utilizacion y suministro de enzimas.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
ES 2 088 464
kInt. Cl. : A61K 47/48
11 N.◦ de publicación:
6
51
ESPAÑA
k
A61K 7/28
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 91302397.4
kFecha de presentación : 20.03.91
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 450 800
kFecha de publicación de la solicitud: 09.10.91
T3
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86
87
87
k
54 Tı́tulo: Uso y administración de enzimas.
k
30 Prioridad: 21.03.90 GB 9006328
05.10.90 GB 9021671
Weena 455
NL-3013 AL Rotterdam, NL
k
72 Inventor/es: Beggs, Thomas Stewart y
k
74 Agente: Carpintero López, Francisco
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.08.96
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.08.96
ES 2 088 464 T3
k
73 Titular/es: Unilever N.V.
Aviso:
k
Davis, Paul James
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 088 464 T3
DESCRIPCION
Campo y antecedentes de la invención
5
10
Esta invención se refiere al uso de enzimas para realizar una función deseada, y a los productos para
este propósito. Un ejemplo de una función tal es atacar a especies presentes en la microflora oral.
Esta invención implica el uso de dos enzimas, una de las cuales genera un producto intermedio que es
un substrato para la otra enzima. La última enzima transforma el intermedio en un agente que es activo
frente a una diana.
La otra enzima puede entonces ser una peroxidasa, que funciona para convirtiendo el peróxido de
hidrógeno en especies oxidadas más potentes, p. ej. por reacción con haluros tales como el ión yoduro
produciendo hipoyodito o por reación con tiocianato produciendo hipotiocianato.
15
20
El peróxido de hidrógeno presenta citotoxicidad, pero se descompone rápidamente in vivo. Las especies oxidadas producidas por la peroxidasa poseen aún mayor toxicidad, pero tienen aún una vida más
corta in vivo.
Sumario de la técnica anterior
El uso de enzimas para producir mortandad celular ya ha sido propuesto, y algunas de estas propuestas han buscado hacer uso de un sistema bi-enzimático.
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30
35
Knowles y col., Journal of Clinical Investigation 52 1443 (1973), han descrito el uso de glucosa oxidasa
conjugada quı́micamente con anticuerpos capaces de unirse a células diana, consiguiendo ası́ el objetivo
de actividad de mortandad celular frente a aquellas células que se desea eliminar selectivamente. Proporcionan peroxidasa y haluso en solución, y demuestran la mortandad de células bacterianas.
Okuda y col., Infection and Inmunity 27 690 (1980), han descrito el uso de xantina oxidasa
(que al menos produce predominantemente superoxido más que peróxido) y lactoperoxidasa conjugada
quı́micamente con anticuerpos capaces de unirse a células diana.
En el transcurso de un periodo de 90 minutos, in vitro, consiguieron una reducción de células vivas
de Candida albicans, in vitro, que era entre uno y dos órdenes de magnitud mejor que la conseguida con
lactoperoxidasa en solución.
Sumario de la invención
40
45
En la presente invención, uno o más vehı́culos contienen, en el mismo venhı́culo o distribuido entre
una pluralidad de vehı́culos:
i) al menos una de dos enzimas, que son una enzima para generar un agente activo frente a una diana
en el interior de la boca y una segunda enzima para generar un intermedio que sea substrato para la
primera enzima, y
ii) al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse al sitio diana en una superficie
en el interior de la boca,
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estando cada dicha enzima conjugada con dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o conteniendo
el producto agentes para unir la enzima a dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el momento de
uso, con lo que cuando se usa, las enzimas se acoplan al sitio diana en proximidad una de la otra.
Mediante esta invención, las dos enzimas y la diana se mantienen todas en proximidad, de modo que
las enzimas puedan cooperar para generar el agente activo, p.ej. una especie haluro oxidada de vida
corta, en proximidad al sitio diana.
Un aspecto de la invención consiste en un producto que comprende los vehı́culos anteriormente mencionados. Otro aspecto es un procedimiento de distribución de enzima(s) mediante administración de los
vehı́culos.
Ambas enzimas pueden incluirse en el vehı́culo o vehı́culos (no necesariamente en el mismo vehı́culo).
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Alternativamente, una de las enzimas puede ser un material que esté presente in vivo en la vecindad
general del sitio diana y que al usarse quede unida al sitio diana a través de dicho anticuerpo o fragmento
de anticuerpo. Esto harı́a concentrarse esa enzima en la proximidad a la otra enzima y en el sitio diana.
5
Las enzimas que se usan pueden ser una oxidasa que genere peróxido de hidrógeno más una peroxidasa que utiliza este como substrato, p.ej. para formar hipohalito. También pueden formarse radicales
superóxido e hidroxilo. Una peroxidasa puede utilizar también el peróxido para transformar tiocianato
a hipotiocianato. Se considera en particular la glucosa oxidasa. Otra posibilidad es la galactosa oxidasa,
que podı́a usarse ya que su substrato la galactosa está presente naturalmente en el yogur.
10
La peroxidasa de rábano picante (Armoracia rusticana) está disponible comercialmente y puede usarse
conjuntamente con cualquiera de estas oxidasas. Otra posibilidad es la lactoperoxidasa.
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Se consideran varias aplicaciones de la invención, aunque la invención no se limita a estas. Una aplicación que se considera particularmente es atacar especies de la microflora oral supragingival.
La microflora oral es un ecosistema complejo que contiene una amplia variedad de especies microbianas. Una de estas especies puede seleccionarse como el sitio diana. Sin embargo, el efecto de hacer
diana en una especie significará atacar tanto a esa especie como a otras especies presentes en estrecha
proximidad a la primera. Por consiguiente, distribuyendo a una especie que esté presente en la placa
dental se distribuirán agentes citotóxicos a la placa y actuarán frente a todas las especies que existan
conjuntamente en la placa, incluidas a aquellas responsables de la formación de la placa. El dextrano
extra-celular producido por tales organismos podrı́a usarse él mismo como sitio diana empleando un anticuerpo o fragmento con afinidad para unirse al dextrano.
