efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el

EFECTOS
DE
LA
ISATINA
SOBRE
LA
NEUROTRANSMISIÓN DOPAMINÉRGICA EN EL
NÚCLEO ESTRIADO. UN ESTUDIO IN VIVO
MEDIANTE MICRODIÁLISIS CEREBRAL.
Tesis Doctoral
Lorenzo Antonio Justo Cousiño
Vigo 2014
Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud
Facultad de Biología
EFECTOS DE LA ISATINA SOBRE LA
NEUROTRANSMISIÓN DOPAMINÉRGICA EN
EL NÚCLEO ESTRIADO. UN ESTUDIO IN
VIVO MEDIANTE MICRODIÁLISIS
CEREBRAL.
Tesis Doctoral presentada por:
Lorenzo Antonio Justo Cousiño
Vigo, Octubre de 2014
i
ii
La Dra. Lilian Rosana Ferreira Faro y el Dr. Rafael Durán Barbosa,
Profesora Contratada Doctora y Profesor Titular, respectivamente, del
Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud de la
Universidad de Vigo.
Certifican que:
El presente trabajo titulado “EFECTOS DE LA ISATINA SOBRE LA
NEUROTRANSMISIÓN DOPAMINÉRGICA EN EL NÚCLEO
ESTRIADO.
UN
ESTUDIO
IN
VIVO
MEDIANTE
MICRODIÁLISIS CEREBRAL”, presentado por D. Lorenzo Antonio
Justo Cousiño para alcanzar el grado de Doctor por la Universidad de
Vigo, ha sido realizado bajo nuestra dirección. Considerando que se
encuentra concluido, autorizamos su presentación para que pueda ser
juzgado por el Tribunal correspondiente.
Y para que así conste, firmamos el presente en Vigo a 29 de octubre de
2014.
Fdo.
Dra. LILIAN ROSANA FERREIRA FARO
iii
Dr. RAFAEL DURÁN BARBOSA
iv
Si el cerebro humano fuera tan simple que pudiéramos entenderlo, entonces
seríamos tan simples que no podríamos entenderlo.
Emerson M. Pugh
Daría todo lo que sé, por la mitad de lo que ignoro.
René Descartes
A mi familia, porque sin ella nada de esto sería posible.
A Santiago Cousiño, porque siempre será eterno.
En general, a todos mis seres queridos
porque este trabajo lleva un poco de cada uno de ellos.
v
vi
El presente trabajo de investigación fue realizado bajo un
Contrato Predoctoral de la Consellería de Educación de la
Xunta de Galicia, que se engloba dentro de las “Axudas de
apoio á etapa predoutoral do Plan Galego de Investigación,
Innovación e Crecemento 2011-2015 (Plan I2C) para o ano
2011”, publicado en el Diario Oficial de Galicia el 15 de julio
de 2011.
vii
viii
AGRADECIMIENTOS
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
x
Aunque ya pasaron algunos años, aún recuerdo cuando fascinado
visualizaba los primeros cromatogramas desde el primer minuto hasta el
último. Finalizaba el año 2009 y yo me adentraba de lleno en el mundo de
la neuroquímica, de la cirugía extereotáxica, de la microdiálisis, de la
cromatografía, de los domingos y festivos en el laboratorio, de las
revisiones bibliográficas, de los congresos y seminarios, de las vacaciones
que se convierten en valiosos períodos de trabajo, de la docencia
universitaria,… En definitiva, lo que yo denomino un aprendizaje basado
en problemas llevado a su máxima expresión.
Sin embargo, si tuviera que volver a decidir, escogería este mismo
camino por diversos motivos: por las increíbles experiencias que he vivido
a lo largo de estos años (tanto dentro como fuera de la universidad), por
todo lo que he aprendido (y lo muchísimo que aún me falta por aprender),
pero sobre todo por todas esas personas que se han cruzado conmigo a lo
largo de este período y han enriquecido mi vida.
Debido a limitaciones espaciales resulta imposible recordar a cada una
de ellas en este apartado de agradecimiento, aunque a todas las guardo en
mi pensamiento.
En primer lugar, quiero agradecer profundamente a mis directores de
tesis, los doctores Rafael Durán, Miguel Alfonso y Lilian Faro. Gracias
por haberme guiado tan acertadamente en mis comienzos científicos, por
transmitirme con pasión la metodología en la que sois tan duchos, pero
también por permitirme exponer ideas, debatir (y volver a debatir), probar
y aprender por mí mismo. Algunas veces he acertado y en otras no tanto,
pero en todas he aprendido. También tengo que decir que no solo habéis
sido un ejemplo en el plano profesional, sino que además lo habéis sido
en el plano personal, para mí constituís un ejemplo de personas que esta
sociedad tanto necesita.
Es necesario agradecer a todo el equipo de neuroquímica de la
Universidad de Vigo: a las Dras. Iris Machado y Brenda Nunes que me
ayudaron tanto en los inicios, a la Dra. Rosa Carmina por todos sus
consejos y su ayuda en la cromatografía de fluorescencia, a Hanna Tak
por su fantástica compañía en el laboratorio y a todos los que han estado
de forma más puntual por nuestro laboratorio.
xi
De este fantástico equipo de investigación requiere una mención
especial Daniel Fajardo, ya que iniciamos juntos la dura profesión de
investigación. Ha sido un inmejorable compañero en el campo de batalla
y como un hermano en los duros momentos.
También quiero agradecer a todo el equipo docente de la Facultad de
Fisioterapia por enriquecer tanto mi experiencia docente siendo un equipo
tan implicado. Aunque el ambiente de trabajo es excepcional con todos,
quiero citar especialmente al Dr. Manuel Gutiérrez, ya que sin sus
consejos esta tesis no tendría existencia.
A mi familia, gracias básicamente por TODO. Aunque generalmente
se diga que la familia te toca, no se elige, yo considero que en realidad la
familia se forma por el apoyo incondicional, el cariño y la unión. Si
pudiera, yo os volvería a escoger a todos: a mi padre, a mi madre, a mi
hermana, a mi sobrina y a todos mis primos y tíos.
A todos mis amigos, este trabajo va por vosotros, ya que siempre
confiasteis en mí. También a esa persona que durante este tramo final ha
estado conmigo y es capaz de hacerme sonreír siempre.
A la gran familia que forma Os Coribantes, gracias por estar siempre
ahí y por proporcionarme, a través de la música y vuestra amistad, una vía
de escape para todos los problemas.
Quiero agradecer todo el apoyo institucional y financiero recibido por
parte de la Universidad de Vigo, donde destacan la Facultad de Biología
y la Facultad de Fisioterapia, la Xunta de Galicia y el Ministerio de
Educación Cultura y Deporte del Gobierno de España.
xii
ÍNDICE
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
xiv
1. INTRODUCCIÓN………………………………….………………..1
1.1.
NEUROTRANSMISIÓN DOPAMINÉRGICA ................................. 3
1.1.1.
Síntesis de la dopamina ................................................................... 5
1.1.2.
Almacenamiento de la dopamina .................................................... 6
1.1.3.
Liberación de la dopamina .............................................................. 8
1.1.4.
Inactivación de la dopamina ............................................................ 9
1.1.4.1.
Inactivación de la dopamina por medio de la MAO.............. 11
1.1.5.
Receptores dopaminérgicos........................................................... 18
1.1.6.
Sistemas dopaminérgicos .............................................................. 21
1.1.6.1.
1.2.
Los ganglios basales .............................................................. 22
ENFERMEDAD DE PARKINSON ................................................... 29
1.2.1.
Epidemiología de la enfermedad de Parkinson ............................. 30
1.2.2.
Etiopatogenia y diagnóstico de la EP ............................................ 31
1.2.3.
Farmacoterapia antiparkinsoniana ................................................. 36
1.3.
1.2.3.1.
Levodopa (L-DOPA)............................................................. 36
1.2.3.2.
Agonistas dopaminérgicos .................................................... 38
1.2.3.3.
Inhibidores de la catecol-O-metiltransferasa (ICOMT) ........ 40
1.2.3.4.
Inhibidores de la monoamino oxidasa B (IMAO-B) ............. 41
1.2.3.5.
Anticolinérgicos .................................................................... 44
1.2.3.6.
Amantadina ........................................................................... 44
1.2.3.7.
Otros agentes farmacológicos ............................................... 46
ISATINA .............................................................................................. 51
1.3.1.
Antecedentes históricos ................................................................. 51
1.3.2.
Propiedades físico-químicas de la isatina ...................................... 52
1.3.3.
Localización de la isatina .............................................................. 53
xv
1.3.4.
Metabolismo de la isatina .............................................................. 55
1.3.5.
Actividad de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica 60
1.3.6.
Relación entre la isatina y la enfermedad de Parkinson ................ 64
1.3.7.
Otros efectos biológicos de la isatina ............................................ 65
2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS……………………………….71
2.1.
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN .......................................... 73
2.2.
OBJETIVOS ........................................................................................ 79
2.2.1.
Objetivo general ............................................................................ 79
2.2.2.
Objetivos específicos..................................................................... 79
3. MATERIAL Y MÉTODOS………………………….…...………..81
3.1.
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ......................................... 83
3.2.
REACTIVOS Y PATRONES ............................................................ 83
3.3.
MICRODIÁLISIS CEREBRAL ........................................................ 86
3.3.1.
Fundamentos de la técnica ............................................................ 86
3.3.1.1.
Breve reseña histórica y estado actual de la técnica .............. 86
3.3.1.2.
Descripción de la técnica....................................................... 88
3.3.1.3.
Características de la microdiálisis cerebral ........................... 89
3.3.2.
Implantación de la sonda en el núcleo estriado ............................. 91
3.3.3.
Administración de sustancias y recogida de muestras .................. 94
3.3.4.
Rendimiento de las sondas de microdiálisis cerebral .................... 97
3.3.4.1.
Cálculo de la recuperación y administración in vitro ............ 99
xvi
3.4.
ANÁLISIS DE LOS DIALIZADOS: CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)........................................ 102
3.4.1.
Fundamentos de la técnica .......................................................... 102
3.4.1.1.
Breve reseña histórica ......................................................... 102
3.4.1.2.
Descripción de la técnica..................................................... 103
3.4.2.
Equipo cromatográfico ................................................................ 108
3.4.2.1.
Equipo cromatográfico para detección de dopamina y sus
metabolitos …………………………………………………………….108
3.4.2.2.
3.4.3.
Equipo cromatográfico para la detección de aminoácidos .. 109
Condiciones cromatográficas para la determinación de dopamina y
sus metabolitos............................................................................................ 111
3.4.4.
Condiciones cromatográficas para la determinación de aminoácidos
neurotransmisores ....................................................................................... 112
3.5.
DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................ 114
3.5.1.
Efecto de las diferentes concentraciones de isatina..................... 115
3.5.2.
Caracterización de la liberación de dopamina estriatal estimulada
por isatina.................................................................................................... 116
3.5.3.
Mediación de las isoformas de la MAO en el efecto de la isatina
sobre la liberación de dopamina ................................................................. 118
3.5.4.
Efectos de la isatina junto con compuestos con acción
antiparkinsoniana sobre la neurotransmisión dopaminérgica ..................... 119
3.5.5.
Mediación de los receptores glutamatérgicos en el efecto de la
isatina sobre la liberación de dopamina ...................................................... 122
3.5.6.
Mediación del óxido nítrico en el efecto de la isatina sobre la
liberación de dopamina ............................................................................... 123
3.5.7.
Efecto de la isatina sobre aminoácidos neurotransmisores en el
núcleo estriado ............................................................................................ 123
xvii
3.6.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Y TRATAMIENTO
ESTADÍSTICO ............................................................................................. 124
4. RESULTADOS…………………….………...……………………127
4.1.
RESULTADOS CROMATOGRÁFICOS ...................................... 129
4.2.
EFECTO DE LA PERFUSIÓN INTRAESTRIATAL DE ISATINA
SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA ............................................ 131
4.3.
CARACTERIZACIÓN DE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
ESTRIATAL ESTIMULADA POR ISATINA........................................... 134
4.3.1.
Administración de isatina disuelta en un medio Ringer sin Ca++..135
4.3.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con TTX ..................... 137
4.3.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con reserpina .............. 139
4.3.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con nomifensina ........ .141
4.3.5.
Administración de isatina en un medio Ringer con alta
concentración de K+ .................................................................................... 143
4.4.
MEDIACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA MAO EN EL
EFECTO
DE
LA
ISATINA
SOBRE
LA
LIBERACIÓN DE
DOPAMINA .................................................................................................. 145
4.4.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con clorgilina .............. 145
4.4.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con selegilina .............. 147
4.5.
EFECTOS DE LA COADMINISTRACIÓN DE ISATINA Y
COMPUESTOS DE ACCIÓN ANTIPARKINSONIANA ........................ 151
4.5.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con tropolona y
dinitrocatecol .............................................................................................. 152
4.5.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con atropina ................ 156
4.5.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con ropinirol ............... 158
xviii
4.5.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con amantadina ........... 160
4.5.5.
Efecto de la isatina en animales tratados con L-DOPA .............. 162
4.6.
MEDIACIÓN DE LOS RECEPTORES GLUTAMATÉRGICOS
EN EL EFECTO DE LA ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE
DOPAMINA .................................................................................................. 166
4.6.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con AP-5 ..................... 167
4.6.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con MK-801 ............... 169
4.7.
MEDIACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO EN EL EFECTO DE LA
ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA .......................... 171
4.7.1.
Efecto
de
la
isatina
en
animales
tratados
con
L-
NAME…………………………………………………………………….172
4.7.2.
Efecto
de
la
isatina
en
animales
tratados
con
7-
NI………………………………………………………………………… 174
4.8.
EFECTO
DE
LA
ISATINA
SOBRE
AMINOÁCIDOS
NEUROTRANSMISORES EN EL NÚCLEO ESTRIADO ...................... 176
5. DISUSIÓN…..…...............................…………………….………..183
5.1.
EFECTO DE LA PERFUSIÓN INTRAESTRIATAL DE ISATINA
SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA ............................................ 188
5.2.
CARACTERIZACIÓN IN VIVO DE LA LIBERACIÓN DE
DOPAMINA ESTRIATAL ESTIMULADA POR ISATINA ................... 195
5.2.1.
Administración de isatina en un medio Ringer sin Ca++ ............. 199
5.2.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con TTX ..................... 201
5.2.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con reserpina .............. 202
5.2.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con nomifensina ......... 205
5.2.5.
Administración de isatina en un medio Ringer con alta
concentración de K+ .................................................................................... 208
xix
5.2.6.
Sumario de la caracterización de los posibles mecanismos
neuroquímicos de la isatina......................................................................... 210
5.3.
MEDIACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA MAO EN EL
EFECTO
DE
LA
ISATINA
SOBRE
LA
LIBERACIÓN
DE
DOPAMINA .................................................................................................. 211
5.4.
EFECTOS DE LA COADMINISTRACIÓN DE ISATINA Y
COMPUESTOS DE ACCIÓN ANTIPARKINSONIANA SOBRE LA
LIBERACIÓN DE DOPAMINA ................................................................. 218
5.4.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con tropolona y
dinitrocatecol .............................................................................................. 218
5.4.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con atropina ................ 223
5.4.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con ropinirol ............... 225
5.4.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con amantadina ........... 226
5.4.5.
Efecto de la isatina en animales tratados con L-DOPA .............. 227
5.4.6.
Sumario de la coadministración de isatina y compuestos de acción
antiparkinsoniana ........................................................................................ 231
5.5.
MEDIACIÓN DE LOS RECEPTORES GLUTAMATÉRGICOS
EN EL EFECTO DE LA ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE
DOPAMINA .................................................................................................. 232
5.6.
MEDIACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO EN EL EFECTO DE LA
ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA .......................... 235
5.7.
EFECTO
DE
LA
ISATINA
SOBRE
AMINOÁCIDOS
NEUROTRANSMISORES EN EL NÚCLEO ESTRIADO ...................... 237
xx
6. CONCLUSIONES…..…………………………………..………..241
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS….……………..………..245
xxi
xxii
ABREVIATURAS
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
xxiv
3-MT
3-metoxitiramina
6-OHDA
6-hidroxidopamina
7-NI
7-Nitroindazol
ACh
Acetilcolina
AD
Aldehído deshidrogenasa
AMPc
Adenosín monofosfato cíclico
ANOVA
Análisis de varianza
AP-5
Ácido DL-2-Amino-5-fosfatopentanoico
ASP
Aspartato
ATP
Adenosín trifosfato
Ca++
Calcio
CaCl2
Cloruro de calcio
COMT
Catecol-o-metiltransferasa
DA
Dopamina
DAT
Transportador de dopamina
DDC
DOPA descarboxilasa
DMSO
Dimetil sulfóxido
DNC
Dinitrocatecol
DOPAC
Ácido dihidroxifenilacético
EDTA
Ácido etilendiaminotetraacético
EEM
Error estándar de la media
EP
Enfermedad de Parkinson
GABA
Ácido gamma-aminobutírico
GLI
Glicina
GLU
Glutamato
xxv
GMPc
Guanosín monofosfato cíclico
GP
Globo pálido
H3PO4
Ácido fosfórico
HIAA
Ácido 5-hidroxiindolacético
HPLC-EC
Cromatografía de líquidos de alta resolución con detección
electroquímica
HVA
Ácido homovanílico
i.e.
Intraestriatal
i.m.
Intramuscular
i.p.
Intraperitoneal
ICOMT
Inhibidor de la catecol-o-metiltransferasa
IMAO
Inhibidor de la monoamino oxidasa
K+
Potasio
KCl
Cloruro de potasio
KH2PO4
Fosfato potásico
L-DOPA
L-3,4-dihidroxifenilalanina
L-NAME
L-NG-nitroarginina metil-éster
MAO
Monoamino oxidasa
MK-801
Dizolcipina
MPTP
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
Na+
Sodio
NAC
N-acetil-Cisteína
NaCl
Cloruro de sodio
NaOH
Hidróxido de sodio
xxvi
NMDA
N-metil D-aspartato
NO
Óxido nítrico
NOM
Nomifensina
NOS
Sintasa del óxido nítrico
OPA
O-ftalaldehído
RES
Reserpina
SN
Sustancia negra
SNC
Sistema Nervioso Central
SNP
Sistema Nervioso Periférico
SOS
Octano sulfonato sódico
TAU
Taurina
TH
Tirosina hidroxilasa
TTX
Tetrodotoxina
VEJ
Virus de la encefalitis japonesa
VMAT-2
Transportador vesicular de monoaminas-2
xxvii
xxviii
LISTA DE FIGURAS
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
xxx
Figura 1.1: Estructura química de la dopamina ................................................. 3
Figura 1.2: Síntesis y metabolismo de la dopamina......................................... 11
Figura 1.3: Reacción de la desaminación oxidativa realizada por la
monoamino oxidasa (MAO) en el metabolismo de las monoaminas ................ 12
Figura 1.4: Diagramas de cinta de las unidades monoméricas de las dos
isoformas de la monoamino oxidasa (MAO) de humanos ................................ 14
Figura 1.5: Tomografía de emisión de positrones (PET) donde se observan las
regiones de mayor acumulación de inhibidores selectivos e irreversibles de la
MAO marcados con radiotrazadores ................................................................. 16
Figura 1.6: Representación esquemática de la sinapsis dopaminérgica ........... 20
Figura 1.7: Distribución de los grupos neuronales dopaminérgicos en el
cerebro de roedores ........................................................................................... 22
Figura 1.8: Conexiones anatómicas de los ganglios basales ............................ 23
Figura 1.9: Circuito de los ganglios basales en condiciones normales ............ 26
Figura 1.10: Circuito de los ganglios basales en la EP .................................... 28
Figura 1.11: Principales alteraciones neuropatológicas en la EP ..................... 32
Figura 1.12: Representación esquemática del modo de acción de los
principales compuestos antiparkinsonianos ...................................................... 46
Figura 1.13: Algoritmo de tratamiento para la EP ........................................... 49
Figura 1.14: Autorradiograma donde se muestran los sitios de unión de la
[3H]isatina ......................................................................................................... 54
Figura 1.15: Representación esquemática de la formación y degradación de la
isatina ................................................................................................................ 56
Figura 3.1: Secuenciación temporal y eventos en un experimento de
microdiálisis inversa.......................................................................................... 87
Figura 3.2: La sonda de microdiálisis mimetiza la función de un vaso
sanguíneo........................................................................................................... 89
xxxi
Figura 3.3: Procedimiento para la implantación de la cánula-guía y colocación
de la sonda. Presentación histológica de la localización de la sonda de
microdiálisis en el núcleo estriado .................................................................... 93
Figura 3.4: Representación de la sonda de microdiálisis ................................. 94
Figura 3.5: Equipo suministrado por CMA Microdialysis que se empleó en la
experimentación ................................................................................................ 95
Figura 3.6: Cronograma representativo de un experimento de 3 horas de
duración ............................................................................................................. 96
Figura 3.7: Cronograma representativo de un experimento de 4 horas de
duración ............................................................................................................. 96
Figura 3.8: Gráficas proporcionadas por CMA Microdialysis que muestran la
recuperación relativa de las sondas CMA/12 en función de la longitud de la
membrana y en función del flujo aplicado ....................................................... 98
Figura 3.9: Cálculo de la recuperación in vitro y cálculo del paso de sustancias
administradas a través de la membrana ........................................................... 100
Figura 3.10: Voltamograma hidrodinámico de patrones de DOPAC, dopamina
y HVA ............................................................................................................. 109
Figura 3.11: Equipo cromatográfico utilizado en la experimentación ........... 110
Figura 3.12: Esquema general de microdiálisis cerebral y HPLC utilizado en
esta investigación ............................................................................................ 113
Figura 3.13: Cronograma que muestra el protocolo de administración de
isatina en ratas a las que se les administró sistémicamente benserazida y LDOPA .............................................................................................................. 122
Figura 4.1: Cromatograma representativo de patrones de las sustancias
analizadas por medio de HPLC-EC y superposición de cromatogramas de
dializados de muestras experimentales ........................................................... 130
Figura 4.2: Efecto de la perfusión de isatina (1, 5, 10 mM) y DMSO (5%)
sobre los niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA............................ 133
xxxii
Figura 4.3: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) diluida en
un medio Ringer sin Ca++ sobre los niveles estriatales de dopamina, DOPAC y
HVA ............................................................................................................... 136
Figura 4.4: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con TTX
(10 µM) ........................................................................................................... 138
Figura 4.5: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en ratas reserpinizadas ..... 140
Figura 4.6: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
nomifensina (50 µM)....................................................................................... 142
Figura 4.7: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) disuelta en
un medio Ringer con alta concentración de KCl (50 mM) sobre los niveles
estriatales de dopamina, DOPAC y HVA ...................................................... 144
Figura 4.8: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
clorgilina (1 mM) ............................................................................................ 146
Figura 4.9: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
selegilina (1 mM) ............................................................................................ 148
Figura 4.10: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales pretratados con
selegilina (1 mM) ............................................................................................ 150
Figura 4.11: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
tropolona (1 mM) ............................................................................................ 154
Figura 4.12: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
dinitrocatecol (100 µM) .................................................................................. 155
xxxiii
Figura 4.13: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
atropina (1 mM) .............................................................................................. 157
Figura 4.14: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
ropinirol (5 mM) ............................................................................................. 159
Figura 4.15: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con
amantadina (5 mM) ......................................................................................... 161
Figura 4.16: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con LDOPA (25 µM) ............................................................................................... 163
Figura 4.17: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con LDOPA i.p (500 mg/kg) y benserazida i.p. (80 mg/kg) .................................... 165
Figura 4.18: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con AP5 (650 µm) ....................................................................................................... 168
Figura 4.19: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con MK801 (500 µm) ................................................................................................... 170
Figura 4.20: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con LNAME (100 µm) ............................................................................................. 173
Figura 4.21: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina, DOPAC y HVA en animales tratados con 7-NI
(100 µm) .......................................................................................................... 175
Figura 4.22: Cromatograma representativo de patrones de los aminoácidos
analizados y superposición de cromatogramas de dializados de muestras
experimentales................................................................................................. 177
xxxiv
Figura 4.23: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de aspartato ........................................................................ 178
Figura 4.24: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de glutamato ....................................................................... 179
Figura 4.25: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de glicina ............................................................................ 180
Figura 4.26: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de taurina ............................................................................ 181
xxxv
xxxvi
LISTA DE TABLAS
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
xxxviii
Tabla 1.1: Principales sustratos de la monoamino oxidasa (MAO) ................ 13
Tabla 1.2: Principales características físico-químicas de la isatina.................. 53
Tabla 3.1: Listado de los reactivos donde se muestran los compuestos
utilizados, su acción y su procedencia............................................................... 85
Tabla 3.2: Ventajas y limitaciones de la microdiálisis cerebral ...................... 90
Tabla 3.3: Factores que limitan la recuperación in vivo en experimentos de
microdiálisis ..................................................................................................... 97
Tabla 3.4: Porcentaje de recuperación de las sondas utilizadas en esta
investigación .................................................................................................. 101
Tabla 3.5: Resumen de todos los compuestos aplicados, especificando la
concentración utilizada y agrupados según la duración de la experimentación
......................................................................................................................... 114
Tabla 3.6: Protocolo de administración de diferentes concentraciones de isatina
en el núcleo estriado ....................................................................................... 115
Tabla 3.7: Protocolo de administración intraestriatal de isatina disuelta en una
solución Ringer sin Ca++ ................................................................................. 116
Tabla 3.8: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con TTX ....................................................................................... 117
Tabla 3.9: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas sistémicamente con reserpina ...................................................... 117
Tabla 3.10: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
tratadas con nomifensina ................................................................................ 117
Tabla 3.11: Protocolo de administración intraestriatal de isatina disuelta en un
medio Ringer alto K+....................................................................................... 118
Tabla 3.12: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
tratadas con inhibidores de la MAO (clorgilina y selegilina).......................... 118
Tabla 3.13: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con selegilina ............................................................................... 119
xxxix
Tabla 3.14: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
tratadas con inhibidores de la COMT (tropolona y dinitrocatecol) ................. 120
Tabla 3.15: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con atropina .................................................................................. 120
Tabla 3.16: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
tratadas con ropinirol ...................................................................................... 120
Tabla 3.17: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
tratadas con amantadina ................................................................................. 121
Tabla 3.18: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
tratadas con L-DOPA ..................................................................................... 121
Tabla 3.19: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con antagonistas glutamatérgicos NMDA (AP-5 y MK- 801) ..... 122
Tabla 3.20: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con inhibidores de la NOS (L-NAME y 7-NI) ............................. 123
Tabla 3.21: Protocolo de administración intraestriatal de isatina para su
posterior análisis con HPLC fluorimétrica para determinación de aminoácidos
neurotransmisores .......................................................................................... 124
Tabla 4.1: Valores basales (expresado en ng/20 min) para la dopamina, el
DOPAC y el HVA .......................................................................................... 131
Tabla 4.2: Valores basales (expresados en ng/20 min) para el aspartato (ASP),
el glutamato (GLU), la taurina (TAU) y la glicina (GLI) ............................... 176
xl
RESUMEN
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
xlii
La isatina (indol-2,3-diona) es un inhibidor endógeno de la
monoamino oxidasa (MAO) que presenta una amplia variedad de efectos
biológicos. Diversos investigadores han demostrado que la administración
de isatina incrementa los niveles cerebrales de dopamina y se ha
evidenciado que los niveles de isatina en orina aumentan en relación al
grado de severidad de la enfermedad de Parkinson.
Este trabajo de investigación se justifica en base a que existe escasa
experimentación in vivo sobre el efecto de la isatina en la
neurotransmisión dopaminérgica y a que en investigaciones previas se
describieron resultados contradictorios. Además, se desconocen los
mecanismos neuroquímicos por los que actúa la isatina sobre el sistema
dopaminérgico y no se ha descrito la posible interacción neuroquímica de
la isatina con fármacos utilizados en la enfermedad de Parkinson. Por
último, el elevado potencial terapéutico de la isatina como un posible
candidato dentro de la farmacoterapia antiparkinsoniana suscita mayor
interés para su estudio.
El objetivo general de esta tesis doctoral consistió en determinar los
efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo
estriado de ratas conscientes y en libre movimiento. Para ello, se utilizaron
las técnicas de microdiálisis cerebral y cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC).
Inicialmente, se realizó una evaluación dosis-repuesta de la
administración estriatal de isatina. En segundo lugar, se evaluó el
mecanismo por el cual la isatina incrementa los niveles estriatales de
dopamina. Además, se estudió la mediación de las isoformas de la MAO,
de los receptores glutamatérgicos y del óxido nítrico en el efecto de la
isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica estriatal. También se
determinaron los efectos de la coadministración de isatina y compuestos
con acción antiparkinsoniana. Por último, se estudió el efecto de la isatina
sobre aminoácidos neurotransmisores en el núcleo estriado.
Las principales conclusiones de este trabajo de investigación son: La
administración intraestriatal de isatina incrementa de forma
concentración-dependiente la liberación de dopamina en el núcleo
estriado y esta liberación es de tipo exocitótico. Además, en la liberación
de dopamina estimulada por isatina podrían estar involucrados los
receptores de NMDA de glutamato y el óxido nítrico. En la concentración
utilizada en este estudio la isatina también podría producir una inhibición
no selectiva de la MAO. Asimismo, los compuestos con acción
antiparkinsoniana que presentan mejor interacción neuroquímica con la
isatina serían: los inhibidores de la COMT, la amantadina y la L-DOPA.
xliii
xliv
1
INTRODUCCIÓN
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
INTRODUCCIÓN
1.1. NEUROTRANSMISIÓN DOPAMINÉRGICA
La dopamina (DA) o 3,4-dihidroxifeniletilamina es una amina biógena
que pertenece al grupo de las catecolaminas. Está formada por un grupo
catecol (anillo bencénico 3,4 dihidroxilado) unido a un grupo amino en
cadena lateral y es producida a partir del aminoácido tirosina (Figura 1.1).
La dopamina es el neurotransmisor catecolaminérgico más
importante del Sistema Nervioso Central (SNC) que interviene en la
regulación de una gran variedad de funciones como la conducta, la
emotividad, la afectividad y la comunicación neuroendocrina. En el
Sistema Nervioso Periférico (SNP) modula la función cardíaca y renal, el
tono vascular y la motilidad gastrointestinal (Bahena-Trujillo et al. 2000).
Figura 1.1: Estructura química de la dopamina.
La función de los sistemas dopaminérgicos ha sido una temática de
estudio en el campo de las Neurociencias, puesto que alteraciones en la
transmisión dopaminérgica se ha relacionado, directa o indirectamente,
con trastornos severos del SNC, como la enfermedad de Parkinson (EP),
la esquizofrenia y la dependencia de sustancias de abuso (Bahena-Trujillo
et al. 2000; Harsing 2008; Meiser et al. 2013).
3
INTRODUCCIÓN
La dopamina fue sintetizada inicialmente en 1910, antes de que se
descubriera su importancia como neurotransmisor, pero su investigación
fue abandonada al tener bajo efecto periférico sobre la presión sanguínea
en comparación con la adrenalina (Bahena-Trujillo et al. 2000; Harsing
2008; Meiser et al. 2013).
La investigación de la neurotransmisión dopaminérgica se remonta a
la década de 1950, época en la cual destacan los trabajos de Carlsson y
Greengard que les llevaron a ganar el premio Nobel de Medicina y
Fisiología en el año 2000. En la década de 1960 se generaron las primeras
evidencias de la relación entre las alteraciones dopaminérgicas y la EP o
algunos trastornos psiquiátricos, como la esquizofrenia. En la década de
1970 se estudió la distribución de los receptores para este neurotransmisor
y se planteó la existencia de dos familias de receptores dopaminérgicos,
denominadas D1 y D2 que incluyen un total de 5 tipos. En la última década
se utilizaron diferentes estrategias experimentales para el estudio in situ e
in vivo de los sistemas dopaminérgicos, así como para la caracterización
farmacológica y molecular de sus receptores (Bahena-Trujillo et al. 2000;
Harsing 2008; Meiser et al. 2013).
Las neuronas dopaminérgicas representan una pequeña proporción de
la población neuronal total en el SNC (aproximadamente medio millón de
neuronas en humanos, de las cuales un 70% se ubican en la sustancia
negra). Sin embargo, por medio de su alta y divergente ramificación, ese
pequeño número de neuronas puede influenciar amplios territorios
cerebrales. Además, teniendo en cuenta la baja cantidad de neuronas y el
amplio número de funciones en las que interviene, han llevado a postular
a la dopamina como un neuromodulador (Björklund y Dunnet 2007;
Iversen e Iversen 2007; Schultz 2007).
4
INTRODUCCIÓN
Por otra parte, el mecanismo preciso mediante el cual la dopamina
regula la actividad fisiológica en las neuronas estriatales no se entiende
completamente. Los estudios electrofisiológicos sugieren que puede
realizar tanto una acción excitatoria como inhibitoria (Calabresi et al.
2007).
1.1.1.
Síntesis de la dopamina
La dopamina es sintetizada en el citosol de las neuronas
dopaminérgicas a partir de la L-tirosina, aminoácido semiesencial que
puede ser obtenido a través de la dieta o sintetizado en el hígado a partir
de la fenilalanina. La tirosina llega al encéfalo atravesando la barrera
hemato-encefálica utilizando un sistema de transporte específico para
aminoácidos neutros (Harsing 2008; Meiser et al. 2013).
Se pueden considerar dos etapas enzimáticas en la biosíntesis de la
dopamina. En primer lugar, la tirosina es hidroxilada para obtener L-3,4dihidroxifenilalanina (L-DOPA) por medio de la enzima citosólica
tirosina hidroxilasa (TH; EC 1.14.16.2), que utiliza como cofactores el
oxígeno
molecular,
la
tetrahidrobiopterina
(BH4)
y
el
Fe+2.
Posteriormente, la L-DOPA es descarboxilada por medio de la enzima
DOPA descarboxilasa (DDC; EC 4.1.1.28) dando lugar a la dopamina y
utilizando como cofactor el fosfato de piridoxal (Harsing 2008; Meiser et
al. 2013).
Ambas vías enzimáticas están altamente reguladas. Altos niveles de
dopamina inhiben la TH y la DDC, regulando su propia concentración
intracelular, lo que se denomina inhibición por productos finales (BahenaTrujillo et al. 2000; López y Arancibia 2008).
5
INTRODUCCIÓN
Otra forma de control de la síntesis de dopamina es la regulación por
medio de receptores. Aquí podemos encontrar la regulación por medio de
autorreceptores y heterorreceptores.
La
activación
de autorreceptores
ubicados
en la terminal
dopaminérgica, por medio de agonistas dopaminérgicos, inhibe la síntesis
y liberación de dopamina. El receptor que parece estar implicado es el
subtipo D3 que pertenece a la familia D2 (Bahena-Trujillo et al. 2000).
Mediante la activación de otros receptores ubicados en la terminal
dopaminérgica también se puede modular su síntesis. La activación de los
receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) de glutamato estimulan la
actividad de la TH, mientras que la activación de los receptores de ácido
gamma-aminobutírico de tipo B (GABAB) inhiben su síntesis (Volkow et
al. 1996; Bahena-Trujillo et al. 2000).
Además de la clásica vía de biosíntesis se han observado vías
alternativas para la formación de dopamina en roedores. Hallazgos en el
cerebro de ratas in vivo¸ muestran que la tirosina se descarboxila a
tiramina que puede ser hidroxilada por proteínas pertenecientes a la
superfamilia de citocromo P450 (concretamente la familia 2 y subfamilia
D; CYP2D), aunque la contribución de esta vía sobre el total de dopamina
parece ser pequeña. Otra posibilidad sintética es la hidroxilación de
tirosina por medio de la tirosinasa (EC 1.14.18.1), principal fuente de
catecolaminas observada en ratones Knockout para TH (Meiser et al.
2013).
1.1.2.
Almacenamiento de la dopamina
En la terminal presináptica, la dopamina se puede encontrar en tres
depósitos: dos reservorios vesiculares y un reservorio citoplasmático.
6
INTRODUCCIÓN
Una vez formada, la dopamina es almacenada en vesículas por medio
de un transportador de alta afinidad denominado transportador vesicular
de monoaminas-2 (VMAT-2), ubicado en la membrana de las vesículas
(Bahena-Trujillo et al. 2000; Harsing 2008; López y Arancibia 2008;
Meiser et al. 2013).
Este almacenamiento se realiza por medio de una bomba ATP-protón
dependiente que genera un gradiente ácido. En las vesículas se puede
alcanzar una concentración de hasta 500 mM. El almacenamiento
vesicular está presente en alta densidad en las terminales nerviosas. Este
almacenamiento vesicular previene la degradación enzimática y la
generación de estrés oxidativo en el citosol (Bahena-Trujillo et al. 2000;
Harsing 2008; López y Arancibia 2008; Meiser et al. 2013).
En cuanto a los reservorios vesiculares, se describe un reservorio
designado como “liberable”, que está constituido por las vesículas
próximas a la membrana presináptica que liberan el neurotransmisor ante
la llegada del potencial de acción. El otro reservorio vesicular es un gran
almacén inactivo que se comunica con el anterior (Harsing 2008).
El almacenamiento vesicular es muy dinámico y se caracteriza por
tener una pérdida pasiva de dopamina que se fuga del almacenamiento
vesicular. Esta pérdida es contrarrestada activamente por la acción de los
transportadores vesiculares. Debido a ello, parte de la dopamina es
degradada en el citosol de la propia célula que la genera. En condiciones
de reposo, se considera que el metabolismo de la dopamina podría reflejar
más un proceso de fuga pasivo que un proceso activo de exocitosis
seguido de una recaptación neuronal (Eisenhofer et al. 2004; Harsing
2008).
Además, la dopamina está presente en bajas concentraciones en el
citosol donde es susceptible de degradación enzimática. Este reservorio se
7
INTRODUCCIÓN
constituye por la dopamina recaptada del espacio sináptico y la dopamina
que difunde desde las vesículas. Desde este reservorio la dopamina puede
ser liberada por acción inversa del transportador de dopamina (DAT),
puede ser almacenada en las vesículas o ser degradada por enzimas.
Adicionalmente, la dopamina se puede encontrar en la hendidura sináptica
y en el espacio extrasináptico (Harsing 2008).
1.1.3.
Liberación de la dopamina
La liberación de la dopamina se produce principalmente mediante un
proceso de exocitosis dependiente de Ca++, como consecuencia de la
llegada del potencial de acción. El gradiente electroquímico generado por
la entrada de iones Ca++ provoca un debilitamiento de la unión de las
vesículas al citoesqueleto, por medio de la fosforilación de las proteínas
de anclaje (sinapsina I y II). De este modo, la vesícula es transportada a la
zona activa para fusionarse con la membrana celular y liberar su contenido
a la hendidura sináptica. En este proceso se ven involucradas diversas
proteínas: sinaptotagmina, sintaxtina, proteínas asociadas a sinaptosomas
(SNAP-25), factor sensible a N-etilmaleimida (NSF), proteínas de unión
a NSF o SNAPs y otras (Bahena-Trujillo et al. 2000; López y Arancibia
2008).
La liberación de dopamina calcio-dependiente también se denomina
liberación fásica. La dopamina liberada de esta forma es eliminada por
medio del proceso de recaptación, aunque dicho proceso no captura toda
la dopamina. La dopamina que permanece en el espacio extrasináptico
puede ser monitorizada por medio de microdiálisis cerebral (Harsing
2008).
Se puede producir liberación de dopamina independiente de Ca++ por
medio del DAT, que en determinadas condiciones puede operar en sentido
inverso y en vez de introducir dopamina del espacio sináptico la libera del
8
INTRODUCCIÓN
citoplasma (lo que también se denomina liberación tónica). Compuestos
como la anfetamina y sus análogos tras entrar en la terminal
dopaminérgica provocan un descenso de dopamina en el reservorio
citoplasmático, ya que mediante la reversión del transportador esta
dopamina es liberada en la hendidura sináptica (Bannon 2005; Harsing
2008).
La liberación de dopamina está determinada por tres factores:

La descarga espontánea de las neuronas dopaminérgicas.

