Guión prácticas 1

TÉCNICA INMUNOHISTOQUIMICA
Conjunto de técnicas que hacen uso de anticuerpos. Los anticuerpos están formados por
dos cadenas pesadas y dos ligeras, que se agrupan en una molécula en forma de Y, con
dos sitios de unión para antígeno
Existen varios tipos de anticuerpos, de los cuales los IgG son los más abundantes en
suero y los que más utilidad tienen en técnicas de laboratorio.
Antígeno es la molécula a la cual se une el anticuerpo. Son de muy distinta naturaleza.
Fundamentalmente los Anticuerpos (Ac) reconocen proteínas, pero también se
sintetizan Ac contra carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, compuestos orgánicos
sintéticos, etc. La región de la molécula a la cual se une el anticuerpo se denomina
epítopo. Los epítopos pueden estar formados por regiones contiguas o no en la
secuencia de aminoácidos de una proteína.
La unión antígeno-anticuerpo es una unión reversible y de alta afinidad. La producción
de anticuerpos consiste básicamente en:
a) Preparación del antígeno,
b) Inyección de este a un animal y
c) Obtención del suero del suero del animal.
MARCAJE DE ANTICUERPOS:
Los anticuerpos se pueden marcar para permitir su detección, lo cual implica la unión
covalente al dominio Fc de moléculas o átomos fácilmente detectables, tales como:
-125I emisor  se detecta con contador de centelleo o autoradiografia.
- Enzimas se le pegan enz completas a la región Fc: peroxidasa de rábano, fosfatasa
alcalina, -galactosidasa, etc.
Detección con:
* Sustratos que dan lugar a productos coloreados solubles, que se pueden medir en un
espectrofotómetro.
* Sustratos que dan lugar a productos coloreados insolubles, que forman un precipitado
en el lugar en el que se encuentra el anticuerpo, útiles por ejemplo en
inmunolocalización y western blots.
* Sustratos que producen luz (detectada con luminómetro o película fotográfica).
* Biotina, luego detectada con avidina/streptavidina (acopladas a algún otro tipo de
marcador). La afinidad avidina/streptavidina-biotina es la más alta conocida la unión
es en la práctica irreversible.
* Fluorocromos (por ejemplo Fluoresceína y Rhodamina). Detección con microscopio
de fluorescencia o espectrofluorímetro.
INMUNOHISTOQUÍCA DE FOSFATASA ALCALINA EN SECCIONES
DE PARAFINA
Material: embriones de ratón
Fijación: Paraformaldehido
Protocolo
Sesión 1
En esta primera sesión realizaremos hasta el paso 6.
1.- Desparafinización del tejido en Xileno 3 veces durante 5 minutos cada
uno de ellas
2.- Hidratación del tejido mediante una cadena decreciente de alcoholes
durante 3 minutos en cada alcohol 100%-90%-80%-70%-50%
3.- Lavar el tejido en PBS durante 5minutos
4.- Incubar las muestras en TENG-T durante 15 minutos
5.- Lavar de nuevo en PBS limpio durante 5 minutos
6.- Añadir el anticuerpo primario diluido en TENG-T durante toda la noche
El paso 7 y 8 será realizado por el becario encargado de las prácticas
7.- Para quitar el exceso de anticuerpo primario lavar en PBS limpio 2 veces
durante 5 minutos cada vez
8.- Añadir el anticuerpo secundario correspondiente diluido en TENG-T e
incubar durante 1 hora y 30 minutos
Sesión 2
En esta última sesión serán realizados todos los pasos. Al final el alumno
tendrá que observar su muestra al microscopio y determinar si la técnica ha
funcionado correctamente así como realizar un pequeño resumen del
marcaje del anticuerpo usado
9.- Retirar el exceso de anticuerpo secundario lavando en PBS 2 veces
durante 5 minutos cada vez
10.- Incubar en una estufa a 55ºC durante 35 minutos para inhibir la
fosfatasa alcalina endógena del tejido
11.- Lavar de nuevo en PBS 2 veces durante 5 minutos
12.- Revelar con NBT/BCIP diluido en NTMT ha una dilución de 1:50 durante
20 minutos
13.- Lavar en PBS
14.- Deshidratar el tejido mediante una cadena creciente de alcoholes de
forma rápida
15.- Poner en Xileno las muestras 3 veces durante 5 minutos cada vez
16.- Pegar el cubre al porta con le tejido para su conservación con medio de
montaje DPX.
Reactivos
PBS
1.- Solución A: 0.5M NaH2PO4
Solución B: 0.5M Na2HPO4
2.- Se añade solución A a la solución B hasta que el pH sea de 7.4 (PB)
3.- Diluimos el PB 5 veces con agua bidestilada para alcanzar una
concentración final de 0.1M
4.- Disolvemos 1.5M NaCl por litro de PB 0.1M (PBS 10x)
5.- para hacer PBS 1x diluimos 10 veces la solución PBS 10x
TENG-T
-10 mM Tris-HCl pH: 8
- 5 mM EDTA pH:8
-150 mM NaCl
-0.25% Gelatina
-0.05% Tween 20
NTMT
-100 mM NaCl
-100 mM Tris-HCl pH: 9.5
-50 mM MgCl2
-0.1% Tween 20
- Agua Bidestilada
-pH Final: 9