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35
Un sitio diana posible es el Streptococcus mutans. Este se ha identificado como un importante contribuyente a la placa dental, y ha mostrado ser capaz de inducir lesiones de caries clı́nicas en animales
exentos de gérmenes cuando se establece una mono-infección. El S. mutans tiene la capacidad de utilizar
hidratos de carbono de la dieta para la sı́ntesis de una matriz polisacárida insoluble, lo que facilita la
unión a, y la colonización de, superficies duras, ası́ como la producción de ácidos capaces de disolver el
esmalte. Estas caracterı́sticas se han identificado como determinantes de virulencia importantes. Aunque otras especies y géneros han demostrado ser capaces de producir tanto ácidos como placa, o incluso
de iniciar caries en animales exentos de gérmenes, el S. mutans es ampliamente recomnocido como al
menos una causa significativa de la caries dental debido al depósito de sus ácidos y a la producción de
polisacáridos.
40
Otras especies que pueden seleccionarse como especies diana son S. sanguis, A. viscosus y A. naeslundii. Todas estas están presentes en la placa dental como parte substancial de las especies que se
encuentran normalmente en la placa dental. Debido a su frecuente presencia, estas tres pueden preferirse
como sitio diana.
30
Otra aplicación es atacar especies de la microflora subgingival responsable de la enfermedad periodontal. Las especies dianas podrı́an bien ser los Bacteroides gingivalis.
45
Una posible aplicación cosmética es la reducción del color de los dientes. En esta aplicación, se han
usado enzimas que producen un material con función blanqueante tal como un ión hipohalito. El sitio
diana se encuentra en la superficie dental. La unión a la diana conforme a esta invención sirve para
disponer las enzimas adyacentes a la superficie. En consecuencia, se produce una substancia blanqueante
en la vecindad de la superficie dental en la que pueda existir coloración.
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Para cualquier aplicación oral (cuidado dental) es necesario que el (los) vehı́culo(s) del producto
sea(n) aceptable(s) para usarse dentro de la boca, p.ej. vehı́culo(s) adecuado(s) para aplicación tópica
en la boca.
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Breve descripción de los dibujos
La invención puede llevarse a cabo de varios modos. Algunos de ellos se ilustran en los dibujos adjuntos, que son diagramas esquemáticos de disposiciones de dianas y enzimas. G.Ox indica glucosa oxidasa.
HRP indica peroxidasa de rábano picante. PEI indica polietilenimina.
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En los dibujos:
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las Figs. 1 a 4 muetran cada una diferentes disposiciones en las que las enzimas están unida a una
diana mediante anticuerpos completos;
5
las Figs. 5 a 7 muestran cada una disposiciones en las que un complejo formado utilizando polietilenimina está unido a la diana mediante fragmentos de anticuerpo, y
la Fig 8 muestra una enzima unida a una diana mediante fragmentos de anticuerpo.
Descripción detallada de realizaciones
10
Como se ha expuesto anteriormente, una caracterı́stica de esta invención es que dos enzimas cooperantes se unen a un sitio diana.
15
Una posibilidad es que las enzimas estén unidas al sitio diana, pero no enlazadas entre sı́ más directamente, por ejemplo que ambas enzimas estén unidas, p.ej. conjugadas a través de enlaces covalentes, a
respectivos anticuerpos completos que sean capaces de unirse al sitio diana. Esto se ilustra en las Figs.
1 y 2.
20
En la Fig. 1 el número 10 indica una diana que es S. mutans con sitios antigénicos 12. El número 14
indica un anticuerpo anti-S. mutans que tiene glucosa oxidasa (G.Ox) conjugadada con él. El número 16
indica un anticuerpo anti-S. mutans que tiene peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con él.
En la Fig. 2 se evita la necesidad de conjugación quı́mica utilizando anticuerpos múltiples. Este es el
tema de de una solicitud de tramitación conjunta de la misma fecha.
25
El número 20 indica un primer anticuerpo que es anti-S. mutans de conejo. El número 22 indica antiglucosa oxidasa de conejo unida a esa enzima. El número 24 indica anti-peroxidasa de rábano picante de
conejo unida a peroxidasa de rábano picante. El número 26 indica inmunoglobulina anti-conejo de cabra
que actúa uniendo los anticuerpos 22 y 24 a anticuerpos anti-diana 20.
30
Otra posibilidad es que el producto incluya agentes para unir las enzimas conjuntamente, al menos
en el momento de uso. Los agentes de unión pueden estar distanciados de, pero sin embargo unidos o
pudiéndose unir a, un anticuerpo que sea capaz de unirse al sitio diana.
40
Se prefiere que las enzimas estén unidas conjuntamente de otra manera que por conjugación quı́mica
a un anticuerpo que se una directamente al sitio diana (que puede ser una célula). Los anticuerpos
especı́ficos contra la diana son probablemente menos fácilmente asequibles que otros anticuerpos u otros
materiales que pueden usarse para unir las enzimas conjuntamente. Por consiguiente, el solicitante prefiere no someter estos anticuerpos especı́ficos contra la diana a reacciones quı́micas artificiales utilizadas
para formar enlaces covalentes que conjuguen las enzimas con anticuerpos.
45
La unión conjunta de enzimas de modo distinto que a través del sitio diana o de anticuerpos especı́ficos
contra la diana, puede hacer más fácil controlar la distribución de enzimas y disponer los dos tipos de
enzimas próximos entre sı́, de modo que el intermedio que es el producto de una enzima se genera en la
proximidad de la otra enzima.
