Las actividades
agronómicas, clínicas y zootécnicas han usado
estas técnicas. Por ejemplo en fitopatología se ha
utilizado el ELISA para detectar virus del mosaico
de la manzana o el virus de la patata “A” e “Y”
(39). En Medicina se ha utilizado el RIA para la
detección de drogas como la digoxina o morfina
(48,49), y en la Medicina Veterinaria para la
detección de anticuerpos contra enfermedades
Figura 5. Prueba de ELISA indirecto.
Vol. 6/No. 1/Enero-Marzo, 1995.
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virales o bacterianas, así como también para el
seguimiento de la actividad endócrina del tiroides o
las adrenales (39,50,51). Particularmente en
reproducción animal existen numerosos trabajos
donde mediante la cuantificación de hormonas se
comparan perfiles hormonales tanto de machos
como hembras (52).
Concretándonos a esta última, se puede
mencionar que los ensayos de unión, se han
u t i l i z a d o frecuentemente para realizar el
diagnóstico temprano en ganado bovino, ya
que a través del RIA o EIA se pueden detectar
niveles fisiológicamente altos de progesterona en
plasma sanguíneo o leche, de los 21 a 24 días
después del servicio (53), indicando de esta
manera que la hembra probablemente está
gestante. En caso contrario, cuando los niveles de
progesterona detectados son bajos, entonces la
vaca no está gestante (54) (figura 6). Los trabajos
realizados en este aspecto indican que existe un
100% de efectividad para el diagnóstico negativo
y del 80 al 97% de eficiencia para el diagnóstico
positivo de gestación. En este último caso, el
porcentaje que es menor con respecto a la no
gestación, puede ser debido a varios factores, uno
de éstos es la mortalidad embrionaria temprana
Figura 6. Perfil de progesterona en vacas.
Revista Biomédica
(55, 56).
El seguimiento de la actividad ovárica en el
posparto se puede realizar a través de la
cuantificación de la progesterona sanguínea o
láctea, la cual es útil para determinar el reinicio
de la actividad cíclica ovárica después del parto
(57).
La medición de progesterona también es de
gran utilidad en los programas de inseminación
artificial, sincronización de estros y transferencia
de embriones, ya que permite detectar la presencia
de cuerpo lúteo funcional producto de la ovulación
y que es indispensable para la implantación del
embrión (56,58,59). Por otra parte también facilita
el diagnóstico de algunas patologías reproductivas.
Actualmente se pueden utilizar técnicas rápidas de
RIA o EIA para cuantificar hormonas, cuya duración
es de 2 a 3 horas y que permiten disponer de la
información el mismo día que se toma la muestra
(61).
COMENTARIOS FINALES.
Los ensayos de unión en este momento se
han tecnificado y simplificado a tal grado que es
posible hacer uso de éstos sin tener amplio
conocimiento de sus bases teóricas ni del
procedimiento. Sin embargo, los principales
problemas radican en el elevado costo de adquisición
y la dificultad para obtenerlos, ya que la mayoría
son de manufactura extranjera. Por otra parte, el
retraso con el que algunos distribuidores surten los
estuches, puede ocasionar que los reactivos lleguen
a su destino con una fecha próxima a su caducidad,
debido a que el trazador tiene una vida media
relativamente corta. Sin embargo, hasta ahora no
se cuenta con estuches comerciales para medir una
gran cantidad de biomoléculas de importancia
biológica o médica, razón por la cual es conveniente
que los investigadores puedan establecer sus propias
técnicas inmunoanalíticas.
43
Técnicas de unión.
AGRADECIMIENTOS.
Al Químico Jorge Alvarez y al M.C. Ricardo
Aké por las valiosas sugerencias para la preparación
del presente documento.
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