La capacidad autorregulatoria de las neuronas dopaminérgicas,
que incluyen: la regulación de la liberación, de la síntesis y la
tasa de disparo de las neuronas.

La regulación por medio de las aferencias inhibitorias y
excitadoras mediadas por heterorreceptores en las neuronas
dopaminérgicas. A nivel estriatal, la regulación por medio de
heterorreceptores de glutamato y GABA está bien caracterizada.
Además, la liberación de dopamina puede ser controlada por un gran
número de factores locales como el óxido nítrico (NO) que es liberado por
interneuronas estriatales (Harsing 2008).
1.1.4.
Inactivación de la dopamina
Una vez en la hendidura sináptica, la dopamina interactúa tanto con
receptores pre- como post-sinápticos. Tras haber ejercido su acción en el
terminal sináptico puede seguir tres vías diferentes: ser recaptada hacia el
terminal sináptico (principalmente por el DAT), sufrir degradación
enzimática (por las enzimas monoamino oxidasa, MAO y catecol-ometiltransferasa, COMT) o difundir fuera de la hendidura sináptica
(Bahena-Trujillo et al. 2000; López y Arancibia 2008).
9
INTRODUCCIÓN
El DAT es una proteína transmembrana que pertenece a la familia de
transportadores dependientes de Na+ y Cl-. Se expresa exclusivamente en
neuronas dopaminérgicas. La dopamina es introducida en contra de su
gradiente de concentración utilizando el gradiente de entrada de Na+. La
recaptación de dopamina limita la duración de la acción en los receptores
y su difusión a otras sinapsis. Además, permite el reciclaje y reutilización
de la dopamina no metabolizada. La recaptación es el principal
procedimiento para la inactivación de la dopamina (Bannon 2005; Harsing
2008).
Los principales metabolitos ácidos derivados de la degradación de la
dopamina son: el ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) y el ácido
homovanílico (HVA).
La dopamina es metabolizada por la MAO (EC 1.4.3.4) dando lugar
al dihidrofenilacetaldehído (DOPAL), que al ser muy inestable es
rápidamente oxidado a DOPAC por medio de la aldehído deshidrogenasa
(AD; EC 1.2.1.3). Posteriormente, el DOPAC sale de la neurona y es
captado por la glía donde se ejerce la acción de la COMT (EC 2.1.1.6)
generando HVA. La COMT degrada la dopamina a 3-metoxitiramina (3MT) que por acción de la MAO se transforma en 3-metoxi-4hidroxiacetaldehido (MHPA), transformándose en HVA por medio de la
aldehído deshidrogenasa (Meiser et al. 2013).
En la Figura 1.2 se representa la síntesis y degradación de la dopamina
con las enzimas implicadas.
Alteraciones en los niveles de los metabolitos de la dopamina
(DOPAC y HVA) reflejan cambios en la actividad de la MAO y se utilizan
comúnmente para medir la actividad de la MAO tanto in vivo como in
vitro (Youdim y Bakhle 2006; Harsing 2008).
10
INTRODUCCIÓN
-Enzimas implicadas:
AD: Aldehído deshidrogenasa.
COMT: Catecol-o-metiltransferasa.
DDC: DOPA descarboxilasa.
MAO: Monoamino oxidasa
TH: Tirosina hidroxilasa.
.
Figura 1.2: Síntesis y metabolismo de la dopamina. Abreviaturas: 3-MT, 3Metoxitiramina; AD, aldehído deshidrogenasa; COMT, catecol-o-metiltransferasa;
DDC, DOPA descarboxilasa; DOPAL, dihidrofenilacetaldehído; L-DOPA, L-3,4Dihidroxifenilalanina;
MAO,
Monoamino
oxidasa;
MHPA,
3-metoxi-4-
hidroxiacetaldehído; TH, tirosina hidroxilasa (modificada de Laatikainen et al. 2013).
1.1.4.1.
Inactivación de la dopamina por medio de la MAO
La MAO es una flavoenzima (utiliza como cofactor el dinucleótido de
flavina adenina, FAD) ubicada en la membrana externa mitocondrial que
cataliza la desaminación oxidativa de un amplio número de monoaminas
dando lugar a la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), como se
muestra en la Figura 1.3 (Shih et al. 1999; Edmonson et al. 2007;
Bortolato y Shih 2011).
La importancia de esta enzima se pone en manifiesto con la incipiente
investigación que se ha realizado sobre la misma, de la que se pueden
11
INTRODUCCIÓN
constatar más de 20 000 publicaciones desde el año 1950 (Edmonson et
al. 2007).
Figura 1.3: Reacción de la desaminación oxidativa realizada por la monoamino
oxidasa (MAO) en el metabolismo de las monoaminas. El primer producto de la acción
de la MAO sobre las monoaminas es el correspondiente aldehído, que normalmente se
oxida rápidamente por la aldehído deshidrogenasa (AD) en el ácido carboxílico, que es
el metabolito final excretado. El ciclo FAD-FADH2 genera peróxido de hidrógeno que
requiere inactivación por una catalasa o, en el cerebro, por la glutatión peroxidasa
(Youdim y Bakhle 2006).
Dependiendo de la selectividad por el sustrato y de la sensibilidad al
inhibidor se pueden diferenciar dos isoformas de la MAO (denominadas
MAO-A y MAO-B), que además presentan una distribución anatómica y
una regulación comportamental diferente. Aunque se ha observado en
diferentes especies que ambas presentan una similitud aminoacídica del
70 % y una organización intrón-exón idéntica, en humanos un solo
aminoácido resulta crucial para las variaciones de la especificidad de cada
isoforma (la isoleucina-335 y la tirosina-326, para las isoformas A y B
respectivamente) (Thorpe et al. 1987; Riederer et al. 1987; Edmonson
1995; Binda et al. 2001; Geha et al. 2001; Binda et al. 2003; Ma et al.
2004; Nicotra et al. 2004; Edmonson et al. 2007; Bortolato y Shih 2011).
12
INTRODUCCIÓN
En la Tabla 1.1 podemos observar los principales sustratos de la MAO.
Principales sustratos de la MAO
Indolaminas
Serotonina
Dopamina
Triptamina
Catecolaminas
Noradrenalina
Adrenalina
Otras aminas
Feniletilamina
Tiramina
Tabla 1.1: Principales sustratos de la monoamino oxidasa (MAO) (modificada
de Bortolato y Shih 2011).
La MAO-A está compuesta por 527 aminoácidos, es inhibida
selectivamente por clorgilina y sus sustratos preferentes son la serotonina
(la de mayor afinidad) y la noradrenalina. La MAO-B está compuesta por
520 aminoácidos, es selectivamente inhibida por selegilina (deprenil) y
los sustratos por lo que presenta mayor afinidad son: la feniletilamina y la
benzilamina. Los diagramas de cinta de ambas isoformas se muestran en
la Figura 1.4 (Thorpe et al. 1987; Shih et al. 1999; Geha et al. 2001;
Edmonson et al. 2007; Bortolato y Shih 2011).
13
INTRODUCCIÓN
Figura 1.4: Diagramas de cinta de las unidades monoméricas de las dos
isoformas de la monoamino oxidasa (MAO) de humanos. En la izquierda, la isoforma A
y en la derecha, la isoforma B (Finberg 2014).
Existe controversia sobre la isoforma de la MAO que metaboliza la
dopamina. En términos generales, se considera que la degradación de
dopamina, triptamina y tiramina es mediada por ambas isoformas, pero la
relativa contribución de ambas isoformas parece variar en relación al
tejido y a la especie estudiada. En lo referente a la preferencia a los
sustratos, la dicotomía MAO-A y MAO-B no es absoluta; se solapan
parcialmente en su especificidad y en ausencia de una isoforma la otra
puede metabolizar los sustratos no preferentes como mecanismo
compensatorio (Saura et al. 1996; Binda et al. 2001; Nicotra et al. 2004;
Binda et al. 2007; Bortolato et al. 2008; Olanow et al. 2009a; Bortolato y
Shih 2011).
Ambas isoenzimas se expresan en la mayoría de los tejidos
apareciendo en diferentes ratios, la MAO-A es abundante en fibroblastos
y placenta, mientras que la MAO-B es la única enzima expresada en
14
INTRODUCCIÓN
plaquetas y linfocitos (Thorpe et al. 1987; Nicotra et al. 2004; Bortolato
y Shih 2011).
En el SNC ambas isoenzimas se encuentran en neuronas y células
gliales. Igualmente, las dos isoformas están presentes en diversas regiones
cerebrales, aunque algunas regiones presentan mayor expresión de una
isoforma. La MAO-A está presente principalmente en los cuerpos
celulares de neuronas dopaminérgicas y noradrenérgicas, mientras que la
MAO-B es la única isoforma presente en neuronas serotonérgicas. El
significado de esta ubicación es incierta, ya que la serotonina parece ser
metabolizada
preferentemente
por
la
MAO-A.
Esta
compartimentalización, que parece controvertida, podría ser un
mecanismo para proteger los sustratos específicos de la degradación
enzimática y facilitar una metabolización más selectiva (Thorpe et al.
1987; Saura et al. 1996; Nicotra et al. 2004; Fowler et al. 2005; Bortolato
y Shih 2011).
Otros autores apuntan a que esta localización puede ser debida a un
mecanismo de protección de las neuronas de la estimulación por la
oxidación a aminas extrañas que puedan actuar como falsos
neurotransmisores (Shih et al. 1999) o como mecanismo para prevenir la
acumulación no específica de neurotransmisores (Fowler et al. 2005).
Existen diferencias en la distribución de ambas isoformas de la MAO
entre distintas especies. Aunque la dopamina es considerada un sustrato
no selectivo para ambas isoformas, se considera que el metabolismo
dopaminérgico es llevado a cabo por la MAO-A en roedores, mientras que
en humanos y primates la dopamina es metabolizada principalmente por
la MAO-B (Saura et al. 1996; Fowler et al. 2005; Bortolato et al. 2008;
Bortolato y Shih 2011; Riederer y Laux 2011).
15
INTRODUCCIÓN
En el cerebro humano la isoforma predominante en los ganglios
basales es la MAO-B, que es la isoforma que lleva a cabo el 80% de la
actividad MAO en esta región (Figura 1.5). Sin embargo, se considera que
en ratas ambas isoformas pueden ejercer su función en el estriado para la
degradación dopaminérgica, existiendo una relación 1:1 entre ambas
isoformas (Youdim y Riederer 2004; Factor 2008). Aunque otros autores
indican que el ratio MAO-A/MAO-B en estriado de roedores es de 2:1,
mientras que en primates es 1:10 (Di Monte et al. 1996).
Figura 1.5: Tomografía de emisión de positrones (PET) donde se observan las
regiones de mayor acumulación de inhibidores selectivos e irreversibles de la MAO
marcados con radiotrazadores. En la imagen izquierda se ha inyectado un inhibidor
selectivo de la isoforma A ([11C]clorgilina) y en la imagen derecha se ha inyectado un
inhibidor selectivo de la isoforma B ([ 11C]selegilina). Se puede apreciar mayor
captación del inhibidor de la isoforma B en el cerebro humano (Fowler et al. 2005).
La MAO-B tiene una ubicación predominantemente extraneuronal,
principalmente en astrocitos. El incremento de esta isoenzima con la edad
se ha atribuido a la proliferación de células gliales asociada a la pérdida
neuronal. Este incremento de la MAO-B se considera que causa un
incremento de estrés oxidativo, debido al aumento de H2O2 que puede
interactuar con el hierro libre formando radicales hidroxilo, que pueden
16
INTRODUCCIÓN
dañar ácidos nucleicos, proteínas, lípidos de membrana, lo que conlleva a
la muerte neuronal. Pacientes con EP presentan elevada actividad de la
MAO-B en la sustancia negra. Aunque también se indica que el H2O2
podría presentar funciones de señalización neuronal (Shih et al. 1999;
Nicotra et al. 2004; Fowler et al. 2005; Novaroli et al. 2006; Edmonson
et al. 2007; Factor 2008).
Además, la MAO-B convierte el neurotóxico 1-metil-4-fenil-1,2,3,6tetrahidropiridina
(MPTP)
en
su
metabolito
tóxico
(1-metil-4-
fenilpiridina, MPP+), que selectivamente destruye las neuronas
dopaminérgicas de la sustancia negra causando un parkinsonismo
secundario. Por este motivo y por su capacidad para generar especies
reactivas de oxígeno, se considera que la MAO podría estar involucrada
en la patogénesis de la EP (Thorpe et al. 1987; Shih et al. 1999; Binda et
al. 2001; Ma et al. 2004; Edmonson et al. 2007). Además, se ha observado
que niveles elevados de MAO-B podría inducir apoptosis en células
neuronales y renales (Binda et al. 2001).
Se han descrito diversos inhibidores de la MAO (IMAOs), tanto
selectivos como no selectivos para cada isoforma, como agentes
terapéuticos útiles en diversas enfermedades, desde trastornos afectivos
hasta enfermedades neurodegenerativas. En este último caso, destaca la
aplicación de inhibidores selectivos de la MAO-B en la EP, donde resaltan
la selegilina y la rasagilina; más recientemente se está investigando la
safinamida, que se encuentra en ensayos clínicos fase III (Shih et al. 1999;
Eisenhofer et al. 2004; Youdim et al. 2006; Riederer et al. 2007; López y
Linazasoro 2009; Puy-Núñez y Cebrián-Pérez 2012; Barbosa y Bossoni
2014; Finberg 2014).
El efecto terapéutico de los IMAO-B en la EP se basa en su capacidad
de reducir el metabolismo de la dopamina. De este modo, permiten el
17
INTRODUCCIÓN
incremento del tiempo de permanencia de la dopamina en la sinapsis al
inhibir su principal vía de degradación enzimática. Asimismo, se
comienza a constatar la posibilidad de efectos neuroprotectores de los
IMAO mediante la disminución de estrés oxidativo y radicales libres. Se
han observado niveles elevados de dopamina y disminuidos de sus
metabolitos en cerebros post-morten de pacientes tratados con selegilina.
Además, la inhibición selectiva de esta isoenzima permite evitar los
efectos secundarios de la inhibición de la MAO-A (Shih et al. 1999;
Finberg y Youdim 2002; Eisenhofer et al. 2004; Youdim et al. 2006;
Fernández et al. 2007). Aunque los IMAO-B también pueden presentar
mecanismos neuroprotectores independientes a los de la inhibición de la
MAO (Bortolato et al. 2008).
Por otra parte, también se ha observado que algún inhibidor selectivo
de la isoforma A, como la moclobemida, puede tener efectos
antiparkinsonianos (Bortolato et al. 2008).
A pesar de la larga historia de los inhibidores de la MAO en la
medicina, la forma en la que afectan a la liberación neuronal de
neurotransmisores monoaminérgicos aún requiere mayor investigación
(Finberg 2014).
1.1.5.
Receptores dopaminérgicos
Los receptores de la dopamina pertenecen a la superfamilia de
receptores acoplados a proteínas G. En base a sus características
moleculares se han descrito 5 subtipos de receptores agrupados en 2
familias: la familia D1 y la familia D2. La familia D1 está constituida por
los subtipos D1 y D5; que están acoplados a proteínas Gs y estimulan la
adenilil ciclasa y por tanto incrementan la formación de adenosín
monofosfato cíclico (AMPc). La familia D2 está constituida por los
receptores D2, D3 y D4 y, al contrario que la familia D1, están acoplados a
18
INTRODUCCIÓN
proteínas Gi/o por lo que inhiben la adenilil ciclasa disminuyendo la
formación de AMPc (Figura 1.6).
Existe una diferente distribución neuroanatómica de los distintos
subtipos de receptores dopaminérgicos, siendo el subtipo D1 el más
abundante en el SNC. Las diferencias en su distribución y
comportamiento intracelular permiten a la dopamina ejercer múltiples
funciones fisiológicas (Missale et al. 1998; Nicola et al. 2000; Pivonello
et al. 2007).
Debido al gran número de procesos en los que interviene la dopamina,
se ha estudiado ampliamente el funcionamiento de los receptores
dopaminérgicos, principalmente los que intervienen en las funciones
motrices.
Los tipos de receptores que intervienen principalmente en el control
motor son D1, D2 y D3. La activación del subtipo D1, cuya expresión es
exclusivamente postsináptica, incrementa moderadamente la actividad
motora. El efecto que ejerce la activación de los subtipos D2 y D3 es más
compleja ya que depende de su expresión presináptica y postsináptica. Los
receptores D4 y D5 parecen ejercer poca influencia sobre el control motor
ya que presentan poca expresión en las regiones motoras primarias. Sin
embargo, se considera que la participación de ambas familias de
receptores es necesaria para la actividad motriz (Bealieu y Gainetdinov
2011).
19
INTRODUCCIÓN
Figura 1.6: Representación esquemática de la sinapsis dopaminérgica. La
tirosina se transforma en L-DOPA por la tirosina hidroxilasa (TH) y la DOPA
descarboxilasa convierte la L-DOPA en dopamina. La dopamina puede almacenarse en
vesículas sinápticas para luego liberarse por exocitosis. Una vez liberada, la dopamina
puede unirse a receptores post-sinápticos y autorreceptores, metabolizarse o recaptarse.
La dopamina puede ser metabolizada por la monoamino oxidasa (MAO) o por la
catecol-o-metiltransferasa (COMT). Abreviaturas: 3-MT, 3-metoxitiramina; AMPc,
adenosín monofosfato cíclíco; DAT, transportador de dopamina (modificada de
Blackstone 2009).
20
INTRODUCCIÓN
1.1.6.
Sistemas dopaminérgicos
Los sistemas dopaminérgicos son de gran interés puesto que su
alteración se ha relacionado, directa o indirectamente, con diversos
trastornos que afectan severamente al SNC, observándose alteraciones a
nivel motor, cognitivo, motivacional y de aprendizaje (Bahena-Trujillo et
al. 2000; Schultz 2007).
La principal proporción de neuronas dopaminérgicas en el SNC se
localiza en tres núcleos dopaminérgicos: sustancia negra pars compacta
(SNc), área tegmental ventral y núcleo arqueado. Aproximadamente el
70% de la dopamina cerebral está contenida en el cuerpo estriado (Nicola
et al. 2000; Fernández et al. 2006; Harsing 2008).
Los sistemas dopaminérgicos han sido estudiados principalmente por
técnicas de fluorescencia e inmunocitoquímica. Los grupos neuronales
dopaminérgicos han sido denominados desde A8 hasta A17 atendiendo a
la clasificación elaborada por Dahlström y Fuxe en 1964 (Figura 1.7). Se
pueden describir 3 sistemas dopaminérgicos principales:

Sistemas ultracortos: formados por células dopaminérgicas del bulbo
olfatorio y neuronas interflexiformes de la retina.

Sistemas de longitud intermedia: constituidos por el sistema
tuberohipofisario, con neuronas localizadas en el hipotálamo dorsal y
posterior y el grupo periventricular medular.

Sistemas largos: este grupo incluye las neuronas de la región
retrorubral, del área tegmental ventral y de la sustancia negra pars
compacta. Las principales vías dopaminérgicas centrales de
proyección larga son: la vía nigro-estriatal, la vía mesolímbica y la vía
mesocortical. La vía nigro-estriatal interviene en el control de los
movimientos complejos. La principal aportación de la dopamina al
núcleo estriado la realiza la sustancia negra pars compacta, que
21
INTRODUCCIÓN
además de proyectar hacia el estriado conduce dopamina hasta sus
terminaciones. La disminución de este neurotransmisor en el núcleo
estriado provoca cuadros artrocinéticos como la EP y la corea de
Huntington. Las vías mesolímbica y mesocortical son importantes
para los afectos, las emociones y la motivación (Bahena-Trujillo et al.
2000; Björklund y Dunnet 2007).
Figura 1.7: Distribución de los grupos neuronales dopaminérgicos en el
cerebro de roedores. Se utiliza la nomenclatura propuesta por Fuxe y Dahlström
(Björklund y Dunnet 2007).
1.1.6.1.
Los ganglios basales
Los ganglios basales están constituidos por cinco núcleos
interconectados que se localizan en el telencéfalo basal. Dichos núcleos
son: el caudado, el putamen, el globo pálido, la sustancia negra y el núcleo
subtalámico (Figura 1.8). A pesar de que el caudado y el putamen se
encuentran separados por la cápsula interna, existen diversos puentes de
células que conectan ambos núcleos, que además son similares funcional
y anatómicamente. De hecho, habitualmente ambas estructuras se
22
INTRODUCCIÓN
denominan núcleo estriado (Blandini et al. 2000; Herrero et al. 2002;
Obeso et al. 2008).
Figura 1.8: Conexiones anatómicas de los ganglios basales. Abreviaturas:
GPe, globo pálido externo; GPi, globo pálido interno; SNc, sustancia negra pars
compacta; SNr, sustancia negra pars reticulata (traducido de Lewis et al. 2003).
23
INTRODUCCIÓN
El núcleo estriado es la estructura de mayor tamaño de los ganglios
basales, está compuesto en un 95% por neuronas GABAérgicas espinosas
de tamaño intermedio y es el principal receptor de los ganglios basales,
siendo la mayoría de las conexiones que recibe de carácter excitatorio. A
este núcleo llegan aferencias glutamatérgicas de la corteza, núcleos
talámicos y estructuras límbicas (presenta la mayor densidad de receptores
glutamatérgicos de los ganglios basales). La somatotopía cortical es
preservada en los ganglios basales. Otra aferencia de elevada importancia
que recibe el estriado procede de neuronas dopaminérgicas de la sustancia
negra pars compacta y del área tegmental ventral. La dopamina ejerce una
acción neuromoduladora sobre los impulsos excitatorios que recibe el
estriado (Blandini et al. 2000; Nicola et al. 2000; Herrero et al. 2002;
Fernández et al. 2006; Obeso et al. 2008).
Los ganglios basales utilizan diversos tipos de neurotransmisores.
Podemos observar moléculas pequeñas como la dopamina, noradrenalina,
serotonina, GABA, glutamato y acetilcolina. Este tipo de moléculas son
de efecto rápido y de corta duración, en general del tipo “todo o nada”.
Por otra parte, los péptidos neuroactivos presentes en los ganglios basales
(Sustancia P, encefalina y dinorfina) producen efectos preferentemente de
larga duración y de carácter modulatorio, que suelen estar mediados por
segundo mensajeros. Además, la actividad estriatal es modulada por
moléculas como el óxido nítrico (NO) (Kiss 2000; Fernández et al. 2006).
Habitualmente, la fisiología de las conexiones de los ganglios basales
se explica en base al modelo de la vía directa e indirecta (Figura 1.9). Este
modelo expone que el estriado transmite el flujo de información recibida
de la corteza a los núcleos de salida (la sustancia negra pars reticulata y
el globo pálido interno) por medio de dos vías: una directa y una indirecta.
La activación de una vía u otra conllevaría acciones opuestas sobre el
movimiento: la vía directa lo activa mientras que la indirecta lo inhibe
24
INTRODUCCIÓN
(Blandini et al. 2000; Herrero et al. 2002; Lewis et al. 2003; Rodríguez y
Obeso 2006; DeLong y Wichmann 2007).
La vía directa es monosináptica. Tiene su origen en las neuronas
espinosas GABAérgicas medias que coexpresan sustancia P, dinofirna y
receptores de tipo D1. Su acción es inhibitoria (Lewis et al. 2003;
Rodríguez y Obeso 2006; DeLong y Wichmann 2007).
La vía indirecta es polisináptica. Parte de neuronas GABAérgicas
estriatales que expresan encefalina y receptores de tipo D2. Se proyecta al
globo pálido externo, el cual a su vez envía aferencias GABAérgicas al
núcleo subtalámico, que establece sinapsis con los núcleos de salida
mediante conexiones glutamatérgicas. Por lo tanto su acción es excitatoria
(Lewis et al. 2003; Rodríguez y Obeso 2006).
Los núcleos de salida proyectan mediante sinapsis GABAérgicas a los
núcleos ventral lateral y ventral anterior del tálamo y a los núcleos
troncoencefálicos. Las eferencias talamocorticales proyectan sobre las
áreas sensitivo-motoras de la corteza, cerrando el circuito (Lewis et al.
2003; Rodríguez y Obeso 2006).
Los datos actuales indican que la dopamina probablemente ejerza
múltiple acciones en la fisiología neuronal del núcleo estriado, tanto
inhibiendo como incrementando la actividad neuronal, dependiendo del
nivel de despolarización de la membrana y el estado fisiológico de la
neurona (Calabresi et al. 2007).
25
INTRODUCCIÓN
Figura 1.9: Circuito de los ganglios basales en condiciones normales. Se pueden
observar redes neuronales paralelas que surgen del estriado que conecta e integra
funciones entre los ganglios basales, varias regiones de la corteza cerebral y el tálamo.
En el circuito motor, que se muestra aquí, áreas de la corteza motora proyectan de forma
somatotópica a la región posterolateral del putamen, donde sinaptan por medio de
neuronas excitatorias glutamatérgicas con neuronas medias espinosas del estriado.
Estas neuronas estriatales utilizan ácido gamma-aminobutírico (GABA) como principal
neurotransmisor y sustancia P (SP) o encefalina (Enc) como cotransmisores, están
organizadas en dos vías: la vía directa y la vía indirecta. La vía directa conecta el
estriado el globo pálido interno (GPi) y la sustancia negra pars reticulata (SNr). El GPi
y la SNr son los núcleos de salida de los ganglios basales y proyectan al tronco
encefálico (núcleo pedúnculo-pontino; NPP) y al tálamo. Las conexiones de los núcleos
de salida al tálamo son inhibitorias, mientras que la proyección tálamo-cortical es
excitatoria. La vía indirecta conecta al estriado con los núcleos de salida, pero estas
fibras previamente pasan por el globo pálido externo (GPe) y el núcleo subtalámico
(NST), la salida de estos núcleos es excitatoria (traducido de Lewis et al. 2003).
26
INTRODUCCIÓN
Mediante estudios neuroanatómicos más recientes se ha ampliado la
conceptualización del circuito motor, observándose la existencia de
circuitos transversales que se establecen entre los distintos núcleos o desde
el tálamo, permitiendo cierta autorregulación de la circuitería. Otras
conexiones que han ido adquiriendo relevancia son: conexiones recíprocas
del núcleo pedúnculo-pontino con todos los ganglios basales, una vía
hiperdirecta excitadora desde la corteza motora hasta el núcleo
subtalámico e inervaciones dopaminérgicas extraestriatales desde la SNr
hacia ambos segmentos del globo pálido (Braak y Tredici 2008; Obeso et
al. 2008).
La sintomatología motora de la EP se ha asociado a la pérdida de la
aferencia dopaminérgica en el estriado provocada por la degeneración de
la pars compacta de la sustancia negra. Este proceso neurodegenerativo
causa una reestructuración funcional de esta circuitería que se traduce en
un incremento de las eferencias GABAérgicas de los ganglios basales, lo
que explicaría la bradicinesia (Figura 1.10) (Blandini et al. 2000; Herrero
et al. 2002; Lewis et al. 2003; DeLong y Wichmann 2007).
27
INTRODUCCIÓN
Figura 1.10: Circuito de los ganglios basales en la EP. La pérdida de dopamina va
a provocar alteraciones en el circuito motor, que presentarán como resultante una fuerte
influencia inhibitoria de los núcleos de salida sobre el tálamo. Esto provocará una
disminución de las excitaciones del tálamo a la corteza, lo que clínicamente se manifiesta
como bradicinesia. La influencia que recibe el núcleo pedúnculo-pontino (NPP) de los
ganglios basasles alterados puede contribuir a las alteraciones de la marcha.
Abreviaturas: Enc, encefalina; GABA, ácido gamma-aminobutírico; GPe, globo pálido
externo; GPi, globo pálido interno; SNc, sustancia negra pars compacta, SNr, sustancia
negra par reticulata; SP, sustancia P; NST, núcleo subtalámico (traducido de Lewis et
al. 2003).
28
INTRODUCCIÓN
1.2. ENFERMEDAD DE PARKINSON
La EP recibe su nombre de James Parkinson, un médico inglés que en
1817 publicó una obra titulada “Un ensayo sobre la parálisis agitante”,
donde describe esta patología a través de 6 casos clínicos (Parkinson
2002).
La
EP
es
un
trastorno
neurodegenerativo
progresivo
que
patológicamente se caracteriza por la degeneración de las neuronas
dopaminérgicas de las sustancia negra pars compacta (Wirdefeldt et al.
2011; Fritsch et al. 2012; Gazewood et al. 2013).
La etiología de este trastorno es desconocida, aunque estudios
recientes señalan tanto la implicación de factores ambientales como la
predisposición genética (Fernández 2012; Fritsch et al. 2012).
Las principales características clínicas, que suponen el eje
fundamental para el diagnóstico de la EP, son las alteraciones motoras
(síntomas cardinales): temblor en reposo, rigidez, bradicinesia y
alteraciones posturales, que se asocian a una respuesta positiva a LDOPA. Sin embargo, la EP no produce exclusivamente alteraciones
motoras sino que se observa una afectación multisistémica con cambios
cognitivos, neuropsiquiátricos y síntomas relacionados con trastornos en
el SNA (Jankovic 2008; Sesar 2009; Fernández 2012; Fritsch et al. 2012;
Mulero et al. 2012; Gazewood et al. 2013).
La EP afecta principalmente a adultos mayores y presenta un curso de
carácter crónico e irreversible, por lo que la búsqueda de una intervención
que consiga ralentizar o frenar el transcurso de la enfermedad resulta de
vital importancia. De momento no se ha alcanzado un tratamiento
curativo, pero tanto el tratamiento farmacológico como no farmacológico
29
INTRODUCCIÓN
ha mejorado sustancialmente la calidad de vida de los pacientes
(Katzenschlager 2014).
1.2.1.
Epidemiología de la enfermedad de Parkinson
La EP es la segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente,
después de la enfermedad de Alzheimer. Lo que conlleva un importante
impacto en la calidad de vida de los pacientes así como en los cuidadores,
además de suponer un importante gasto sanitario.
Los estudios epidemiológicos de la EP presentan una serie de
limitaciones, ya que existen diferencias metodológicas, genéticas y
ambientales en las diversas poblaciones estudiadas. A nivel metodológico
las principales variaciones son: distintos criterios diagnósticos
(principalmente clínico), diferente edad de estudio y métodos de selección
de casos (Abasolo-Osinaga et al. 2006; Wirdefeldt et al. 2011; GarcíaRamos et al. 2013).
Aunque existe variabilidad entre los diferentes estudios, en términos
generales se considera un incidencia anual mundial que varía de 1,5-22
pacientes/ 100 000 habitantes por año. Estimaciones más precisas en las
que se comparan estudios con metodología similar muestran un incidencia
de 17/ 100 000 habitantes por año, con un pico de incidencia máxima en
la década de los 70 años y con un ligero predominio del sexo masculino.
La prevalencia mundial varía entre 167- 5703 por 100 000 habitantes,
aunque estudios menos estrictos establecen una prevalencia de 100-300
casos por 100 000 habitantes.
Actualmente, en España se estima que existen más de 300 000
pacientes con EP, lo que puede llegar a suponer un gasto económico hasta
más de 17 000 euros por paciente y en estos pacientes la mortalidad
aumenta casi al doble (Wirdefeldt et al. 2011; García-Ramos et al. 2013).
30
INTRODUCCIÓN
La Asociación Europea de la Enfermedad de Parkinson en su segunda
declaración de consenso (2012) indica que existen más de 1,2 millones de
personas que padecen EP en Europa y el gasto económico anual se
establece en 13,9 billones de euros.
Considerando los estudios de prevalencia, algunos autores estiman
que en el año 2030 la cifra de pacientes de EP se duplicará, alcanzándose
una cifra que oscila entre 8,7 y 9,3 millones de casos en el oeste europeo
y en los países más poblados (Dorsey et al. 2007).
1.2.2.
Etiopatogenia y diagnóstico de la enfermedad de
Parkinson
La etiología de la EP no se comprende completamente, es de carácter
multifactorial involucrando tanto factores genéticos, como ambientales
(Wirdefeldt et al. 2011; Fernández 2012).La patogenia de la EP se
considera que es un proceso formado por una compleja cascada de eventos
que culminan en la muerte celular por medio de la vía apoptótica (Jenner
y Olanow 2006; Olanow et al. 2009a).
El principal cambio patológico que destaca en la EP es la afectación
de la neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta, con
la consecuente pérdida de dopamina estriatal (Figura 1.11). La
degeneración de la sustancia negra pars compacta provoca las principales
alteraciones motoras observadas en la EP, lo que es la base diagnóstica de
este patología (Jenner y Olanow 2006; Wirdefeldt et al. 2011;
Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
31
INTRODUCCIÓN
Figura 1.11: Principales alteraciones neuropatológicas en la EP. En la sección de
la izquierda se muestra una sección transversal a nivel de la sustancia negra de un sujeto
sano (superior) y de un paciente con EP (inferior) donde se puede apreciar la reducción
del pigmento de neuromelanina en la sustancia negra pars compacta (SNc). En la
sección central se puede observar la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SNc de
un paciente de EP (inferior) en comparación con una muestra de sujeto sano. La sección
de la derecha muestra una neurona dopaminérgica que presenta cuerpo de Lewy
(Olanow et al. 2009a).
Este proceso degenerativo involucra diversos mecanismos:

Estrés oxidativo y nitrosativo: El origen de los radicales de oxígeno se
considera que deriva de cambios bioquímicos indirectos, como
incremento de los niveles de Fe+2 y alteración de los mecanismos
antioxidantes. La generación de las especies de nitrógeno se relaciona
con alteraciones en la actividad de la óxido nítrico sintasa (NOS; EC
1.14.13.39).

Excitotoxicidad:
La
evidencia
que
apoya
la
hipótesis
de
excitotoxicidad se basa en la hiperactividad de la salida glutamatérgica
del núcleo subtalámico y el incremento de tinción para 3-nitrotirosina
en los cuerpos de Lewy.
32
INTRODUCCIÓN

Inflamación: la respuesta inflamatoria puede ser debida a diversas
causas. Se ha observado que la ingesta regular de aspirina y otros
atiinflamatorios no esteroideos (AINES) disminuye el riesgo de
padecer EP.

Disfunción mitocondrial: Se han observado alteraciones en el
complejo I mitocondrial y en la alfa-cetoglutarato deshidrogenasa. Se
ha propuesto un origen tóxico y mecanismos genéticos para esta
disfunción.