35
Ası́ pues, puede ser ventajoso que el agente de unión sea uno o más intermediarios a los que las
enzimas se unan o puedan unirse, y que se fijen o puedan fijarse a un anticuerpo capaz de unirse al sitio
diana.
50
También se prefiere que la unión del agente de unión a un anticuerpo que se une al sitio diana sea
mediante unión anticuerpo-antı́geno. Esto es beneficioso para evitar la conjugación quı́mica con el anticuerpo especı́fico para la diana.
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60
Una disposición preferida utiliza dos tipos más de anticuerpos además del primer anticuerpo mencionado que se une a los sitios diana. En esta disposición, una enzima (p.ej. la peroxidasa de rábano picante)
está unida, p.ej. conjugada quı́micamente a través de enlace covalente, con un segundo anticuerpo que
puede unirse al primer anticuerpo, mientras que la otra enzima (p.ej. glucosa oxidasa) está unida al
tercer anticuerpo capaz de unirse al segundo anticuerpo. El agente de unión es entonces la combinación
del segundo y tercer anticuerpos.
Un ejemplo de esta disposición se muestra en la Fig. 3. El número 30 indica anticuerpo bovino contra
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el S. mutans diana 10. El número 32 indica inmunoglobulina anti-bovina de conejo que está conjugada
con la peroxidasa de rábano picante y se une al anticuerpo bovino 30. El número 34 indica inmunoglobulina anti-conejo de oveja conjugada con glucosa oxidasa. Esto se une al anticuerpo 32.
5
10
En la Fig. 4 se muestra una variación que es en cierta manera análoga a la de la Fig. 2. Los números
10, 12, 20 y 22 tienen el mismo significado que el de la Fig. 2, pero el número 36 indica inmunoglobulina
anti-conejo de cabra conjugada quı́micamente con peroxidasa de rábano picante.
Otra posibilidad es que las dos enzimas estén conjugadas con un único intermediario que se une a los
primeros anticuerpos.
Una posibilidad de un intermediario semejante es un polı́mero sintético que tenga una funcionalización
quı́mica que permita la unión de enzimas por reacción quı́mica. Un polı́mero adecuado es la polietilenimina que es un polı́mero ramificado con grupos amino en los terminales de las ramificaciones.
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Un complejo de tal polı́mero con ambas enzimas unidas a él a través de enlaces covalentes puede
unirse al sitio diana de varios modos. Una posibilidad es que el producto incluya un anticuerpo contra
una de las enzimas, y un anticuerpo adicional capaz de de formar un puente al unirse tanto a esta como
al anticuerpo que se une al sitio diana. Esto se ilustra con la Fig. 5 y es directamente análogo a la
disposición de la Fig.2.
Otra posibilidad es que el producto incluya un conjugado de anticuerpo doble con dos especificidades,
que tenga la capacidad de unirse a una de las enzimas y también de unirse al anticuerpo que se une a la
diana. Los conjugados de anticuerpo doble son conocidos per se. Esta disposición se ilustra con la Fig.6.
El número 30 indica anticuerpo bovino frente al S. mutans diana. El número 37 indica un conjugado de
anticuerpo doble de anticuerpos anti-bovino y anti-glucosa oxidasa.
Otra posibilidad es que la polietilenimina polı́mera tenga sitios antigénicos caracterı́sticos de la diana
unidos covalentemente a ella. Un anticuerpo capaz de unirse a la diana pretendida se unirı́a entonces a
estos sitios antigénicos del polı́mero, y de este modo acopları́a el polı́mero al sitio diana. Esta disposición
se ilustra con la Fig. 7, en la que el número 38 indica un antı́geno unido a la polietilenimina y el número
39 indica un anticuerpo anti-diana que se une a la diana 10 y al antı́geno.
La glucosa oxidasa y la peroxidasa de rábano picante son ambas enzimas con cadenas glicosı́licas
colgantes. Tales enzimas pueden unirse covalentemente a la polietilenimina oxidando primeramente las
enzimas en solución acuosa con peryodato para generar grupos aldehı́do en las cadenas glicosı́licas colgantes. Estos grupos formarán entonces bases de Schiff con grupos amino de la polietilenimina a un pH
alcalino (p.ej. pH 9,5), después de lo cual puede utilizarse la reducción con borohidruro para reducir
cualquier grupo aldehı́do que no haya reaccionado y también incrementar la estabilidad al reducir las
bases de Schiff.
Estas enzimas pueden conjugarse también con anticuerpos mediante la misma técnica.
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Los anticuerpos completos usados en esta invención pueden ser monoclonales o policlonales. Cuando
se emplean juntos un anticuerpo de una especificidad y un anticuerpo de diferente especificidad, es posible
que un anticuerpo sea monoclonal mientras que el otro sea policlonal.
La invención puede llevarse a cabo utilizando fragmentos de anticuerpo, especialmente utilizando un
fragmento de anticuerpo para la unión al sitio diana, junto con uno o más fragmentos para unir enzimas
al primer fragmento.
El primer fragmento de anticuerpo que se une a un sitio diana puede ser un fragmento Fv de un
anticuerpo frente a la diana deseada. Un fragmento semejante contiene solo las regiones variables de
cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo. El fragmento podrı́a ser posiblemente un fragmento F(ab)2
que proporcionarı́a dos sitios de unión. Puede ser alternativamente tan pequeño como una región variable
única de una cadena de un anticuerpo.
Están descritas técnicas para la producción eficiente de fragmentos de anticuerpo activos
biológicamente en E. coli por A. Skevia y A. Pluckthun (1988), Science, 240, 1038; M. Better y col.,
(1988), Science, 240, 1041; y E.S. Ward y col., Nature, 341, 544. La clonación y expresión de genes que
codifican fragmentos de anticuerpos en E. coli está también descrita en la solicitud europea publicada
EP-A-368684 (Medical Research Council).
