1. Fijación en formol lO% en PBS ( tampón fosfato salino) pH 7,2. 2.

PROCESAMIENTO DE CORTES PARA INMUNOHISTOQUIMICA (OPTICO)
1. Fijación en formol lO% en PBS ( tampón fosfato salino) pH 7,2.
2. Cortes de 6µm. Baño a 40oC
3. Pegar los cortes al porta con poli-L-lisina o Silano.
4. Dejar secar toda la noche a 37 oC.
5. Desparafinar : Xileno 30'.
6. Rehidratar - alcohol 100o – 96º - 90º - 80º - 70º - agua destilada.
5'
5'
5’
5’
5’
5’
7. Inhibición de peroxidasa endógena: H2O2 3% en H2O destilada 5'.
8. Lavar en PBS pH 7,4 3’.
9. Digestión dependiendo del antisuero 1io.
10. Lavar en PBS, dependiendo del antisuero 1io 10'.
11. Suero porcino (normal) diluido 1/20 en PBS pH 7,4 más albumina 1% 20'.
12. Quitar el sobrenadante del suero normal y añadir el antisuero 1io, dejar 90’.
13. Lavar en PBS pH 7,4 5'.
14. 1er Puente: biotinilado anti-mouse 30'.
dilución 1/400, en PBS pH 7,4 más albumina al 1%
15. Lavar en PBS 5', quitar exceso de PBS pero dejar el tejido húmedo.
16. 2o Puente: extravidina peroxidasa al 1/800 en PBS pH 7,4 más albumina al 1% 30'.
17. Lavar en PBS 5'.
18. Revelado con DAB (diamino-bencidina); el tiempo varía según el tejido.
19. Lavar en PBS 5'.
20. Pasar por agua destilada 5'.
21. Contrastar con hematoxilina de Harris, meter y sacar rápidamente.
Lavar en agua destilada 10'.
22. Deshidratación, alcohol 70o - 80º - 90o – 96º - 100o – xileno - xileno
5' 5'
5'
5’
5’ 10’
10’
23. Montar.
REACTIVOS
* Suero normal dilución 1/20.
100µl en 2 ml de PBS más albúmina.
* Antisuero 1io 1/200.
* 1er Puente: suero biotinilado 1/400.
* 2o Puente: 1/800.
* Peroxidasa endógena al 3%
3ml H202 en 100ml de agua destilada.
Si se hace digestión con tripsina: tripsina a 0,1 mg en
100ml Cl2Ca (pH 7,8).
* Revelado con DAB: DAB 5mg en 10 ml de PBS pH 7,4 y en el último momento añadir
2 gotas de peroxidasa al 3%.
PBS pH 7,4 para hacer 3 l. Se conserva a tª ambiente:
- KH2PO4 600mg.
- K2HPO4- 3H20 4,5g.
- NaCl 23,2 g.
Digestión: disolver 0,1 mg tripsina en 100ml de Cl2Ca al 1%
pH 7,8 ( con ClH 0,1 N ó 0,2 N).