Proteólisis alterada: existen diversas evidencias que apoyan que la
proteólisis alterada contribuye a la muerte neuronal de las neuronas
nigrales y a la formación de los cuerpos de Lewy.
Aunque se desconoce cómo interactúan estos mecanismos y la
implicación de cada uno de ellos en la generación de la EP (Jenner y
Olanow 2006; Wirdefeldt et al. 2011).
Generalmente en la patogénesis de la EP se describe la existencia de
una vulnerabilidad selectiva de la vía nigro-estriatal, considerando
únicamente la afectación de los sistemas dopaminérgicos. Este abordaje
puede resultar útil a nivel práctico, pero es necesario tener en cuenta que
la EP es un trastorno que produce una afectación multisistémica y donde
otros sistemas de neurotransmisores se ven involucrados. Los cambios
patológicos
también
incluyen
degeneración
en
las
neuronas
noradrenérgicas del locus coeurulus, neuronas colinérgicas del núcleo
basal de Meynert, neuronas serotonérgicas del rafe dorsal, células
nerviosas del sistema olfatorio, núcleo pedúnculo pontino, núcleo motor
dorsal del nervio vago y el sistema nervioso autónomo (Hardy y GwinnHardy 1998; Jenner y Olanow 2006; Olanow et al. 2009a; Mulero et al.
2012). Todos estos cambios podrían explicar la sintomatología, tanto
33
INTRODUCCIÓN
motora como no motora, que no responden a la farmacología
dopaminérgica (Jenner y Olanow 2006).
El proceso neurodegenerativo de la EP comienza años antes de que se
produzcan las manifestaciones motoras, lo que se denomina período
premotor o preclínico. Las estimaciones iniciales indicaban que existía un
período preclínico de 5 o 6 años, basado en hallazgos neuropatológicos en
la sustancia negra y estudios de imagen de la dopamina estriatal (Sesar
2009; Savica et al. 2010).
La presencia de cuerpos de Lewy y los estudios epidemiológicos de
manifestaciones no motoras sugieren que el período preclínico se extiende
hasta 20 años antes de las manifestaciones motoras. En esta fase
premotora, las manifestaciones no motoras con las que se ha asociado la
EP son: estreñimiento, alteraciones del sueño REM, ansiedad y anemia.
La pérdida de olfato y la depresión también preceden a las alteraciones
motoras, pero en un período más corto de tiempo. Además, esta
sintomatología persiste en períodos posteriores de la enfermedad y puede
llegar a ser tan discapacitante como la motora (Savica et al. 2010;
Wirdefeldt et al. 2011; Fernández 2012; Mulero et al. 2012; Sprenger y
Poewe 2013).
Las manifestaciones motoras son la base para el diagnóstico de la EP.
Estas manifestaciones extrapiramidales están presentes cuando la pérdida
neuronal de la sustancia negra pars compacta es del 60-70% y la pérdida
de dopamina en el estriado alcanza el 80% (Jankovic 2008; Sesar 2009;
Wirdefeldt et al. 2011; Fernández 2012; Tsai y Yuan 2012; Gazewood et
al. 2013).
Los síntomas que sirven de guía para el diagnóstico de la EP son:
temblor, rigidez y bradicinesia. La alteración de reflejos posturales
también es característica, pero no está presente en los períodos iniciales
34
INTRODUCCIÓN
(Jankovic 2008; Sesar 2009; Olanow et al. 2009a; Wirdefeldt et al. 2011;
Fernández 2012).
El temblor se caracteriza por ser un temblor de reposo, que se aprecia
cuando el paciente tiene la extremidad relajada y desaparece con el
movimiento. Presenta un comienzo insidioso y asimétrico, generalmente
se inicia en una extremidad superior y posteriormente se extiende a la
extremidad inferior del mismo lado. La frecuencia con la que se tiembla
es de 4-6 Hz (Jankovic 2008; Sternberg et al. 2013).
La rigidez consiste en un aumento del tono muscular que se caracteriza
por una resistencia ante la movilización pasiva de un segmento. Esta
rigidez se denomina en tubo de plomo puesto que es constante en todo el
recorrido y si se combina con temblor se produce el fenómeno de rueda
dentada (Sesar 2009; Solopova et al. 2014).
La bradicinesia consiste en un enlentecimiento generalizado de las
funciones motoras, es el síntoma más incapacitante de la EP. En las
primeras fases se manifiesta como dificultad para realizar movimientos de
precisión o alteración de la marcha; con el desarrollo de la EP se puede
observar escasez de parpadeo, trastornos de deglución, hipomimia facial,
hipofonia y bradilalia (Jankovic 2008; Daneault et al. 2013).
Los criterios habitualmente utilizados para el diagnóstico de la EP se
basan en los criterios del UK Parkinson´s Disease Society Brain Bank.
Para el diagnóstico de la EP debe estar presente la bradicinesia y al menos
alguno de los siguientes síntomas: rigidez, temblor de reposo a 4-6 Hz o
inestabilidad postural. Se requieren al menos 3 de los siguientes criterios
adicionales para EP definitivo: inicio unilateral, temblor de reposo,
afectación progresiva, asimetría persistente, respuesta excelente a LDOPA, corea grave inducida por L-DOPA, respuesta a L-DOPA al menos
durante 5 años y curso clínico de diez años o más (Jankovic 2008; Sesar
35
INTRODUCCIÓN
2009; Gazewood et al. 2013). También se utilizan los criterios propuestos
por Gelb et al. (1999), que agrupa los hallazgos característicos de la EP
(temblor de reposo, bradicinesia, rigidez e inicio asimétrico) y los
hallazgos sugerentes de un diagnóstico alternativo.
De todos modos, actualmente, la confirmación definitiva de la EP se
realiza por medio de análisis histopatológico post mortem (Jankovic 2008;
Sesar 2009).
1.2.3.
Farmacoterapia antiparkinsoniana
La farmacología antiparkinsoniana actual va enfocada a un abordaje
sintomatológico de la EP que permita mejorar la calidad de vida del
paciente. En este momento no se dispone de un tratamiento que modifique
el transcurso de la enfermedad (Tsai y Yuan 2012; Conolly y Lang 2014).
La L-DOPA es considerada el compuesto más efectivo para el
tratamiento de los síntomas motores de la EP, aunque en muchos casos se
inicia el tratamiento con otros compuestos para evitar las complicaciones
motoras relacionadas con la levodopaterapia (Factor 2008; Tsai y Yuan
2012; Sprenger y Poewe 2013; Conolly y Lang 2014).
1.2.3.1.
Levodopa (L-DOPA)
La L-DOPA es el principal compuesto para el tratamiento de la EP. Es
un aminoácido aromático, precursor de la dopamina natural. Cuando es
administrada oralmente se absorbe en el intestino delgado y presenta una
vida media de 90 minutos (Riederer et al. 2007; Tabernero 2009; PuyNúñez y Cebrián-Pérez 2012; Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
Normalmente se administra L-DOPA con inhibidores de la DDC para
reducir su metabolismo periférico y evitar los efectos adversos. De este
modo, su metabolización es principalmente central, ya que ejerce su
36
INTRODUCCIÓN
acción una vez transformada en dopamina. Los inhibidores de la DDC
disponibles en el mercado son la benserazida y la carbidopa (Tabernero
2009; Puy-Núñez y Cebrián-Pérez 2012; Pagonabarraga y Kulisevsky
2014).
Una vez que la L-DOPA atraviesa la barrera hematoencefálica,
mediante un sistema transportador de aminoácidos neutros, es captada por
las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta, donde
es convertida a dopamina y posteriormente liberada en todas aquellas
regiones
cerebrales
inervadas
por
las
vías
nigroestriatal
y
mesolímbicocortical (Riederer et al. 2007; Puy-Núñez y Cebrián-Pérez
2012; Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
El nivel de evidencia que ha mostrado el tratamiento con L-DOPA es
fuerte (nivel A) y sigue considerándose como el tratamiento
dopaminérgico más eficaz para la mejoría de la sintomatología motora de
la EP, con un grado de recomendación A (Tabernero 2009; Pagonabarraga
y Kulisevsky 2014).
Debido a la precoz aparición de complicaciones motoras derivadas del
tratamiento en monoterapia con dosis medio-altas de L-DOPA, en
pacientes con una edad de inicio por debajo de los 60 años se ha
consensuado el comienzo con agonistas dopaminérgicos e IMAO (Tsai y
Yuan 2012; Conolly y Lang 2014).
El tratamiento con L-DOPA se ha relacionado principalmente con el
desarrollo de discinesias. Debido a la corta vida media de este compuesto
se generan picos y valles de estimulación dopaminérgica en los ganglios
basales (liberación pulsátil). Prácticamente todos los pacientes tratados
con dosis altas y de larga evolución (más de 10 años) presentan
fluctuaciones motoras o discinesias (Factor 2008; Tabernero 2009;
Sprenger y Poewe 2013; Tsai y Yuan 2012; Conolly y Lang 2014).
37
INTRODUCCIÓN
Con el objetivo de reducir las complicaciones asociadas con la
administración oral de L-DOPA, en los últimos años se ha comenzado a
practicar la infusión continua de L-DOPA/carbidopa intraduodenal
(Duodopa®) en pacientes con EP avanzada. Mediante la administración
intraduodenal se pretende evitar las complicaciones motoras derivadas de
las fluctuaciones en plasma de los niveles de L-DOPA (Valldeoriola y
Yáñez 2009; Hickey y Stacy 2011; García et al. 2012).
A causa de la paulatina pérdida neuronal que se produce en la EP,
existe una pérdida de efecto en el tratamiento con L-DOPA, ya que este
compuesto requiere ser captado por las neuronas dopaminérgicas de la
sustancia negra (Riederer et al. 2007; Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
1.2.3.2.
Agonistas dopaminérgicos
Los agonistas dopaminérgicos son fármacos capaces de activar los
receptores dopaminérgicos postsinápticos, presentando cada agonista una
afinidad diferente por cada subtipo de receptor. Aunque se desconoce la
relevancia clínica de la afinidad de cada compuesto, algunos autores
postulan como más relevantes los de la familia D2 (Tsai y Yuan 2012).
La evidencia preclínica sugiere que la estimulación de receptores de
la familia D1 y D2 proporcionaría mejores efectos que la estimulación de
un tipo solo. Sin embargo, los estudios clínicos demuestran que la
estimulación simultánea de D1 y D2 no es mayor que estimulación sola
sobre D2 (Riederer et al. 2007).
Los agonistas dopaminérgicos se dividen en derivados ergóticos
(pergolida y cabergolina) y no ergóticos (pramiprexol, ropinirol,
rotigotina y apomorfina). Debido a los efectos secundarios de los
derivados ergóticos (serositis y valvulopatía cardíaca), en la práctica
38
INTRODUCCIÓN
clínica se utilizan los agonistas no ergóticos (Factor 2008; Tsai y Yuan
2012; Sprenger y Poewe 2013).
La inclusión de los agonistas dopaminérgicos en las guías de EP se
realizó con la finalidad de disminuir el desarrollo de las complicaciones
motoras del tratamiento mantenido de L-DOPA en monoterapia
(Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
La inclusión de estos agonistas ha permitido una importante
disminución del desarrollo de complicaciones motoras derivadas de la LDOPA. Este efecto deriva de que los agonistas dopaminérgicos presentan
una vida media más larga y de la disminución en los requerimientos totales
de L-DOPA. Además, aunque exista neurodegeneración pueden estimular
los receptores postsinápticos intactos (Factor 2008; Boll et al. 2011;
Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
Todos los agonistas han mostrado ser eficaces sobre los síntomas
motores, tanto en monoterapia en fases iniciales, como combinados en
fases medias y avanzadas, aunque el beneficio motor es mayor en
combinación con L-DOPA. Sin embargo, no se han observado resultados
positivos en los estudios que analizaron el posible efecto neuroprotector
de este grupo farmacológico (Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
Actualmente, se están diseñando diferentes formulaciones de
agonistas dopaminérgicos que permitan una liberación prolongada para
mantener una concentración plasmática estable: ropinirol de liberación
prolongada, pramipexol retardado, parches transdérmicos de rotigotina y
apomorfina subcutánea (Arbelo y Malo 2011; Sprenger y Poewe 2013).
El principal inconveniente de los agonistas dopaminérgicos es el
amplio espectro de efectos secundarios asociados. Además de los efectos
gastrointestinales, los agonistas dopaminérgicos presentan efectos
39
INTRODUCCIÓN
secundarios sistémicos (edemas en extremidades, hipersomnolencia
diurna e hipotensión ortostática) y de la esfera neuropsiquiátrica
(alucinaciones, ideación delirante y agitación psicomotriz), que pueden
ser graves, discapacitantes e incluso perdurar tras la retirada del
tratamiento (Factor 2008; Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
1.2.3.3.
Inhibidores de la catecol-O-metiltransferasa (ICOMT)
La L-DOPA es metabolizada en la periferia principalmente por la
DDC y la COMT. Cuando la DDC es inhibida por la administración
conjunta de L-DOPA con benserazida o carbidopa, el papel de la Ometilación es más importante. La COMT inactiva tanto a la L-DOPA
como a la dopamina en el SNC, mientras que la inactivación periférica de
la COMT incrementa la vida media periférica de la L-DOPA (Oertel et al.
2006; Mendoza y Duarte 2009).
Los ICOMT bloquean la conversión periférica de la L-DOPA en 3-Ometildopa, lo que conlleva a un aumento de la disponibilidad sináptica de
la L-DOPA y permite que esta mantenga su funcionalidad durante más
tiempo (Factor 2008; Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
Los ICOMT incrementan la concentración máxima alcanzada por cada
toma de L-DOPA por lo que se reduce el riesgo de aumentar las
discinesias de pico de dosis.
Los ICOMT que se han utilizado en la práctica clínica son la tolcapona
y la entacapona, presentando una mayor capacidad de atravesar la barrera
hematoencefálica la tolcapona (Castro y Campos 2009; Mendoza y Duarte
2009; Pagonabarraga y Kulisevsky 2014). Estos compuestos están
indicados para el tratamiento de las fluctuaciones motoras de la EP.
40
INTRODUCCIÓN
La tolcapona por su mayor capacidad de atravesar la barrera
hematoencefálica ha resultado ser más eficaz. Sin embargo, su utilización
se ha limitado debido a la hepatotoxicidad que genera, su uso fue
suspendido desde 1998 a 2009 (Factor 2008; Mendoza y Duarte 2009;
Gazewood et al. 2013).
Ambos ICOMT se han mostrado eficaces para disminuir las
complicaciones asociadas al uso de la L-DOPA. Sin embargo, en estudios
clínicos no pudo demostrarse un beneficio preventivo sobre las
fluctuaciones motoras al incluir entacopna en el tratamiento con L-DOPA
y carbidopa. Por tanto, los ICOMT se limitan al tratamiento de las
fluctuaciones motoras (Castro y Campos 2009; Mendoza y Duarte 2009;
Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
1.2.3.4.
Inhibidores de la monoamino oxidasa B (IMAO-B)
La dopamina es metabolizada por ambas isoformas de la MAO, pero
se ha centrado la atención en los inhibidores de la isoforma B como
agentes terapéuticos, ya que es la isoforma predominante en los ganglios
basales en humanos y sus niveles se encuentran incrementados en
pacientes con EP (Riederer et al. 2007; Factor 2008; López y Linazasoro
2009).
Los IMAO-B impiden la oxidación de la dopamina incrementando la
biodisponibilidad de dopamina en el SNC. La MAO-B controla tanto la
concentración intraneuronal de dopamina libre como sus reservorios
citoplasmáticos. Dentro de los IMAO-B utilizados en clínica para la EP
encontramos la selegilina y la rasagilina. Un tercer compuesto de este
grupo, la safinamida, aún se encuentra en fase III de ensayos clínicos
(Riederer et al. 2007; López y Linazasoro 2009; Puy-Núñez y CebriánPérez 2012).
41
INTRODUCCIÓN
La selegilina demostró un efecto sintomático sobre la clínica motora
de la EP, tanto en pacientes iniciales administrada en monoterapia como
en pacientes avanzados. La principal problemática de la selegilina es que
se metaboliza a derivados anfetamínicos, por lo que se asocia con
insomnio y trastornos conductuales (Olanow et al. 2009a; Pagonabarraga
y Kulisevsky 2014).
En cuanto a las recomendaciones con respecto a la selegilina, se
considera que retrasa la incapacidad asociada a la fase precoz no tratada
de la EP, pero aún no se ha determinado el mecanismo exacto por el cual
lo hace (efecto neuroprotector, sintomático o ambos). La selegilina
permite retrasar la introducción de L-DOPA en la EP inicial y presenta
una eficacia leve-moderada sobre la clínica de la EP (López y Linazasoro
2009).
Por otra parte, la rasagilina es un inhibidor selectivo e irreversible de
la MAO-B. Esta pertenece a la familia de las propalgilaminas (siendo la
más potente) y a diferencia de la selegilina no se metaboliza a derivados
anfetaminínicos, además de presentar una mayor potencia y selectividad.
El principal metabolito de la rasagilina es el aminoindano, que presenta
capacidades antiparkinsonianas y neuroprotectoras por sí mismo. El
efecto neuroprotector de la rasagilina parece asociarse al aminoindano que
actúa a nivel de la permeabilidad mitocondrial y de la gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Olanow et al. 2009b; López y
Linazasoro 2009; Hickey y Stacy 2011; Pagonabarraga y Kulisevsky
2014).
La rasagilina ha mostrado ser un compuesto eficaz en el manejo motor
de la EP, tanto en monoterapia como en combinación con otros
compuestos antiparkinsonianos (López y Linazasoro 2009; Boll et al.
2011; Pagonabarraga y Kulisevsky 2014).
42
INTRODUCCIÓN
Una de las características destacables de la rasagilina es que es el único
fármaco que ha demostrado un efecto modificador del curso evolutivo de
la EP en dos ensayos clínicos, lo que ha generado nuevamente interés en
este grupo farmacológico. Además, en algún ensayo se han observado
mejorías cognitivas (atención mantenida, fluencia verbal y memoria de
trabajo) (López y Linazasoro 2009; Boll et al. 2011; Hickey y Stacy 2011;
Katzenschlager 2014). También se ha asociado con actividad
antiapoptótica (Olanow y Schapira 2013).
Por último, la safinamida es un nuevo IMAO que además de la
inhibición enzimática produce inhibición de la recaptación de dopamina,
bloquea los canales de sodio e inhibe la liberación de glutamato. Por estas
características se considera que podría presentar efecto neuroprotector y
efecto sobre las discinesias inducidas por L-DOPA (Olanow et al. 2009a;
Boll et al. 2011; Hickey y Stacy 2011; Barbosa y Bossoni 2014).
Las características que diferencian a la safinamida de la selegilina y la
rasagilina son: es más selectiva para la MAO-B que ambas y su acción es
reversible. Por tanto, en un principio, se puede considerar un fármaco más
seguro que los otros en cuanto a los efectos secundarios de la inhibición
de la MAO-B. Los últimos estudios muestran que la safinamida tiene
efecto antiparkinsoniano, presenta buena tolerancia y mejora las
discinesias inducidas por L-DOPA. Su efecto neuroprotector requiere más
estudios (Barbosa y Bossoni 2014).
Es necesario tener en cuenta que la limitada eficacia sintomática de la
selegilina y la rasagilina en monoterapia se encuentra relacionada con el
hecho de que los IMAO-B son dependientes de la dopamina endógena,
que progresivamente disminuye con el transcurso de la patología
(Riederer et al. 2007).
43
INTRODUCCIÓN
1.2.3.5.
Anticolinérgicos
Los compuestos anticolinérgicos fueron el primer tratamiento eficaz
para la EP, pero dejaron de utilizarse tras la entrada de los agonistas
dopaminérgicos
y
la
L-DOPA.
Actualmente,
los
fármacos
anticolinérgicos se consideran marginales en el tratamiento de la EP y no
se recomienda su uso salvo en casos excepcionales de temblor intenso
resistente a otros tratamientos. Aunque pueden resultar clínicamente útiles
en el tratamiento sintomático, el balance beneficios/efectos secundarios es
generalmente desfavorable (Cubo y Burguera 2009; Olanow et al. 2009a;
Puy-Núñez y Cebrián-Pérez 2012; Gazewood et al. 2013).
Aún no se conoce el mecanismo exacto de los anticolinérgicos. Se ha
postulado que en los ganglios basales existe un balance entre dopamina y
acetilcolina, observándose que los compuestos colinérgicos incrementan
la sintomatología parkinsoniana. De este modo, se considera que la
principal acción de los anticolinérgicos es corregir el desequilibrio entre
la actividad colinérgica y dopaminérgica en el núcleo estriado de pacientes
con EP (Cubo y Burguera 2009; Olanow et al. 2009a).
Los anticolinérgicos utilizados en la EP actúan sobre receptores
muscarínicos, destacando: trihexifenidilo, benzatropina, orfenadrina,
prociclidina y biperideno (Cubo y Burguera 2009; Olanow et al. 2009a).
1.2.3.6.
Amantadina
La amantadina es un fármaco antiviral con efecto sintomático sobre la
EP.
Inicialmente
comercializado
como
antiviral,
su
acción
antiparkinsoniana fue descubierta de forma accidental al ser administrado
como antiviral en un paciente que presentaba la EP (Burguera y Cubo
2009; Boll et al. 2011; Puy-Núñez y Cebrián-Pérez 2012).
44
INTRODUCCIÓN
La amantadina presenta un mecanismo de acción complejo con las
siguientes
capacidades:
anticolinérgica,
podrodopaminérgica
y
antiglutamatérgica. Por medio de la inhibición de la recaptación de
dopamina la amantadina incrementa los niveles estriatales de dopamina.
Además, es antagonista no competitivo de los receptores NMDA,
mecanismo por el cual se considera que puede actuar sobre las discinesias
inducidas por L-DOPA (Burguera y Cubo 2009; Pagonabarraga y
Kulisevsky 2014).
Con respecto a su eficacia clínica se ha observado una mejoría
significativa con respecto al temblor, rigidez y bradicinesia en las fases
iniciales, así como el control de las discinesias en terapias combinadas. Se
considera que puede resultar eficaz tanto en monoterapia como
coadyuvante en el control de las complicaciones motoras, produciendo
una disminución de las discinesias relacionadas con L-DOPA (Burguera
y Cubo 2009; Boll et al. 2011; Sprenger y Poewe 2013; Pagonabarraga y
Kulisevsky 2014).
También se ha postulado que podría presentar efecto neuroprotector
por su actividad de antagonista NMDA, protegiendo a las neuronas
dopaminérgicas de la excitotoxicidad (Olanow et al. 2009a; Boll et al.
2011).
45
INTRODUCCIÓN
Algunos de los efectos adversos que presenta son: confusión,
alucinaciones
visuales,
retención
de
orina,
sequedad
bucal
y
estreñimiento, entre otros (Burguera y Cubo 2009; Pagonabarraga y
Kulisevsky 2014).
Figura 1.12: Representación esquemática del modo de acción de los principales
compuestos antiparkinsonianos: inhibidores de la catecol-o-metiltransferasa (ICOMT),
inhibidores de la dopa-descarboxilasa (IDDC), L-DOPA, amantadina, anticolinérgicos,
agonistas dopaminérgicos e inhibidores de la monoamino oxidasa B (IMAO-B) (Conolly
y Lang 2014).
1.2.3.7.
Otros agentes farmacológicos
Otros agentes farmacológicos que intervienen en la neuroquímica
cerebral son: zonisamida, anticolinesterásicos y antagonistas A2A de
adenosina. Además, existe un gran número de sustancias que se están
investigando y que podrían ser útiles para el manejo de la EP (Boll et al.
2011; Hickey y Stacy 2011).
La zonisamida, derivado del benzisoxasol, es un compuesto
antiepiléptico que desde el año 2009 se comenzó a estudiar para el
46
INTRODUCCIÓN
tratamiento motor de la EP (Murata 2010; Boll et al. 2011; Puy-Núñez y
Cebrián-Pérez 2012).
Este compuesto presenta diversos modos de acción como
antiparkinsoniano: activación de la síntesis de dopamina, inhibición de la
MAO, inhibición de los canales de calcio tipo T e inhibición de la vía
indirecta en los ganglios basales a través de receptores opioides. Además,
se considera que puede tener efectos neuroprotectores (Murata 2010; Boll
et al. 2011; Puy-Núñez y Cebrián-Pérez 2012).
Los fármacos anticolinesterásicos se utilizan en la EP para el
tratamiento de los síntomas cognitivos y conductuales. Su utilización se
basa en que la EP con demencia presenta un déficit colinérgico. Los
anticolinesterásicos comercializados en España son: donepezilo,
rivastigmina y galantamina (Rivera y González 2007; Pascual-Sedano y
Kulisevsky 2009; Sprenger y Poewe 2013; Gazewood et al. 2013).
A pesar de los prometedores resultados que presentan estos
compuestos sobre la demencia, existe la preocupación de que la
modificación colinérgica por estos compuestos pueda agravar el cuadro
motor (Rivera y González 2007; Pascual-Sedano y Kulisevsky 2009).
Los antagonistas A2A de adenosina son una de las terapias no
dopaminérgicas prometedoras para la EP. De los 4 subtipos de receptores
de adenosina, el subtipo A2A se encuentra en altas concentraciones en los
ganglios basales y puede influir en la acetilcolina, el GABA y la
dopamina. El antagonismo de estos receptores facilita la liberación
intraestriatal de GABA, reduciendo la hiperactividad estriadopalidal. Esta
reducción ayuda a incrementar la salida inhibitoria desde el estriado al
globo pálido, reestableciendo el balance de salida de los ganglios basales
(Factor 2008; Olanow et al. 2009a; Hickey y Stacy 2011).
47
INTRODUCCIÓN
El antagonista que más se ha estudiado en ensayos clínicos es la
istradefilina, aunque también ha comenzado a estudiarse el preladenant y
en fase preclínica se encuentra el vipadenent (Olanow et al. 2009a; Boll
et al. 2011; Hickey y Stacy 2011).
Además de un efecto sintomatológico también se postula un efecto
neuroprotector mediante la modulación de glutamato y aspartato (Boll et
al. 2011; Hickey y Stacy 2011).
En la Figura 1.13 se muestra el algoritmo de tratamiento de la EP
expuesto en la Guía oficial de práctica clínica en la enfermedad de
Parkinson de la Sociedad Española de Neurología.
48
INTRODUCCIÓN
Figura 1.13: Algoritmo de tratamiento para la EP (Martínez y Mir 2009).
49
INTRODUCCIÓN
En cuanto a las recomendaciones y consideraciones sobre la
terapéutica de la EP, que se establecen en la Guía oficial de práctica clínica
en la enfermedad de Parkinson de la Sociedad Española de Neurología,
podemos destacar:

No existe un fármaco de primera elección para la EP, depende de
las manifestaciones clínicas, estilo de vida y preferencias del
paciente.

Cuando se va a comenzar el tratamiento dopaminérgico se
recomienda emplear L-DOPA (en la dosis más baja que resulte
efectiva) en pacientes con afectación moderada-grave y pacientes
mayores de 70 años.