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El solicitante de la presente prefiere que un primer fragmento de anticuerpo tenga una cadena peptı́dica
adicional anexa, y otros fragmentos que unan las enzimas a esta cadena peptı́dica. Pueden prepararse
bacterias que produzcan una región variable con una cadena peptı́dica más ya unida al C terminal de
la región. Esto puede realizarse mediante técnicas convencionales de ingenierı́a genética. Por ejemplo,
un gene que codifique una región variable puede alargarse fácilmente mediante técnicas de mutagénesis
dirigidas a sitio, utilizando oligonucleótidos sintetizados in vitro que codifican el péptido que se va a
añadir a la región variable. La mutagénesis dirigida a sitio es ahora una técnica usada ampliamente, y
pueden encontrarse protocolos adecuados en varios libros publicados, por ejemplo en Sambrook y col.,
(1989), Molecular Cloning, 2a
¯ edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York. Un péptido
extra unido proporciona un “brazo” muy conveniente para la unión del agente terapéutico.
Otros fragmentos de anticuerpo que unen enzimas al primer fragmento son preferiblemente un segundo
fragmento de anticuerpo capaz de unirse a una enzima mediante una unión anticuerpo-antı́geno, y un
fragmento F(ab)2 (que es divalente) capaz de unirse a los primero y segundo fragmentos, especialmente
a péptidos antigénicos añadidos a los primero y segundo fragmentos de anticuerpo.
La Fig.8 ilustra una disposición preferida en la que se utilizan fragmentos de anticuerpo.
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Para la unión a la diana 40 que tiene sitios antigénicos 42, hay un fragmento de anticuerpo Fv 44 con
varias réplicas de un péptido 46 añadido al extremo distal (C terminal) de una de las dos cadenas del
fragmento Fv 44.
La glucosa oxidasa (G.Ox) y la peroxidasa de rábano picante (HRP) están unidas cada una mediante
un fragmento Fv respectivo 48, 50 con especificidad para la enzima que concierna, y con una única réplica
del mismo péptido 46 añadido a una cadena del fragmento Fv.
Los péptidos 46 añadidos a los fragmentos Fv anti-enzima 48, 50 quedan unidos a los péptidos 46 del
fragmento Fv anti-diana mediante fragmentos F(ab)2 52 que se unen especı́ficamente a estos péptidos.
Como los fragmentos F(ab)2 son divalentes, pueden formar un puente que una un fragmento anti-enzima,
con la enzima unida, al fragmento anti-diana 44.
Si se emplean varios anticuerpos monoclonales, puede ser deseable distribuir las enzimas y los anticuerpos entre más de un vehı́culo en el producto, de modo que los complejos completos de ambas enzimas
y anticuerpos no se forman hasta el momento de uso. El solicitante ha descubierto, que durante el almacenamiento los complejos grandes con anticuerpos monoclonales son propensos a sufrir una merma en su
capacidad de unirse a un sitio diana.
La distribución de los constituyentes del complejo entre varios vehı́culos puede ser innecesaria si se
emplean anticuerpos monoclonales. En general, los anticuerpos monoclonales formarı́an complejos más
pequeños y durante el almacenaje serı́a de esperar que retuviesen su actividad mejor que los complejos
formados con anticuerpos policlonales. Esto también es cierto cuando se usan fragmentos de anticuerpo.
Una ventaja de los fragmentos de anticuerpo es que los complejos que forman mediante una unión
antı́geno-anticuerpo son bastante pequeños y más estables que los complejos con anticuerpos completos.
45
Cuando un producto tiene las enzimas y uno o más anticuerpos distribuidos entre dos vehı́culos, uno
de ellos puede contener el anticuerpo capaz de unirse a la diana, mientras que el otro vehı́culo contendrı́a
las enzimas y los agentes para unirlas entre sı́, posiblemente como un complejo preformado.
50
Un producto que comprenda un vehı́culo o vehı́culos que contienen enzimas y uno o más anticuerpos o
fragmentos de anticuerpo puede tomar diversas formas. Si el sitio diana está en la boca, las posibilidades
incluyen colutorios, pastas dentales y pastillas para disolver en la boca. Estas formas de producto pueden
usarse incluso cuando se necesiten diversos vehı́culos. Por ejemplo, el producto puede ser un colutorio de
dos componentes que el usuario mezcla inmediatamente antes de usar.
55
Puede ser una pasta dental de dos componentes almacenados en un envase de pasta dental de tal
modo que se mantengan separados o al menos no se mezclen, pero que se administran juntos y se mezclan
en la boca del usuario. Tales productos pastas dentales de dos componentes son conocidos per se.
60
Otra forma de producto posible que disponga de varios vehı́culos puede ser una pastilla para chupar
en la boca, estando los diversos materiales en zonas separadas de la tableta.
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Pueden usarse formas de dos vehı́culos en combinación como medio de proporcionar una pluralidad
de vehı́culos, p.ej., pasta dental tras cuyo uso se administra un colutorio o una pastilla.
5
10
El producto puede incluir alguno o todos los substratos para las enzimas, aparte del intermedio generado enzimáticamente, o puede depender de alguno o todos los substratos presentes en el sitio diana.
Ası́, cuando se usa la glucosa oxidasa y el sitio diana está en la boca, el producto puede depender de
la glucosa de la dieta como substrato enzimático o puede incorporar él mismo glucosa siempre que esté
separada de la glucosa oxidasa.
Ejemplos
La invención se explica adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos experimentales, que demuestran la eficacia del sistema in vitro.
15
20
En los Ejemplos, “PBS” indica solución salina tamponada con fosfato, de pH 8 a menos que se indique
otra cosa.
Las diluciones se expresan en la forma “1/n” que significa que se mezcla una cantidad de solución de
partida con diluyente para obtener unas solución en la que la concentración es una enésima parte de la
que tuviera la solución de partida.
Ejemplo 1: Parte 1 - Materiales empleados
25
La peroxidasa de rábano picante conjugada con inmunoglobulina anti-bovina de conejo fue un producto comercial (Sigma).
La glucosa oxidasa conjugada con inmunoglobulina anti-conejo de oveja fue un producto comercial
(Serotec)
30
35
El anti-S. mutans bovino se preparó de la manera siguiente: se cultivó S. mutans durante una noche en medio Tood-Hewitt. El cultivo se destruyó térmicamente, se mezcló con solución salina esteril y
sı́lice de pirólisis (Gasil) como adyuvante obteniéndose una solución que contenı́a 0,1 g/ml de Gasil y 108
células/ml. Se inyectaron 2 ml de esta solución a un ternero. Se le aplicó una inyección similar tres semanas después y dos semanas más tarde se le extrajo antisuero de sangre completa. La inmunoglobulina
anti-bovina de conejo (usada como comparación) fue también un producto comercial (Sigma).
Todas las soluciones reactivas, y el PBS usado para lavar contenı́an 0,15% v/v del tensoactivo Tween
20 (polioxietilén (20) sorbitan monolaurato).
40
Ejemplo 1: Parte 2 - Procedimiento
Se realizó un procedimiento experimental en el se expuso S. mutans a anti-S. mutans bovino, luego
a materiales que formaban un complejo citotóxico unido además al S. mutans mediante los anticuerpos
bovinos.
45
Se efectuaron controles en los que se omitieron o variaron etapas del procedimiento.
El procedimiento fue una serie de etapas como se indica:
50
55
1. Se transfirieron a botellas estériles McCartney alı́cuotas de 10 ml de un cultivo de S. mutans en
medio Todd-Hewitt. Las bacterias se sedimentaron por centrifugación, el sedimento se lavó 3 veces con
PBS a pH 8 y se resuspendió en 9 ml de PBS.
2. Se añadió 1 ml de una suspensión anti-S. mutans bovina. Esta suspensión era una dilución 1/10
del suero total en PBS a pH 8, esterilizada por filtración. Alternativamente, se añadió 1 ml de PBS a pH
8 como control.
3. La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, luego las células se centrifugaron
dando un sedimento que se lavó tres veces con PBS y se resuspendió en 9 ml de PBS como antes.
60
4. Se añadió 1 ml de conjugado peroxidasa de rábano picante/antibovino de conejo esterilizado por
filtración, a una dilución 1/10 en PBS a pH 8, dando una dilución final de 1/100. Después de 20 minutos
7
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de incubación a temperatura ambiente, las células se centrifugaron dando un sedimento, que se lavó 3
veces con PBS a pH 8 y se resuspendió en 9 ml de PBS como antes.
5
En un control, se añadió 1 ml de PBS en vez del conjugado. En experimentos comparativos, el conjugado se reemplazó por inmunoglobulina anti-bovina de conejo.
10
5. Se añadió 1 ml de conjugado glucosa oxidasa/anticonejo de oveja esterilizado por filtración, a una
dilución 1/10 en PBS a pH 8, dando una dilución final de 1/100 tras la adición. De nuevo, la suspensión
se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego las células se centrifugaron dando un sedimento que se lavó 3 veces con PBS.
6. Las células se resuspendieron en 10 ml de PBS a pH 6,5 que contenı́a 15mg/ml de yoduro potásico
y 5% p/v de D-glucosa, esterilizado por filtración.
15
7. La solución resultante se incubó a 37◦C durante 24 horas. Se tomaron muestras de 0,5 ml inmediatamente al mezclar y a intervalos. Las bacterias de cada muestra se separaron por centrifugación en el
sedimento, que se lavó tres veces con PBS. Las células viables de cada muestra se sometieron a ensayo por
el método de Miles, Misra e Irwin, J. Hygiene 38, 732-749, (1938). Las combinaciones de los materiales
añadidos, y los recuentos de células viables se exponen en la Tabla siguiente.
20
25
8. Muestras de la suspensión producida en la etapa 6 se sometieron a ensayo colorimétrico para
determinar la presencia simultánea de ambas enzimas unidas a las células. Las células se centrifugaron
a 4.000 rpm durante 5 minutos y luego se lavó tres veces el sedimento resuspendiéndole en 3 ml de PBS,
y se centrifugó de nuevo. Tras la última centrifugación, las células se resuspendieron en 0,5 ml de PBS
que contenı́a glucosa 100mM y 1 mg/ml de tetrametil bencidina. Este sistema desarrolla color solamente
cuando están presentes conjuntamente glucosa oxidasa y peroxidasa de rábano picante. El color se dejó
desarrollar durante 5 minutos, entonces se detuvo añadiendo 50 ml de HCl 0,2 M. Se determinaron las
densidades ópticas y están incluidas en la Tabla 1.
TABLA 1
30
Etapa 2 Etapa 4
Etapa 5
35
40
45
Ab
Ab
PBS
Ab
PBS
Ab
Ab
PBS
HRP conj
HRP conj
anti-bov
anti-bov
HRP conj
PBS
PBS
G.ox conj
G.ox conj
G.ox conj
G.ox conj
PBS
G.ox conj
Densidad óptica
en Ensayo
colorimétrico
0
1,079
0,004
0,002
0,015
0,072
0,002
0
5,4x107
9,8x106
2,4x107
8,8x106
2,3x107
3,2x107
2,2x107
Numero de celulas supervivientes
Duración de la incubación (horas)
1
2
4
8
3,2x107
3,6x105
1,2x107
1,8x105
1,4x107
2,2x107
2,6x107
2x107
2x101
1,2x106
2x103
2,8x106
1,04x107
1,6x107
2x107
6x101
5,8x106
4x102
1,6x102
2x106
1,2x107
2x107
2,2x102
3x102
2,8x102
8x101
1,2x105
2,4x104
24
6x106
0
1x102
4x101
8x102
1,4x104
2x102
50
Como puede verse en la Tabla, las células generalmente sobreviven en presencia de anticuerpos frente
a ellas (experimento A). Cuando está presente el conjugado de glucosa oxidasa, pero es incapaz de unirse
a a las células de S. mutans (experimento G) despliega un efecto citotóxico. Despliega un efecto citotóxico
mayor si se une a las células de S. mutans diana (experimento D).