La evidencia científica indica que aún no se dispone de ningún
tratamiento neuroprotector y que no está justificado retrasar el
tratamiento con fármacos dopaminérgicos, ya que no se ha
relacionado con una peor evolución (Martínez y Mir 2009).
Las medicaciones que se están investigando en los últimos años son:
diversas formulaciones de L-DOPA para la mejora de síntomas motores,
antagonistas de adenosina A2A e inhibidores de la MAO-B tanto para
mejora sintomatológica como por su potencial neuroprotector (Hickey y
Stacy 2011).
50
INTRODUCCIÓN
1.3. ISATINA
1.3.1.
Antecedentes históricos
La isatina fue descubierta en 1841 por Erdmann y Laurent como
producto de la oxidación del índigo por medio de ácido nítrico y crómico.
A partir de este momento se produjo una incipiente investigación
científica sobre este compuesto y sus derivados. Sin embargo, hasta 1940
no fue aislada biológicamente, año en el que Böhm notificó la presencia
de isatina en orina de conejos que habían sido alimentados con ácido onitrofenilglioxílico (Sumpter 1943; Medvedev et al. 1996; Silva et al.
2001).
En 1980 Glover et al. describieron en orina humana la presencia de un
compuesto endógeno con capacidad inhibitoria de la MAO denominado
tribulina. Posteriormente, por medio de cromatografía de gases y
espectrometría de masas descubrieron que el principal constituyente de la
tribulina, descrita previamente, se correspondía con la isatina. Este fue el
primer reporte de la presencia de isatina endógena en animales,
encontrándose en estado natural en orina humana, además de en cerebro
y corazón de rata (Glover et al. 1988; Halket et al. 1991).
Inicialmente, la tribulina era considerada un factor biológico con
capacidad inhibitoria de la MAO, aunque actualmente existe cierta
controversia sobre el concepto de tribulina: algunos autores lo consideran
un marcador endógeno de estrés y ansiedad, mientras que otros
investigadores consideran la propia tribulina como un factor biológico de
importancia por sí mismo (Medvedev y Glover 2004).
La bibliografía más reciente clasifica a la tribulina como una familia
de sustancias endógenas no peptídicas que inhiben a la MAO y se unen a
receptores de benzodiacepinas. De este modo, se distinguen diferentes
51
INTRODUCCIÓN
tipos de tribulina: tribulina A (inhibe la MAO-A), tribulina B (inhibe la
MAO-B) y tribulinas BZ (inhiben los receptores de benzodiacepinas
centrales y periféricas). La isatina es el principal componente de la
tribulina con capacidad inhibitoria de la MAO-B, aunque se considera que
se trata de una sustancia independiente (Hamaue et al. 1990a; Pang et al.
1996; Medvedev y Glover 2004). Algunos autores indican que la tribulina
es la isatina, haciendo referencia indistinta a ambas (Glover et al. 1988).
En otros estudios se ha correlacionado el incremento de isatina con el
incremento de tribulina (Jarman et al. 1991; Glover y Sandler 1993),
mientras que en otras experimentaciones se cuantifica de forma
independiente la actividad de la tribulina y de la isatina, observándose que
existen variaciones independientes de ambas (Bhattacharya et al. 1991a;
Doyle et al. 1996; Glover y Sandler 1993). En orina se han constatado
otros compuestos con acción inhibitoria sobre la MAO-B independientes
a la isatina (Pang et al. 1996).
Desde su descubrimiento y por la versatilidad sintética que presenta,
la isatina y sus derivados han sido ampliamente estudiados debido a sus
propiedades biológicas y farmacológicas (Silva et al. 2001; Medvedev et
al. 2007; Semwal et al. 2010; Bhrigu et al. 2010; Raj 2012; Mathur y Nain
2014; Rao et al. 2014). Por su importancia a lo largo de la historia, se han
desarrollado diversos métodos para su cuantificación y se sigue trabajando
en este campo (Mawatari et al. 2001; Han 2010).
1.3.2.
Propiedades físico-químicas de la isatina
La isatina (indol-2,3-diona) es un indol que presenta como fórmula
química C8H5NO2 y un peso molecular de 147,13 g/mol. Tiene una
coloración amarillenta brillante y se disuelve fácilmente en agua y
disolventes orgánicos (Sumpter 1943; Hamaue et al. 1999a; Baluja et al.
52
INTRODUCCIÓN
2013). Las principales características físico-químicas de la isatina se
resumen en la Tabla 1.2.
ESTRUCTURA
QUÍMICA
Peso molecular
147,13 g/mol
Fórmula química
C8H5NO2
Nombre IUPAC
1H-indol-2,3-diona
Clasificación
Indol
Estado físico
Sólido
Solubilidad en agua
2 g/l (20ºC)
Coloración
Amarillenta
Olor
Inodoro
Temperatura ignición
220ºC
Punto de fusión
193-195ºC
Punto de inflamación
200ºC
Densidad aparente
600 kg/m3
Tabla 1.2: Principales características físico-químicas de la isatina.
En cuanto a la información toxicológica, la dosis letal mínima
publicada en rata es de 5 000 mg/ kg. No ha mostrado irritabilidad cutánea
ni ocular en conejo.
1.3.3.
Localización de la isatina
La determinación de isatina en tejido ha mostrado que la distribución
de esta presenta diferente concentración en diversos órganos. En ratas en
estado fisiológico la concentración de isatina en sangre puede exceder 1
53
INTRODUCCIÓN
µM. En el cerebro de rata las regiones que presentan mayor concentración
son: núcleos hipotalámicos y corteza cerebral (1,3 µM), hipocampo y
cerebelo (1,2 µM) y núcleo estriado (1 µM). En los órganos periféricos la
mayor concentración de isatina se ubica en las vesículas seminales y vasos
deferentes (47,9-79 µM), aunque también se puede encontrar isatina en:
corazón (3 µM), hígado (1,5 µM), pulmón (1,2 µM), así como en otros
órganos como bazo y riñón (Medvedev et al. 2007).
En los estudios por medio de radioligando ([3H]isatina) se observó que
la estructura cerebral por la cual la isatina presentó mayor afinidad en rata
era el hipotálamo, lo que concuerda con las variaciones de isatina en
condiciones de estrés y ansiedad (Figura 1.14). Otras estructuras por las
cuales mostró afinidad la isatina fueron: corteza, hipocampo, tálamo,
estriado, núcleo arqueado y plexo coroideo (Crumeyrolle-Arias et al.
2003; Medvedev et al. 2005; Crumeyrolle-Arias et al. 2009). La
administración de pargilina (un IMAO no selectivo) produjo una
disminución de la unión de isatina en las estructuras citadas previamente,
pero no una abolición absoluta de la unión de isatina, lo que pone en
manifiesto que la isatina interactúa con otros elementos además de la
MAO (Crumeyrolle-Arias et al. 2003; Crumeyrolle-Arias et al. 2009).
Figura 1.14: Autorradiograma
donde se muestran los sitios de
unión de la [3H]isatina, donde se
puede observar en color rojo una
elevada
afinidad
por
el
hipotálamo, aunque presenta una
amplia distribución de los sitios de
unión
concordante
múltiples
con
sus
actividades
(Crumeyrolle-Arias et al. 2009).
54
INTRODUCCIÓN
A pesar de que las proteínas a las que se une la isatina en el cerebro de
ratón y rata son similares, solo un pequeño porcentaje son idénticas, lo
que en parte explicaría los diferentes los efectos de la administración de
isatina en ambas especies (Buneeva et al. 2010).
Como se ha descrito previamente, la diversa y discontinua distribución
de la isatina sugiere que realiza diversas funciones tanto a nivel central
como periférico (Glover et al. 1998).
1.3.4.
Metabolismo de la isatina
Actualmente, se desconocen las vías y las enzimas que intervienen en
la formación de isatina endógena. Existen evidencias in vitro de que la
isatina puede formarse a partir del indol, producido por el catabolismo a
nivel intestinal, donde se encuentra involucrado el citocromo P450. Se ha
sugerido que el triptófano incluido en la dieta puede ser convertido en
indol por la flora intestinal, para ser transportado al hígado donde es
oxidado; a su vez, la isatina puede ser degradada originando diversos
metabolitos (Figura 1.15) (Hamaue et al. 1999a; Medvedev et al. 2007).
55
INTRODUCCIÓN
Figura 1.15: Representación esquemática de la formación de isatina a partir de indol y
su degradación a ácido antranílico, 3-hidroxi-2-oxoindol e indirrubina (Medvedev et al.
2007).
En bacterias se ha evidenciado la formación de isatina a partir de un
metabolito oxidativo del triptófano (ácido-3-indolacético), y su
degradación dando lugar al ácido antranílico (Jensen et al. 1995).
El catabolismo de la isatina in vitro se puede realizar por medio de las
vías de la oxidasa y de la reductasa (Figura 1.15). La reducción de isatina
produce como resultado 3-hidroxi-2-oxindol. La oxidación de isatina da
como resultado el ácido antranílico. La dimerización de la isatina da lugar
a la indirrubina. Los metabolitos de la isatina se han encontrado en orina
(Medvedev y Glover 2004; Medvedev et al. 2007).
La importancia de la flora intestinal en la secreción de isatina urinaria
se ha puesto en evidencia mediante el estudio de ratas normales y ratas
axénicas (libres de gérmenes). En estas últimas, la secreción de isatina en
orina era 50 veces menor que en las normales, aunque los niveles de
56
INTRODUCCIÓN
isatina en tejido no presentaban diferencias significativas (Hamaue et al.
1999a; Medvedev et al. 2007).
Tras observar que las ratas axénicas producían menos isatina en orina,
mientras que la isatina cerebral no presentaba alteraciones, Sandier et al.
(1991) postulan que la isatina secretada en orina y la presente en tejido
podrían tener un origen diferente u otra ruta biosintética.
Por otra parte, se ha observado un incremento de la concentración de
isatina en diversas regiones tras someter los animales de experimentación
a estrés agudo. La determinación en tejido ha mostrado que existe una
diferencia significativa en la concentración de isatina entre ratas macho y
hembra. La exposición a estrés agudo indujo un incremento de isatina a
nivel de corazón, sangre y cerebro en el caso de los machos, mientras que
en las hembras no se produjo incremento a nivel cerebral. Este hecho
constata que la regulación de la isatina a nivel central puede diferir de la
regulación periférica, aunque se necesita más investigación (Tozawa et al.
1998; Igosheva et al. 2004).
Para generar una condición de estrés, Tozawa et al. (1998) utilizaron
la privación alimenticia y la exposición al frío en roedores. Ambos tipos
de agentes estresantes incrementaron los niveles de isatina en orina en 24
horas. Estos autores proponen una regulación central de la isatina por
medio
de
células
liberadoras
de
corticotropina
y
neuronas
noradrenérgicas. Los resultados obtenidos mostraron que el pretatamiento
con glucocorticoides y α-metil-p-tirosina disminuye la secreción úrica de
isatina: el primero indica una generación de la isatina involucrando a la
corticotropina y el segundo hace referencia a la disminución de la acción
de la TH lo que hace que se libere menos isatina.
Igosheva et al. (2004) observaron que la exposición de roedores a
estrés mediante inmovilización y estimulación auditiva incrementaba los
57
INTRODUCCIÓN
niveles de isatina en sangre y en corazón. Sin embargo, bajo este modelo
de estrés no se observó modificación en los niveles cerebrales, lo que
sugiere posibles mecanismos de regulación periférica y central diferentes.
Además, las variaciones fueron diferentes entre ambos géneros, siendo
mayor el incremento en los machos. Igualmente, los autores señalan que
se desconoce el mecanismo por el cual se libera/produce isatina ante
situaciones de estrés. Se sugiere que el aumento de isatina podría estar
mediado por neuronas liberadoras de corticotropina y neuronas
noradrenérgicas o por la estimulación periférica de receptores
serotonérgicos (Igosheva et al. 2004).
En conejos se ha observado que la administración de agentes
ansiogénicos y proconvulsivantes producía un incremento de isatina a
nivel cerebral, sin observarse variaciones en los niveles de isatina en
hígado. Lo que lleva a los autores a postular que la isatina podría mediar
la epilepsia y la ansiedad (Clow et al. 1989).
Por otra parte, se ha observado un incremento de isatina cerebral tras
someter a ratas a convulsiones por medio de electroshock, observándose
un incremento de tipo estímulo-dependiente: cuanto más elevado era el
shock provocado mayor era el incremento de isatina (Bhattacharya et al.
1991b).
Existen pocos estudios sobre la isatina en humanos. Destaca el
incremento de isatina observado en líquido céfalo-raquídeo en pacientes
con bulimia nerviosa, lo que se corrobora con los estudios anteriormente
expuestos sobre el posible papel en la regulación de la ansiedad, ingesta
alimenticia y balance de agua. Sin embargo, los autores no pueden
determinar si el incremento de isatina es causa o efecto de la bulimia
nerviosa (Brewerton et al. 1995).
58
INTRODUCCIÓN
En estudiantes se observó que los niveles de isatina en orina no se
correlacionaban con los niveles de cortisol secretado ante el estrés
generado por la realización de una exposición oral (Doyle et al. 1996).
En pacientes diagnosticados con migraña se observó una tendencia a
incrementar los niveles de isatina en orina durante los ataques de migraña,
pero los cambios observados no fueron significativos. En este caso, los
niveles de tribulina se correlacionaron con los niveles de isatina (Jarman
et al. 1991).
Pandey et al. (2002) midieron los niveles de isatina y cortisol en
plasma en pacientes embarazadas. Los niveles de isatina eran mayores que
en los casos control de mujeres no embarazadas. Las pacientes
embarazadas con ansiedad maternal y estrés obstétrico mostraron niveles
sanguíneos de isatina y cortisol más elevados, con respecto a las pacientes
embarazadas con embarazos normales. Los autores postulan a la isatina
como un biomarcador de estrés y ansiedad.
La secreción de isatina en orina ante situaciones de estrés podría estar
mediada por receptores serotoninérgicos 5-HT2A/2C. Los agonistas de estos
receptores incrementan la secreción de isatina en orina en ratas. Para esta
respuesta se considera que los agonistas serotoninérgicos producen una
reacción similar a la del estrés, involucrando la activación de células
corticotropas hipotalámicas y el sistema nervioso simpático. Como origen
de la vía biosintética se propone que la isatina es un derivado del
triptófano, cuya metabolización se vea incrementada por agentes
estresantes produciendo metabolitos oxidativos como la isatina (Tozawa
et al. 1999).
Atendiendo a lo anteriormente expuesto, podemos resumir que un
incremento de isatina se ha observado en diversas condiciones
59
INTRODUCCIÓN
neuropatológicas como: estrés, ansiedad, bulimia nerviosa, epilepsia y EP.
Aunque su vía metabólica no se ha dilucidado.
1.3.5.
Actividad de la isatina sobre la neurotransmisión
dopaminérgica
A pesar de que la isatina fue descubierta por Glover en el año 1980
como principal componente de la tribulina en orina humana, no se
obtuvieron datos objetivos acerca de las variaciones que producía en
niveles de neurotransmisores hasta el año 1996 por Hamaue y su equipo
(Glover et al. 1988; Hamaue et al. 1999a).
La isatina destaca por su capacidad de inhibir la MAO, aunque a
elevadas concentraciones también puede influir sobre otras enzimas
(Medvedev y Glover 2004; Minami et al. 2006). Publicaciones recientes
indican que las principales dianas de la isatina son la guanilato-ciclasa del
receptor del péptido natriurético, la guanilato-ciclasa estimulada por óxido
nítrico soluble y la MAO-B (Buneeva et al. 2010).
Unos estudios in vitro demostraron que la actividad más potente de la
isatina es la inhibición de la MAO-B con una concentración inhibitoria
(IC50) de 3 µM (Glover et al. 1988). Otros estudios in vitro mostraron
que una concentración de 10-4 M producía una inhibición de la MAO del
93% (Hamaue et al. 1999b).
La unión de la isatina a la MAO-B humana se describe del siguiente
modo: competitiva, estrecha, reversible y no covalente. La constante de
inhibición (Ki) es aproximadamente de 3 µM. El grupo 2-oxo de la isatina
se une a la enzima por medio de puentes de hidrógeno al pirrol NH, el
balance de las interacciones de unión involucra diversos enlaces de van
der Waals entre el anillo de la isatina y los residuos aminoacídicos de la
cavidad del sustrato. Aunque también se ha observado que presenta
60
INTRODUCCIÓN
capacidad inhibitoria sobre la MAO-A, pero su potencia es inferior que
sobre la MAO-B (Ki = 15 µM) (Binda et al. 2003; Crumeyrolle-Arias et
al. 2003; Manley et al. 2011).
La isatina tiene la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica
y se ha observado que el transporte al interior de algunos tipos celulares
se puede realizar de forma activa por medio del transportador de
serotonina, aunque también podría introducirse de forma pasiva
(Medvedev et al. 2002; Xu et al. 2006). La administración de isatina 100
mg/kg i.p. resulta en una concentración cerebral de 120 µM en ratas
(Igosheva et al. 2005).
Se ha observado que la administración intraestriatal de isatina (10-6 y
10-4 M) en ratas Wistar producía un incremento significativo de los niveles
extracelulares de dopamina y acetilcolina, siendo mucho mayor el
incremento de dopamina que el de acetilcolina. También se observó que
la administración intraperitoneal de isatina (50-200 mg/kg) incrementaba
los niveles estriatales de dopamina y acetilcolina tras dos horas de su
administración (Hamaue et al. 1999b).
Del mismo modo, se han evaluado los efectos de la administración de
isatina sobre diversos modelos experimentales de la EP como el modelo
de reserpina y el de 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Sin embargo, el
modelo de Parkinson sobre el que se han realizado más estudios es sobre
el modelo del virus de la encefalitis japonesa (VEJ) (Zhou et al. 2001;
Hamue et al. 2004; Minami et al. 2006; Xu et al. 2006).
Los estudios realizados por Hamaue et al. (2004) demuestran que la
administración i.p. de isatina (100 mg/kg por día durante una semana)
produce un incremento de dopamina estriatal en ratas parkinsonizadas con
el VEJ. Del mismo modo, han observado que en el modelo experimental
estudiado se producía un incremento de la tasa de conversión de dopamina
61
INTRODUCCIÓN
en DOPAC en el estriado (relación DOPAC/DA) que era revertida a
niveles basales con la administración de isatina, lo que no se observó con
la administración de selegilina. Ante estos resultados, los autores sugieren
que la isatina administrada exógenamente produjo mejoría en el
parkinsonismo inducido por el VEJ, por medio del incremento de la
concentración de dopamina en el estriado.
Igualmente, Ogata et al. (2003), mediante la misma metodología
(administrando 100 mg/kg i.p. en ratas parkinsonizadas con el VEJ), han
observado que la isatina incrementó los niveles de dopamina en las ratas
parkinsonizadas aunque no observaron modificaciones en el análisis
neuropatológico (pérdida neuronal y gliosis).
Estos hallazgos coinciden con los obtenidos por Xu et al. (2006), que
también observaron que la administración intraperitoneal de isatina
produjo un incremento de los niveles de dopamina en ratas reserpinizadas.
En este caso se administró isatina de forma sistémica en una dosis de 100
mg/kg durante 4 días. La cuantificación de dopamina y sus metabolitos se
realizó por medio de microdiálisis cerebral. Estos autores también
indicaron que la isatina probablemente ejercía un efecto preventivo y
terapéutico en la EP y que podría un compuesto con baja toxicidad de
origen endógeno.
Sin embargo, en la literatura científica podemos encontrar resultados
contradictorios. Zhou et al. (2001) observaron que la administración de
isatina (100 mg/kg i.p.) no producía modificaciones en los niveles de
dopamina ni de sus metabolitos en ratas parkinsonizadas con 6-OHDA,
mientras que sí mejoraba las alteraciones motrices observadas en dichos
animales producidas por apomorfina. Estos hallazgos ligados a la
determinación de un incremento de los niveles de serotonina, sin
variaciones de su principal metabolito, llevan a concluir a estos autores
62
INTRODUCCIÓN
que los efectos de la isatina sobre los niveles de dopamina in vivo parecen
ser complejos y contradictorios, el mecanismo subyacente es incierto y no
está claro el papel que juega la inhibición de la MAO. Además, proponen
otros mecanismos que no involucran la inhibición MAO, como la
liberación de catecolaminas por medio de la acción sobre los receptores
de péptido natriurético atrial.
La administración crónica por vía oral (200 mg/kg durante 4 semanas)
de isatina incrementa la presión sanguínea en roedores, así como los
niveles de catecolaminas en orina (noradrenalina y dopamina) y de
serotonina a nivel hepático. Este incremento de la presión sanguínea se ha
asociado a su capacidad de inhibir la MAO y de incrementar los niveles
de monoaminas (Hamanue et al. 1996).
Se ha observado que la isatina presenta diversas dianas en común con
la selegilina, es decir, que presenta un comportamiento agonista parcial de
la misma. La administración i.p. de 20 mg/kg de isatina en ratones produce
modificaciones en la expresión génica en corteza de ratones similares a
las modificaciones presentadas por la selegilina. Tanto en el caso de la
isatina como de la selegilina no se encontraron diferencias en la expresión
de ambas isoformas de la MAO (Fedchenko et al. 2008).
Se ha observado que la isatina disminuye la actividad de la MAO-B e
incrementa la de la superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa en
ratones parkinsonizados con MPTP, por lo que su posible actividad
neuroprotectora podría derivar de estos mecanismos (Fang y Wang 2008).
Zhang et al. (2011a) observaron que la isatina protegía a las células
dopaminérgicas en cultivo de la exposición a H2O2. Los mecanismos que
observaron para esta protección fueron: mitigación de la disfunción de la
membrana mitocondrial y descenso de los niveles de calcio libre
intracelular.
63
INTRODUCCIÓN
El pretratamiento intraperitoneal de isatina en ratones expuestos a
MPTP disminuye la expresión de proteínas Bax (que pertenecen a la
familia de genes Bcl-2 y está involucrada en la apoptosis de las neuronas
dopaminérgicas de la sustancia negra). De esta manera, la administración
de isatina a ratones tratados con MPTP redujo de forma significativa la
expresión de esta proteína, que había aumentado tras la administración de
MPTP, lo que ha llevado a postular la isatina como un compuesto
protector contra la toxicidad inducida por MPTP (Zhang et al. 2011b).
1.3.6.
Relación entre la isatina y la enfermedad de Parkinson
Existe una estrecha relación entre los niveles de isatina en orina y el
grado de afectación de la EP. Entre los grados III y V (según los criterios
propuestos por Hoehn y Yahr de 1967) se observa un incremento
significativo de los niveles de isatina en orina; así como una tendencia a
decrecer en pacientes en grado I con tratamiento en comparación con los
que no recibieron tratamiento. Los niveles de isatina en orina pueden ser
utilizados como un marcador endógeno de la severidad clínica de la EP
(Hamaue et al. 2000).
Actualmente, se desconoce la causa que provoca el incremento de
isatina en la EP, aunque se postula que puede ser debido al estrés causado
por la enfermedad o como mecanismo compensatorio en respuesta a los
bajos niveles de la dopamina cerebral (Hamaue et al. 1999a; Minami et
al. 2006).
En diversos modelos experimentales de la EP en roedores se ha
observado una mejoría de las alteraciones motrices tras la administración
sistémica de isatina. De este modo se ha descrito: disminución de la
bradicinesia inducida por el VEJ (Hamaue et al. 2004), reducción de la
conducta rotacional en ratas expuestas a apomorfina tras lesión neuronal
64
INTRODUCCIÓN
con 6-OHDA (Zhou et al. 2001) y recuperación de las alteraciones
motrices inducidas por la reserpina (Xu et al. 2006).
Además de actuar sobre otras proteínas, la isatina actúa sobre la
GAPDH, considerada una posible diana neuroprotectora por su capacidad
de interactuar con el citoesqueleto, lo cual resulta de interés en trastornos
como la epilepsia, la EP y la demencia senil (Buneeva et al. 2010).
La isatina puede funcionar como un compuesto endógeno similar a la
selegilina y al igual que esta se puede considerar como un posible
compuesto protector en la EP (Glover y Sandler 1993).
Estos hallazgos han llevado a diversos autores a plantear el estudio de
la isatina como posible factor neuroprotector y compuesto útil en la terapia
antiparkinsoniana (Glover et al. 1988; Hamaue et al. 1999a; Ogata et al.
2003; Hamaue et al. 2004; Minami et al. 2006, Xu et al. 2006; Fang y
Wang 2008; Buneeva et al. 2010).
1.3.7.
Otros efectos biológicos de la isatina
La isatina presenta una amplia variedad de efectos biológicos. Los
diversos estudios realizados en roedores y primates muestran que su
actividad se caracteriza por ser de tipo dosis-dependiente.
Inicialmente, se observó en ratas que a dosis elevadas (80-400 mg/kg)
presentaba actividad anticonvulsivante, mientras a dosis inferiores (20
mg/kg) es proconvulsivante. Para estas investigaciones se observó que la
isatina administrada intraperitonealmente modificaba el efecto de
compuestos con capacidad convulsivante. Los autores consideran que el
efecto proconvulsivante de la isatina puede ser debido a la inhibición
central de los receptores del péptido natriurético atrial y la estimulación
de receptores serotonérgicos, en vez de su acción inhibitoria de la MAOB. Por otro lado, el efecto anticonvulsivante en altas dosis de isatina puede
65
INTRODUCCIÓN
ser producido por sus propios metabolitos (Bhattacharya y Chakrabarti
1998; Glover et al. 1998).
En relación a lo expuesto anteriormente, la administración i.p. de 180
mg/kg de isatina produce una disminución de ataques epilépticos de
origen auditivo, así como una inhibición de reflejos posturales. La
administración
de
isatina
también
produce
cambios
electroencefalográficos, observándose un incremento de la actividad
rítmica episódica (Chocholová y Kolínová 1979). Otros hallazgos
electroencefalográficos tras la administración de isatina fueron:
disminución y retraso de onda lenta de sueño (sobre todo en fase REM) e
incremento de vigilia (Chocholová y Kolínová 1981).
En las dosis de 10-20 mg/kg en ratón y rata respectivamente presenta
actividad ansiogénica. Estas observaciones se han llevado a cabo en test
de campo abierto y de laberinto en ratones y en test de interacción social
en ratas, siendo su efecto equiparable al de otro agente ansiogénico
establecido (yohimbina) y disminuyendo ambos los efectos de fármacos
ansiolíticos (Bhattacharya et al. 1991c; Bhattacharya y Chakrabarti 1998).
Resultados similares se observaron en investigaciones en primates. La
administración de isatina (20 mg/kg i.m.) produjo modificaciones
comportamentales a otro compuesto ansiogénico (pentilenotetrazol).
Ambos compuestos incrementaron los niveles de cortisol en sangre y su
efecto se vio disminuido por el diazepam. Esto refuerza la idea de que,
tanto en roedores como en primates, la isatina en pequeñas dosis induce
una respuesta ansiogénica (Palit et al. 1997).
Igualmente, la isatina en roedores podría inducir disrupción de la
memoria. Se ha propuesto que este efecto es debido a una acción
ansiogénica, por antagonizar los receptores serotoninérgicos y del péptido
natriurétrico atrial (Satyan et al. 1995). Otros estudios muestran que en
66
INTRODUCCIÓN
una dosis de 50 mg/kg i.p. puede inhibir la acción de otros péptidos
natriuréticos (el tipo C y el cerebral), causando alteraciones en la memoria
(Telegdy et al. 2000).
Medvedev et al. (2005) observaron que los efectos ansiogénico y
sedativo producidos por las diferentes dosis de isatina podrían ser debidos
a que las diferentes concentraciones actuaban de manera diferente sobre
los receptores de péptido natriurético tipo A y C: a bajas dosis antagoniza
el efecto ansiolítico del tipo A y a altas dosis antagoniza el efecto
ansiogénico del tipo C.
Por medio de su antagonismo con los péptidos natriuréticos, se ha
observado que la administración sistémica de isatina en ratas (5 mg/kg)
reduce la hipertermia generada por la administración de dichos péptidos
(Pataki et al. 2000).
Abel (1995) observó resultados comportamentales diferentes a los
expuestos previamente. En este caso, administró a ratas dosis de isatina de
0-160 mg/kg y las sometió a situaciones de estrés mediante el test de
natación forzada y el test de campo abierto. El autor describe que la isatina
presenta un efecto sedativo/ansiolítico puesto que las ratas manifestaron
menor actividad en el test de natación y menor desplazamiento en el test
de campo abierto. Esto le llevó a rechazar la hipótesis de que la isatina
funciona como un compuesto de alarma en roedores.
Hota y Achayra (1994) estudiaron los efectos de la isatina a nivel
periférico en diversos modelos animales. Los resultados que obtuvieron
fueron: actividad espasmogénica a nivel gastrointestinal (en cobaya, rata
y conejo), actividad broncodilatadora, inhibición cardíaca en corazón de
rana aislado, hipotensión y depresión respiratoria en perro y efecto
antidiurético.
67
INTRODUCCIÓN
También se ha observado que la isatina inhibe la ingesta de comida en
ratones en una dosis de 25 mg/kg. Esto ha sugerido que la isatina puede
ser un modulador endógeno de la ingesta de alimentos, e incluso estar
involucrada en la anorexia nerviosa. En este caso, los autores no
observaron modificaciones comportamentales en el test de campo abierto.
El mecanismo para este efecto saciador puede ser debido al incremento de
los niveles de serotonina en el hipotálamo y en el cerebro medio y al
incremento de la dopamina por inhibición de la MAO, aunque también
puede involucrar otros mecanismos como la inhibición de la
acetilcolinesterasa (Morley et al. 1996).
Algunos autores han observado que los efectos intracelulares que
median la acción de la isatina sobre el péptido natriurético atrial difieren
en las células dañadas, mientras que en células intactas su acción es mucho
mayor, sugiriendo una regulación de sus efectos por medio de factores
intracelulares (Medvedev et al. 2001).
Estudios en sinaptosomas de roedores han mostrado que la isatina
produce un incremento de ATP. Los autores proponen la existencia de un
ciclo regulador previamente desconocido. Por un lado, la isatina produce
un incremento de ATP que retrasa la potenciación de la isatina sobre el
eje hipotálamo-hipofisario debido a la inhibición del péptido natriurético
atrial. El uso posterior de ATP en diversas reacciones metabólicas típicas
del estrés promovería la acción de la isatina sobre el péptido natriurético
atrial e indirectamente incrementaría la acción del eje hipotálamohipofisario. Este es una hipótesis que requiere mayor validación (Globa et
al. 2008).
Estudios in vitro muestran que bajas concentraciones de isatina
pueden inhibir la guanilato ciclasa activada por NO de plaquetas humanas,
68
INTRODUCCIÓN
lo que puede promover diversos mecanismos de estrés (Medvedev et al.
2002; Severina et al. 2011).
Las proteínas cerebrales con las que la isatina ha presentado alta
afinidad y son homólogas entre diversas especies de mamíferos son:
GAPDH, creatina fosfoquinasa, glucógeno fosforilasa y peroxiredoxina
(Buneeva et al. 2010). En experimentaciones previas, los mismos autores
observaron que, al igual que la selegilina, la isatina podría actuar sobre la
piruvato quinasa, una enzima reguladora de la glucólisis, así como un
factor regulador de las proteínas citoesqueléticas (Buneeva et al. 2007).
El efecto sobre diversas proteínas que actúan sobre la reestructuración
citoesquelética podría explicar el posible efecto antiproliferativo y
proapoptótico (Buneeva et al. 2010).
La evaluación de la isatina como posible compuesto anticancerígeno
ha sido investigada por diversos autores y los derivados de la isatina son
una interesante línea de investigación de antineoplásicos. El principal
mecanismo descrito es la activación de la quinasa regulada por señales
extracelulares, provocando apoptosis (Pandeya et al. 2005; Medvedev et
al. 2007; Vine et al. 2009).
Se ha observado que la isatina inhibe las líneas tumorales de la
leucemia promielocítica y las células cancerígenas del neuroblastoma. A
partir de la acción que realiza la isatina en estas líneas tumorales y los
hallazgos observados en tejidos de mamífero in vivo, se deduce que el
efecto de la isatina es dependiente de la concentración y de tiempo de
exposición (Cane et al. 2000; Igosheva et al. 2005; Hou et al. 2008; JinLian y Li 2008; Cândido-Bacani et al. 2010; Song et al. 2013).
Por su efecto en la inhibición de las enzimas cicloxogenasa-2 (COX2) y óxido nítrico sintasa (NOS) en líneas celulares de macrófagos de
69
INTRODUCCIÓN
ratones, se ha postulado como posible agente antiinflamatorio,
antitumoral y quimiopreventivo (Matheus et al. 2007).
En general, se puede decir que los efectos de la isatina son muy
diversos y los mecanismos subyacentes muy complejos.
70
2
JUSTIFICACIÓN
Y OBJETIVOS
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
2.1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
La isatina es un compuesto generado de forma endógena que presenta
amplia variedad de efectos biológicos, donde destaca su capacidad de
inhibir la MAO. En diversos estudios se ha evidenciado que la
administración i.p. de isatina incrementa los niveles centrales de
dopamina, tanto en ratas normales como en ratas parkinsonizadas
(Hamaue et al. 1999b; Ogata et al. 2003; Hamue et al. 2004; Minami et
al. 2006; Xu et al. 2006). Actualmente, los papeles fisiológicos y
patológicos de la isatina aún no están claros (Mathur y Nain 2014).
No obstante, en la literatura científica se ha observado algún resultado
contradictorio en el que la administración de isatina en ratas
parkinsonizadas con 6-OHDA no produjo modificaciones sobre los
niveles de dopamina, aunque produjo una mejoría de las alteraciones
motrices en este modelo experimental. Este hecho conlleva a plantear la
hipótesis de que la isatina podría presentar otros mecanismos
neuroquímicos aún no dilucidados (Zhou et al. 2001).
Esta hipótesis se ve reforzada por el hecho de que otros IMAO-B
presentan más efectos neuroquímicos que la inhibición de la MAO-B que
los caracteriza. Se puede citar el ejemplo de la safinamida (descrita en el
apartado anterior), un IMAO-B que además inhibe la recaptación de
dopamina, bloquea los canales de sodio e inhibe la liberación de glutamato
(Olanow et al. 2009; Boll et al. 2011; Hickey y Stacy 2011; Barbosa y
Bossoni 2014).
Esto plantea la posibilidad de que la isatina pueda actuar sobre otros
elementos del terminal dopaminérgico y sobre otros neurotransmisores
diferentes a la dopamina, lo que al igual que la safinamida, le podría
conferir mayor relevancia terapéutica.
73
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
Del mismo modo, existe escasa experimentación en la que se realice
un muestreo in vivo de los efectos de la isatina sobre la dopamina estriatal.
Adicionalmente, en el presente trabajo de investigación se utiliza un
diseño experimental diferente, ya que en la mayoría de estudios la isatina
es administrada intraperitonealmente (Hamaue et al. 1999b), mientras que
en este caso se administra disuelta en el líquido de perfusión de
microdiálisis.
Por otra parte, los compuestos con capacidad para inhibir la MAO han
sido ampliamente estudiados por sus beneficios terapéuticos en diversas
patologías del SNC. Actualmente, los IMAO-B son utilizados en la EP,
tanto por sus beneficios sintomatológicos como por su posible acción
neuroprotectora. De todas formas, todavía no se dispone de ningún
compuesto que modifique la progresión de la enfermedad (Youdim et al.
2006; Riederer et al. 2007; López y Linazasoro 2009; Riederer y Laux
2011; Conolly y Lang 2014; Finberg 2014).
La posible utilidad clínica de la isatina se ha evidenciado en estudios
en los que la administración sistémica de este compuesto en ratas
parkinsonizadas provocó una mejoría de las alteraciones motrices (Zhou
et al. 2001; Hamaue et al. 2004; Xu et al. 2006). Así, en ratas
parkinsonizadas con el VEJ , la isatina mostró mejores resultados en la
tasa de conversión de dopamina en DOPAC frente a la selegilina (Hamaue
et al. 2004).
Es necesario citar también, que diversos investigadores han postulado
a la isatina como un posible candidato dentro de la farmacoterapia
antiparkinsoniana (Glover et al. 1988; Ogata et al. 2003; Hamaue et al.
2004; Minami et al. 2006, Xu et al. 2006). Aunque el estudio de este
compuesto se limita únicamente a investigaciones preclínicas.
74
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
Se debe destacar que en la 14ª edición del Congreso Mundial de
Farmacología bajo la temática “Nuevos fármacos para el tratamiento de
los trastornos del Sistema Nervioso Central” la isatina fue presentada
como un compuesto antiparkinsoniano (Scriabine 2002).
En este momento, la base de datos PubChem (pertenenciente al
National Center for Biotechnology Information, NCBI) registra 12
estudios activos de la isatina con la MAO-B como diana (número de
identificación de compuesto: 7054). Estos estudios se centran en la
evaluación de la IC50 (9 de ellos) y de la Ki (los 3 restantes).
Como inhibidor reversible de la MAO, la isatina presenta diversas
ventajas sobre los inhibidores irreversibles, que son los que se utilizan
actualmente en el tratamiento farmacológico de la EP. La inhibición
reversible presenta las siguientes ventajas: la enzima se recupera una vez
que el inhibidor se retira de los tejidos, debido a que presenta una menor
duración de acción el riesgo de perder selectividad es menor frente a los
inhibidores irreversibles y en caso de inhibición reversible competitiva la
inhibición es aliviada cuando la concentración de sustrato incrementa
(Prins et al. 2010).
Además, Edmonson et al. (2007) indican que nuevos inhibidores
reversibles podrían resultar útiles como neuroprotectores, considerando el
incremento de MAO-B con la edad y su posible asociación con trastornos
neurodegenerativos.
Considerando lo expuesto previamente, los resultados de esta tesis
doctoral podrían resultar útiles para generar datos preliminares para
posteriores investigaciones con una notable aplicación clínica.
Sin embargo, experimentaciones con isatina sobre algunas líneas
tumorales han llevado a algunos autores a tomar precauciones a la hora de
75
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
postular a la isatina como posible agente terapéutico (Igosheva et al.
2005). Por el contrario, investigaciones más recientes indican que la
isatina podría presentar efectos neuroprotectores como los observados en
cultivos celulares y en ratones parkinsonizados con MPTP (Fang y Wang
2008; Zhang et al. 2011a; Zhang et al. 2011b).
Medvedev et al. (2007) y Fedchenko et al. (2008) indican que la
isatina también podría atenuar los efectos de ciertos agentes
farmacológicos en dianas específicas como la MAO o compuestos
neuroprotectores.
Por otro lado, a pesar de que la mayoría de pacientes que sufren la
EP reciben más de un fármaco antiparkinsoniano, las investigaciones
tienden a centralizar en buscar los fármacos que pueden ser utilizados
como primera línea terapéutica y han sido ignoradas las potenciales
sinergias de los compuestos utilizados en la actualidad. Por este motivo,
se plantea, además de la administración de la isatina, la coadministración
de esta sustancia con diversos compuestos de acción antiparkinsoniana,
para poder determinar la sinergia que puede resultar efectiva en aumentar
los niveles de dopamina en el núcleo estriado. Del mismo modo, resulta
interesante evaluar desde un punto de vista neuroquímico compuestos que
mejoren la farmacocinética de la L-DOPA en el incremento de los niveles
de dopamina.
En cualquier caso, se debe señalar que hasta el momento aún persiste
la necesidad de nuevas terapias que proporcionen beneficios sintomáticos
no asociados a complicaciones motoras, tratamiento de la sintomatología
no dopaminérgica y un tratamiento que revierta o ralentice la progresión
de la EP (Olanow y Schapira 2013).
76
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
En síntesis, la justificación de esta tesis doctoral se podría resumir en
los siguientes puntos:

La isatina presenta un elevado potencial terapéutico y podría estar
involucrada en diversos trastornos del SNC, donde destaca sobre
todo la EP.

En la literatura previa se observa escasa experimentación in vivo con
este compuesto y existen resultados contradictorios.

Se desconocen los mecanismos neuroquímicos por los que actúa la
isatina sobre el sistema dopaminérgico y sus efectos sobre otros
neurotransmisores.

La
isatina
endógena
podría
interactuar
con
fármacos
antiparkinsonianos administrados exógenamente y dicha interacción
a nivel neuroquímico aún no se ha descrito.
Finalmente, hay que considerar que la aplicación de isatina como
agente terapéutico aún dista mucho de la clínica, pero es necesario tener
en cuenta que las investigaciones previas describen que este compuesto es
generado de forma endógena y niveles altos del mismo se han observado
en pacientes con EP. Por ello, la isatina podría estar involucrada en la
fisiopatología de la EP, generarse como mecanismo compensatorio o
interferir con los compuestos administrados para su tratamiento.
Esta tesis doctoral es realizada en modelos animales, por lo que se
encuadra dentro de investigación básica, por ende los resultados deben ser
considerados con la mesura precisa.
77
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
En este momento la isatina se encuentra en estudio preclínico y esto
puede deberse a las limitaciones a las que se ve sometida la investigación
de la EP:

Alto coste y gran tiempo de desarrollo de la investigación.

Aún se desconoce la etiología específica de la patología.

Los modelos experimentales de EP manifiestan características
limitadas.

No existen biomarcadores validados.

No existe un diseño de estudio que permita dilucidar con
facilidad si un compuesto es neuroprotector (Olanow y
Schapira 2013).
78
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
2.2. OBJETIVOS
2.2.1.
Objetivo general
El objetivo general de este trabajo de investigación consiste en evaluar
los efectos y los mecanismos de acción de la administración de isatina
sobre la liberación in vivo de dopamina y sus principales metabolitos
ácidos (DOPAC y HVA), en el núcleo estriado de ratas conscientes y en
libre movimiento mediante las técnicas de microdiálisis cerebral y
cromatografía de líquidos de alta resolución con detección electroquímica
(HPLC-EC).
2.2.2.
Objetivos específicos
Los objetivos específicos de esta tesis doctoral son:
1. Estudiar los efectos de la administración intraestriatal de diferentes
concentraciones de isatina sobre la liberación in vivo de dopamina y
sus metabolitos en el núcleo estriado de ratas.
2. Determinar los posibles mecanismos neuroquímicos de acción de la
isatina sobre la liberación in vivo de dopamina.
3. Estudiar los efectos de la administración intraestriatal de isatina sobre
la liberación in vivo de dopamina y sus metabolitos en el núcleo
estriado en ratas tratadas con inhibidores selectivos para cada isoforma
de la MAO.
4. Estudiar los efectos de la administración intraestriatal de isatina
combinada con diversos fármacos antiparkinsonianos sobre la
liberación in vivo de dopamina y sus metabolitos en el núcleo estriado
de ratas.
79
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
5. Estudiar los efectos de la administración intraestriatal de isatina sobre
la liberación in vivo de dopamina y sus metabolitos en el núcleo
estriado en ratas tratadas con L-DOPA por vía intraperitoneal.
6. Determinar la posible mediación de receptores glutamatérgicos en el
efecto de la isatina sobre la liberación de dopamina en el núcleo
estriado de ratas.
7. Evaluar la posible participación del óxido nítrico en la liberación de
dopamina inducida por isatina en el núcleo estriado.
8. Estudiar los efectos de la administración intraestriatal de isatina sobre
la liberación in vivo de glutamato, aspartato, taurina y glicina en el
núcleo estriado de ratas.
80
3
MATERIAL Y
MÉTODOS
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
En todos los experimentos se utilizaron ratas hembra de la raza
Sprague-Dawley con un peso comprendido entre los 250-300 g
alimentadas mediante pienso comercial y agua ad libitum. Los animales
se criaron y se mantuvieron en un estabulario en condiciones de
temperatura constante (22 ± 2º C) y períodos de luz:oscuridad controlada
(14:10 h), alojados en jaulas de polipropileno en un número de 4 por jaula.
Después de la operación cada animal fue alojado en una jaula individual.
Toda la experimentación ha sido realizada atendiendo a la Directiva
Europea 2010/63/EU para la protección de animales de laboratorio y al
Real Decreto 53/2013, en el que se establecen las normas básicas
aplicables
para
la
protección
de
los
animales
utilizados
en
experimentación; además de poseer la autorización del Comité Ético de
Bienestar Animal (CEBA) de la Universidad de Vigo.
3.2. REACTIVOS Y PATRONES
En todos los experimentos se utilizaron reactivos de pureza analítica
y el agua fue previamente purificada con un sistema Milli Q (Millipore).
Los reactivos utilizados en experimentación y su procedencia se
muestran en la Tabla 3.1.
83
MATERIAL Y MÉTODOS
Reactivo
Compuesto
Acción
Procedencia
Inhibidor de la NOS.
7-nitroindazol (7- NI)
Sigma-Aldrich
Ácido dihidroxifenilacético Utilizado como patrón.
Sigma-Aldrich
(DOPAC)
Ácido
DL-2-Amino-5- Antagonista
fosfatopentanoico
NMDA Tocris
(DL- competitivo.
AP5)
Ácido homovanílico (HVA)
Utilizado como patrón.
Sigma-Aldrich
Amantadina hidrocloruro
Antiparkinsoniano.
Sigma-Aldrich
Liberador de dopamina.
Aspartato
Utilizado como patrón.
Atropina
Antagonista
de
Sigma-Aldrich
los Sigma-Aldrich
receptores muscarínicos
de ACh.
Benserazida clorhidrato
Inhibidor de la DDC.
Sigma-Aldrich
Clorgilina clorhidrato
Inhibidor de la MAO- A. Sigma-Aldrich
Dimetil sulfóxido (DMSO)
Disolvente orgánico.
Sigma-Aldrich
Dinitrocatecol (OR-486)
Inhibidor de la COMT.
Tocris
Dizocilpina ((+)-MK- 801 Antagonista NMDA no Tocris
maleato)
competitivo.
Dopamina
Utilizado como patrón.
Sigma-Aldrich
Glicina
Utilizado como patrón.
Sigma-Aldrich
Glutamato
Utilizado como patrón.
Sigma-Aldrich
Hidrato de cloral
Anestésico.
Sigma-Aldrich
Isatina
Inhibidor de la MAO- B. Sigma-Aldrich
L-dihidroxifenilalanina (L- Precursor
DOPA)
84
dopamina.
de
la Sigma-Aldrich
MATERIAL Y MÉTODOS
L-dihidroxifenilalanina
Precursor
de
la Sigma-Aldrich
metil-éster clorhidrato (L- dopamina.
DOPA
metil-éster
clorhidrato)
L-NG-nitroarginina
metil- Inhibidor de la NOS.
Sigma-Aldrich
éster (L- NAME metil-éster)
N-Acetil-Cisteína (NAC)
Reactivo
para Sigma-Aldrich
derivatización
Nomifensina maleato
Inhibidor del DAT.
O-ftalaldehído (OPA)
Reactivo
Sigma-Aldrich
para Sigma-Aldrich
derivatización
Reserpina
Inhibidor
del Sigma-Aldrich
empaquetamiento
vesicular
de
catecolaminas
y
serotonina.
Ropinirol clorhidrato
Agonista
receptores
de
D3
los Sigma-Aldrich
de
dopamina.
Selegilina clorhidrato
Inhibidor de la MAO- B. Sigma-Aldrich
Taurina
Utilizado como patrón.
Tetrodotoxina (TTX)
Inhibidor selectivo de los Tocris
canales
de
Sigma-Aldrich
Na+
dependientes de voltaje.
Tropolona
Inhibidor de la COMT.
Sigma-Aldrich
Tabla 3.1: Listado de los reactivos donde se muestran los compuestos utilizados, su
acción y su procedencia.
85
MATERIAL Y MÉTODOS
3.3. MICRODIÁLISIS CEREBRAL
Para la administración intraestriatal de compuestos y recogida de las
muestras se utilizó la técnica de microdiálisis cerebral.
3.3.1.
Fundamentos de la técnica
3.3.1.1.
Breve reseña histórica y estado actual de la técnica
La microdiálisis cerebral es una técnica de muestreo, relativamente
novedosa, que se ha utilizado principalmente en la caracterización
neurofarmacodinámica de compuestos en animales de experimentación in
vivo. Aunque la microdiálisis se puede aplicar en una gran diversidad de
órganos y sistemas, su aplicación principal se puede observar en la
investigación de la neurotransmisión y en particular en los efectos de
fármacos sobre las monoaminas y aminoácidos neurotransmisores
(Bourne 2003; Darvesh et al. 2011).
Aunque inicialmente las aplicaciones de la microdiálisis se han
descrito dentro de la investigación en Neurociencia, debido a su
versatilidad, actualmente la microdiálisis no se aplica únicamente en esta
área. En los últimos años adquirió relevancia en el campo de la Medicina
clínica debido a su utilidad como potencial herramienta para la
monitorización, el diagnóstico y el estudio farmacocinético de
compuestos en fase clínica (Müller 2002; Tisdall y Smith 2006; Shannon
et al. 2013).
Podemos atribuir la invención de esta técnica a Bito, quien en 1966,
describió la posibilidad de obtener una muestra de aminoácidos y otros
electrolitos libres en el líquido extracelular cerebral y en el plasma
sanguíneo de perro mediante la utilización de una membrana
semipermeable. Posteriormente en 1972, Delgado y su equipo
86
MATERIAL Y MÉTODOS
desarrollaron una versión primitiva de las sondas de microdiálisis denominadas “dialitrodo”- para la realización de una perfusión continua
intracerebral en monos despiertos. Ungersted y Pycock llevaron a cabo el
perfeccionamiento de esta técnica, consiguiéndose de este modo en 1974
la primera puesta a punto de la microdiálisis in vivo (Chaurasia 1999;
Chaurasia et al. 2007; Chefer et al. 2009).
A partir del año 1960 se pueden contabilizar más de 11.000
publicaciones científicas en las que se utiliza la microdiálisis cerebral, de
las cuales más de 1.600 con aplicaciones en humanos. Los estudios en
humanos comenzaron en la década de 1990 con el objetivo de determinar
la concentración de diversas sustancias en el espacio extravascular
(Chaurasia 1999; Chaurasia et al. 2007; Chefer et al. 2009).
Tradicionalmente, esta técnica únicamente se utilizaba para la
determinación intersticial de compuestos endógenos y fármacos. Sin
embargo, posteriormente se ha ejecutado la administración de compuestos
a través de la sonda, lo que se denomina “diálisis inversa” o “retrodiálisis”
(Figura 3.1) (Höcht et al. 2007).
Figura 3.1: Secuenciación temporal y eventos en un experimento de microdiálisis
inversa. NT: Neurotransmisor, M: Metabolitos (modificado de Höcht et al. 2013).
87
MATERIAL Y MÉTODOS
3.3.1.2.
Descripción de la técnica
La microdiálisis cerebral es una técnica neuroquímica de muestreo que
se rige por el principio de diálisis mediante la introducción de una
membrana semipermeable en el tejido. Este principio se basa en la ley de
difusión de Fick, que consiste en el paso de moléculas a favor de un
gradiente de concentración. Aunque la difusión es el proceso por el que se
transporta el analito en la membrana, se pueden producir otros procesos
como la ultrafiltración por la modificación de la presión durante el manejo
manual de las jeringas.
En términos generales, la microdiálisis cerebral consiste en un sistema
cerrado basado en la implantación de un una sonda de microdiálisis
mediante cirugía estereotáxica. La sonda de microdiálisis es un dispositivo
metálico que presenta un tubo de entrada y uno de salida. En la parte
inferior del dispositivo se le acopla una membrana semipermeable, aunque
existen diversos diseños de sondas.
La sonda de microdiálisis es uno de los elementos principales de esta
técnica. Mediante una bomba de infusión por un extremo de la sonda (tubo
de entrada) se administra un líquido de perfusión fisiológicamente
compatible a un flujo constante (generalmente de 0,3 a 3 µl/min) y por el
extremo libre (tubo de salida) se recogen las muestras a intervalos
regulares (los tiempos de recolección oscilan de 1 a 20 minutos). Puesto
que la membrana de la sonda es semipermeable, las sustancias atraviesan
la membrana en base al gradiente de concentración entre el medio de
perfusión y el espacio extracelular, mimetizando la función de un capilar
sanguíneo (Figura 3.2). La permeabilidad de membrana generalmente se
limita a compuestos con una masa molecular menor a 100 000 Dalton,
dependiendo del al tamaño de poro utilizado y del material de la
membrana. Por tanto son muestras purificadas libres de proteínas.
88
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 3.2: La sonda de microdiálisis mimetiza la función de un vaso sanguíneo.
Cortesía de CMA Microdialysis.
El paso se realiza en ambos sentidos
lo que permite la obtención de sustancias
endógenas y la administración exógena
de
compuestos,
tanto
en
animales
anestesiados como en libre movimiento
(Chaurasia et al. 2007; Höcht et al. 2007;
Chefer et al. 2009; Darvesh et al. 2011).
Una vez obtenidos los dializados pueden ser analizados por medio de
diversas técnicas analíticas. En este trabajo se utilizó HPLC con detección
electroquímica y fluorimétrica para determinar los compuestos que se
encuentran en las muestras y la concentración de los mismos.
3.3.1.3.
Características de la microdiálisis cerebral
En contraste con otras técnicas, la microdiálisis permite un continuo
muestreo de compuestos de bajo peso molecular con una perturbación
mínima del sistema que se está estudiando. Diversos estudios han
demostrado su elevada sensibilidad en el muestreo de sustancias en el
espacio extracelular de regiones cerebrales discretas, como el núcleo
estriado, así como en la monitorización de la acción de sustancias
exógenas (Chaurasia 1999; Bourne 2003).
La microdiálisis cerebral in vivo presenta un amplio número de
aplicaciones dentro de la Neurociencia: monitorizar alteraciones en los
niveles basales de neurotransmisores ante la exposición a fármacos (tanto
local como sistémica), monitorizar los compuestos en el líquido
extracelular, administrar fármacos y toxinas en el espacio extracelular en
regiones cerebrales concretas, modificar las concentraciones locales de
89
MATERIAL Y MÉTODOS
iones por medio del dializado, monitorizar los niveles de fármacos y sus
metabolitos, correlacionar modificaciones conductuales con alteraciones
en la neurotransmisión, microestimulación de las vías próximas a la sonda
evocando un incremento de neurotransmisor, determinar las constantes de
eliminación en los estudios de binding in vivo y monitorizar eventos
neuroquímicos en el espacio extracelular (Khan y Shuaib 2001; Bourne
2003; Plock y Kloft 2005). Las principales ventajas y limitaciones que
presenta esta técnica se muestran en la Tabla 3.2.
Ventajas



Limitaciones
Recolección de sustancias en el lugar

de acción y liberación directa en el
tisular,
tejido diana.
alteraciones en la permeabilidad de
Facilidad de trabajo con sondas de
la
características muy similares.
Aunque
Muestreo
continuo




Posibilidad
de
acoplar
diversos

invasiva
y
bien
Limitada resolución espacial y
Baja recuperación para moléculas
Requiere un análisis sensitivo y
sistémica y local de sustancias,
Nivel absoluto de compuesto en
tejido
difícil
de
estimar,
la
recuperación de la sonda no alcanza
Compatibilidad con: administración
estimulación y registro
considerada
volúmenes de muestra.
sistemas de análisis químicos.

es
capaz de trabajar con pequeños
Ausencia de degradación enzimática
de neurotransmisores.

hemato-encefálica.
de elevado peso molecular.
Obtención de muestras purificadas
(libres de proteínas).
y
temporal.
Facilidad para establecer una base de
trabajo rutinaria.
barrera
reactiva
tolerada.

de fluido biológico.
gliosis
mínimamente
altamente
dinámico, por lo que no existe pérdida

Técnica invasiva que genera daño
el 100%.

Dificultad asociada a compuestos
electrofisiológico, estudios
lipofílicos y compuestos unidos a
comportamentales.
proteínas.
Tabla 3.2: Ventajas y limitaciones de la microdiálisis cerebral.
90
MATERIAL Y MÉTODOS
En relación a las características de la microdiálisis, esta técnica ha sido
muy empleada para el estudio de monoaminas por diversas razones:

Las monoaminas están ampliamente distribuidas en el sistema
nervioso central y periférico.

Están implicadas en una gran variedad de funciones y su alteración
contribuye a un gran número de patologías y trastornos (EP, depresión,
dolor, adicciones…).

La concentración extracelular de monoaminas es elevada y se ubica
en estructuras de gran tamaño, como en el núcleo estriado.