55
Sorprendentemente, el conjugado de peroxidasa de rábano picante produjo cierta citotoxicidad sin
glucosa oxidasa (experimento F). En el experimento C ambos conjugados estaban presentes y eran capaces de formar un complejo entre sı́ pero incapaces de unirse a las células de S. mutans diana: la actividad
citotóxica era mayor que con el conjugado de glucosa oxidasa sin unir o con el conjugado de peroxidasa
(experimentos G y F).
60
Sin embargo, se consiguió una citotoxicidad mucho mayor con el experimento B, que contiene todos
los componentes para permitir a ambos conjugados complejarse conjuntamente y unirse también a las
células diana. El número de células supervivientes desciende drásticamente en el curso de dos horas, y
eventualmente cae hasta cero.
8
ES 2 088 464 T3
Ejemplo 2
5
10
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, utilizando dos diluciones diferentes del conjugado glucosa
oxidasa/anti-conejo de oveja. En algunos experimentos el conjugado utilizado fue una dilución 1/10 en
PBS a pH 8, de modo que tras la adición la concentración final del conjugado fue 1/100. En otros experimentos el conjugado se utilizó a una dilución 1/160, de modo que tras la adición la dilución final fue
1/1600.
Las combinaciones de los materiales añadidos, los recuentos de células viables, y las densidades ópticas
del ensayo colorimétrico se exponen en la Tabla siguiente.
TABLA 2
15
Etapa 2 Etapa 4
Etapa 5
Ab
Ab
PBS
Ab
PBS
Ab
PBS
PBS
G.ox 1/10
G.ox 1/10
G.ox 1/160
G.ox 1/160
G.ox 1/160
G.ox 1/160
Densidad óptica
en Ensayo
colorimétrico
Numero de celulas supervivientes por ml
Duración de la incubación (horas)
0
1
2
4
8
24
20
25
PBS
HRP
HRP
HRP
HRP
PBS
PBS
conj
conj
conj
conj
0,03
12,7∗
0,02
7,7∗
0,07
0,03
0,02
4x106
8,4x105
5,6x106
7,6x105
6x106
2x106
2,8x106
1,32x106
4x101
2,8x106
5,2x103
4,2x106
1,08x106
2,4x106
1,24x106
0
3x106
0
2,2x106
1,2x106
6,2x106
5,6x106
1,1x103
2,8x106
2x101
1,2x106
5,2x105
4x106
1x106
0
2,6x105
0
2,2x106
4,8x105
2x106
2x105
6x101
0
1,2x102
7x105
1,4x105
5,4x105
30
∗ Valores calculados derivados de los valores reales medidos a dilución mayor.
35
Puede verse en la tabla 2 que las células sobreviven en presencia de anticuerpos frente a ellas (experimento A) y que el conjugado de glucosa oxidasa diluido despliega una actividad citotóxica pequeña en
ausencia de peroxidasa (experimentos F y G).
40
El complejo no unido del conjugado de peroxidasa con el conjugado de glucosa oxidasa diluido (experimento E) despliega marcadamente menos citotoxicidad que un complejo en el que se usó el conjugado
de glucosa oxidasa más concentrado (experimento C). Se observó una citotoxicidad mucho más rápida
con el complejo unido a las células de S.mutans (experimentos B y D). Es particularmente notable que
el complejo con el conjugado de glucosa oxidasa diluido no unido (experimento D) fue considerablemente
más eficaz que el complejo no unido con el conjugado más concentrado (experimento C).
45
Ejemplo 3
Este Ejemplo demuestra la citotoxicidad utilizando glucosa oxidasa y peroxidasa, unidas ambas a las
células diana pero no unidas entre sı́ de otro modo. En este ejemplo, las células eran celulas tumorales
humanas (células LoVo cultivadas), pero el Ejemplo es también un modelo para destruir otras células.
50
55
Las células LoVo se desprendieron de un cultivo de tejido y se suspendió en medio de cultivo para
tejidos RPMI 1640. Se pipetearon alı́cuotas de la suspensión en pocillos de una placa de cultivo de tejidos
que se incubó durante 4 dı́as a 37◦C para que las células LoVo se fijasen a la placa. El medio de cultivo
fue vertido de la placa de cultivo y se añadió una alı́cuota de suspensión de anticuerpo anti-LoVo de
ratón a cada pocillo. Este anticuerpo era un anticuerpo monoclonal denominado AUA-1 (de Unipath
Ltd). Cada alı́cuota eran 200 ml de una dilución 1/1000 de anticuerpo AUA-1.
La placa se incubó durante 1 hora a 37◦C, entonces se vertió de ella la suspensión de anticuerpo.
Seguidamente, cada pocillo recibió una alı́cuota de 200 ml de una solución que contenı́a lo siguiente:
60
9
ES 2 088 464 T3
glucosa oxidasa (G.Ox)
peroxidasa de rábano picante
anticuerpo anti-G.Ox de ratón
anticuerpo anti-HRP de ratón
anticuerpo anti-ratón de conejo
5
10 mg/ml
10 mg/ml
1250 ng/ml
250 ng/ml
50 mg/ml
Serı́a de esperar que se formasen dos tipos de complejo por unión anticuerpo-antı́geno, a saber:
10
a) Lovo:anti-LoVo de ratón:anti-ratón de conejo:anti-G.Ox de ratón:G.Ox
b) Lovo:anti-LoVo de ratón:anti-ratón de conejo:anti-HRP de ratón:HRP
15
Algunos pocillos se usaron como controles, y recibieron una alı́cuota de una solución que contenı́a
solamente las enzimas.