Sus características físico-químicas están bien caracterizadas y se
dispone de instrumentación analítica sensible para su cuantificación
en los dializados (Chefer et al. 2009).
En comparación con otras técnicas de administración de compuestos,
como la microinfusión, presenta las siguientes ventajas: no incrementa el
volumen en el tejido de estudio, permite una concentración estable de
compuesto en el tejido en la administración crónica, permite acceder a un
tejido diana de mayor tamaño atendiendo a la superficie de membrana y
facilita estudios dosis-respuesta en el mismo animal puesto que no es
necesario el reimplante de la sonda para sucesivas dosis. Frente a otras
técnicas de muestreo, como la voltametría, la microdiálisis permite la
administración de compuestos para su estudio, aunque presenta menor
resolución temporal y requiere un equipo específico para el análisis de los
dializados (Bourne 2003; Höcht et al. 2007).
3.3.2.
Implantación de la sonda en el núcleo estriado
La obtención de dializados cerebrales requiere la implantación, por
medio de cirugía estereotáxica, de una cánula-guía que sirva de soporte de
la sonda. La implantación de la cánula-guía se realizó con ayuda de un
aparato de estereotaxia, un dispositivo mecánico que fija totalmente la
91
MATERIAL Y MÉTODOS
cabeza del animal, permitiendo llegar con precisión a cualquier punto del
cerebro atendiendo a las coordenadas estereotáxicas especificadas en un
atlas estereotáxico. Dicho atlas estereotáxico proporciona las coordenadas
exactas en las tres direcciones del espacio (antero-posterior AP, lateral L
y vertical V) con respecto a los puntos estereotáxicos de referencia
(Paxinos y Watson 1986).
En esta investigación, para la intervención quirúrgica los animales
fueron anestesiados con hidrato de cloral (400 mg/kg i.p.) y fijados en el
aparato de estereotaxia (Nashigire SR-6) para la implantación de una
cánula-guía. Dichas cánulas-guía han sido comerciales y del tipo CMA/12
(CMA/ Microdialysis, Suecia). Para la implantación intraestriatal de la
cánula-guía se siguieron las siguientes coordenadas establecidas por el
atlas estereotáxico de Paxinos y Watson (1986): antero-posterior= 1.0
mm, lateral= 3.0 mm y vertical= 6.0 mm; tomando como punto de
referencia el Bregma (punto de corte de la sutura longitudinal con la
primera sutura transversal del cráneo). De este modo, toda la membrana
de la sonda queda introducida en el estriado. Para alcanzar dichas
referencias se realizó un corte longitudinal en la superficie craneal,
después se efectuó un orificio en el cráneo por el cual se introdujo la
cánula-guía mediante el micromanipulador del estereotáxico. En este
punto la cánula se fijó por medio de cemento acrílico. Para favorecer la
adhesión del cemento acrílico se colocaron dos tornillos en el cráneo en
los huesos craneales adyacentes (Figura 3.3).
92
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 3.3: 1.Procedimiento para la implantación de la cánula-guía y colocación
de la sonda. En la sección A se introduce la cánula a través del orificio craneal y se
coloca el tornillo de fijación, en la sección B se coloca el cemento dental para la fijación
de la cánula. Previamente a la experimentación (sección C y D) se retira el protector de
la cánula y se introduce la sonda. 2. Presentación histológica de la localización de la
sonda de microdiálisis en el núcleo estriado de acuerdo con las coordenadas del atlas
estereotáxico de Paxinos y Watson para el estriado: AP=1.0, L=3.0 y V=6.0 mm
(Campos et al. 2008).
En todos los experimentos los animales fueron operados bajo las
mismas condiciones. Tras la cirugía estereotáxica se esperó 24 h para
comenzar la recogida de muestras con el fin de permitir la recuperación
post-quirúrgica (trauma generado en el tejido, alteración de la
permeabilidad de la barrera hemotencefálica y gliosis reactiva). Una vez
pasado este período se retiró el protector de la cánula-guía y se colocó la
sonda, dando comienzo a la experimentación. Las sondas comerciales
para microdiálisis utilizadas fueron el modelo CMA/12 14/03 PES (CMA/
Microdialysis, Suecia) con una membrana de diálisis de polietersulfona
(PES) de 3mm de longitud y 0,5 mm de diámetro externo. La parte
metálica de la sonda tiene una longitud de 14 mm, un diámetro externo de
0,64 mm y un volumen interno de 3 µl (Figura 3.4).
93
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 3.4: Representación de la sonda de microdiálisis, en color gris se representa
los compuestos endógenos que atraviesan la membrana para ser analizados
posteriormente. En color naranja se representa el compuesto administrado en el líquido
de perfusión que llega al espacio intersticial (modificada de Plock y Kloft 2005).
Una vez finalizado el experimento se extrajo el cerebro del animal y
se realizó la comprobación histológica de la ubicación de la sonda
mediante un examen macroscópico, efectuando para ello un corte coronal
a la altura de la entrada de la sonda, como se observa en la Figura 3.3.
3.3.3.
Administración de sustancias y recogida de muestras
Una vez colocada la sonda se conectó mediante tubos de teflón –
etileno-propileno fluorado- (0,65 mm de diámetro externo y 0,12 mm de
diámetro interno) a una bomba de microdiálisis CMA/402 (CMA
Microdialysis, Suecia) a través de la cual se perfundió una solución Ringer
(NaCl 147 mM, KCl 4 mM, CaCl2 3,4 mM; pH=7,4) a un flujo constante
de 1,5 µl/min. Las muestras se recogieron cada 20 minutos mediante un
microcolector de fracciones CMA/142 (CMA Microdialysis, Suecia).
Considerando el flujo de perfusión y el tiempo de recolección el volumen
final de cada muestra fue de 30 µl.
94
MATERIAL Y MÉTODOS
En la Figura 3.5 se muestra el equipo suministrado por
CMA/Microdialysis (CMA Microdialysis, Suecia) para la realización de
los experimentos de microdiálisis cerebral.
Figura 3.5: Equipo suministrado por CMA Microdialysis que se empleó en la
experimentación. A. Sonda de microdiálisis/12. B. Cánula-guía CMA/12. C. Tubería de
teflón. D. Adaptadores de tubería. E. Tornillo de anclaje para cirugía estereotáxica. F.
Bomba de infusión CMA/402. G. Microjeringa de 1 ml. H. Microcolector de fracciones
CMA/142. Cortesía de CMA Microdialysis.
Los experimentos llevados a cabo en este trabajo de experimentación
han tenido una duración de 3 y 4 horas. En ambos casos la primera y la
última hora se corresponden con la administración de una solución Ringer
para establecer los niveles basales de neurotransmisores y la restauración
95
MATERIAL Y MÉTODOS
a las condiciones basales, respectivamente. Los experimentos de 3 horas
de duración se han realizado para evaluar los efectos de la isatina y la
coadministración
de
isatina
con
otros
compuestos
sobre
la
neurotransmisión. Los experimentos de 4 horas se han realizado cuando
era necesario un pretratamiento o se aplicó una solución Ringer
modificada.
El protocolo experimental para cada grupo se detallará posteriormente
en el apartado específico. Las Figuras 3.6 y 3.7 muestran los cronogramas
generales de los protocolos experimentales.
Figura 3.6: Cronograma representativo de un experimento de 3 horas de duración.
En la parte superior se muestra el compuesto aplicado en cada período temporal y en la
parte inferior el número de muestras.
Figura 3.7: Cronograma representativo de un experimento de 4 horas de duración.
En la parte superior se muestra el compuesto aplicado en cada período temporal y en la
parte inferior el número de muestras.
96
MATERIAL Y MÉTODOS
3.3.4.
Rendimiento de las sondas de microdiálisis cerebral
En toda experimentación en la que se trabaja con microdiálisis es
necesario considerar que no se recolecta el 100% de las sustancias
presentes en el medio extracelular que rodea a la sonda, sino que se recoge
tan solo una fracción del total dependiendo de los factores que se exponen
a continuación (Tabla 3.3).
•Flujo de la bomba de microdiálisis: La concentración de analito por muestra
(recuperación relativa) es inversamente proporcional al flujo aplicado. Además, al
reducir el flujo aplicado las tasas de agotamiento de analito próximo a la sonda
decrecen. Por el contrario, la recuperación absoluta de analito (volumen de dializado)
es proporcional al flujo aplicado, de este modo para obtener un volumen suficiente de
muestra es necesario incrementar el flujo aunque de este modo se reducirá la eficiencia
del muestreo y se pueden producir más alteraciones sobre el tejido que se aplica.
•Propiedades de la membrana (longitud y Cut-Off): La recuperación es
proporcional a la superficie de la membrana. La longitud de la membrana está limitada
por el tamaño de la estructura de estudio. Los materiales de membrana también
influyen en la recuperación, los más utilizados son: celulosa regenerada,
poliacrilonitrilo y éter-policarbonato.
•Propiedades del analito: Mediante microdiálisis se pueden recolectar un gran
número de analitos, dependiendo de las condiciones de recolección la recuperación
relativa presentará grandes variaciones. Las principales características del analito que
influyen en la recuperación relativa son: el peso molecular y su hidrofobicidad; cuanto
mayor sean ambas menor será la recuperación.
•Otros factores: La temperatura influye sobre el coeficiente de difusión de diferentes
moléculas y este se incrementa 1-2% por cada grado Celsius. Otros factores que
influyen son factores tisulares, la difusión es menor que en una solución acuosa, esto
se debe principalmente al reducido volumen de fluido y a la elevada trayectoria de
difusión en el tejido (tortusidad).
Tabla 3.3: Factores que limitan la recuperación in vivo en experimentos de
microdiálisis (Khan y Shuaib 2001; Chaurasia et al. 2007; Chefer et al. 2009).
97
MATERIAL Y MÉTODOS
Efecto de la longitud de membrana (A) y el
flujo aplicado (B) sobre la recuperación.
A
B
Figura 3.8: Gráficas proporcionadas por CMA Microdialysis que muestran la
recuperación relativa de las sondas CMA/12 en función de la longitud de la membrana
(A) y en función del flujo aplicado (B).
Para conocer la cantidad de sustancia a analizar que atraviesa la
membrana
de
la
sonda
bajo
unas
determinadas
condiciones
experimentales es necesario calcular la recuperación relativa de la sonda.
Podemos definir la recuperación relativa de la sonda como la relación
entre la concentración de una sustancia medida en el dializado recogido
(Cdializado) y su concentración en el medio exterior a la membrana de
diálisis (Cexterior), en este caso el medio extracelular. Esta recuperación se
puede determinar tanto in vivo como in vitro y se expresa como porcentaje
(Chaurasia 1999; Khan y Shuaib 2001; Watson et al. 2006).
98
MATERIAL Y MÉTODOS
3.3.4.1.
Cálculo de la recuperación y administración in vitro
El cálculo de la recuperación in vitro llevado a cabo en este trabajo de
investigación se realizó como se describe a continuación. Se colocó la
sonda en un vial con los patrones de las sustancias de estudio (dopamina,
DOPAC, HVA, glutamato, aspartato, glicina, taurina) disueltas en Ringer
en una concentración de 1ng/µl. Posteriormente se perfundió una solución
Ringer en las mismas condiciones que se realizó la experimentación (flujo
1,5 µl/min). Una vez obtenidos los dializados estos se analizaron mediante
HPLC con detección electroquímica para las aminas y con detección
fluorimétrica (derivatización OPA-NAC) para los aminoácidos. La
metodología se muestra en la Figura 3.9 –A. Finalmente se contrastaron
los valores cromatográficos que muestran la solución de patrones
inyectados directamente en el cromatógrafo (Cexterior) y el dializado
(Cdializado) aplicando la siguiente fórmula:
Recuperación in vitro= (Cdializado /Cexterior) x 100
La tasa de difusión de isatina a través de la sonda también fue
calculada in vitro. La isatina fue disuelta en una solución Ringer a una
concentración 10 mM y fue colocada en la microjeringa de la bomba de
microdiálisis, para ser perfundida en una solución Ringer donde se ubicó
la sonda. La metodología se muestra en la Figura 3.9 –B. Finalmente, se
analizó la solución Ringer en la que se ubicó la sonda y se comparó con
el patrón de concentración conocida, siguiendo la metodología descrita
por Manabe et al. (1997). Las condiciones de administración fueron las
mismas que durante la experimentación in vivo.
Administración in vitro= (Clíquido sonda /Cmicrojeringa) x 100
99
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 3.9: Cálculo de la recuperación in vitro (A) y cálculo del paso de
sustancias administradas a través de la membrana (B) (modificada de Plock y Kloft
2005).
En la Tabla 3.4 se muestran los valores de recuperación in vitro
(expresados en %) obtenidos para: dopamina, sus metabolitos,
aminoácidos neurotransmisores y los valores para la administración de
isatina.
100
MATERIAL Y MÉTODOS
Valores medios de recuperación de
las sondas utilizadas en este trabajo
Compuesto
Recuperación sonda (%)
ASP
14,29 ± 0,65
DA
13,45 ± 0,83
DOPAC
14,14 ± 0,93
GLI
12,29 ± 3,24
GLU
13,52 ± 1,53
HVA
19,75 ± 1,13
TAU
12,10 ± 2,97
ISA
1,01 ± 0,09
Condiciones de trabajo
3 mm
Membrana
1,5 µl/ min
Flujo
Cut off
100 000 Dalton
Membrana
PES
Tabla 3.4: Porcentaje de recuperación de las sondas utilizadas en esta
investigación. Se expresan como la media ± E.E.M. de 41 sondas.
En la interpretación de los resultados obtenidos por microdiálisis los
métodos de cuantificación y cálculo de la recuperación suponen una
temática controvertida. El cálculo de la recuperación in vitro presenta las
ventajas de que posee una detección más sensitiva debido a la facilidad
del muestreo y permite el almacenaje de las muestras. Sin embargo, la
resistencia impuesta in vitro no se corresponde con la resistencia impuesta
por el tejido, por lo que en el análisis de resultados es necesario tener en
cuenta esa diferencia, la recuperación in vivo será menor que in vitro
(Watson et al. 2006; Chefer et al. 2009).
101
MATERIAL Y MÉTODOS
3.4. ANÁLISIS DE LOS DIALIZADOS: CROMATOGRAFÍA
DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
El análisis de neurotransmisores en dializados requiere métodos
analíticos sensitivos para su cuantificación. En la actualidad disponemos
de diversas metodologías. La cromatografía de líquidos con detección
electroquímica ha sido comúnmente seleccionada para el análisis de
catecolaminas en dializados. Esto se debe a que la separación en columna
simplifica la detección simultánea de los compuestos en un período de
tiempo adecuado. Por otra parte, la detección de aminoácidos en
dializados mediante detección fluorimétrica permite medir cantidades del
orden de picogramos utilizando o-ftalaldehído (OPA) como derivatizador,
aunque los tiempos de retención son ligeramente mayores (Perry et al.
2009; Zapata et al. 2009).
Las muestras obtenidas mediante microdiálisis cerebral fueron
analizadas por cromatografía de líquidos de alta resolución con detección
electroquímica (HPLC-EC) para la determinación de dopamina y sus
metabolitos. El análisis de aminoácidos neurotransmisores en los
dializados fue llevada a cabo mediante HPLC con detección fluorimétrica
(derivatización con OPA-NAC).
3.4.1.
Fundamentos de la técnica
3.4.1.1.
Breve reseña histórica
Podemos considerar que los inicios de la HPLC se remontan a la
aproximación teórica realizada por Martin y Synge en 1941, donde
postulan que se puede conseguir una mayor eficacia en la cromatografía
de líquidos disminuyendo el tamaño de la partícula de la fase estacionaria
e incrementando la presión en la fase móvil utilizada.
102
MATERIAL Y MÉTODOS
A finales de 1960 se comienzan a realizar los primeros trabajos
experimentales en los que se describe la HPLC. En estos trabajos se
empieza a introducir diversas capas en las columnas cromatográficas con
partículas de 40 µm de diámetro. En este período destaca la aportación de
investigadores como: Horvath, Huber, Snyder y Kirkland, entre otros.
Desde entonces, la HPLC ha sufrido un importante proceso de
perfeccionamiento, extendiéndose su utilización más allá de la
investigación (Karger 1997; Snyder 1997).
Ungerstedt y colaboradores fueron los primeros en combinar HPLC
con detección electroquímica para analizar la dopamina y sus metabolitos
en dializados cerebrales. Desde comienzos de los 80 esta técnica fue
mejorada por diversos laboratorios hasta convertirse en un método
sensitivo con el que cuantificar catecolaminas e indolaminas (Zapata et al.
2009).
Actualmente, la HPLC
ha comenzado a
dar paso
a la
ultracromatografía de líquidos de alta eficacia (UPLC) en algunos diseños
experimentales, ya que presenta mayor sensibilidad, lo que permitiría
menor volumen de muestra y menor cantidad de analito, con lo que se
consigue mayor resolución temporal. Además una mayor resolución de
picos permite un mejor análisis de los pequeños picos próximos a los
metabolitos (Reinhoud et al. 2013).
3.4.1.2.
Descripción de la técnica
La cromatografía de líquidos es una técnica de separación en la cual
una muestra se distribuye en las dos fases del sistema cromatográfico.
Presenta una fase estacionaria (columna) que se caracteriza por ser sólida,
porosa y con sustancias activas en sus paredes en forma de partículas de
103
MATERIAL Y MÉTODOS
pequeño diámetro. Por otra parte, la fase móvil está formada por un
líquido, existiendo diferentes tipos de solventes para su composición.
La cromatografía se basa en la retención que sufren los componentes
de una muestra cuando se hacen pasar a través de la fase sólida
estacionaria (columna cromatográfica) empujados por una fase líquida
(fase móvil). Existen diversos mecanismos de retención, aunque lo
característico es que en todas las muestras, en las mismas condiciones, los
diferentes compuestos presentan tiempos de retención específicos
(Bidlingmeyer 1992; Meyer 2010).
En función de la polaridad de la fase móvil y de la fase estacionaria
podemos definir dos modalidades de cromatografía: cromatografía en fase
normal y cromatografía en fase inversa.
En la cromatografía en fase normal la fase móvil es apolar y la fase
estacionaria es polar. Por tanto, un compuesto será más fuertemente
retenido cuanto más polar sea, eluyendo más tarde que los componente
apolares. En cambio, en la modalidad en fase inversa la fase móvil es polar
y la estacionaria apolar, por lo que existirá mayor retención en la columna
para los componentes apolares aumentando su tiempo de retención, ya que
los componentes polares se transportan con mayor facilidad en la fase
móvil (Meyer 2010).
Asimismo, en función de la fase móvil podemos decir que la
separación se produce en condiciones isocráticas cuando la composición
de la fase móvil no se modifica y se denomina cromatografía en gradiente
cuando la composición de la fase móvil se modifica durante el
experimento.
La modalidad de cromatografía utilizada en esta investigación es
cromatografía en fase inversa bajo condiciones isocráticas; es decir, en la
104
MATERIAL Y MÉTODOS
técnica cromatográfica empleada en este trabajo la fase estacionaria fue
apolar y la fase móvil polar, no realizándose modificaciones en la
composición de la misma a lo largo del experimento.
Como se ha descrito anteriormente, la cromatografía es una técnica de
separación, sin embargo una vez separados los compuestos deben ser
cuantificados por medio de otras técnicas. En este caso se utilizó para las
monoaminas la detección electroquímica, que se caracteriza por ser
altamente sensible, de bajas dimensiones y presentar un coste y unos
requerimientos energéticos bajos. Puesto que la detección electroquímica
no requiere derivatización de la muestra (como la detección fluorimétrica)
resulta un método más sencillo para el análisis de catecolaminas, aunque
es más sensible a los cambios de flujo de la bomba, incrementado la
relación de señal-ruido (Bicker et al. 2013).
En términos generales, la detección electroquímica se basa en la
medida de corriente resultante de la reacción de oxidación-reducción de
los analitos del dializado. Esta corriente es inducida por electrodos
ajustados a un determinado potencial. Podemos diferenciar dos
modalidades de detección electroquímica en HPLC: amperométrica y
coulométrica. En la amperométrica solo una fracción de analito es oxidada
o reducida (normalmente del 5 al 15 %), mientras que en la detección
coulométrica se produce la conversión del 100 % del analito (Tsunoda
2006; Zapata et al. 2009).
La detección coulométrica se considera más sensible y específica,
mostrando límites de detección más bajos que la amperométrica;
requiriendo menor volumen de muestra. Igualmente la detección
coulométrica muestra mejores resultados para la detección de todos los
analitos relacionados con el catabolismo dopaminérgico.
105
MATERIAL Y MÉTODOS
El detector coulométrico se compone de una célula analítica con dos
electrodos ajustados a diferentes voltajes, de manera que se incrementa la
selectividad de detección. El primer electrodo realiza la oxidación de los
compuestos que no resultan de interés para el análisis y que pueden
interferir en el registro del analito de interés. El segundo electrodo se
ajusta al potencial de análisis para inducir la reacción electroquímica de
los analitos de interés, para ello se realiza habitualmente un voltamograma
hidrodinámico (Bicker et al. 2013).
Para poder trabajar con detección electroquímica es necesario que los
compuestos analizados sean electroactivos, es decir, que sean susceptibles
de ser oxidados o reducidos a un potencial óptimo. La oxidación o
reducción del compuesto genera una corriente que es directamente
proporcional a la concentración del analito. Se ha evidenciado que la
detección electroquímica permite una correcta determinación de la
dopamina y sus metabolitos, ya que son fácilmente convertidos en
quinonas y no se requiere derivatización (Durán et al. 1998; Tsunoda
2006).
Por otra parte, la mayoría de aminoácidos son pequeñas moléculas
alifáticas que no poseen fluorescencia ni capacidad electroactiva, lo que
dificulta su análisis mediante HPLC. Para ello se requiere un proceso de
derivatización que genere un aducto fluorescente. Existen diversos
derivatizadores
utilizados
para
el
análisis
de
aminoácidos
neurotransmisores, siendo el OPA uno de los que más se ha utilizado.
Además, este presenta la ventaja sobre otros reactivos de que por sí mismo
no presenta fluorescencia. El OPA reacciona con los aminoácidos en
presencia de N-acetil-cisteína (NAC) para generar diastereoisómeros que
pueden ser analizados por medio de HPLC en fase inversa (Shah et al.
2002; Fukushima et al. 2003).
106
MATERIAL Y MÉTODOS
Podemos dividir los métodos de derivatización en dos categorías:
precolumna y postcolumna. Los agentes de derivatización son aplicados
generalmente mediante los métodos precolumna, es decir antes de la
separación cromatográfica. Además este tipo de derivatización posee la
ventaja de que incrementa la hidrofobicidad de los analitos lo suficiente
para que sean retenidos en una fase estacionaria en modo inverso
(Fukushima et al. 2003).
Tras la separación en la columna los analitos son analizados mediante
un detector de fluorescencia. La fluorescencia consiste en un proceso de
emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de
radiación electromagnética. Las especies excitadas pasan al estado
fundamental por medio de la liberación del exceso de energía en forma de
fotones, que son captados por el detector. Una lámpara emite una fuerte
radiación, que es recogida por un filtro que determina el ancho de banda
espectral de interés y enfoca este haz sobre una célula. Otra lente recoge
la energía fluorescente, que es liberada de la célula por la estimulación del
haz excitador, para llevarla a un fotomultiplicador que mide la
fluorescencia emitida.
Tanto en la detección electroquímica como en la fluorimétrica, el
registro resultante de la separación de compuestos de la muestra tras su
paso por el cromatógrafo y el equipo de detección se denomina
cromatograma, en el cual cada sustancia se representa por un pico
cromatográfico. La identificación de los componentes en el cromatograma
se puede realizar utilizando patrones de sustancias puras y de esta forma
se puede determinar el tiempo de retención característico para cada
sustancia específica. La cuantificación se puede realizar comparando la
altura de los picos o el área de los picos con los de patrones de
concentración conocida.
107
MATERIAL Y MÉTODOS
3.4.2.
Equipo cromatográfico
Los componentes comunes de los equipos de cromatografía de
líquidos son: un sistema de bombeo para impulsar la fase móvil a un flujo
constante, una válvula de inyección para introducir la muestra en el
sistema a alta presión y a un flujo continuo, una columna (que contiene la
fase estacionaria), un detector y un sistema de registro para obtener los
cromatogramas.
3.4.2.1.
Equipo cromatográfico para la detección de dopamina y sus
metabolitos
En este trabajo de investigación se utilizó un sistema de bombeo Jasco
PU-980 de doble pistón, una válvula de inyección Rheodyne 7125 con un
bucle de inyección de 20 µl y una columna de fase inversa Dionex C18 de
una longitud de 15 cm y 5 µm de tamaño de partícula.
La detección se realizó mediante un detector electroquímico ESA
Coulochem III, dotado de una célula de detección ESA 5011A. El
potencial de oxidación al que se ajustó el primer electrodo fue de + 50
mV, mientras que el electrodo de análisis fue de +400 mV, ya que este
potencial nos permite detectar la dopamina y sus metabolitos evitando el
registro de otros compuestos no deseados. La determinación de este
potencial se realizó mediante un voltamograma hidrodinámico de patrones
(Figura 3.10).
108
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 3.10: Voltamograma hidrodinámico de patrones de DOPAC, dopamina
(DA) y HVA. Se observa la respuesta cromatográfica de los patrones a los diferentes
potenciales aplicados en mV. Se puede apreciar como a 400 mV se obtiene una adecuada
respuesta para los tres compuestos.
Los datos han sido analizados con el programa de software
cromatográfico Cromanec XP versión 1.0.4 (Micronec, España).
3.4.2.2.
Equipo cromatográfico para la detección de aminoácidos
Para la detección de aminoácidos se utilizó un sistema de bombeo
Jasco PU-980 de doble pistón, una válvula de inyección Rheodyne 7125
con un bucle de inyección de 20 µl y una columna de fase inversa
Kromasil 100 C18 (25 cm de longitud y 5 µm de tamaño de partícula). Se
muestra en la Figura 3.11.
109
MATERIAL Y MÉTODOS
La detección se realizó mediante un detector de fluorescencia CMA
280 (CMA Microdyalisis, Suecia). Como fuente de excitación utiliza una
lámpara de tungsteno de 20 W, con una longitud de excitación entre 340360 nm y una longitud de emisión entre 395-545 nm. La determinación de
la sensibilidad para la detección de cada aminoácido fue puesta a punto
mediante el análisis de patrones. Los datos han sido analizados con el
programa de software cromatográfico Cromanec XP versión 1.0.4
(Micronec, España).
Figura 3.11 : Equipo cromatográfico utilizado en la experimentación. A. válvula de
inyección Rheodyne 7125. B. Bomba Jasco PU-980. C. Tubería y adaptadores para
HPLC. D. Columna cromatográfica. E. Detector electroquímico ESA Coulochem III
(para análisis de la dopamina y sus metabolitos). F. Detector de fluorescencia CMA 280
(para análisis de aminoácidos). G. Célula analítica ESA 5011A.
110
MATERIAL Y MÉTODOS
3.4.3.
Condiciones cromatográficas para la determinación de
dopamina y sus metabolitos
La detección electroquímica depende de la transferencia electrónica
entre la fase móvil y el electrodo de detección. La fase móvil debe tener
una constante dieléctrica suficientemente alta para permitir la ionización
del electrolito y debe ser electroquímicamente inerte a la superficie del
electrodo. Por tanto, la composición de la fase móvil resulta crítica
(Zapata et al. 2009).
Para el análisis de la dopamina, DOPAC y HVA se utilizó un solvente
formado por KH2PO4 100mM, SOS 1mM, EDTA 1mM y 5% de metanol.
El pH fue ajustado a 3,4 con ácido fosfórico (H3PO4). Una vez preparada
la fase móvil se filtró a través de un filtro Whatman de 0,45 µm y se
desgasificó con helio. El flujo al que se ajustó la bomba de la fase móvil
fue de 1,5 ml/min, con una presión aproximada de 165 kg/cm2.
Estas
condiciones
cromatográficas
fueron
desarrolladas
específicamente para el estudio de la liberación de dopamina y sus
metabolitos en el núcleo estriado de rata. De este modo se consigue una
buena separación de dopamina, DOPAC y HVA en un tiempo total de
registro inferior a 20 minutos. Estas condiciones de trabajo han sido
utilizadas recientemente en nuestro laboratorio para la caracterización de
los efectos de diversas sustancias sobre la dopamina en el núcleo estriado
(Ferreira-Nunes et al. 2010; Machado et al. 2010; Faro et al. 2012a; Faro
et al. 2013).
Por otra parte, la composición, la polaridad y el pH de la fase móvil
evita que el registro sea afectado por otros picos cromatográficos
pertenecientes a sustancias del dializado que no son objeto de estudio,
como es el caso del ácido úrico derivado del metabolismo celular (Durán
et al. 1998).
111
MATERIAL Y MÉTODOS
3.4.4.
Condiciones cromatográficas para la determinación de
aminoácidos neurotransmisores
La condiciones cromatográficas siguieron los protocolos aplicados
previamente para el análisis de aminoácidos mediante fluorescencia en
nuestro laboratorio (Cianca et al. 2009).
El reactivo utilizado para la derivatización de las muestras fue OPANAC. El procedimiento fue el siguiente: 20 µl de la muestra se disuelven
con 20 µl de NaOH 0,1M y 60 µl de tampón borato de sodio 0,01 M hasta
un volumen final de 100 µl. Finalmente se añaden 5 µl de OPA-NAC
dejando que reaccione durante 2 minutos a temperatura ambiente. Por
último, se inyectan 20 µl de la disolución en el cromatógrafo.
El análisis cromatográfico se realizó en condiciones isocráticas, la fase
móvil estuvo compuesta por un 12% de acetonitrilo en un tampón de
acetato de sodio 30 mM. El flujo aplicado fue de 1,5 ml/min. El pH fue
ajustado a 5,5 utilizando ácido acético glacial. Una vez preparada la fase
móvil fue filtrada a través de un filtro Whatman de 0,45 µm y se
desgasificó con helio.
En la Figura 3.12 se muestra el esquema completo de muestreo
mediante microdiálisis cerebral asociada a HPLC donde se representan
todos los elementos de la experimentación utilizada en esta investigación.
112
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 3.12: Esquema general de microdiálisis cerebral y HPLC utilizado en esta
investigación. 1. Bomba de microdiálisis con dos microjeringas para el tratamiento
específico (A, B). 2. Sonda de microdiálisis ubicada sobre la cánula-guía. 3.
Microcolector de fracciones. 4. Bomba de HPLC. 5. Fase móvil. 6. Columna
cromatográfica. 7. Detector. 8. Sistema de registro -equipo de sobremesa (modificado
de CMA).
113
MATERIAL Y MÉTODOS
3.5. DISEÑO EXPERIMENTAL
Las concentraciones y dosis utilizadas para cada compuesto se han
establecido atendiendo a los siguientes parámetros:
-
Experiencia previa de nuestro equipo de investigación.
-
Evidencia publicada en la literatura científica.
-
Pruebas preliminares antes de iniciar el grupo experimental.
En la Tabla 3.5 se resumen las dosis/concentraciones utilizadas en los
diferentes experimentos organizados en función si se aplicó un diseño
experimental de 3 horas (coadministración con isatina) o de 4 horas
(aplicando el compuesto como pretratamiento y posteriormente en
coadministración).
Experimentos de 3 horas
Experimentos de 4 horas
Compuesto
Compuesto
Concentración/
Dosis
Concentración/
Dosis
Isatina
1 mM
Ringer sin Ca++
-
Isatina
5 mM
TTX
10 µM
Isatina
10 mM
Reserpina i.p.
10 mg/kg
DMSO
5%
Ringer alto K+
50 mM
Nomifensina
50 µM
Selegilina
1 mM
Clorgilina
1 mM
Atropina
1 mM
Selegilina
1 mM
AP-5
650 µM
Tropolona
1 mM
MK-801
500 µM
Dinitrocatecol
100 µM
L-NAME
100 µM
Ropinirol
5 mM
7 NI
100 µM
Amantadina
5 mM
L-DOPA i.e.
25 µM
Otros diseños
Benserazida
80 mg/kg
L-DOPA (i.p.)
500 mg/kg
Tabla 3.5: Resumen de todos los compuestos aplicados, especificando la
concentración utilizada y agrupados según la duración de la experimentación.
114
MATERIAL Y MÉTODOS
3.5.1.
Efecto de las diferentes concentraciones de isatina
Los primeros grupos experimentales consistieron en el estudio de los
efectos de la administración intraestriatal de isatina. Para ello, la isatina se
disolvió directamente en el líquido de perfusión (Ringer) en las diferentes
concentraciones usadas en este estudio (1, 5, y 10 mM) y administrada
directamente a través de la sonda de microdiálisis en el núcleo estriado.
Para la disolución de la isatina en la concentración de 10 mM fue
necesario emplear DMSO (5 %). Para determinar que el efecto observado
sobre la dopamina y sus metabolitos no era producido por el disolvente se
realizó un grupo control donde se administró únicamente DMSO (5 %)
disuelto en el líquido de perfusión.
La isatina fue administrada durante una hora a un flujo de 1,5 µl/min
tras una hora de recogida de muestras basales. Tras la administración de
isatina se recogieron nuevamente muestras sometidas únicamente al
líquido de perfusión. El esquema de administración se muestra en la Tabla
3.6.
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo 1
Ringer
Isatina 1 mM
Ringer
Grupo 2
Ringer
Isatina 5 mM
Ringer
Grupo 3
Ringer
Isatina 10 mM
Ringer
Grupo 4
Ringer
DMSO 5 %
Ringer
Tabla 3.6: Protocolo de administración de diferentes concentraciones de isatina en
el núcleo estriado.
115
MATERIAL Y MÉTODOS
3.5.2.
Caracterización de la liberación de dopamina estriatal
estimulada por isatina
Para determinar los mecanismos neuroquímicos por los cuales la
isatina producía modificaciones en los niveles de dopamina y sus
metabolitos, la isatina fue administrada en animales pretratados con otros
compuestos o medios de perfusión modificados y se coadministró con
otras sustancias de efecto farmacológico conocido sobre la terminal
dopaminérgica.
-
Medio Ringer sin Ca++: en este caso la isatina se disolvió en una
solución Ringer sin CaCl2 (manteniendo la osmolaridad del medio). El
protocolo ejecutado fue el siguiente: tras una hora de muestras basales
se perfundió el medio sin Ca++, posteriormente se administró isatina
disuelta en este medio modificado durante una hora; durante la última
hora se perfundió un medio sin modificar (Tabla 3.7).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Isatina 10 mM
Grupo
Ringer sin
60 min
Ringer
Ringer sin Ca
Ca++
++
+
Ringer
Ringer sin Ca++
Tabla 3.7: Protocolo de administración intraestriatal de isatina disuelta en una
solución Ringer sin Ca++.
-
Pretratamiento con TTX: tras una hora de recogida de muestras
basales, se administró la TTX (10 µM) durante otra hora,
posteriormente se administró la isatina juntamente con la TTX durante
una hora más. En la última hora de experimentación fue administrada
una solución Ringer (Tabla 3.8).
116
MATERIAL Y MÉTODOS
Tiempos
60 min
60 min
60 min
60 min
Isatina 10 mM
Grupo
Ringer
TTX
TTX 10 µM
+
Ringer
TTX 10 µM
Tabla 3.8: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con TTX.
-
Pretratamiento con reserpina: la reserpina (10 mg/kg) fue administrada
intraperitonealmente una hora antes del comienzo de la recogida de
muestras
mediante
microdiálisis.
La
reserpina
fue
disuelta
inicialmente en ácido acético glacial y posteriormente diluida en
glucosa al 5,5 % hasta alcanzar una concentración final de 5 mg/ml
(Tabla 3.9).
Tiempos
60 min antes de
60 min
60 min
Ringer
Isatina 10 mM
60 min
experimento
Grupo
Reserpina 10 mg/kg
Reserpina
intraperitoneal
Ringer
Tabla 3.9: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas sistémicamente con reserpina.
-
Coadministración de nomifensina: la nomifensina fue disuelta en una
solución Ringer hasta la concentración de 50 µM y administrada
durante una hora después de la recogida de las muestras basales. En
otro grupo se administró nomifensina (50 µM) e isatina conjuntamente
en la segunda hora de experimentación (Tabla 3.10).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
Nomifensina 50 µM
Ringer
Nomifensina
Ringer
Isatina 10 mM + Nomifensina 50 µM
Ringer
50 µM
Tabla 3.10: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas tratadas
con nomifensina.
117
MATERIAL Y MÉTODOS
-
Medio Ringer con alta concentración de K+: el Ringer con alta
concentración de K+ (50 mM) se perfundió durante una hora después
de recoger las muestras basales. En otro grupo se administró isatina
disuelta en este medio en la segunda hora de experimentación (Tabla
3.11).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
Ringer Alto K+ 50 mM
Ringer
Ringer Alto
Ringer
Isatina 10 mM + Ringer Alto K+ 50 mM
Ringer
K
+
Tabla 3.11: Protocolo de administración intraestriatal de isatina disuelta en un
medio Ringer alto K+.
3.5.3.
Mediación de las isoformas de la MAO en el efecto de
la isatina sobre la liberación de dopamina
Para observar cómo varía el efecto de la isatina sobre la dopamina al
inhibir las isoformas A y B de la MAO se coadministró isatina con un
inhibidor selectivo de la isoforma A (clorgilina en una concentración 1
mM) o con un inhibidor selectivo de la isoforma B (selegilina en una
concentración 1 mM).
Ambos inhibidores se administraron durante una hora en la segunda
hora de experimentación, primero de forma aislada y después en conjunto
con la isatina (Tabla 3.12).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
Clorgilina 1 mM
Ringer
inhibidores
Ringer
Isatina 10 mM + Clorgilina 1 mM
Ringer
de la MAO
Ringer
Selegilina 1 mM
Ringer
Ringer
Isatina 10 mM + Selegilina 1 mM
Ringer
Tabla 3.12: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas tratadas
con inhibidores de la MAO (clorgilina y selegilina).
118
MATERIAL Y MÉTODOS
Debido a que la isatina se describe como un inhibidor selectivo de la
isoforma B, la selegilina también se administró como pretratamiento
(aplicándola una hora antes de la isatina y durante una hora más en
conjunto) para determinar si una aplicación previa producía alteraciones
en el efecto de la isatina (Tabla 3.13).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Isatina 10 mM
Grupo
Selegilina
60 min
Ringer
Selegilina 1 mM
+
Ringer
Selegilina 1 mM
pretatada
Tabla 3.13: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con selegilina.
3.5.4.
Efectos de la isatina junto con compuestos con acción
antiparkinsoniana sobre la neurotransmisión dopaminérgica
Para determinar las interacciones dopaminérgicas que pueden
presentar otros compuestos antiparkinsonianos con los efectos de la
isatina sobre los niveles de dopamina se coadministró la isatina
juntamente con compuestos que se describen en la literatura científica
como antiparkinsonianos o que presentan la misma acción que estos.
-
Coadministración con inhibidores de la COMT: los inhibidores de la
COMT utilizados fueron la tropolona (1 mM) y el dinitrocatecol (100
µM). Estos fueron disueltos en Ringer y coadministrados juntamente
con la isatina durante la segunda hora de experimentación (Tabla
3.14).
119
MATERIAL Y MÉTODOS
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
Tropolona 1 mM
Ringer
inhibidores
Ringer
Isatina 10 mM + Tropolona 1 mM
Ringer
de la COMT
Ringer
Dinitrocatecol 100 µM
Ringer
Ringer
Isatina 10 mM + Dinitrocatecol 100 µM
Ringer
Tabla 3.14: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas tratadas
con inhibidores de la COMT (tropolona y dinitrocatecol).
-
Pretratamiento con atropina: la atropina, antagonista competitivo de
los receptores muscarínicos de la acetilcolina, fue disuelta en el
líquido de perfusión (concentración 1 mM) y administrada durante una
hora previa a la infusión de isatina. Posteriormente se coadministraron
ambos compuestos durante una hora (Tabla 3.15).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Isatina 10 mM
Grupo
Atropina
60 min
Ringer
Atropina 1 mM
+
Ringer
Atropina 1 mM
Tabla 3.15: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con atropina.
-
Coadministración con ropinirol: el ropinirol, agonista dopaminérgico
con mayor afinidad sobre receptores dopaminérgicos del subtipo D3,
fue disuelto en el líquido de perfusión (concentración 5 mM) y
coadministrado juntamente con la isatina durante la segunda hora de
experimentación (Tabla 3.16).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
Ropinirol 5 mM
Ringer
ropinirol
Ringer
Isatina 10 mM + Ropinirol 5 mM
Ringer
Tabla 3.16: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas tratadas
con ropinirol.
-
Coadministración con amantadina: la amantadina es un antivírico que
ejerce diversas acciones sobre la neurotransmisión: antagonista de los
120
MATERIAL Y MÉTODOS
receptores glutamatérgicos de tipo NMDA, incrementa la liberación
de dopamina y bloquea su recaptación. La amantadina fue disuelta en
el líquido de perfusión (concentración 5 mM) y coadministrada con la
isatina durante la segunda hora de experimentación (Tabla 3.17).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
Amantadina 5 mM
Ringer
amantadina
Ringer
Isatina 10 mM + Amantadina 5 mM
Ringer
Tabla 3.17: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas tratadas
con amantadina.
-
Coadministración intraestriatal con L-DOPA: la L-DOPA, precursor
de la dopamina, fue disuelto en el líquido de perfusión (concentración
25 µM) y coadministrada con la isatina durante la segunda hora de
experimentación (Tabla 3.18).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
L-DOPA 25 µM
Ringer
L-DOPA i.e.
Ringer
Isatina 10 mM + L-DOPA 25 µM
Ringer
Tabla 3.18: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas tratadas
con L-DOPA.
-
Administración sistémica de L-DOPA: para determinar el efecto que
presenta la isatina sobre la dopamina en animales a los que se
administró L-DOPA sistémicamente se diseñó un grupo experimental
específico para ello, antes de comenzar el muestreo se administró
benserazida i.p. (80 mg/kg) para inhibir la DOPA descarboxilasa
(DDC), 40 minutos después de la administración de benserazida se
administró L-DOPA (metil éster) i.p. a una dosis de 500 mg/kg. La
isatina se administró en el estriado después de las 4 horas de muestreo
con Ringer. Se realizaron grupos control específicos para la
benserazida y la L-DOPA administradas por vía intraperitoneal
(Figura 3.13).
121
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 3.13: Cronograma que muestra el protocolo de administración de isatina en
ratas a las que se les administró sistémicamente benserazida y L-DOPA. Los compuestos
ubicados en la parte superior del cronograma muestran las sustancias perfundidas en
cada período temporal específico.
3.5.5.
Mediación de los receptores glutamatérgicos en el
efecto de la isatina sobre la liberación de dopamina
El siguiente grupo experimental tenía como objetivo determinar la
implicación de los receptores glutamatérgicos de tipo NMDA en los
efectos de la isatina sobre la liberación de dopamina estriatal. Con este fin
se estudió el efecto de la isatina en presencia de AP- 5 (650 µM) o MK801 (500 µM), antagonista competitivo y no competitivo de los receptores
glutamatérgicos NMDA, respectivamente.
Para ello se realizó un pretratamiento con los antagonistas después de
una
hora
de
muestras,
para
posteriormente
coadministrarlos
intraestriatalmente durante otra hora con isatina (Tabla 3.19).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
AP-5 650 µM
Isatina 10 mM +
Ringer
AP-5 650 µM
antagonistas
glutamatérgicos
Ringer
MK- 801 500
Isatina 10 mM +
µM
MK- 801 500 µM
Ringer
Tabla 3.19: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con antagonistas glutamatérgicos NMDA (AP-5 y MK- 801).
122
MATERIAL Y MÉTODOS
3.5.6.
Mediación del óxido nítrico en el efecto de la isatina
sobre la liberación de dopamina
Al igual que en el caso anterior se comprobó si el óxido nítrico podía
tener alguna participación en la acción de la isatina sobre la liberación de
dopamina. Para ello se administró la isatina en conjunto con inhibidores
de la óxido nítrico sintasa (NOS; del inglés Nitric Oxide Synthase): el LNAME y el 7-NI.
La disolución de ambos inhibidores se realizó en el líquido de
perfusión hasta las concentraciones utilizadas (100 µM). Cada uno de los
compuestos fue administrado intraestriatalmente durante una hora de
forma aislada y después en conjunto con la isatina una hora más (Tabla
3.20).
Tiempos
60 min
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
L-NAME 100 µM
Isatina 10 mM + L-
Ringer
NAME 100 µM
antagonistas
NOS
Ringer
7-NI 100 µM
Isatina 10 mM + 7-NI
Ringer
100 µM
Tabla 3.20: Protocolo de administración intraestriatal de isatina en ratas
pretratadas con inhibidores de la NOS (L-NAME y 7-NI).
3.5.7.
Efecto
de
la
isatina
sobre
aminoácidos
neurotransmisores en el núcleo estriado
Para determinar el efecto de la isatina sobre la liberación de
aminoácidos neurotransmisores en el núcleo estriado se administró, vía
intraestriatal, la isatina (10 mM) durante una hora. Se siguió el mismo
protocolo de administración que para el estudio del efecto de isatina 10
mM sobre la liberación de dopamina (Tabla 3.21).
123
MATERIAL Y MÉTODOS
Tiempos
60 min
60 min
60 min
Grupo
Ringer
Ringer
Ringer
aminoácidos
Ringer
Isatina 10 mM
Ringer
Tabla 3.21: Protocolo de administración intraestriatal de isatina para su posterior
análisis
con
HPLC
fluorimétrica
para
determinación
de
aminoácidos
neurotransmisores.
3.6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Y TRATAMIENTO
ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos en períodos de 20 minutos se expresan como
porcentaje de liberación respecto al basal.
En el caso de la dopamina y los aminoácidos los valores basales se
determinaron calculando la media de las dos muestras anteriores a la
administración de los diferentes tratamientos considerándolas como el
100% de liberación.
En el caso del DOPAC y HVA se consideró como basal, para el
cálculo del efecto de las sustancias, la muestra anterior a la administración
de los compuestos. Esto se debe a que los metabolitos requieren más
tiempo para su estabilización, por lo que resulta más apropiado considerar
solo la tercera muestra inicial como basal.
En todos los casos, los resultados fueron corregidos considerando los
porcentajes de recuperación de cada sonda calculados in vitro para cada
sustancia analizada.
Dichos resultados se expresan como la media ± E.E.M. para un
número de experimentos de n=5-7, a excepción del grupo de isatina 10
mM en el que se utilizó un n=11. Los resultados fueron tratados
estadísticamente mediante el análisis de varianza (ANOVA) y el test de
124
MATERIAL Y MÉTODOS
comparación múltiple de Student Newman-Kleus. Los niveles de
significación considerados fueron:

*

a
P< 0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 respecto al basal.
P< 0,05, bP<0,01 y cP<0,001 respecto al grupo de isatina 10 mM,
en el mismo tiempo.
125
MATERIAL Y MÉTODOS
126
4
RESULTADOS
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
RESULTADOS
4.1. RESULTADOS CROMATOGRÁFICOS
Las condiciones cromatográficas utilizadas en esta investigación,
descritas en el apartado anterior, fueron desarrolladas específicamente
para el estudio de la liberación de dopamina y sus metabolitos en el núcleo
estriado de ratas. En estas condiciones se consigue una buena separación
de las sustancias analizadas en un corto período de tiempo, sin que se
produzca interferencia por otras moléculas.
En la Figura 4.1 se muestra un cromatograma representativo de
patrones (A) en el que se pueden apreciar los picos correspondientes a la
dopamina y sus metabolitos (DOPAC y HVA). Igualmente, en todos los
cromatogramas aparece el principal metabolito de la serotonina, el ácido
5-hidroxiindolacético (HIAA). En la sección B de la figura se muestra una
superposición de cromatogramas de muestras de dializados: en verde y
azul se representan cromatogramas correspondientes a la administración
de una solución Ringer (muestras basales), mientras que en magenta se
representa la evolución de los cromatogramas anteriores tras la
administración 10 mM de isatina, donde se aprecia claramente el
incremento de la dopamina.
129
RESULTADOS
A
B
Figura 4.1: A. Cromatograma representativo de patrones de las sustancias
analizadas por medio de HPLC-EC en las condiciones cromatográficas descritas
previamente. Todas las sustancias se han registrado a la misma sensibilidad.
B. Superposición de cromatogramas de dializados cerebrales de muestras
experimentales: en azul y verde se representan los cromatogramas de muestras basales
y en magenta el de un dializado tras administrar 10 Mm de isatina. La dopamina fue
registrada a una sensibilidad 10 veces mayor que el resto de compuestos.
130
RESULTADOS
4.2. EFECTO DE LA PERFUSIÓN INTRAESTRIATAL DE
ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
Los niveles extracelulares de dopamina y sus metabolitos en el núcleo
estriado fueron estables durante el período de experimentación en las ratas
control que no fueron sometidas a ningún tipo de tratamiento (únicamente
perfusión continua de solución Ringer). Los valores basales, expresados
en ng/20 min, se muestran en la Tabla 4.1.
Compuesto
Dopamina
DOPAC
HVA
Valor basal (ng/ 20 min)
0,32 ± 0,04
33,62 ± 9,38
1,91 ± 0,33
Tabla 4.1: Valores basales (expresado en ng/20 min) para la dopamina, el DOPAC
y el HVA.
Para determinar el efecto de la administración de isatina sobre los
niveles extracelulares de dopamina y sus metabolitos en el núcleo estriado
se realizó la perfusión, a través de la sonda de microdiálisis, de diferentes
concentraciones de isatina: 1 mM, 5 mM y 10 mM.
Las
diferentes
intraestriatalmente
concentraciones
durante
60
de
minutos
isatina
produjeron
administradas
incrementos
significativos en los niveles extracelulares de dopamina, siendo estos
incrementos dependientes de la concentración utilizada. Los incrementos
obtenidos fueron: 355,2 ± 104,1 %; 699,4 ± 72,2 % y 1240,8 ± 145,9 %,
respecto al basal, para las concentraciones de 1 mM, 5 mM y 10 mM
respectivamente (Figura 4.2).
En todos los casos, el incremento máximo se produjo 40 minutos
después de comenzar la perfusión de la isatina. Tras dicho aumento
máximo, los niveles extracelulares de dopamina tendieron a normalizarse,
volviendo a los valores basales 40 minutos después del término de la
administración de la isatina.
131
RESULTADOS
En la Figura 4.2 también se muestran las variaciones en las
concentraciones extracelulares de DOPAC y HVA, en relación al basal,
para las distintas concentraciones de isatina. En este caso se observó que
la administración de isatina en las concentraciones de 1 mM y 5 mM no
produjo modificaciones estadísticamente significativas en los niveles
estriatales de DOPAC y HVA. Sin embargo, la perfusión intraestriatal de
isatina en una concentración de 10 mM produjo una disminución
significativa de estos niveles, alcanzando los valores mínimos de 70,9 ±
12,6 % y 81,4 ± 6,4 %, con respecto al basal, para el DOPAC y el HVA,
respectivamente. Los valores mínimos se observaron 80 minutos después
del comienzo de la administración de isatina. Durante los 40 minutos
restantes de los experimentos los valores de ambos metabolitos vuelven a
equipararse a los basales.
Para determinar si el DMSO (utilizado para disolver la isatina en una
concentración de 10 mM) provocó modificaciones en los niveles
estriatales de la dopamina y sus metabolitos se realizó un grupo control en
el que se administró únicamente DMSO (5%) disuelto en Ringer. Los
resultados obtenidos mostraron que el DMSO en esta concentración no
alteró significativamente los niveles de dopamina, DOPAC y HVA
durante toda la experimentación (Figura 4.2).
132
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 5 mM
Isatina 1 mM
Control 5 % DMSO
A
***
1400
1200
***
1000
***
***
800
600
***
400
**
*
***
**
200
***
***
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
***
***
**
100
120
140
160
*
**
*
120
140
160
180
HVA (% respecto al basal)
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
B
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
20
40
60
80
Tiempo (min)
C
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
20
180
40
60
80
100
180
Tiempo (min)
Figura 4.2: Efecto de la perfusión de isatina (1, 5, 10 mM) y DMSO (5%) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C). La isatina fue perfundida
durante 60 minutos a partir del momento indicado por la flecha. Los resultados se
muestran como la media ± EEM (n= 4-11) expresados como porcentaje en relación a
los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05, **P<0,01
y ***P<0,001, con respecto al basal.
133
RESULTADOS
4.3. CARACTERIZACIÓN
DE
LA
LIBERACIÓN
DE
DOPAMINA ESTRIATAL ESTIMULADA POR ISATINA
Para determinar los posibles mecanismos de acción de la isatina sobre
la liberación de dopamina y sus metabolitos, los animales de
experimentación
fueron
sometidos
a
diferentes
tratamientos
y
modificaciones del medio de perfusión:

Los medios de perfusión modificados que se utilizaron fueron: un
medio Ringer sin Ca++ y un medio Ringer con alta concentración
de K+ (50 mM).

Para estudiar la implicación de los canales de Na+ dependientes
de voltaje se utilizó TTX (10 µM).

Para establecer si la dopamina liberada era de origen vesicular se
utilizó reserpina (10 mg/kg i.p.).

Para determinar la implicación del transportador de dopamina
(DAT) se administró nomifensina (50 µM).
De este modo, se consiguió investigar si el incremento en los niveles
de dopamina inducidos por la isatina era debido a un mecanismo
exocitótico (vesicular, dependiente de calcio y de voltaje) y/o mediado por
el DAT.
134
RESULTADOS
4.3.1.
Administración de isatina disuelta en un medio Ringer
sin Ca++
Para evaluar el papel del calcio externo sobre la liberación de
dopamina inducida por la isatina, se sustituyó el medio Ringer por uno
modificado libre de Ca++. El efecto producido en los niveles extracelulares
de dopamina y sus metabolitos se muestra en la Figura 4.3.
Una hora después del comienzo de la perfusión del medio Ringer sin
Ca++ se produjo un descenso significativo en los niveles de dopamina y
DOPAC hasta un 55,0 ± 5,8 % y 79,7 ± 5,0 %, en relación al basal,
respectivamente. No se observaron modificaciones significativas en los
niveles de HVA.
Los valores anteriores son considerados como basales para determinar
el efecto de la isatina disuelta en un medio libre de Ca++.
La administración de isatina disuelta en este medio produjo un ligero
incremento en los niveles de dopamina hasta un 119,4 ± 20,4 %, respecto
al basal (40 minutos después del comienzo de la administración de
isatina). Los niveles de DOPAC no sufrieron modificaciones
significativas. Los niveles de HVA descendieron hasta un 63,1 ± 6 % con
respecto al basal; dicho descenso se produjo a los 40 minutos del término
de administración de isatina y no se observó un regreso a los niveles
basales al término de los experimentos.
Estas
variaciones
en
los
niveles
de
dopamina
fueron
significativamente distintas a las producidas por la isatina en un medio
Ringer normal, pues supuso una reducción del 90,4 % del efecto máximo
de la isatina, lo que indica que la liberación de dopamina inducida por
isatina es dependiente de Ca++ extracelular.
135
RESULTADOS
HVA (% respecto al basal)
DOPAC (% respecto al basal)
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
1400
Isatina 10 mM + Ringer sin calcio
A
***
1200
***
1000
***
800
600
***
400
200
*** a ** c
***
***
*
** b
**
160
180
200
***
***
**
160
180
200
*
**
0
20
40
60
80
100
120
140
220
240
220
240
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
**
*
20
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
40
60
80
100
**
120
140
Tiempo (min)
C
**
*
20
40
60
80
100
120
140
160
180
*
***
***
***a
200
220
240
Tiempo (min)
Figura 4.3: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) diluida en un
medio Ringer sin Ca++ sobre los niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA
(C). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento indicado por la
flecha. La perfusión del Ringer sin Ca++ fue realizada durante 120 minutos, mostrado
en la barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 4-11) de los valores
basales considerados el 100%. Niveles de significación:
***
a
b
c
*
P< 0,05,
**
P<0,01,
P<0,001, con respecto al basal y P< 0,05, P< 0,01, P< 0,001, con respecto al grupo
de isatina (10 mM).
136
RESULTADOS
4.3.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con TTX
Para evaluar el papel de los canales de Na+ dependientes de voltaje en
la liberación de dopamina inducida por la isatina, se comprobó su efecto
en animales tratados con TTX (10 µM).
La administración intraestriatal de TTX, a través de la sonda de
microdiálisis, durante 60 minutos disminuyó significativamente los
niveles extracelulares de dopamina y DOPAC hasta un 59,8 ± 12,1 % y
51,8 ± 14,1 %, respecto al basal, respectivamente. No se produjeron
modificaciones significativas en los niveles de HVA.
Los valores anteriores fueron considerados como basales para
determinar el efecto de la isatina en animales tratados con TTX.
La administración de isatina en animales tratados con TTX produjo un
ligero, pero significativo, incremento en los niveles de dopamina hasta un
204,9 ± 65,7 %, respecto al basal (60 minutos después del comienzo de la
administración de isatina). Se observó un descenso máximo de los niveles
de HVA hasta un 28,6 ± 9,8 %, con respecto al basal, produciéndose dicho
descenso en la última muestra del experimento. Los niveles de DOPAC
no sufrieron modificaciones estadísticamente significativas.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, de modo que supuso una
reducción de un 83,5 % del efecto máximo de la isatina, lo que indica que
el tratamiento con TTX induce un bloqueo del efecto de la isatina sobre la
liberación de dopamina (Figura 4.4).
137
RESULTADOS
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + TTX 10 µM
DA (% respecto al basal)
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
DOPAC (% respecto al basal)
A
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
***
***
***
***
*
20
40
60
80
100
120
*** b *** c *** b
140
160
180
200
220
240
Tiempo (min)
B
***
**
**
***
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
C
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
*
**
** b *** a
*** c *** c ***c
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
Tiempo (min)
Figura 4.4: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los niveles
estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con TTX (10
µM). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento indicado por la
flecha. La perfusión de TTX fue realizada durante 120 minutos, mostrado mediante la
barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 6-11) de los valores
basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05, **P<0,01,
***
P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con respecto al grupo
de isatina (10 mM).
138
RESULTADOS
4.3.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con reserpina
Para comprobar si la liberación de dopamina inducida por isatina era
de origen vesicular o citoplasmático, los animales fueron pretratados con
reserpina (10 mg/kg i.p.) 60 minutos antes del inicio de los experimentos.
Dos horas después de la administración de reserpina los niveles
extracelulares de dopamina disminuyeron significativamente hasta un
68,7 ± 7,6 %, con respecto a los niveles basales. Los niveles de DOPAC
y HVA también sufrieron descensos significativos hasta un 61,9 ± 4,4 %
y 62,5 ± 6,9 %, con respecto al basal, respectivamente.
Los valores anteriores fueron considerados como basales para
determinar el efecto de la isatina en animales reserpinizados.
La administración de isatina en animales reserpinizados produjo un
incremento de los niveles de dopamina hasta un 267,8 ± 135,2 %, con
respecto a los niveles basales (60 minutos después del comienzo de la
administración de isatina). Los niveles de DOPAC y HVA sufrieron
descensos significativos hasta un 52,3 ± 5,3 % y 40,5 ± 3,9 %,
respectivamente, en relación al basal (80 minutos después del comienzo
de la administración de isatina). Los niveles de HVA fueron
significativamente más bajos que en el caso de la administración de isatina
sola.
Las variaciones observadas en los niveles de dopamina fueron
significativamente distintas a las producidas por la isatina sola, lo que
supuso un descenso del 78,4 % del efecto máximo de la isatina, indicando
que la liberación de dopamina inducida por isatina es disminuida por la
reserpina, siendo por lo tanto una liberación vesicular (Figura 4.5).
139
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
1400
Isatina 10 mM + RES 10 mg/kg
A
***
1200
***
1000
***
800
600
400
*a
*
200
*b
*a
***
40
60
80
100
120
*
*
0
20
***
140
160
180
200
220
240
***
***
**
**
*
**
160
180
200
220
240
*
**
*
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
**
20
40
60
80
100
120
140
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
20
40
60
80
100
**
b
120
140
*c
160
** b *** c ** b
180
200
220
*a
240
Tiempo (min)
Figura 4.5: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los niveles
estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en ratas reserpinizadas. La
reserpina se administró i.p. 60 minutos antes del inicio del experimento. La isatina fue
perfundida durante 60 minutos a partir del momento indicado por la flecha. Los datos
se expresan como la media ± EEM (n= 4-11) de los valores basales considerados el
100%. Niveles de significación: *P< 0,05, **P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal
y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con respecto al grupo de isatina (10 mM).
140
RESULTADOS
4.3.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con
nomifensina
Con el objetivo de investigar el posible papel del DAT en la liberación
de dopamina inducida por isatina, se administró la isatina en animales
tratados con nomifensina, compuesto que inhibe la recaptación de
dopamina a través del transportador.
La administración de nomifensina (50 µM) a través de la sonda de
microdiálisis incrementó los niveles de dopamina hasta un 1178,8 ± 206,4
% respecto a los basales (40 minutos después del comienzo de la
administración
de
nomifensina).
La
nomifensina
no
produjo
modificaciones significativas en los niveles de los metabolitos.
Cuando la isatina fue administrada juntamente con la nomifensina los
niveles de dopamina se incrementaron hasta un 1398,8 ± 286,7 %,
respecto a los basales (40 minutos después del comienzo de la
administración de isatina). Además, se produjo un incremento
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC hasta un 179,1 ±
19,6 %, con respecto al basal (20 minutos después del comienzo de la
administración), los niveles de este metabolito son significativamente
diferentes a los de la administración de isatina sola. No se produjeron
modificaciones significativas en los niveles de HVA.
Este incremento en los niveles de dopamina no mostró diferencias
significativas con respecto al efecto de la administración de isatina sola.
Por tanto, la nomifensina no altera la liberación de dopamina inducida por
isatina (Figura 4.6).
141
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + NOM 50 µM
NOM 50 µM
A
***
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
***
**
***
***
***
***
*** ***
**
20
40
60
80
***
100
120
140
160
180
180
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
B
250
*b
200
b
a
a
150
100
50
***
***
**
100
120
140
160
*
**
*
120
140
160
0
20
40
60
80
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
C
250
200
150
100
50
0
20
40
60
80
100
180
Tiempo (min)
Figura 4.6: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los niveles
estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
nomifensina (50 µM). La isatina y la nomifensina fueron perfundidas durante 60 minutos
a partir del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ±
EEM (n= 5-11) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación:
*
P< 0,05,
**
P<0,01,
***
P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, con
respecto al grupo de isatina (10 mM).
142
RESULTADOS
4.3.5.
Administración de isatina en un medio Ringer con alta
concentración de K+
Para estudiar el efecto de la isatina sobre la liberación de dopamina
inducida por despolarización se perfundió en el núcleo estriado un medio
Ringer con 50 mM de KCl.
La administración de este medio Ringer modificado, a través de la
sonda de microdiálisis, incrementó los niveles de dopamina hasta 1179,1
± 170,9 %, respecto a los basales (20 minutos después del comienzo de su
administración). Los niveles de HVA se redujeron hasta un 58,30 ± 11,2
%, con respecto a los basales (40 minutos después del comienzo de la
administración
del
medio).
No
se
observaron
modificaciones
significativas en los niveles de DOPAC.
La administración de isatina disuelta en este medio produjo un
incremento en los niveles de dopamina hasta 3438,2 ± 644,9 %, respecto
al basal (40 minutos después del comienzo de la administración de
isatina). Los niveles de DOPAC y HVA sufrieron descensos significativos
hasta 57,6 ± 3,96 % y 60,9 ± 5,5 %, respectivamente, en relación al basal
(60 minutos después del comienzo de la administración de la isatina).
Las variaciones observadas en los niveles de dopamina fueron
significativamente distintas a las producidas por la isatina en un medio
Ringer normal, suponiendo un incremento de 2,8 veces del efecto máximo
de la isatina, lo que indica que la isatina aumenta la liberación de
dopamina estimulada por KCl (Figura 4.7).
143
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Isatina 10 mM + KCl 50 mM
A
*** c
KCl 50 mM
*** c
*** c
***
***
20
40
60
80
***
***
** b
***
*a
100
120
140
160
180
160
180
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
B
250
200
150
100
*** ***
50
***
***
**
0
20
40
60
80
100
120
140
*
**
*a
** ***
***
100
120
140
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
250
C
200
150
100
50
*
0
20
40
60
80
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.7: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) disuelta en un
medio Ringer con alta concentración de KCl (50 mM) sobre los niveles estriatales de
dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C). La isatina y el medio Ringer con alta
concentración de KCl fueron perfundidas durante 60 minutos a partir del momento
indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 4-11) de los
valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05, **P<0,01,
***
P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con respecto al grupo
de isatina (10 mM).
144
RESULTADOS
4.4. MEDIACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA MAO EN EL
EFECTO DE LA ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE
DOPAMINA
Con el objetivo de investigar cómo influyen las isoformas A y B de la
MAO sobre el efecto de la isatina en la liberación in vivo de dopamina se
administraron intraestriatalmente inhibidores selectivos e irreversibles
para cada isoforma de la enzima (clorgilina para la isoforma A y selegilina
para la isoforma B).
4.4.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con clorgilina
La administración de clorgilina (1 mM) a través de la sonda de
microdiálisis incrementó los niveles de dopamina hasta un 890,9 ± 214,9
%, respecto a los basales (40 minutos después del comienzo de la
administración de la clorgilina). La clorgilina produjo un descenso
significativo sobre el DOPAC y HVA hasta un 44,4 ± 12,2 % y 43,99 ±
10,3 %, con respecto al basal, respectivamente. Este descenso máximo se
observó en la última muestra de los experimentos.
Cuando la isatina fue administrada juntamente con la clorgilina los
niveles de dopamina se incrementaron hasta un 890,9 ± 214,9 %, respecto
a los basales (20 minutos después del comienzo de la administración de
isatina). Además, se produjo un descenso significativo en los niveles
extracelulares de DOPAC y HVA hasta un 71,3 ± 11,2 % y 55,9 ± 6,9 %,
con respecto al basal, respectivamente (80 minutos después del comienzo
de la administración de isatina).
Este incremento en los niveles de dopamina no mostró diferencias
significativas con respecto al efecto de la administración de isatina sola.
Por tanto, la clorgilina no altera la liberación de dopamina inducida por
isatina (Figura 4.8).
145
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + Clorgilina 1 mM
Clorgilina 1 mM
A
***
1400
1200
***
1000
***
***
**
600
400
**
*
**
200
*
0
20
DOPAC (% respecto al basal)
***
800
40
60
80
100
120
140
160
180
Tiempo (min)
B
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
a
a
***
20
40
60
80
100
a
**
*
***
**
*
**
** b
180
120
140
160
*
**
*
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
*
20
40
60
80
100
*
120
** a
140
*
*a
*a
*a
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.8: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
clorgilina (1 mM). La isatina y la clorgilina fueron perfundidas durante 60 minutos a
partir del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM
(n= 4-11) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P<
0,05, **P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, con respecto al
grupo de isatina (10 mM).
146
RESULTADOS
4.4.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con selegilina
La administración de selegilina (1 mM), a través de la sonda de
microdiálisis, incrementó los niveles de dopamina hasta un 822,97 ±
259,03 %, respecto a los niveles basales (60 minutos después del
comienzo de la administración de la selegilina). Además, produjo un
descenso significativo sobre el DOPAC hasta un 44,1 ± 11,1 % con
respecto al basal (80 minutos después del comienzo de la administración
de la selegilina). La selegilina no produjo modificaciones significativas en
los niveles de HVA.
Cuando la isatina fue administrada juntamente con la selegilina los
niveles de dopamina se incrementaron hasta un 1627,9 ± 544,3 %,
respecto a los niveles basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de la isatina). Además, se produjo un descenso
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC hasta un 52,1 ± 17,1
%, con respecto al basal (80 minutos después del comienzo de la
administración de la isatina). No se produjeron modificaciones
significativas sobre los niveles extracelulares de HVA.
Este incremento en los niveles de dopamina no mostró diferencias
significativas con respecto al efecto de la administración de isatina sola.
Por tanto, la selegilina no altera la liberación de dopamina inducida por
isatina (Figura 4.9).
147
RESULTADOS
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + Selegilina 1 mM
Selegilina 1 mM
DA (% respecto al basal)
A
2500
**
**
2000
1500
1000
***
500
**
***
**
***
**
***
**
**
100
120
140
*
**
**
**
160
180
0
20
40
60
80
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
***
a
***
*
*
20
40
60
80
100
**
*
120
140
*
**
120
140
*
*
160
*a
a
180
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
*
160
180
Figura 4.9: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los niveles
estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con selegilina
(1 mM). La isatina y la selegilina fueron perfundidas durante 60 minutos a partir del
momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 4-11)
de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05,
**
P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, con respecto al grupo de isatina
(10 mM).
148
RESULTADOS
Para determinar si el pretratamiento con selegilina (1 mM) podría
modificar el efecto de la isatina sobre la liberación de dopamina se
administró durante 60 minutos selegilina previamente a la administración
conjunta con isatina.
La administración de selegilina durante una hora produjo un
incremento significativo de los niveles de dopamina hasta un 649,6 ±
135,7 %, respecto a los niveles basales (60 minutos después del comienzo
de la administración de la selegilina). La selegilina no produjo
modificaciones en los niveles de los metabolitos de la dopamina.
Los valores anteriores fueron considerados como basales para
determinar el efecto de la isatina en animales tratados con selegilina.
La administración conjunta de isatina con selegilina no produjo
modificaciones significativas en los niveles de dopamina, con respecto a
los niveles basales. Aunque se produjo un descenso significativo en los
niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un 33,5 ± 4,7 % y 49,8 ±
9,01 %, con respecto a los niveles basales respectivamente. Estos efectos
se produjeron 80 y 100 minutos después del comienzo de la
administración de la isatina, respectivamente para el DOPAC y el HVA.
Los efectos sobre los metabolitos fueron significativamente diferentes a
los de la administración de isatina sola.
Las variaciones observadas en los niveles de dopamina fueron
significativamente distintas a las producidas por la administración de
isatina sola en el mismo tiempo, supuso un descenso del 79,99 % del
efecto máximo de la isatina, lo que indica que la liberación de dopamina
inducida por isatina es disminuida por el pretratamiento con selegilina
(Figura 4.10).
149
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + Selegilina 1 mM
A
***
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
***
**
***
**
**
b
20
40
60
80
***
b
100 120 140 160 180 200 220 240
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
***
***
**
*a
**a
**
160
180
b
20
40
60
80
100
120
140
*a
*b
200
220
240
**
*
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
*
*a
20
40
60
80
100
120
140
160
**
**a
180
200
**b
220
**a
240
Tiempo (min)
Figura 4.10: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales pretratados con
selegilina (1 mM). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento
indicado por la flecha. La perfusión de selegilina fue realizada durante 120 minutos,
mostrado en la barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 4-11) de
los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05, **P<0,01,
***
P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, con respecto al grupo de isatina
(10 mM).
150
RESULTADOS
4.5. EFECTOS DE LA COADMINISTRACIÓN DE ISATINA Y
COMPUESTOS DE ACCIÓN ANTIPARKINSONIANA
Los resultados que se muestran a continuación representan los efectos
de diferentes compuestos con acción antiparkinsoniana sobre la liberación
de dopamina inducida por isatina.
La finalidad de estos experimentos fue proporcionar información
adicional sobre los mecanismos de acción de la isatina. Como la isatina es
un compuesto endógeno, se buscó determinar cómo pueden interactuar los
diferentes compuestos con el efecto de la isatina sobre la liberación de
dopamina y sus metabolitos.
Los compuestos utilizados en esta serie de experimentos fueron:

Inhibidores de la COMT: tropolona y dinitrocatecol.

Antagonista de los receptores colinérgicos: atropina.

Agonista dopaminérgico: ropinirol.

Antivírico con acción inespecífica utilizado en la EP: amantadina.