Seguidamente, cada pocillo recibió una porción de 50 ml de una solución de catalasa. Se emplearon
varias concentraciones de catalasa. La catalasa funcionó destruyendo peróxido de hidrógeno.
20
25
La placa se incubó durante una hora a 37◦ C, después de lo cual se determinó el grado en que las
células LoVo seguı́an siendo viables. Para hacer esto, se tomaron 100 ml de solución de cada pocillo y se
reemplazaron por 50 ml de una solución de 1 mg/ml de: bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil)
tetrazolio (MTT) (Sigma Chemical Co). Las células vivas generaron cristales azules de formazan. Estos
cristales azules se disolvieron añadiendo 100 ml de HCl 0,04 N en isopropanol a cada pocillo. Se leyó la
densidad óptica en un lector de placa ELISA a 570 nm.
Los resultados fueron:
Concentración de catalasa
(mg/ml)
30
0
2,5
5
10
20
40
80
35
40
45
Absorbancia a 570 nm
Solución enzimática Enzimas y anticuerpos
L
H
H
H
H
H
H
L
L
L
L
L
H
H
L = 0,2 dentro del error experimental
H = 1,1 dentro del error experimental
50
55
60
Ası́, en ausencia de catalasa, incluso las enzimas libres destruyen las células LoVo. A 40 mg/ml o más
de catalasa, su efecto secuestrante de H2 O2 suprimió toda citotoxicidad. Concentraciones inferiores de
catalasa suprimieron el citotóxico por enzimas libres pero no cuando estaban presentes los anticuerpos.
Esto demuestra que las enzimas fueron capaces de destruir células y que los anticuerpos hicieron que las
enzimas fueran más eficaces al fijarlas a las células diana.
Ejemplo 4
Como el Ejemplo 3, este ejemplo demuestra la citotoxicidad al utilizar glucosa oxidasa y una peroxidasa, ambas unidas a las células diana. Las células en este ejemplo fueron de S. sanguis que es una
especie que existe en la boca. Los anticuerpos utilizados en este ejemplo se prepararon por técnicas
convencionales.
Las células de S. sanguis se extrajeron por centrifugación de un medio de cultivo, se lavaron tres veces
resuspendiendo en PBS y centrifugando, luego se resuspendieron en PBS. Se colocaron alı́cuotas en una
10
ES 2 088 464 T3
serie de tubos, se centrifugaron y resuspendieron en una suspensión (en PBS) esterilizada por filtración
de anticuerpos anti-S. sanguis policlonales de ratón (obtenidos de fluido ascı́tico).
5
Las suspensiones se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir a los anticuerpos unirse a las células. Las células se centrifugaron de nuevo y se lavaron con PBS.
Algunos tubos, utilizados como comparación, recibieron PBS en vez de la suspensión de anti-S. sanguis de ratón.
10
A continuación, las células se resuspendieron en 1 ml de PBS que contenı́a:
glucosa oxidasa (G.Ox)
peroxidasa de rábano picante (HRP)
anticuerpo monoclonal anti-G.Ox de ratón
anticuerpo monoclonal anti-HRP de ratón
anticuerpo policlonal anti-ratón de conejo
15
100
100
1,25
1,25
50
mg/ml
mg/ml
mg/ml
mg/ml
mg/ml
(El anticuerpo anti-ratón de conejo se añadió a una solución que ya contenı́a los otros cuatro materiales).
20
En algunos tubos se substituyó la solución anterior que contenı́a las enzimas y los anticuerpos por
PBS solo. En otros tubos se utilizó una solución que contenı́a las enzimas y los anticuerpos, pero se
omitió el anticuerpo anti-ratón de conejo.
25
30
Se incubaron todas las suspensiones a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir a las
enzimas unirse a las células. Entonces se extrajeron las células por centrifugación, se lavaron con PBS y
se resuspendieron en 1 ml de PBS que contenı́a 15 mg/ml de yoduro potásico y 5% p/v de glucosa.
Estas suspensiones se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente. Se tomaron porciones
de muestras de cada suspensión al principio de esta incubación y tras periodos de 1, 2, 3, 4 y 24. Se
determinaron las células viables de cada muestra de la misma manera que en el Ejemplo 1, y los resultados
se exponen en la Tabla 3 siguiente.
TABLA 2
35
Anti-diana
40
45
A Anti-S.sanguis ratón
B Anti-S.sanguis ratón
C Anti-S.sanguis ratón
D
50
Ninguno
Enzimas y anticuerpos
Ninguno
Todos
Anti-ratón de
conejo omitido
Todos
0
Celulas supervivientes por ml
Duración de la incubación (horas)
1
2
3
4
24
5x107 1,4x107 4,2x107 2,2x106 4x107 4,6x105
4,4x107 4x106 2,4x107 4,6x105 1,6x105
1
5x107 6x106 3,6x107 7,4x106 2,6x107 2,4x104
5,2x107 6,4x106 2,6x107 2,8x106 8x106 4,6x104
La muestra B, con ambas enzimas unidas a las células diana, proporcionó una citotoxicidad mucho
más eficaz que las otras muestras.
Ejemplo 5
55
60
Este ejemplo proporciona un modelo in vitro del uso de dos enzimas unidas a la diana para blanquear
el coloreado dental. Se utilizó una membrana de nitrocelulosa como superficie modelo.
La membrana se incubó con suero de ratón normal durante una hora. Este suero contiene inmunoglobulina de ratón.