Precursor de la dopamina: L-DOPA.
151
RESULTADOS
4.5.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con tropolona
y dinitrocatecol
Para investigar el efecto de la inhibición de la COMT sobre la
liberación in vivo de dopamina inducida por isatina se administró isatina
juntamente con tropolona (1 mM) y dinitrocatecol (100 µM) en diferentes
grupos experimentales.
La administración de tropolona (1 mM) a través de la sonda de
microdiálisis incrementó los niveles de dopamina y DOPAC hasta un
240,9 ± 63,3 % y 211,8 ± 21,8 %, respecto a los basales, respectivamente.
El incremento máximo de la dopamina se produjo a los 20 minutos del
inicio de la administración de tropolona y el del DOPAC a los 40 minutos.
La tropolona no produjo modificaciones significativas sobre el HVA.
Cuando la isatina fue administrada juntamente con la tropolona los
niveles de dopamina se incrementaron hasta un 3038,0 ± 857,4 %,
respecto a los niveles basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de la isatina). Además, se produjo un descenso
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un
73,4 ± 8,1 % y 61,1 ± 10,1 % con respecto a los niveles basales,
respectivamente (80 minutos después del comienzo de la administración
de la isatina). Los efectos sobre los metabolitos no son significativamente
diferentes a los de la administración de la isatina sola.
Estas
variaciones
en
los
niveles
de
dopamina
fueron
significativamente distintas a las producidas por la isatina sola, pues
supuso un incremento de 3,7 veces del efecto de la isatina en el mismo
tiempo y 2,5 veces del efecto máximo de la isatina, lo que indica que la
liberación de dopamina inducida por isatina es incrementada por la
tropolona (Figura 4.11).
152
RESULTADOS
La administración de dinitrocatecol (100 µM), a través de la sonda de
microdiálisis, incrementó los niveles de dopamina hasta un 480,2 ± 138,3
%, respecto a los basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de dinitrocatecol) y un descenso de hasta un 15,6 ± 2,7 %
en los niveles del HVA al término de los experimentos, con respecto al
basal. El dinitrocatecol no produjo modificaciones significativas sobre el
DOPAC.
Cuando la isatina fue administrada juntamente con el dinitrocatecol
los niveles de dopamina se incrementaron hasta un 2492,7 ± 578,2 %,
respecto a los basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de la isatina). Además, se produjo un descenso
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un
63,1 ± 12,7 % y 18,1 ± 1,7 %, con respecto al basal, respectivamente. Los
efectos sobre el DOPAC no fueron significativamente diferentes a los de
la administración de isatina sola, mientras que sobre el HVA se observó
un descenso mayor comparado con el grupo de isatina sola. El máximo
descenso en el DOPAC se observó a los 80 minutos del comienzo de la
administración de isatina, mientras que el HVA presentó el descenso
máximo en la última muestra de los experimentos.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, lo que supuso un incremento
de 3 veces del efecto de la isatina en el mismo tiempo y el doble del efecto
máximo de la isatina, lo que indica que la liberación de dopamina inducida
por isatina es incrementada por el dinitrocatecol (Figura 4.12).
153
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + Tropolona 1 mM
Tropolona 1 mM
A
***b
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
**
***
**a
20
40
60
80
*
***
**a *** **a
100
120
***
140
160
180
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
250
B
** c
*a
200
*c
*c
150
100
*
*
**
50
***
***
**
100
120
140
0
20
40
60
80
160
180
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
250
C
200
150
100
*
*
*
50
**
*
*
*
120
140
0
20
40
60
80
100
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.11: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
tropolona (1 mM). La isatina y la tropolona fueron perfundidas durante 60 minutos a
partir del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM
(n= 4-11) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P<
0,05, **P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con
respecto al grupo de isatina (10 mM).
154
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + DNC 100 µm
A
DNC 100 µM
***b
3000
2500
2000
1500
***
***
1000
**
500
*
***
*
**b
***
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
180
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
B
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
b
a
a
*
20
40
60
80
**
**
***
***
100
120
140
160
*
**
*
*a
*b
**
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
a
b
20
40
60
80
100
*b
120
*c
** b
**b
** c
** c
140
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.12: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
dinitrocatecol (100 µM). La isatina y el dinitrocatecol fueron perfundidos durante 60
minutos a partir del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la
media ± EEM (n= 5-11) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de
significación: *P< 0,05, **P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP<
0,005, cP< 0,001, con respecto al grupo de isatina (10 mM).
155
RESULTADOS
4.5.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con atropina
Para comprobar el efecto de antagonistas de los receptores
colinérgicos de la acetilcolina sobre el efecto de la isatina, se perfundió a
través de la sonda de microdiálisis un antagonista de tipo muscarínico, la
atropina. De este modo, también se evalúa la interacción de isatina con
anticolinérgicos, que son fármacos utilizados en la EP.
La administración intraestriatal de atropina (1 mM) durante una hora
produjo un incremento máximo hasta un 186,6 ± 31,4 %, con respecto a
los basales (20 minutos después del comienzo de la administración de la
atropina). La atropina no produjo modificaciones significativas en los
niveles de los metabolitos de la dopamina. Los valores anteriores fueron
considerados como basales para determinar el efecto de la isatina en
animales tratados con atropina.
La administración conjunta de isatina (10 mM) y atropina, en animales
tratados con este antagonista, produjo un incremento en los niveles
extracelulares de dopamina hasta un 381,0 ± 144,6 %, con respecto a los
basales (20 minutos después del comienzo de la administración de la
isatina). Los niveles de DOPAC y HVA descendieron hasta un 26,5 ± 5,2
% y 46,7 ± 12,1 %, en relación al basal, respectivamente (80 minutos
después del comienzo de la administración de la isatina). Este descenso
fue significativamente menor al producido por la administración de isatina
sola.
Las variaciones observadas en los niveles de dopamina fueron
significativamente distintas a las producidas por la isatina sola, ya que
supuso un descenso de un 69,3 % del efecto máximo de la isatina. Este
resultado indica que la acción de la isatina sobre la liberación de dopamina
estriatal podría estar mediada, en parte, por la activación de receptores
muscarínicos de acetilcolina en el núcleo estriado (Figura 4.13).
156
RESULTADOS
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
HVA (% respecto al basal)
DOPAC (% respecto al basal)
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + Atropina 1 mM
A
***
***
***
**
**
20
40
60
80
***
b
*
100
120
140
a
160
180
200
***
***
**
220
240
240
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
*** a *** b
*** a
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
*
**
*
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
*
*** b *** b **a
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo (min)
160
180
200
220
**a
240
Figura 4.13: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
atropina (1 mM). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento
indicado por la flecha. La perfusión de atropina fue realizada durante 120 minutos,
mostrado mediante la barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 511) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05,
**
P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, con respecto al grupo
de isatina (10 mM).
157
RESULTADOS
4.5.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con ropinirol
Para investigar el efecto de agonistas de receptores dopaminérgicos
sobre la liberación in vivo de dopamina inducida por isatina, esta se
administró juntamente con ropinirol, agonista dopaminérgico con mayor
afinidad sobre los receptores de tipo D3.
La administración de ropinirol (5 mM) a través de la sonda de
microdiálisis incrementó los niveles de dopamina hasta un 368,3 ± 2,8 %,
respecto a los basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de ropinirol). Además, se produjo un incremento
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un
144,2 ± 9,1 % y 182,3 ± 19,1 %, con respecto al basal, respectivamente
(60 minutos después del comienzo de la administración del ropinirol).
Cuando la isatina fue administrada juntamente con el ropinirol los
niveles de dopamina se incrementaron hasta un 857,3 ± 142,6 % respecto
a los basales (40 minutos después del comienzo de la administración de la
isatina). Además se produjo un descenso significativo en los niveles
extracelulares de DOPAC y HVA hasta un 56,2 ± 9,8 % y 75,5 ± 9,2 %,
con respecto al basal, respectivamente. El descenso provocado sobre los
metabolitos no es significativamente diferente a los de la administración
de isatina sola, estos descensos se observaron en la última muestra de los
experimentos en el caso del DOPAC y en la penúltima en el caso del HVA.
Las
variaciones
en
los
niveles
de
dopamina
no
fueron
significativamente distintas a las producidas por la isatina sola, lo que
indica que la liberación de dopamina inducida por isatina no es modificada
por ropinirol (Figura 4.14).
158
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
1400
Isatina 10 mM + Ropinirol 5 mM
A
Ropinirol 5 mM
***
1200
***
1000
***
800
600
***
***
400
***
***b ***
***
*a
200
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
B
200
150
*
*c
*c
100
*c
50
***
***
**
**
**b
100
120
140
160
180
b
0
20
40
60
80
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
200
C
*c
*c
b
150
*
100
**
*
50
*
**
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.14: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
ropinirol (5 mM). La isatina y el ropinirol fueron perfundidos durante 60 minutos a
partir del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM
(n= 4-11) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P<
0,05, **P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con
respecto al grupo de isatina (10 mM).
159
RESULTADOS
4.5.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con
amantadina
Para investigar el efecto de la amantadina sobre la liberación in vivo
de dopamina inducida por isatina se administró esta juntamente con
amantadina, un compuesto antivírico utilizado clínicamente en el manejo
de la EP.
La administración de amantadina (5 mM), a través de la sonda de
microdiálisis, incrementó los niveles de dopamina y HVA hasta un 1283,2
± 386,2 % y 133,6 ± 7,1 %, con respecto a los basales, respectivamente.
Dichos incrementos se produjeron a los 40 y 60 minutos del comienzo de
la administración de amantadina. Además, se produjo un descenso
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC hasta un 41,7 ± 14,5
%, con respecto al basal (última muestra de la experimentación).
Cuando la isatina fue administrada juntamente con la amantadina los
niveles de dopamina se incrementaron hasta un 2992,9 ± 554,5 %,
respecto a los niveles basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de isatina). Además, se produjo un descenso significativo
en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un 43,1 ± 7,7 % y
72,5 ± 7,6 %, con respecto al basal, respectivamente (80 minutos después
del comienzo de la administración de la isatina). El descenso provocado
sobre los metabolitos no fue significativamente diferente a los de la
administración de isatina sola.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, suponiendo un incremento de
3,6 veces del efecto de la isatina en el mismo tiempo y de 2,4 veces del
efecto máximo de la isatina, lo que indica que la liberación de dopamina
inducida por isatina es incrementada por la amantadina (Figura 4.15).
160
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Isatina 10 mM + Amantadina 5 mM
A
Amantadina 5 mM
***c
***b
**
**
20
40
60
**
**
***
***
80
100
**
***
120
140
160
180
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
***
***
a
***
**
***
**
*b
160
180
**
20
40
60
80
100
120
140
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
** b
*
*b
**
**
20
40
60
80
100
120
140
*
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.15: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
amantadina (5 mM). La isatina y la amantadina fueron perfundidas durante 60 minutos
a partir del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ±
EEM (n= 4-11) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación:
*
P< 0,05, **P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001,
con respecto al grupo de isatina (10 mM).
161
RESULTADOS
4.5.5.
Efecto de la isatina en animales tratados con L-DOPA
Para investigar el efecto de la L-DOPA sobre la liberación in vivo de
dopamina inducida por isatina se administró isatina juntamente con dicho
compuesto. La L-DOPA es el compuesto precursor de la dopamina y es el
principal agente terapéutico utilizado para el tratamiento de la EP.
La administración de L-DOPA (25 µM), a través de la sonda de
microdiálisis, incrementó los niveles de dopamina hasta un 2064,6 ± 139,1
%, con respecto a los basales (40 minutos después del comienzo de la
administración de L-DOPA). Además, se produjo un incremento
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un
151,9 ± 5,6 % y 161,4 ± 21,9 %, con respecto al basal, respectivamente
(60 minutos después del comienzo de la administración de L-DOPA). El
incremento provocado sobre los metabolitos fue significativamente
diferente al de la administración de isatina sola.
Cuando la isatina fue administrada juntamente con la L-DOPA los
niveles de dopamina se incrementaron hasta un 2584,9 ± 497,9 % respecto
a los basales (40 minutos después del comienzo de la administración de
isatina). Además, se produjo un incremento significativo en los niveles
extracelulares de DOPAC hasta un 371,2 ± 96,3 % con respecto al basal
(40 minutos después del comienzo de la administración de isatina). No se
produjeron modificaciones significativas sobre el HVA.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, lo que supuso un incremento
de 2 veces del efecto máximo de la isatina, lo que indica que la liberación
de dopamina inducida por isatina es incrementada por la L-DOPA (Figura
4.16).
162
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Isatina 10 mM + L-DOPA 25 µM
A
L-DOPA 25 µM
***b
3000
***c
2500
***b
2000
***b
1500
**
1000
***c
***
***
***
500
***
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
600
B
500
*b
*c
400
300
200
*
** b
*b
*a
*b
** c
b
100
0
20
40
60
80
***
***
**
100
120
140
a
160
180
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*b
C
20
a
40
60
80
100
b
a
a
*
**
*
120
140
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.16: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con LDOPA (25 µM). La isatina y la L-DOPA fueron perfundidas durante 60 minutos a partir
del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM (n=
4-11) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05,
**
P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con
respecto al grupo de isatina (10 mM).
163
RESULTADOS
Para determinar el efecto de la administración sistémica de L-DOPA
sobre el incremento de los niveles de dopamina inducidos por isatina se
administró L-DOPA metil-éster (500 mg/kg i.p.). Previamente a la
administración de L-DOPA se administró benserazida, un inhibidor de la
DDC para evitar la metabolización periférica de la L-DOPA.
La administración de benserazida (80 mg/kg i.p.) no produjo
modificaciones en los niveles de la dopamina y sus metabolitos durante
toda la administración.
Tras 40 minutos de la administración de benserazida se administró LDOPA i.p. La L-DOPA fue incrementando ligeramente los niveles de
dopamina a partir del minuto 120 de los experimentos, alcanzándose un
máximo incremento aproximadamente en el minuto 260 de la
experimentación. Los niveles de dopamina alcanzaron unos valores de
1786,6 ± 725,6 %, con respecto a los niveles basales.
La isatina comenzó a administrarse por medio de la sonda de
microdiálisis en el minuto 240. Se observó un incremento máximo de los
niveles de dopamina en el minuto 260 hasta un 6171,7 ± 3248,4 %, con
respecto a los basales.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola en el mismo tiempo,
suponiendo un incremento de 7,4 veces del efecto de la isatina, lo que
indica que la liberación de dopamina inducida por isatina es incrementada
por la L-DOPA.
La administración de L-DOPA i.p. provocó un incremento
significativo de los niveles de DOPAC y HVA a partir de los 120 minutos
de experimentación. Los valores máximos para el DOPAC y el HVA
fueron: 1682,7 ± 230,2 % (minuto 320 de experimentación) y 1980,9 ±
421,5 % (minuto 340 de experimentación), con respecto al basal,
respectivamente.
La administración de isatina en animales pretratados con L-DOPA
produjo un incremento significativo en los niveles de DOPAC y HVA.
Los valores máximos tras la administración de isatina para el DOPAC y
el HVA fueron: 1273,04 ± 461,4 % (minuto 280 de experimentación) y
1638,1 ± 91,6 % (minuto 360 de experimentación), con respecto al basal,
respectivamente (Figura 4.17).
164
RESULTADOS
4000
3000
*a
L-dopa ip
5000
Isatina 10 mM + L-DOPA 500 mg/kg ip
Benserazida 80 mg/kg ip
A
Benserazida ip
6000
***
** *
* *** *** ** ** *
***
**
1000
0
20
3000
60
100
140
180
220
*a
***a
**
2000
***a
**a *a
***
260
*a
*
*** ***
300
340
Tiempo (min)
B
1500
D
2000
AT
L-DOPA ip
2500
Benserazida ip
B
L
DOPAC (% respecto al basal)
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
L-DOPA 500 mg/kg ip
**b
***c
***c ***c ***c
***
**b
1000
500
** *** *b *b *b *b
*
**
* *
*b *b
*a
0
20
60
100
140
180
220
260
300
340
2500
2000
1500
L-DOPA ip
3000
Benserazida ip
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
C
***c
** ***c
*
*
1000
*
*
500
*
0
20
60
100
*
140
***
*** ***
180
***
220
***c
***c
***c
**b
***c
***c
***c ***c***c
***
260
300
**b
***c
340
Tiempo (min)
Figura 4.17: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con LDOPA i.p (500 mg/kg) y benserazida i.p. (80 mg/kg). La benserazida fue administrada
al inicio de la experimentación y la L-DOPA 40 minutos después. La isatina fue
perfundida durante 60 minutos a partir del momento indicado por la flecha (minuto 240).
Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 5-11) de los valores basales
considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05, **P<0,01, ***P<0,001, con
respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con respecto al grupo de isatina (10
mM).
165
RESULTADOS
4.6. MEDIACIÓN
DE
LOS
RECEPTORES
GLUTAMATÉRGICOS EN EL EFECTO DE LA ISATINA
SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
El objetivo de estos experimentos fue determinar la participación de
los receptores ionotrópicos glutamatérgicos de tipo NMDA en el efecto
de la isatina sobre la liberación de dopamina en el núcleo estriado.
Para ello se utilizaron dos antagonistas diferentes de los receptores
NMDA: AP-5 (antagonista competitivo) y MK-801 (antagonista no
competitivo).
166
RESULTADOS
4.6.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con AP-5
La administración intraestriatal de AP-5 (650 µM) durante una hora
no produjo modificaciones significativas en los niveles de dopamina.
Además, se observó un incremento significativo en los niveles
extracelulares de DOPAC y HVA hasta un 129,9 ± 8,3 % y 131,9 ± 4,6
%, con respecto al basal, respectivamente (60 minutos después del
comienzo de la administración de AP-5).
Los valores anteriores fueron considerados como basales para
determinar el efecto de la isatina en animales tratados con AP-5.
La administración de isatina juntamente con AP-5 produjo un
incremento significativo de los niveles de dopamina hasta un 550,7 ±
201,4 %, respecto a los basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de la isatina). Además, se produjo un descenso
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un
70,9 ± 12,6 % y 90,1 ± 20,4 %, en relación al basal, respectivamente (80
minutos después del comienzo de la administración de isatina).
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, supuso una reducción del 55,6
% del efecto máximo de la isatina, lo que indica que el tratamiento con
AP-5 induce un descenso del efecto de la isatina sobre la liberación de
dopamina (Figura 4.18).
167
RESULTADOS
DOPAC (% respecto al basal)
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Isatina 10 mM + AP-5 650 µM
A
***
***
***
** b
** a
***
***
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
***
***
**
***
***
160
180
200
220
*
*
*
*
240
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
*
***
20
40
60
80
100
120
140
**
240
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
***
20
40
60
80
100
120
140
160
*
**
180
200
*
220
240
Tiempo (min)
Figura 4.18: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
AP-5 (650 µm). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento
indicado por la flecha. La perfusión de AP-5 fue realizada durante 120 minutos,
mostrado mediante la barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 611) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05,
**
P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, con respecto al grupo
de isatina (10 mM).
168
RESULTADOS
4.6.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con MK-801
La administración intraestriatal de MK-801 (500 µM) durante una
hora produjo una disminución significativa de los niveles de dopamina
hasta un 59,4 ± 13,4 %, con respecto a los basales. No se produjeron
modificaciones significativas sobre los niveles de los metabolitos.
Los valores anteriores fueron considerados como basales para
determinar el efecto de la isatina en animales tratados con MK-801.
La administración de isatina juntamente con MK-801 produjo un
incremento significativo en los niveles de dopamina hasta un 530,4 ±
160,0 %, respecto a los niveles basales (40 minutos después del comienzo
de la administración de la isatina). Además se produjo un descenso
significativo en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un
75,6 ± 9,6 % y 95,6 ± 9,3%, con respecto a los basales, respectivamente
(80 minutos después del comienzo de la administración de isatina). Estos
descensos no difieren del efecto de la isatina sola en los niveles de los
metabolitos en el mismo tiempo de administración.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, suponiendo una reducción del
57,3 % del efecto máximo de la isatina, lo que indica que el tratamiento
con MK-801 provoca una disminución del efecto de la isatina sobre la
liberación de dopamina (Figura 4.19).
169
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
1400
Isatina 10 mM + MK-801 500 µM
A
***
1200
***
1000
800
***
*** b
600
400
***
200
**
**
0
20
40
60
80
100
120
***
*
140
160
180
200
220
240
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
b
*a
***
***
20
40
60
80
100
120
140
160
*
***
**
180
200
220
240
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
c
*
20
40
60
80
100
120
140
160
*
**
180
200
*
220
240
Tiempo (min)
Figura 4.19: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con
MK-801 (500 µm). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento
indicado por la flecha. La perfusión de MK-801 fue realizada durante 120 minutos,
mostrado mediante la barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 611) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05,
**
P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, bP< 0,01, cP< 0,001, con
respecto al grupo de isatina (10 mM).
170
RESULTADOS
4.7. MEDIACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO EN EL EFECTO DE
LA ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
El objetivo de estos experimentos fue comprobar si la producción de
óxido nítrico por la NOS podría ejercer algún papel sobre los efectos de
la isatina en los niveles extracelulares de la dopamina y sus metabolitos.
La realización de estos grupos experimentales se justifica por el hecho de
que los antagonistas glutamatérgicos NMDA modificaron el efecto de la
isatina y porque la enzima NOS es sensible a la activación de estos
receptores.
Para ello se realizaron dos grupos experimentales con inhibidores de
la NOS: L-NAME y 7-NI.
171
RESULTADOS
4.7.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con L-NAME
La administración intraestriatal de L-NAME (100 µM) durante una
hora no produjo modificaciones significativas en los niveles de dopamina
y sus metabolitos.
La administración de isatina juntamente con L-NAME produjo un
incremento significativo de los niveles de dopamina hasta un 497,7 ±
194,03 %, respecto a los basales (60 minutos después del comienzo de la
administración de isatina). Además, se produjo un descenso significativo
en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un 52,0 ± 16,7 % y
62,2 ± 7,4 %, en relación al basal, respectivamente. Estos descensos no
difieren del efecto de la isatina sola en los niveles de los metabolitos en el
mismo tiempo de administración. El máximo descenso del DOPAC se
observó a los 80 minutos del comienzo de la administración de isatina,
mientras que el HVA presentó el descenso máximo a los 60 minutos del
comienzo de la administración de isatina.
Los valores anteriores fueron considerados como basales para
determinar el efecto de la isatina en animales tratados con L-NAME.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, pues supuso una reducción
del 59,9 % del efecto máximo de la isatina, lo que indica que el tratamiento
con L-NAME provoca una disminución del efecto de la isatina sobre la
liberación de dopamina (Figura 4.20).
172
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Isatina 10 mM + L-NAME 100 µM
A
***
***
***
** b
***
**
**
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
***
***
**
220
240
*
**b
220
240
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
**
20
40
60
80
100
120
140
***
**
160
180
200
***
***
**
**
***
**
*
160
180
200
220
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
b
20
40
60
80
100
c
120
140
**b
240
Tiempo (min)
Figura 4.20: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con LNAME (100 µm). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento
indicado por la flecha. La perfusión de L-NAME fue realizada durante 120 minutos,
mostrado mediante la barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 811) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05,
**
P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y bP< 0,01, cP< 0,001, con respecto al
grupo de isatina (10 mM).
173
RESULTADOS
4.7.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con 7-NI
La administración intraestriatal de 7-NI (100 µM) durante una hora no
produjo modificaciones significativas sobre los niveles de dopamina y
DOPAC. Los niveles de HVA se incrementaron hasta un 146,2 ± 12 %,
con respecto al basal (60 minutos después del comienzo de la
administración de 7-NI).
Los valores anteriores fueron considerados como basales para
determinar el efecto de la isatina en animales tratados con 7-NI.
La administración de isatina juntamente con 7-NI produjo un
incremento significativo en los niveles de dopamina hasta un 884,1 ±
263,2 %, respecto a los basales (20 minutos después del comienzo de la
administración de isatina). Además, se produjo un descenso significativo
en los niveles extracelulares de DOPAC y HVA hasta un 50,4 ± 8,5 % y
76,8 ± 10,9 %, en relación al basal, respectivamente. Estos descensos no
difirieron del efecto de la isatina sola en los niveles de los metabolitos en
el mismo tiempo de administración. El máximo descenso del DOPAC se
observó a los 80 minutos del comienzo de la administración de isatina,
mientras que el HVA presentó el descenso máximo a los 60 minutos.
Las variaciones en los niveles de dopamina fueron significativamente
distintas a las producidas por la isatina sola, ya que supuso una reducción
del 28,7 % del efecto máximo de la isatina, lo que indica que el tratamiento
con 7-NI induce un descenso del efecto de la isatina sobre la liberación de
dopamina (Figura 4.21).
174
RESULTADOS
DA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Isatina 10 mM + 7-NI 100 µM
A
***
***
***
***
***
*** a
***
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
DOPAC (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
B
**
***
***
**
***
20
40
60
80
100
120
140
***
***
***
160
180
200
*
**
220
**
240
HVA (% respecto al basal)
Tiempo (min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C
*
*
*
***
20
40
60
80
100
120
140
160
***
180
***
200
*
*
220
*
240
Tiempo (min)
Figura 4.21: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de dopamina (A), DOPAC (B) y HVA (C) en animales tratados con 7NI (100 µm). La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del momento
indicado por la flecha. La perfusión de 7-NI fue realizada durante 120 minutos,
mostrado mediante la barra negra. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 511) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P< 0,05,
**
P<0,01, ***P<0,001, con respecto al basal y aP< 0,05, con respecto al grupo de isatina
(10 mM).
175
RESULTADOS
4.8. EFECTO DE LA ISATINA SOBRE AMINOÁCIDOS
NEUROTRANSMISORES EN EL NÚCLEO ESTRIADO
En la Figura 4.22 se muestra un cromatograma representativo de
patrones (A) en el que se pueden apreciar los picos correspondientes a los
aminoácidos analizados: aspartato, glutamato, taurina, glicina. En la
sección B se expone una superposición de cromatogramas de muestras de
dializados: en azul se representa un cromatograma correspondiente a la
administración de un medio Ringer (muestras basales), mientras que en
magenta se representa la evolución de los cromatogramas anteriores tras
la administración de 10 mM de isatina, apreciando las variaciones en los
niveles de los aminoácidos.
Los niveles extracelulares de los aminoácidos analizados fueron
estables durante el período de experimentación en las ratas control que no
fueron sometidas a ningún tipo de tratamiento (únicamente perfusión
continua de medio Ringer). Los valores basales, expresados en ng/20 min,
se muestran en la Tabla 4.2.
Compuesto
Valor basal
ASP
1,8 ± 0,5
GLU
TAU
GLI
2,2 ± 0,5
0,3 ± 0,1
0,3 ± 0,1
(ng/ 20 min)
Tabla 4.2: Valores basales (expresados en ng/20 min) para el aspartato (ASP), el
glutamato (GLU), la taurina (TAU) y la glicina (GLI).
176
RESULTADOS
A
B
Figura 4.22: A. Cromatograma representativo de patrones de los aminoácidos
analizados por medio de HPLC con detección fluorimétrica según las condiciones
descritas previamente. B. Superposición de cromatogramas de dializados de muestras
experimentales: en azul se representa un cromatograma de muestra basal y en magenta
un dializado tras administrar 10 mM de isatina.
177
RESULTADOS
La perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) durante una hora
produjo un incremento significativo en los niveles extracelulares de
aspartato hasta un 194,3 ± 29,6 %, con respecto a los basales. Este
incremento se produjo tras 40 minutos de perfusión de isatina,
recuperándose los valores basales 20 minutos después del término de la
administración de la misma (Figura 4.23).
ASPARTATO (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Ringer
300
250
**
200
150
100
50
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.23: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de aspartato. La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir
del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM (n=
5) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: **P<0,01, con
respecto al basal.
178
RESULTADOS
La perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) durante una hora
produjo un incremento significativo sobre los niveles extracelulares de
glutamato hasta un 461,02 ± 114,7 %, con respecto a los basales. Este
incremento máximo se produjo tras 60 minutos de perfusión de isatina,
recuperándose los valores basales 40 después del término de la
administración de la misma (Figura 4.24).
GLUTAMATO (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Ringer
800
700
***
**
600
500
**
400
**
300
200
100
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.24: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de glutamato. La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir
del momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM (n=
5) de los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: **P<0,01,
***
P<0,001, con respecto al basal.
179
RESULTADOS
La perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) durante una hora
produjo un incremento significativo sobre los niveles extracelulares de
glicina de un 140,7 ± 16,3 %, con respecto a los basales. Este incremento
máximo se produjo tras 40 minutos de perfusión de isatina, recuperándose
los valores basales tras el incremento observado anteriormente (Figura
4.25).
GLICINA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Ringer
300
250
200
*
150
100
50
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (min)
140
160
180
Figura 4.25: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de glicina. La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del
momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 5) de
los valores basales considerados el 100%. Niveles de significación: *P<0,05 con
respecto al basal.
180
RESULTADOS
La perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) durante una hora no
produjo modificaciones significativas en los niveles de taurina (Figura
4.26).
TAURINA (% respecto al basal)
Isatina 10 mM
Ringer
300
250
200
150
100
50
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tiempo (min)
Figura 4.26: Efecto de la perfusión intraestriatal de isatina (10 mM) sobre los
niveles estriatales de taurina. La isatina fue perfundida durante 60 minutos a partir del
momento indicado por la flecha. Los datos se expresan como la media ± EEM (n= 5) de
los valores basales considerados el 100%.
181
RESULTADOS
182
5
DISCUSIÓN
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
DISCUSIÓN
En relación al objetivo general fijado en este trabajo, consistente en
evaluar los efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica
en el núcleo estriado, se administraron diferentes concentraciones de
isatina a través de la sonda de microdiálisis.
La medición de la dopamina y sus metabolitos es una de las ventajas
que presenta la microdiálisis. Sin embargo, la explicación y discusión de
las variaciones de los niveles de los metabolitos puede resultar difícil. Una
de las dificultades es que la concentración del DOPAC en dializado no
refleja del todo los niveles reales. Así, en tejido se considera que el ratio
dopamina/DOPAC es positivo, excepto en condiciones de inhibición de la
MAO. En dializado este ratio se revierte, de este modo se observa una
concentración 100 veces mayor a la de la dopamina (Arbuthnott et al.
1990a).
Por
este
motivo,
en
nuestro
registro
cromatográfico
incrementamos 10 veces la sensibilidad del cromatógrafo para el análisis
de la dopamina.
Igualmente,
es
necesario
considerar
algunas
limitaciones
metodológicas para la técnica de muestreo in vivo por microdiálisis. Una
de las limitaciones que presenta es la resolución temporal de 20 minutos
y una relación cuantitativa imponderable entre la concentración de las
sustancias en el dializado y en la hendidura sináptica, lo que hace que el
análisis o la extrapolación cuantitativa sea compleja (Arbuthnott et al.
1990a).
Al mismo tiempo, es necesario considerar que la cantidad de
dopamina y metabolitos obtenida en los dializados es aquella que se
encuentra en el espacio extracelular, por tanto es aquella que se escapa de
los diferentes procesos fisiológicos de inactivación como la recaptación,
la metabolización y la difusión (Pani et al. 1990). Igualmente, algunos
autores explican que el DOPAC, a diferencia de moléculas activas como
185
DISCUSIÓN
la dopamina, pasa más rápido al espacio extracelular, por lo que el registro
de sus variaciones puede ser más difícil (Westerink et al. 1988).
Es necesario considerar con cautela las variaciones de los metabolitos
como indicadores de actividad neuronal debido a los estados de
sulfoconjugación y la acción de los transportadores de metabolitos.
Aunque generalmente la tasa de conversión del neurotransmisor en sus
metabolitos sea considerada un indicador de metabolismo, los niveles de
metabolitos se pueden disociar funcionalmente de los niveles del
neurotransmisor y los niveles recogidos en el espacio intersticial no
necesariamente deben reflejar la actividad neuronal (Cumming et al.
1992).
Además, Westerink et al. (1988) consideran que el DOPAC puede
derivar parcialmente de tejidos neuronales distantes que no sean
influenciados por los compuestos aplicados. Asimismo, estos autores
apuntan a que solo el 50% del DOPAC basal formado se relaciona con la
actividad neuronal.
La concentración máxima de isatina utilizada en el presente estudio
fue de 10 mM, aunque pueda parecer a priori una concentración elevada
para la administración intraestriatal, es necesario tener en cuenta que no
toda la isatina disuelta en el líquido de perfusión atraviesa la sonda de
microdiálisis. En este trabajo de investigación, la tasa de perfusión de
isatina fue aproximadamente del 1 %. Por tanto, la administración de una
concentración 10 mM a nivel estriatal equivale a 100 µM. Así,
considerando el flujo de la bomba de microdiálisis (1,5 µl/min), cada 20
minutos se administran in situ 0,43 µg de isatina.
Igualmente, las diferentes concentraciones de isatina utilizadas no
produjeron modificaciones comportamentales objetivables a simple vista.
En los estudios en los que se determinó que la isatina produce efectos motores
186
DISCUSIÓN
(de carácter beneficioso sobre la sintomatología motora en los animales
parkinsonizados), ésta fue administrada a nivel sistémico y en modelos
experimentales de Parkinson que, además, fueron sometidos a test motores
específicos (Zhou et al. 2001; Ogata et al. 2003; Hamaue et al. 2004; Xu et
al. 2006). En otros estudios se ha observado que la administración sistémica
de 50-200 mg/kg de isatina no produjo alteraciones comportamentales
(Hamaue et al. 1999a).
Además, Pani et al. (1990) indican que los cambios in vivo en la
concentración de dopamina inducidos por diferentes compuestos pueden
afectar a los niveles extracelulares de dopamina, sin tener consecuencias
comportamentales, ya que es posible que la dopamina no interactúe en el
espacio sináptico hasta el punto de producir cambios comportamentales.
Asimismo, Blaha et al. (1996) señalan que el incremento de dopamina
producido únicamente por inhibición de la MAO no es suficiente para
provocar alteraciones conductuales como pueden producir otros
compuestos con efectos más complejos a nivel neuroquímico, como la
anfetamina.
Debido a que la mayoría de estudios acerca de los efectos de la isatina
sobre neurotransmisión utilizan una administración sistémica no se puede
establecer una comparación directa de los resultados de estos estudios con
los obtenidos a través de la microdiálisis.
Por otro lado, se puede comparar la concentración de isatina utilizada
en este trabajo de investigación con las dosis utilizadas en otros estudios,
donde la isatina fue administrada de forma sistémica en una dosis de 50250 mg/kg, realizándose varias administraciones en días contiguos.
Bhattacharya et al. (1991c) han observado que dosis de 50-100 mg/kg de
isatina, administradas intraperitonealmente 30 minutos antes de sacrificar
al animal, se corresponden con una concentración de 9 mg/kg
187
DISCUSIÓN
(equivalentes a 60 μM) en el cerebro de la rata. Por tanto, los resultados
obtenidos con las dosis utilizadas en estudios previos son comparables con
los obtenidos en esta investigación, considerando la tasa de perfusión del
1 % obtenida en esta investigación.
Existen escasas referencias en las que se utiliza la administración
intraestriatal de isatina, siendo las concentraciones utilizadas en la
bibliografía disponible de 10 µM y 1 mM (Hamaue et al. 1999b).
Para disolver la isatina en una concentración de 10 mM fue necesario
utilizar DMSO (5 %). Como se puede observar en la Figura 4.2 la
administración de DMSO (5 %) disuelto en Ringer no produjo
modificaciones en los niveles de dopamina ni de sus metabolitos.
Igualmente, en publicaciones previas, para disolver la isatina se ha
utilizado DMSO (Zhou et al. 2001; Ogata et al. 2003; Hamaue et al.
2004), aunque en otros estudios también se utilizó glicolato de celulosa
(Xu et al. 2006).
5.1. EFECTO DE LA PERFUSIÓN INTRAESTRIATAL DE
ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
En base a los resultados obtenidos, se puede afirmar que la
administración i.e. de isatina produce un incremento significativo en los
niveles extracelulares de dopamina acompañado de un descenso en los
niveles de sus metabolitos (DOPAC y HVA). Además, este efecto es
dependiente de la dosis administrada, puesto que el efecto máximo se
produjo con la concentración de 10 mM, siendo significativamente menor
con las concentraciones de 5 y 1 mM (Figura 4.2), lo que indica que la
isatina administrada intraestriatalmente in vivo mediante microdiálisis
induce un incremento de tipo dosis-dependiente de los niveles de
dopamina. En este sentido, previamente se ha descrito que la inhibición
188
DISCUSIÓN
de la MAO producida por la isatina era dependiente de concentración
(Hamaue et al. 1992).
En el caso de los metabolitos de la dopamina, únicamente la
concentración 10 mM de isatina produjo un descenso significativo.
Los resultados obtenidos en este trabajo de investigación concuerdan
ampliamente con los descritos en publicaciones previas en los que la
administración intraestriatal (Hamaue et al. 1999b) y sistémica (Hamaue
et al. 1999b; Ogata et al. 2003; Hamaue et al. 2004; Minami et al. 2006;
Xu et al. 2006) de isatina produjo un incremento de los niveles de
dopamina en el núcleo estriado de ratas. Además, la administración oral
de isatina se relacionó con un incremento de monoaminas en orina
(Hamanue et al. 1996).
El hecho de que la administración de isatina produjera un incremento
significativo de los niveles de dopamina acompañado de un descenso de
los niveles de DOPAC es congruente con la hipótesis de que la isatina
actúa inhibiendo la MAO, principal enzima de la degradación de la
dopamina. Por tanto, se sugiere que la dopamina de nueva síntesis en vez
de ser degrada por acción de la MAO, sea liberada en el espacio
extracelular haciendo que la concentración de sus principales metabolitos
disminuya. En cambio, si los niveles de los metabolitos permanecieran
inalterados se podría sugerir que la isatina presentaría otros mecanismos,
como la inhibición de la recaptación de dopamina o el incremento de la
excitabilidad neuronal (Rivett et al. 1982; Sharp et al. 1986; Lamensdorf
et al. 1996; Zhou et al. 2001).
Basándonos en los resultados obtenidos en nuestra investigación,
podemos plantear la hipótesis de que la isatina, por medio de la inhibición
de la MAO, produce un efecto más directo sobre el DOPAC que sobre el
HVA. Este hecho se correlaciona con otros estudios de microdiálisis en el
189
DISCUSIÓN
estriado, en los cuales se determinó que la administración de un inhibidor
no selectivo de la MAO (pargilina) produjo un mayor descenso del
DOPAC que del HVA, observándose que la disminución del HVA se
produjo de forma más tardía que la del DOPAC (Sharp et al. 1986; Obata
y Yamanaka 1995).
Otros autores observaron que la administración i.p. de pargilina (75
mg/kg) produjo un incremento de los niveles estriatales de dopamina de
1,7 veces con respecto al basal. Este incremento de dopamina se
acompañó de la desaparición de los niveles de DOPAC y HVA, que se
ubicaron en el 5% de los niveles basales (Elverfors et al. 1997). Según
estos autores, el incremento de los niveles de dopamina se debe
posiblemente a que en esta dosis la pargilina provocaría una inhibición
completa de ambas isoformas de la MAO. Resultados similares fueron
encontrados por Wood et al. (1987), Blaha et al. (1996) y Pani et al.
(1990), con incrementos en los niveles de dopamina y descenso de sus
metabolitos tras la administración sistémica de pargilina en la misma
dosis. Además, (Pani et al. 1990) consideran que es posible que la
pargilina no solo inhiba la MAO neuronal, sino también la enzima glial
que sería la responsable de la metabolización de la dopamina que se
recupera en la microdiálisis.
Igualmente, se ha constatado que la disminución de los niveles de
DOPAC y HVA en cerebros de roedor inducida por la administración de
pargilina se debe a una inhibición de ambas isoenzimas de la MAO. Sin
embargo, los autores indican que es necesario tener en cuenta que existen
múltiples factores que pueden provocar alteraciones en los metabolitos de
la dopamina, ya que los niveles de los metabolitos vienen determinados
por la síntesis de neurotransmisor, su metabolismo y la eliminación de los
propios metabolitos (Cumming et al. 1992).
190
DISCUSIÓN
Considerando las variaciones observadas
sobre los
niveles
extracelulares de dopamina y sus metabolitos tanto con la administración
de pargilina como con la isatina en nuestro caso, podríamos extrapolar los
mecanismos descritos para la pargilina para explicar nuestros resultados.
Por tanto, la isatina podría actuar inhibiendo tanto la MAO glial como la
neuronal e inhibir ambas isoformas de la MAO, para producir los efectos
observados en este trabajo de investigación.
Además, en otros estudios se observó una acción protectora de la
isatina ante una dosis letal de triptamina en animales pretratados con
pargilina. No se conoce el mecanismo exacto, pero los autores sugieren
que la isatina protege o enmascara la MAO ante la inactivación por la
pargilina (Kastner y Muller 1981; Medvedev et al. 1996).
No obstante, es necesario considerar que el incremento de dopamina
observado tras la inhibición de la MAO es difícil de interpretar in vivo. Se
ha descrito la presencia de un retrocontrol inhibitorio de la síntesis
catecolaminégica como resultado del incremento de la dopamina en el
núcleo estriado (Westerink et al. 1984), lo que puede llevar a resultados
diferentes de los observados en el presente trabajo de investigación.
Igualmente, estudios recientes con IMAOs-B indican que la dopamina
no desaminada por acción de un IMAO podría actuar sobre receptores
presinápticos, lo que reduciría la liberación de dopamina y provocaría que
no se incrementasen los niveles de dopamina en el dializado (Aluf et al.
2013).
Por otra parte, en estudios de cortes neuronales se ha sugerido que
IMAOs, al producir un cúmulo de dopamina, podrían acabar produciendo
una disminución de la síntesis de dopamina por medio de la inhibición de
la TH derivada de dicha acumulación (Schoepp y Azzaro 1983). Estudios
posteriores muestran que la administración crónica de selegilina inhibe la
191
DISCUSIÓN
TH, por medio de la activación de receptores tanto pre como
postsinápticos (Vrana et al. 1992; Lamensdorf y Finberg 1997). En
nuestro caso, al tratarse de un estudio con tratamiento agudo y al no
observarse una disminución conjunta de dopamina y metabolitos se ha
descartado que la isatina produjera este efecto.
En lo referente a los efectos de la isatina sobre la neurotransmisión
dopaminérgica, Zhou et al. (2001) obtuvieron resultados contradictorios.
Estos investigadores observaron que la administración de isatina (40-100
mg/kg i.p.) no produjo modificaciones en los niveles estriatales de
dopamina en ratas parkinsonizadas con 6-OHDA, mientras que la
pargilina (75 mg/kg i.p.) sí que incrementaba dichos niveles. Para
justificar sus resultados estos autores indican que la dosis utilizada en
estudios previos de isatina no era selectiva para la MAO-B, lo que provocó
que otros autores obtuvieran modificaciones sobre la dopamina. Además,
exponen que existe variabilidad de los diferentes modelos experimentales
de la EP. También proponen la existencia de mecanismos de acción de la
isatina independientes de la MAO.
En apartados posteriores se discutirá más profusamente la forma en la
que la isatina podría estar inhibiendo la MAO en nuestro paradigma
experimental.
Ya que las variaciones en los metabolitos de la dopamina (DOPAC y
HVA) resultan relevantes en el estudio de la actividad MAO, en este
apartado es necesario profundizar más en su discusión.
En primer lugar, el DOPAC como principal metabolito de la
degradación de la dopamina es considerado un buen indicador del
metabolismo dopaminérgico (Westerink et al. 1984; Colzi et al. 1996;
Elsworth y Roth 1997). Esta acción es llevada a cabo por la MAO en la
membrana externa mitocondrial y el DOPAC es el principal producto de
192
DISCUSIÓN
la oxidación de la dopamina de nueva síntesis.
Además, el ratio
DOPAC/dopamina es considerado el índice más fiable de utilización de
dopamina (Garret y Soares da Silva 1990), mientras que en primates el
HVA es considerado un mejor indicador del metabolismo dopaminérgico
(Elsworth y Roth 1997).
Se considera que tanto el DOPAC como el HVA son liberados del
interior celular por medio de un mecanismo de transporte activo
(Miyamoto et al. 1991; Miyamoto et al. 1993).
Otros metabolitos de la dopamina, como el DOPAL, se caracterizan
por ser inestables, reaccionar con facilidad con otras moléculas y son
considerados un mal indicador de la liberación o metabolismo de
dopamina (Colzi et al. 1996; Elverfors et al. 1997).
Además, se considera que cuando se administran compuestos que
liberan dopamina de nueva síntesis, el DOPAC disminuye debido a que la
MAO intraneuronal carece de su principal sustrato. Por tanto, el DOPAC
procede de un reservorio intraneuronal de dopamina de nueva síntesis
(Zetterström et al. 1988), mientras que una disminución de los niveles de
dopamina y DOPAC simultáneamente es un fuerte indicador de una
disminución de la síntesis dopaminérgica (Leviel et al. 2012).
La importancia del DOPAC en el metabolismo dopaminérgico
también se pone en evidencia en estudios previos, en los cuales
descartaron que los compuestos que administraron no produjeron una
inhibición de la MAO, ya que no observaron modificaciones sobre los
niveles de DOPAC. Por ello, la monitorización del DOPAC es útil como
indicador de la acción de compuestos sobre esta enzima (Fairbrother et al.
1990).
193
DISCUSIÓN
Aunque la concentración relativa de dopamina y sus metabolitos sea
considerada una medición de la actividad dopaminérgica y de la
utilización de este neurotransmisor, la relación entre los niveles de
DOPAC y la liberación de dopamina es compleja. Es necesario considerar
que una vez formados, los metabolitos ácidos, son eliminados mediante el
transportador de metabolitos o por medio de conjugación (Westerink
1985; Wood et al. 1987; Cumming et al. 1992).
Por otra parte, el DOPAC no debe ser únicamente concebido como
marcador de la liberación de dopamina, ya que esta puede ser
metabolizada previamente a la liberación, por ejemplo ante la acción de
antagonistas dopaminérgicos (Soares da Silva 1987).
En este trabajo de investigación se puede observar que el descenso de
los niveles de DOPAC fue superior al de HVA, que además disminuye de
forma más tardía. Esto puede ser debido a que la metabolización de la
dopamina en el estriado es principalmente realizada por la MAO, que
conlleva la producción de su metabolito DOPAC, mientras que la
producción del HVA es derivada de la acción extracelular de la COMT
(que metaboliza un menor porcentaje de la dopamina) y que requiere
posterior metabolización por la MAO. Por tanto, se considera que el HVA
deriva principalmente del DOPAC (Westerink 1985; Wood et al. 1987;
Arbuthnott et al. 1990b).
El origen del DOPAC recolectado en dializados es difícil de discutir.
El DOPAC podría proceder de la dopamina liberada y posteriormente
recaptada. Sin embargo, en estudios previos se observó que la
administración de agentes liberadores de dopamina produce una
disminución de los niveles de DOPAC y que la inhibición del DAT no
reduce estos niveles. Esto ha llevado a sugerir que es posible que el
DOPAC no se produzca tras la recaptación, sino que derive de la
194
DISCUSIÓN
dopamina que es nuevamente sintetizada, en sustitución de la dopamina
liberada. Si se asume que el DOPAC intraneuronal difunde al espacio
extraneuronal tras la síntesis dopaminérgica, las variaciones de los niveles
de este metabolito también podrían aportar información sobre la tasa de
formación de dopamina. Este hecho se ha observado por la gran
sensibilidad que presentan los niveles de DOPAC ante tratamientos como
α-metilparatirosina, inhibidor de la síntesis dopaminérgica que provoca
disminución de los niveles extracelulares de dopamina (Arbuthnott et al.
1990a).
Por último, los mecanismos descritos por otros autores para el
incremento de los niveles de dopamina por inhibición de la MAO son: la
inhibición de la MAO previene la metabolización de la dopamina tras la
liberación o puede incrementar el reservorio liberable de dopamina de
nueva síntesis. Aunque algunos investigadores han indicado que los
IMAOs, probablemente, actúen más sobre la dopamina recaptada que
sobre la dopamina de nueva síntesis (Butcher et al. 1990).
5.2. CARACTERIZACIÓN IN VIVO DE LA LIBERACIÓN DE
DOPAMINA ESTRIATAL ESTIMULADA POR ISATINA
Como ya se ha indicado, existen antecedentes científicos que sugieren
que la isatina podría actuar por medio de otros mecanismos neuroquímicos
diferentes a la inhibición de la MAO (Yuwiler 1990; McIntyre y Norman
1990; Panova et al. 1997; Zhou et al. 2001) y se ha observado que otros
inhibidores de la MAO presentaban diversos mecanismos de acción
(Neusch et al. 1997; Olanow et al. 2009a; Boll et al. 2011; Hickey y Stacy
2011; Barbosa y Bossoni 2014).
195
DISCUSIÓN
En la literatura científica no existen antecedentes que describan los
posibles
mecanismos
neuroquímicos
de
la
isatina
sobre
la
neurotransmisión dopaminérgica.
Igualmente, para otros compuestos que producen un descenso de los
metabolitos dopaminérgicos se han propuesto mecanismos neuroquímicos
diferentes a la inhibición de la MAO, como el bloqueo de la recaptación
dopaminérgica y la liberación de dopamina de nueva síntesis (Nishijima
et al. 1996). Este dato sugiere que un incremento de dopamina asociado a
una disminución de sus metabolitos es indicativo de una inhibición de la
MAO, pero no excluye otros mecanismos.
Por otra parte, algunos autores sugieren que el bloqueo de la
degradación de la dopamina no necesariamente implica la liberación de la
misma. Así como la liberación de dopamina por la administración de un
IMAO-B no necesariamente es producida por la acción de la inhibición
enzimática. Además, en el mecanismo de acción de otros IMAO-B,
algunos autores plantean que pueden estar involucrados otros elementos
como la feniletilamina, que es un sustrato específico de MAO-B (Lauber
y Waldmeier 1987; Youdim y Tipton 2002).
Mediante la comparación de los datos obtenidos en esta investigación
con los efectos de diferentes sustancias y medios de perfusión
modificados,
con
acción
conocida
sobre
la
neurotransmisión
dopaminérgica, se pueden caracterizar los mecanismos por los cuales la
isatina incrementa los niveles de dopamina (Westerink et al. 1987;
Westerink et al. 1989; Arbuthnott et al. 1990a; Arbuthnott et al. 1990b;
Kannari et al. 2000).
Utilizando previamente esta metodología en nuestro laboratorio se han
caracterizado los mecanismos neuroquímicos de diversos compuestos
sobre la neurotransmisión dopaminérgica in vivo (Faro et al. 2002;
196
DISCUSIÓN
Campos et al. 2007; Vidal et al. 2007; Ferreira-Nunes et al. 2010; Faro et
al. 2012b).
En los estudios clásicos de microdiálisis se pueden observar dos tipos
de liberación de dopamina (Westerink et al. 1989; Arbuthnott et al.
1990a):

Uno de ellos es el clásico mecanismo exocitótico de liberación de
dopamina asociado al potencial de acción. Este tipo de liberación se
caracteriza por ser dependiente de Ca++ extracelular y TTX.