En consecuencia, los anticuerpos de ratón se unieron a la membrana. La membrana se incubó con una
solución al 3% de albúmina de suero bovino para bloquear cualquier sitio de unión a proteı́nas restante
11
ES 2 088 464 T3
en la membrana. Se utilizaron muestras de membrana tratadas como antes como muestras de control y
ensayo (4 de cada).
5
10
Seguidamente, las muestras de ensayo de la membrana (pero no las muestras de control) se incubaron
con una solución que contenı́a:
glucosa oxidasa (G.Ox)
peroxidasa de rábano picante (HRP)
anticuerpo monoclonal anti-G.Ox de ratón1,
anticuerpo monoclonal anti-HRP de ratón1,
anticuerpo policlonal anti-ratón de conejo
100
100
25
25
50
mg/ml
mg/ml
mg/ml
mg/ml
mg/ml
similar a la usada en el Ejemplo previo.
15
20
25
30
Esto condujo a la formación de complejos como se ilustra en la Fig. 2, proporcionando la diana la
membrana de nitrocelulosa.
Las muestras de ensayo y las muestras de control se colorearon seguidamente con té. Se dejó enfriar
a temperatura ambiente una infusión de hojas de té (2% en peso) en agua hirviendo, y se incubó con las
muestras de ensayo y control durante 5 minutos, tras lo cual las muestras se lavaron en PBS durante 1
hora para eliminar el color no fijado.
Se incubaron las muestras en una solución de PBS de pH 7,2 que contenı́a 5,4% en peso de glucosa
durante una noche (18 horas). Se esperaba que esto proporcionarı́a substrato para las enzimas unidas, lo
que llevarı́a a la producción de especies reactivas en la proximidad del coloreado del té.
La intensidad del color de las muestras se evaluó antes y después de la incubación con la solución de
glucosa, utilizando un cromómetro Minolta CR 200 para evaluar la reflectancia. El resultado se expresó
en una escala numérica.
Los incrementos observados en la reflectancia, y las desviaciones tı́picas fueron:
35
Muestras de ensayo (con enzimas)
Muestras de control
1,17 ± 0,042
0,15 ± 0,31
Esto muestra un incremento estadı́sticamente significativo (p < 0,05) en el brillo de las muestras de
ensayo en comparación con las muestras de control.
40
45
50
55
60
12
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REIVINDICACIONES
1. Un producto que comprende uno o más vehı́culos que contienen, en el mismo vehı́culo o distribuido
entre una pluralidad de vehı́culos:
5
10
15
i) al menos una de dos enzimas, que son una enzima para generar un agente activo frente a una diana
situada en el interior de la boca y una segunda enzima para generar un intermedio que sea substrato para
la primera enzima, y
ii) al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse al sitio diana en una superficie
situada en el interior de la boca,
estando cada una de dichas enzimas unida a dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o conteniendo
el producto agentes para unir la enzima a dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el momento de
uso, con lo que cuando se usa, las enzimas se acoplan al sitio diana en proximidad la una de la otra.
2. Un producto conforme a la reivindicación 1, en el que la primera enzima es una oxidasa que genera
peróxido de hidrógeno y la segunda enzima es una peroxidasa.
20
3. Un producto conforme a la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que incluye ambas enzimas.
4. Un producto conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada enzima está
conjugada quı́micamente con un anticuerpo.
25
30
5. Un producto conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos una de
las enzimas está conjugada quı́micamente con un anticuerpo que se une mediante una unión anticuerpoantı́geno a un anticuerpo que es capaz de unirse al sitio diana.
6. Un producto conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye agentes para unir
las enzimas entre sı́, estando los agentes distanciados de, pero unidos o pudiéndose unir a, un anticuerpo
o fragmento de anticuerpo que es capaz de unirse al sitio diana.
7. Un producto conforme a la reivindicación 6, en el que la fijación del agente de unión al anticuerpo
o fragmento de anticuerpo capaz de unirse al sitio diana, se hace mediante una unión anticuerpo-antı́geno
35
40
8. Un producto conforme a la reivindicación 7, en el que una enzima está unida o puede unirse a un
segundo anticuerpo que se une al anticuerpo que es capaz de unirse al sitio diana, y la otra enzima está
unida o puede unirse a un tercer anticuerpo que se une al segundo anticuerpo.
9. Un producto conforme a la reivindicación 8, en el que al menos una enzima está conjugada
quı́micamente con su anticuerpo respectivo.
10. Un producto conforme a la reivindicación 6, en el que ambas enzimas están conjugadas
quı́micamente a un material soporte que proporciona el mencionado agente de unión.
45
11. Un producto conforme a la reivindicación 10, en el que el material soporte es polietilenimina.
12. Un producto conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sitio
diana es una especie bacteriana oral.
50
55
13. Un producto conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el, o cada,
vehı́culo es aceptable para tenerse en el interior de la boca.
14. Un producto conforme a la reivindicación 13, que es, o en el que se dispone al menos un vehı́culo
mediante, una pasta de dientes, un colutorio o una pastilla.
15. Un procedimiento cosmético para reducir las manchas dentales, que comprende administrar un
producto conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
60
16. Un procedimiento cosmético para reducir las manchas dentales, que comprende administrar:
i) al menos una de dos enzimas, que son una enzima para generar un agente blanqueante activo frente
a las manchas dentales, y una segunda enzima para generar un intermedio que sea substrato para la
13
ES 2 088 464 T3
primera enzima, y
ii) al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a la mancha diana de las superficies dentales,
5
estando cada dicha enzima unida a dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o conteniendo el producto agentes para unir la enzima a dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el momento de uso,
con lo que cuando se usa, las enzimas se acoplan al sitio diana en proximidad una de la otra.
10
17. Uso de al menos un vehı́culo, al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y al menos una
enzima, todos como los especificados en la reivindicación 1, para preparar un producto para atacar una
diana en una superficie en el interior de la boca.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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