Otros mecanismos de liberación son independientes de Ca++
extracelular y TTX. De este modo, la dopamina se puede liberar por
medio de la acción inversa del transportador (como lo realiza la
anfetamina), por toxicidad neuronal (como el MPP+, metabolito activo
del MPTP) o por la activación de múltiples mecanismos (como el
glutamato).
Por tanto, existen dos mecanismos diferenciados de liberación de
dopamina objetivable por medio de microdiálisis cerebral. Así, agentes
liberadores pueden utilizar un mecanismo exocitótico (liberación fásica),
inversión del transportador (liberación tónica) o ambos mecanismos
(Arbuthnott et al. 1990a).
Así como podemos determinar diferentes mecanismos de liberación,
la dopamina en el terminal dopaminérgico puede provenir de diferentes
reservorios o compartimentos, interactuando los diferentes compuestos y
medios administrados de diferente modo con estos reservorios. De los tres
reservorios que se conceptualizan, dos son vesiculares y uno
citoplasmático (Arbuthnott et al. 1990a):
197
DISCUSIÓN

El reservorio vesicular de largo almacenamiento contiene dopamina
“inactiva” y parece no participar en la liberación. Se considera que la
reserpina actúa sobre este compartimento.

El compartimento citoplasmático, donde se encuentra la dopamina no
empaquetada en vesículas o en forma libre, proporciona dopamina al
mecanismo dependiente de transportador. Aquellos compuestos que
liberan dopamina y son inhibidos por medio de nomifensina liberan
dopamina de este reservorio. La elevada sensibilidad de la anfetamina
tanto a la nomifensina como a α-metilparatirosina indican que este
reservorio se genera tanto de dopamina de largo almacenamiento
como del reservorio vesicular liberable, que está constituido por
dopamina de nueva síntesis.

Por último, del reservorio vesicular de dopamina de nueva síntesis
(dopamina liberable) se libera dopamina por medio del proceso de
despolarización. Este reservorio también puede ser repuesto con
dopamina del reservorio de largo almacenamiento, sin embargo la
reposición por medio de esta vía es lenta.
Igualmente, tras la administración de reserpina, también se puede
reponer dopamina para su liberación del reservorio de largo
almacenamiento. Bajo este tratamiento, la liberación de dopamina se
realiza por acción inversa del DAT.
En caso de que la dopamina no sea liberada, puede ser transferida entre
los diferentes reservorios o metabolizada por la MAO. En cambio si es
liberada, por medio de la recaptación se podría rellenar el reservorio
citoplasmático, donde la dopamina también puede ser metabolizada.
En relación a la isatina y a los IMAO, se teoriza que bloqueando la vía
degradativa por medio de la inhibición de la MAO debería incrementarse
la liberación de dopamina por acción de todos los liberadores, tanto los
198
DISCUSIÓN
que actúan por medio de transportador como los que actúan por liberación
vesicular.
Además, Kaakkola y Wurman (1992) consideran que la
metabolización por la MAO-B adquiere mayor relevancia en el
metabolismo de la dopamina cuando se inhibe la recaptación, se inhibe la
MAO-A o se incrementa la liberación.
En estudios previos se ha evidenciado que pequeñas modificaciones
en la composición iónica (Ca++, Mg++, K+) en el líquido de perfusión de
microdiálisis produce alteraciones significativas en los niveles basales de
dopamina estriatal (Osborne et al. 1991).
Los efectos observados con la perfusión de los medios modificados y
los diferentes compuestos de forma aislada, para la caracterización de los
mecanismos de isatina, concuerdan con los obtenidos en publicaciones
previas, lo que confiere mayor validez a la metodología (Faro et al. 2002;
Campos et al. 2007; Vidal et al. 2007; Ferreira-Nunes et al. 2010; Faro et
al. 2012b).
Para determinar el posible mecanismo de acción por el cual la isatina
induce la liberación de dopamina estriatal se utilizó la concentración de
10 mM, ya que en el estudio de la dosis-respuesta únicamente esta
concentración produjo un incremento significativo de los niveles de
dopamina acompañado de un descenso de sus principales metabolitos, lo
que resulta indicativo que en esta concentración podría actuar por medio
de la inhibición de la MAO.
5.2.1.
Administración de isatina en un medio Ringer sin Ca++
Previamente, otros autores han demostrado que la liberación de
dopamina es altamente dependiente de la concentración de Ca++ en el
líquido de perfusión (Westerink et al. 1987; Westerink et al. 1988;
Osborne et al. 1991; Bergquist et al. 1998; Itoh et al. 1998). La liberación
199
DISCUSIÓN
que se ve modificada por la eliminación del Ca++ en el medio de perfusión
se considera que es de tipo vesicular (Arbuthnott et al. 1990a; Arbuthnott
et al. 1990b; Osborne et al. 1991).
En la Figura 4.3 se puede observar que la eliminación del Ca++ del
medio de perfusión produjo una disminución del efecto máximo de la
isatina del 90,4 %, lo que indica que la liberación de dopamina inducida
por isatina es dependiente de Ca++.
Con respecto a los metabolitos, no se observaron modificaciones
significativas sobre los niveles de DOPAC, pero el HVA descendió
significativamente con respecto a los niveles basales, sin observarse una
recuperación de dichos niveles al final del experimento.
En investigaciones previas se ha observado que la administración de
un medio de perfusión libre de Ca++ produjo una disminución de los
niveles basales de dopamina y de DOPAC hasta un 10-30 % y un 70 % de
los valores basales, respectivamente (Santiago y Westerink 1990; Osborne
et al. 1991; Gazzara y Andersen 1994; Olivier et al. 1995; Bergquist et al.
1998). Además, Olivier et al. (1995) sugieren que un medio libre de Ca++
también podría inhibir la síntesis de dopamina.
Igualmente, no se produjo una eliminación total de los niveles de
dopamina puesto que el medio de perfusión no presenta Ca++, pero no se
elimina el Ca++ , tanto extracelular como intracelular, que existe en el
tejido estriatal del animal de experimentación (Arbuthnott et al. 1990a).
La disminución del efecto de la isatina sobre la dopamina podría
explicarse debido a que la eliminación del Ca++ en el medio de perfusión
puede provocar menos liberación por vía exocitótica o que se sintetice
menos dopamina. En ambos casos, considerando que la isatina actúa
principalmente por medio de la inhibición de la MAO, aunque se degrade
200
DISCUSIÓN
menos dopamina, al no liberarse o al no sintetizarse no aumentará en el
espacio extracelular, que es donde se monitorizan los niveles por medio
de microdiálisis.
5.2.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con TTX
La aplicación de TTX como bloqueante de canales de Na+
dependientes de voltaje se utilizó clásicamente para mostrar si el impulso
nervioso está involucrado en la liberación estimulada por una sustancia.
Esto permite clasificar la liberación estimulada de dopamina en
dependiente de potencial de acción o independiente de potencial de
acción. En general, se considera que cualquier compuesto que es sensible
a la TTX es sensible al Ca++, ya que para la liberación exocitótica de las
vesículas sinápticas se requiere de despolarización por medio de las
corrientes de Na+ dependientes de voltaje, la apertura de los canales de
Ca++ dependiente de voltaje y la entrada de este ión (Westerink et al. 1987;
Westerink et al. 1989; Arbuthnott et al. 1990a; Santiago y Westerink
1990; Itoh et al. 1998).
En investigaciones previas se ha observado que la administración de
TTX (en rango µM) produce una disminución de los niveles basales de
dopamina y de DOPAC hasta un 10 % y 80 %, respectivamente
(Fairbrother et al. 1990; Santiago y Westerink 1990; Gazzara y Andersen
1994).
En este trabajo de investigación, el tratamiento con TTX (10 µM)
produjo una disminución significativa de los niveles de dopamina y
DOPAC. En la Figura 4.4 se puede observar que la administración de
isatina en animales tratados con esta toxina produjo una disminución del
efecto máximo de la isatina sobre la liberación de dopamina del 83,5 %.
201
DISCUSIÓN
Asimismo, la administración de TTX produjo un descenso
significativo de los niveles de DOPAC, observándose que existió una
tendencia al descenso después de la administración de isatina. En el caso
del HVA se observó que la TTX potenció el efecto de la isatina sobre el
descenso de este metabolito.
Estos resultados indican que la liberación de dopamina por acción de
isatina es dependiente de despolarización del terminal dopaminérgico, ya
que el bloqueo de los canales de Na+ dependiente de voltaje por TTX
impide la despolarización del terminal y con ello la liberación de
dopamina, aunque se inhiba la principal vía degradativa de la misma.
Estos resultados refuerzan los hallazgos en el grupo anterior
consistentes en que la liberación de dopamina estimulada por isatina es de
tipo vesicular, ya que la liberación es dependiente de Ca++ y de
despolarización podemos considerar que se trata de una liberación de tipo
fásico, donde se libera dopamina del reservorio vesicular liberable.
Una hipótesis que podría explicar este efecto consistiría en que la
isatina aumenta la dopamina en el reservorio citoplasmático por inhibición
de MAO, esta dopamina puede ser transferida al reservorio vesicular
liberable; por este motivo la disminución de Ca++ y la TTX bloquean su
efecto.
5.2.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con reserpina
La reserpina es un inhibidor del empaquetamiento de dopamina en las
vesículas sinápticas, por tanto expone al neurotransmisor a la acción de la
MAO en el citoplasma neuronal o a su liberación desde el reservorio
citoplasmático (Raiteri et al. 1979; Heeringa y Abercrombie 1995).
202
DISCUSIÓN
El pretratamiento i.p. con reserpina una hora antes del comienzo del
muestreo con microdiálisis produjo un descenso significativo de los
niveles extracelulares de dopamina y sus metabolitos.
Como se observa en la Figura 4.5 el pretratamiento con reserpina
produjo un descenso del 78,4 % del efecto máximo de la isatina y un
descenso más pronunciado sobre los niveles de HVA con respecto al
descenso producido por isatina sobre la liberación de dopamina, aunque
el DOPAC también descendió significativamente. Estos datos corroboran
la hipótesis de que la dopamina liberada por acción de la isatina es de tipo
exocitótico y de origen vesicular.
La acción de la reserpina consiste en inactivar el empaquetamiento
vesicular de la dopamina por medio del bloqueo del transportador VMAT2, provocando que la liberación evocada bajo los efectos de la reserpina
sea por medio del transportador y del reservorio citoplasmático.
Cuando se administra reserpina los niveles de dopamina en dializado
disminuyen, ya que la dopamina no se encuentra disponible para su
liberación vesicular (Arbuthnott et al. 1990a).
También es necesario señalar que la aplicación de reserpina en todos
los animales produjo catatonia. En este caso no se apreció ninguna mejoría
tras la administración intraestriatal de isatina, aunque tampoco se aplicó
ninguna evaluación motriz específica como en estudios previos (Zhou et
al. 2001; Hamaue et al. 2004; Xu et al. 2006) Además, mediante la técnica
de microdiálisis se realiza una administración muy focalizada en la región
que se implanta la sonda (Westerink et al. 1989).
En estudios previos con isatina y reserpina, Xu et al. (2006)
observaron que la administración de reserpina i.p. durante 4 días (4
administraciones de 0,2; 0,18; 0,15; 0,15 mg/kg) indujo un descenso de
203
DISCUSIÓN
dopamina intraestriatal medidos por microdiálisis cerebral equivalente al
26-64% con respecto al control. La administración de isatina durante 4
días (100 mg/kg i.p por día) en ratas reserpinizadas indujo un aumento
gradual de la dopamina hasta equipararse con el grupo control, al mismo
tiempo que mejoraba la bradicinesia inducida por la reserpina. Del mismo
modo, los niveles de DOPAC y HVA decrecían tras la administración de
reserpina, pero después del tratamiento con isatina dichos niveles fueron
similares al control.
Igualmente, se ha observado un efecto similar con la administración
de pargilina. En este caso la administración de reserpina subcutánea (5
mg/kg) produjo un descenso de los niveles dopaminérgicos estriatales
hasta un 2 % con respecto al basal. Este descenso de los niveles de
dopamina se acompañó de un incremento de los metabolitos. En estos
casos, la administración i.p. de pargilina (75 mg/kg) 2 horas más tarde
produjo una recuperación de los niveles de dopamina estriatal y un
descenso de los niveles de metabolitos (Elverfors et al. 1997).
En otros estudios, se ha observado, también, que debido a la inhibición
de la liberación vesicular por acción de la reserpina, compuestos que
incrementan la liberación de dopamina podrían inducir una liberación por
medio del DAT (Fairbrother et al. 1990). Igualmente, los resultados
obtenidos en este trabajo son similares a los obtenidos por Xu et al. (2006),
donde la reserpina no produce una abolición total del efecto de la isatina
sobre los niveles de la dopamina. Esto explicaría por qué la isatina, a pesar
de inducir una liberación vesicular en condiciones normales, cuando los
animales son pretratados con reserpina, podría existir cierta liberación por
medio de la acción inversa del DAT. Aunque también es posible una
liberación vesicular disminuida debido a un bloqueo no completo por
acción de la reserpina.
204
DISCUSIÓN
La reserpina es considerada el primer compuesto utilizado como
modelo experimental de parkinsonismo en animales (Tieu 2011).
Igualmente, debido a las alteraciones neuroquímicas y a las
manifestaciones motrices que produce, se sigue utilizando actualmente
para inducir modelos experimentales de la EP (Bezard y Przedborski
2011; Santos et al. 2013; Pinna y Morrelli 2014).
Desde esta perspectiva, podemos considerar que la isatina produjo
mejorías en las alteraciones neuroquímicas en el modelo experimental de
la EP inducido por reserpina, ya que se consiguió incrementar los niveles
disminuidos de dopamina producidos por la reserpina (incremento de 2,7
veces, con respecto al efecto de la reserpina). Partiendo de estos resultados
coincidimos con otros investigadores que postulan a la isatina como un
posible compuesto útil en el abordaje de la EP (Glover et al. 1988;
Hamaue et al. 1999a; Ogata et al. 2003; Hamaue et al. 2004; Minami et
al. 2006; Xu et al. 2006; Fang y Wang 2008; Buneeva et al. 2010).
5.2.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con
nomifensina
Para determinar la implicación del DAT en la liberación de dopamina
inducida por isatina se utilizó la nomifensina. Este compuesto es un
bloqueador del DAT y se utiliza para determinar si el bloqueo de este
transportador está implicado en el incremento de los niveles extracelulares
de dopamina (Raiteri et al. 1979; Arbuthnott et al. 1990a).
Además, este grupo se justifica porque estudios previos en el núcleo
estriado de ratas mostraron que la clorgilina inhibe la recaptación de
dopamina, mientras que la pargilina no presenta ese efecto (Culver et al.
2002). Asimismo, en estudios con sinaptosomas se observó que tanto la
clorgilina y selegilina, IMAO-A e IMAO-B respectivamente, pueden
bloquear la recaptación de monoaminas. Sin embargo, el DAT fue el
205
DISCUSIÓN
transportador que requirió mayor concentración de selegilina para su
bloqueo, frente al noradrenérgico y serotonérgico (Lai et al. 1980).
Por otra parte, se considera que en condiciones de incremento de
síntesis de dopamina (por medio de la administración de L-DOPA) o de
inhibición de su degradación (por inhibidores de la MAO), el mecanismo
de liberación por medio del transportador adquiere mayor relevancia, ya
que estas sustancias pueden activar la liberación de dopamina por medio
del transportador (Raiteri et al. 1979).
Nuestros resultados muestran que la administración i.e. de
nomifensina (50 µM) e isatina (10 mM) de forma aislada produjo un
incremento similar sobre los niveles de dopamina. La administración
conjunta de ambos compuestos también produjo un incremento
significativo en los niveles de dopamina que no difiere significativamente
del efecto de cualquiera de las sustancias administradas de forma aislada
(Figura 4.6).
La administración de nomifensina también provocó un incremento
significativo de los niveles de DOPAC, en la coadministración con isatina
no se observaron modificaciones significativas sobre los niveles de este
metabolito. En el caso del HVA no se produjeron modificaciones
significativas con la administración de nomifensina, ni con la
coadministración.
La nomifensina, al igual que otros inhibidores de la recaptación de
dopamina, tiene la capacidad de incrementar los niveles extracelulares de
dopamina (Hurd y Ungerstedt 1989; Butcher et al. 1991; Kaakkola y
Wurman 1992; Budygin et al. 2000). En relación a los metabolitos de la
dopamina, se ha observado que la nomifensina tanto incrementó los
niveles de DOPAC y HVA (Hurd y Ungerstedt 1989), que los disminuyó
206
DISCUSIÓN
(Kaakkola y Wurman 1992), así como, no produjo alteraciones de los
metabolitos (Butcher et al. 1991).
Ya que no se observó diferencia significativa entre los efectos
observados por la coadministración de isatina y nomifensina, se podría
considerar que actúan por mecanismos similares. Es decir, al no existir un
efecto aditivo, parece que el DAT puede estar implicado en el aumento de
los niveles de dopamina por acción de la isatina. Como ya se ha indicado
previamente, a nivel clínico un efecto dual que abarque la inhibición de la
MAO y el bloqueo del DAT de forma simultánea es considerado
beneficioso para la EP (Binda et al. 2011).
Al igual que en este caso, en otras investigaciones se observó que la
coadministración de selegilina y nomifensina mostró unos resultados
similares a la administración de la nomifensina sola. Como la selegilina
no modificó el efecto de la nomifensina sobre la dopamina, los autores
sugieren que la MAO-B no está involucrada en la desaminación de
dopamina seguida del bloqueo del transportador (Butcher et al. 1990).
Mientras que Harsing et al. (1979) observaron que la selegilina producía
una inhibición de la recaptación de dopamina estriatal.
Sin embargo, en otros estudios, la nomifensina incrementó los niveles
estriatales de dopamina en ratas pretratadas con pargilina i.p. (Blaha et al.
1996). Estos resultados discrepantes podrían ser explicados por
diferencias metodológicas, ya que en este caso la pargilina fue
administrada previamente, por ello la pargilina pudo estimular la
liberación de dopamina y posteriormente la nomifensina pudo bloquear la
recaptación de esa dopamina liberada.
Por último, aunque está ampliamente constatada la implicación del
DAT en la liberación de dopamina, puede resultar difícil determinar si el
incremento de dopamina inducido por isatina fue producido por el bloqueo
207
DISCUSIÓN
de la recaptación o por la facilitación de la liberación por medio de modo
inverso del DAT.
En definitiva, teniendo en cuenta los resultados obtenidos y la
discrepancia observada en la bibliografía lo más oportuno resulta
considerar que el DAT realiza un importante papel en la eliminación de
dopamina liberada por isatina.
5.2.5.
Administración de isatina en un medio Ringer con alta
concentración de K+
En la literatura científica, la liberación de dopamina inducida por
despolarización con alta concentración de K+, es uno de los métodos
frecuentemente utilizados para estudiar la movilización de vesículas del
almacenamiento vesicular de dopamina para su liberación exocitótica
(Fairbrother et al. 1990; Ripley et al. 1997; Shui et al. 1998).
De forma contraria, la reducción de K+ en el líquido de perfusión
produce una disminución significativa de los niveles estriatales de
dopamina, DOPAC y HVA. Esto se debe a una hiperpolarización del
terminal neuronal (Osborne et al. 1991).
La administración de isatina diluida en un medio Ringer con KCl 50
mM incrementó 2,8 veces el efecto máximo de la isatina. Si consideramos
el efecto aislado de este medio modificado (incrementa 11,8 veces los
niveles basales de dopamina) observamos claramente un efecto aditivo
(Figura 4.7). Por tanto la isatina incrementa la liberación in vivo de
dopamina estimulada por despolarización.
La administración del medio con alta concentración de KCl no
modificó el efecto de la isatina sobre los metabolitos de la dopamina.
208
DISCUSIÓN
Estos resultados concuerdan con lo descrito por Fairbrother et al.
(1990): la perfusión de un medio con concentraciones elevadas de K+
produce un incremento de dopamina de tipo dosis-dependiente. En
concentraciones de K+ por encima de 60 mM se produce además un
descenso de los niveles de DOPAC y HVA. Esta liberación es de tipo
exocitótica, aunque ante la eliminación de esta vía de liberación también
puede operar por medio del DAT. La estimulación por K+ se considera
que libera dopamina de nueva síntesis.
Los resultados obtenidos en este trabajo de investigación concuerdan
con estudios previos. Harsing y Vizi (1984) observaron que tanto la
selegilina como la clorgilina incrementaron la liberación de dopamina
estimulada por alto K+ en estriado aislado de rata. En ambos casos,
observaron que los IMAOs inhibieron la enzima aproximadamente el 90
%.
Con respecto a los IMAOs, Butcher et al. (1988) observaron que la
administración i.p. de pargilina (75 mg/kg) podría aumentar la
disponibilidad de dopamina en el reservorio citoplasmático para poder ser
liberada con mayor facilidad por otros compuestos que estimulan la
liberación de dopamina.
La isatina aumentaría los niveles de dopamina citoplasmática que está
disponible para llenar el reservorio liberable, lo que facilitaría la
reposición ante una estimulación continua o mantenida, como la
provocada por K+. Como la isatina inhibe la principal vía degradativa,
existe más dopamina disponible para su liberación.
Igualmente, el descenso en los metabolitos de la dopamina se
explicaría por el hecho de que la despolarización estimula la liberación
vesicular, lo que impide que la dopamina se encuentre disponible para su
conversión en DOPAC y HVA.
209
DISCUSIÓN
Sin embargo, otros investigadores observaron que la administración
de 60 mM de K+ produjo un incremento pronunciado de dopamina con un
ligero descenso del DOPAC. Lo justifican indicando que los niveles de
DOPAC no se relacionan directamente con la liberación estimulada de
dopamina, sino que en condiciones de liberación inducida, los niveles de
DOPAC podrían reflejar más las síntesis que la liberación dopaminérgica
(Westerink et al. 1989). Esto justifica el hecho de que el medio con alto
K+ no modifique el efecto de la isatina sobre los metabolitos.
En conclusión, nuestros resultados concuerdan con estudios previos
en los que la liberación estimulada por K+ es incrementada por IMAOs,
como la clorgilina y la pargilina. Debido a que con la administración de
pargilina se observó un mayor incremento que con clorgilina, se plantea
que el aumento de liberación estimulada de dopamina es mayor cuando se
inhiben ambas isoformas (Butcher et al. 1990).
Por tanto, un incremento tan elevado de la dopamina al administrar
isatina en un medio Ringer con alto K+ nos lleva a sugerir que se está
produciendo una fuerte inhibición de la MAO.
5.2.6.
Sumario de la caracterización de los posibles
mecanismos neuroquímicos de la isatina
Los resultados en su conjunto nos indican que la liberación in vivo de
dopamina inducida por isatina depende del contenido vesicular. Dicho
proceso de liberación es de tipo fásico por medio de exocitosis,
dependiente de Ca++ y de la despolarización del terminal dopaminérgico.
Aunque en nuestras condiciones de estudio también puede estar
interviniendo el DAT o este puede realizar un cierto papel en el
aclaramiento de la dopamina evocada por isatina.
210
DISCUSIÓN
Los datos observados con alto K+ muestran que la administración de
isatina en nuestro caso presenta un perfil neuroquímico más similar al de
la pargilina que al de la selegilina, es decir, que está actuando por medio
de una inhibición no selectiva. Esta observación corrobora lo expuesto en
el apartado anterior.
5.3. MEDIACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA MAO EN EL
EFECTO DE LA ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE
DOPAMINA
En apartados anteriores, así como en la bibliografía (Panova et al.
1997; Zhou et al. 2001), se ha expuesto la posibilidad de que la isatina
interactúe de forma no específica con las isoformas de la MAO, a pesar
de que habitualmente se describa como un IMAO-B (Hamaue et al.
1999b; Binda et al. 2003; Buneeva et al. 2010; Manley et al. 2011).
Para determinar la influencia de otros inhibidores de la MAO sobre el
efecto de la isatina en la liberación de dopamina se administraron
clorgilina y selegilina a través de la sonda de microdiálisis. La clorgilina
es un inhibidor selectivo e irreversible de la isoforma A de la MAO,
mientras que la selegilina es un inhibidor selectivo e irreversible de la
isoforma B (Finberg 2014).
Para seleccionar la concentración administrada intraestriatalmente de
cada IMAO se realizó previamente un estudio de dosis-respuesta con cada
compuesto. Finalmente, en ambos casos se seleccionó la concentración 1
mM, ya que fue la concentración más baja que produjo modificaciones
significativas y claramente observables sobre los niveles de dopamina.
Igualmente, se buscó que ambas concentraciones produjeran el mismo
efecto para poder establecer una comparación sobre la modificación que
pudieran provocar sobre el efecto de la isatina.
211
DISCUSIÓN
La
administración
de
clorgilina
y
selegilina
incrementó
significativamente los niveles de dopamina 8,9 y 8,2 veces,
respectivamente. Tanto la coadministración de clorgilina, como la de
selegilina, con isatina no produjeron modificaciones del efecto producido
por la isatina sola.
Estos resultados indican que en nuestras condiciones experimentales
los inhibidores selectivos para cada isoforma no interfieren con el efecto
de la isatina, al menos en las concentraciones utilizadas. Asimismo, un
aspecto a tener en cuenta es que tanto la selegilina como la clorgilina son
inhibidores selectivos para cada isoforma, pero en dosis elevadas se
vuelven inespecíficos.
Como se indicó en el apartado de mecanismos, la administración de
un IMAO produce un incremento o potencia el efecto de compuestos
liberadores de dopamina. Sin embargo, en nuestro caso la isatina no
potenció la liberación de dopamina estimulada por la selegilina ni por la
clorgilina, esto podría ser debido a que la isatina estaría compitiendo con
los otros IMAOs por el mismo sustrato, es decir, la dopamina.
En la misma línea, Panova et al. (1997) estudiaron in vitro e in vivo la
interacción de isatina con inhibidores no selectivos de la MAO. Estos
autores observaron que la administración de isatina a dosis de 80 mg/kg
redujo la inhibición de un IMAO no selectivo sobre la MAO-B, pero no
sobre la MAO-A. Igualmente, indican que el incremento de monoaminas
observado en diversos laboratorios por la administración de isatina es
posible que no involucre la inhibición de la MAO-A, como se suponía
previamente.
Otros autores sugirieron que la isatina, aunque se administre a dosis
elevadas, podría interactuar de forma específica con la isoforma B, debido
a los efectos comportamentales que produce (Panova et al. 1997).
212
DISCUSIÓN
Además, en otros estudios se ha atribuido a la inhibición de la MAOB, por acción de la isatina, un incremento de los niveles de dopamina y
una disminución del ratio DOPAC/dopamina incrementado por el VEJ
(Hamaue et al. 2004).
Lamensdorf et al. (1996) observaron que la administración sistémica
de forma crónica de selegilina producía un incremento en los niveles de
dopamina. Igualmente, Rogríguez-Gómez et al. (1997) observaron que la
administración de selegilina durante tres semanas incrementó los niveles
estriatales de dopamina en relación a su acción como IMAO, pero además
observaron que la actividad de la TH se había incrementado.
Estos datos en conjunto sugieren que la isatina produce una inhibición
de la MAO-B, pero no resulta excluyente de que también produzca
inhibición de la MAO-A. De hecho, los mismos efectos observados con
clorgilina apuntan a una inhibición no selectiva. Así, una inhibición no
selectiva de la MAO a altas dosis fue descrita previamente al observarse
que la isatina aumentó los niveles de serotonina y noradrenalina, que son
sustratos preferentes de la MAO-A. Sin embargo, al observar en algún
caso que no existía modificaciones sobre el HIAA se consideró que
pueden existir mecanismos alternativos hasta ahora no dilucidados, como
el incremento de la excitabilidad de neuronas monoaminérgicas que
produciría un incremento de los niveles de serotonina y noradrenalina
(Medvedev et al. 1996).
Igualmente, Butcher et al. (1990) observaron que la administración
sistémica de selegilina en ratas, solo mostró alteraciones en la
metabolización de la dopamina en una dosis en la cual también inhibía
parcialmente la MAO-A. En este caso disminuyó los niveles de los
metabolitos sin alterar la salida de dopamina, mientras que en dosis
inferiores no modificó los niveles de DOPAC. Por otra parte, estos autores
213
DISCUSIÓN
observaron que la clorgilina, en este caso, incrementó los niveles de
dopamina y disminuyó los de sus metabolitos. Además, la pargilina
modificó los mismos parámetros que la clorgilina, pero con un efecto
mayor. Similarmente, Themann et al. (2002) observaron que la
administración sistémica de una dosis elevada de selegilina de forma
aguda y subcrónica produjo un incremento de los niveles de dopamina y
un descenso del DOPAC.
En ambos trabajos, los autores sugieren que para un incremento
máximo o pronunciado en los niveles extracelulares de la dopamina es
necesario un fuerte bloqueo de ambas isoformas de la MAO, ya que bajo
condiciones de total inhibición de la MAO-A ejerce su acción la MAO-B
(Butcher et al. 1990; Themann et al. 2002), por lo que al bloquear una
isoforma, la otra puede asumir la carga metabolizadora de la misma.
Igualmente, en estudios previos donde se utilizó clorgilina y selegilina
para estudiar el metabolismo de la serotonina se observó que, aunque la
serotonina es metabolizada principalmente por la MAO-A, cuando se
administra clorgilina no se inhibe completamente su metabolización, solo
se inhibe por completo cuando se administra la clorgilina junto con la
selegilina. Esto refuerza la idea de que cuando una isoforma es inhibida
actúa la otra (Green y Youdim 1975; Arbuthnott et al. 1990a).
En primates la administración i.p. de selegilina produjo un incremento
de los niveles de dopamina en diversos núcleos basales acompañada de
una disminución de sus principales metabolitos. Por otra parte, la
administración conjunta de selegilina y clorgilina produjo un incremento
mayor de los niveles de dopamina con un descenso mayor de los
metabolitos, lo que sugiere que en este caso el metabolismo es mayoritario
por la isoforma B, pero no exclusivo (Lakshmana et al. 1998).
214
DISCUSIÓN
Considerando alguna de estas aportaciones (Butcher et al. 1990;
Lakshmana et al. 1998) y los datos de nuestro estudio, se deduce que es
más factible que se produzca una fuerte inhibición de ambas isoformas de
la MAO por acción de la isatina, ya que se observó un gran incremento de
dopamina y un descenso de sus metabolitos. En este caso, la dopamina
liberada tras la inhibición de la MAO-A resulta en una acumulación de
dopamina que debe ser metabolizada y ante la inhibición de isoforma A
también se puede encargar la isoforma B (Arbuthnott et al. 1990b).
Por tanto, los resultados observados con la administración de isatina
indican que en la concentración utilizada puede estar produciendo una
inhibición no selectiva. Además, la coadministración de otro IMAO, que
modifica los niveles dopaminérgicos en administración aislada, no
incrementó los niveles de dopamina, lo que es indicativo de la fuerte
inhibición que posiblemente produzca la isatina.
Nuestra hipótesis inicial consistía en que la clorgilina y la selegilina
producirían un efecto diferente sobre la dopamina liberada por isatina, ya
que son inhibidores de isoenzimas diferentes e incluso pueden presentar
efectos diferentes a la inhibición de la MAO.
Como por medio de la coadministración no se observaron cambios en
la liberación de dopamina inducida por isatina, se procedió a realizar un
pretratamiento con selegilina para observar si se podía modificar el efecto
de la isatina.
Nuestros resultados muestran que el pretratamiento con la misma
concentración de selegilina supuso una disminución significativa del
efecto máximo de la isatina del 80 %. Además, se produjo un descenso
más marcado de los niveles de DOPAC y HVA.
215
DISCUSIÓN
Estos resultados indican que el pretratamiento con selegilina modifica
el efecto de la isatina, mientras que la coadministración no produce
variaciones significativas sobre los efectos de la misma. Por tanto, una
inhibición enzimática previa limita el efecto de la isatina, lo que indica
que puede existir competencia entre ambos inhibidores.
Con respecto al pretratamiento de selegilina es necesario tener en
cuenta los siguientes aspectos: al producirse un incremento previo con
selegilina estos niveles son considerados basales, por lo que al comparar
el efecto de la isatina con estos niveles parece una fuerte disminución,
siendo realmente una limitación del efecto. Igualmente, la liberación de
dopamina con el pretratamiento puede limitar la disponibilidad de
dopamina con el tratamiento siguiente. Aunque en este caso consideramos
que el incremento no es tan elevado como para agotar las reservas
liberables.
Por otra parte, investigaciones previas describen que los IMAOs
reversibles podrían ser desplazados por la dopamina, en condiciones de
incremento de la misma en el citosol. Mientras que los IMAOs
irreversibles no son desplazados del sitio activo (Colzi et al. 1993).
Por tanto, el efecto observado con el pretratamiento con selegilina,
también podría ser explicado por el hecho de que la isatina es un IMAO
reversible, por lo que la dopamina en niveles elevados desplazaría al
compuesto de la enzima.
Los resultados obtenidos con la administración de isatina y otros
IMAOs pueden explicarse teniendo en cuenta los siguientes aspectos:
216
DISCUSIÓN

La dopamina se considera un sustrato no selectivo para ambas
isoformas.

La metabolización de dopamina estriatal en ratas puede realizarse
por ambas isoenzimas.

En caso de inhibición de una enzima la otra puede metabolizar el
sustrato, aunque no sea su preferente.

A elevadas concentraciones, tanto la selegilina como la clorgilina
pierden selectividad por la isoforma.

En la concentración administrada, la isatina podría ser no selectiva:
la ki para la MAO-B es de 3 µM y para la MAO-A es de 15 µM, la
concentración que se administró in situ se estima en 100 µM.

El incremento de dopamina por la administración de la isatina va
provocar
un
incremento
de
la
actividad
MAO-B,
independientemente del mecanismo que lo produzca.
Por tanto, podemos concluir que la selegilina administrada en esta
investigación no actuó de forma selectiva sobre la MAO-B o bien activó
otros mecanismos. Esta misma observación se podría aplicar a los
resultados obtenidos con la isatina.
Estas observaciones concuerdan con lo descrito por Panova et al.
(1997) y Zhou et al. (2001) de que es posible que la dosis administrada de
isatina no sea selectiva. Esta misma conclusión podría ser extrapolada a
los estudios previos de isatina (Hamaue et al. 1999b; Ogata et al. 2003;
Hamaue et al. 2004; Xu et al. 2006; Minami et al. 2006). Aunque
generalmente se referencia la isatina como IMAO-B, a nivel experimental
los datos no se ajustan a la bibliografía general.
217
DISCUSIÓN
5.4. EFECTOS DE LA COADMINISTRACIÓN DE ISATINA Y
COMPUESTOS DE ACCIÓN ANTIPARKINSONIANA
SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
Estudios previos en ratas han evaluado la posible interacción de
diversos compuestos de acción antiparkinsoniana para determinar la
existencia de posibles sinergias (Skuza et al. 1994).
Así, la realización de este grupo de experimentos nos permite realizar
una aproximación neuroquímica al modo en que pueden interactuar
compuestos de acción antiparkinsoniana con la isatina. Igualmente, será
posible emitir alguna hipótesis sobre otros mecanismos de acción de la
isatina.
5.4.1.
Efecto de la isatina en animales tratados con tropolona
y dinitrocatecol
Para determinar el efecto de la inhibición de la COMT sobre el efecto
de la isatina se coadministró esta con la tropolona y el dinitrocatecol.
La tropolona es un ICOMT de primera generación que se caracteriza
por realizar una inhibición de tipo reversible y no competitiva. El
dinitrocatecol (OR-486) pertenece a los ICOMT de segunda generación,
se caracteriza por presentar el nitrocatecol en su estructura química, al
igual que otros elementos de su grupo como la entacapona y la tolcapona.
Estos compuestos presentan mayor selectividad por la COMT que por
otras enzimas y menos interacciones tóxicas (Nissinen 2010).
Estudios recientes demuestran que polimorfismos en los genes de la
COMT y de la MAO-B predisponen a los pacientes con la EP a sufrir
complicaciones motoras, lo que lo pone en evidencia la importancia de
ambas enzimas (Hao et al. 2014).
218
DISCUSIÓN
Männistö y Kaakkola (1990) indican que previamente a la utilización
en humanos, los ICOMT deben ser evaluados con otros compuestos que
modifiquen la neurotransmisión dopaminérgica como los IMAO, lo que
incrementa el interés por estudiar esta coadministración.
Nuestros resultados muestran que la administración i.e. de tropolona
aumentó significativamente los niveles de dopamina y DOPAC 2,4 y 2,1
veces, respectivamente (Figura 4.11). La administración i.e. de
dinitrocatecol aumentó significativamente los niveles de dopamina 4,8
veces y disminuyó los niveles de HVA 6,4 veces (Figura 4.12).
La coadministración de isatina con tropolona y dinitrocatecol produjo
un incremento de los efectos de isatina de 3,7 y 3 veces, respectivamente.
También se observó un descenso significativo tanto para el DOPAC como
para el HVA. Esto indica que el efecto de isatina sobre neurotransmisión
dopaminérgica estriatal es potenciada por ambos ICOMT.
Los resultados observados concuerdan con estudios previos en los que
la administración sistémica de tropolona (100 mg/kg) produjo un descenso
significativo de los niveles de HVA y un incremento de los niveles
estriatales de dopamina y DOPAC (Broch 1972). Otros investigadores
también observaron que la administración de tropolona producía un ligero
descenso de los niveles estriatales de HVA en ratones normales, mientras
que casi suprimía su formación en ratones tratados previamente con
compuestos que incrementaban este metabolito (Roffler-Tavlor et al.
1971).
Otros estudios mediante la administración oral de tolcapona
observaron un descenso significativo de los niveles estriatales de HVA y
un incremento del DOPAC, sin modificaciones en los niveles de
dopamina (Maj et al. 1990; Li et al. 1998; Budygin et al. 1999; Huotari et
al. 1999). Otros estudios con nitecapona (OR-462) muestran que la
219
DISCUSIÓN
administración conjunta de este compuesto con L-DOPA/carbidopa
incrementa los niveles estriatales de dopamina y sus metabolitos, aunque
la acción de la nitecapona se considera principalmente periférica (Lindén
et al. 1988). En la misma línea, la coadministración oral LDOPA/benserazida con tolcapona, produce un incremento en los niveles
estriatales de dopamina y sus metabolitos, observándose que reduce el
influjo de HVA producido por L-DOPA/benserazida y se potencia el
incremento de DOPAC (Napolitano et al. 2003).
Por otro lado, se observó que la administración sistémica de Ro 410960 (ICOMT) no modifica los niveles de dopamina, produce un descenso
de los niveles de HVA y un incremento del DOPAC, además potencia el
efecto de la L-DOPA sobre los niveles de dopamina (Männistö y
Kaakkola 1990). Estudios posteriores muestran los mismos resultados con
la tolcapona (Acquas et al. 1992; Napolitano et al. 1995).
Además, se considera que cuando la COMT es inhibida se produce un
incremento compensatorio en los niveles extracelulares de DOPAC
(Kaakkola y Wurman 1992), lo que explicaría las variaciones en los
niveles de DOPAC producidos por la tropolona observadas en la literatura
y en nuestro estudio. Igualmente, el descenso de los niveles de HVA
estriatales es considerado un marcador de la inhibición central de la
COMT (Nissinen 2010). También, es necesario tener en cuenta que el
HVA estriatal proviene principalmente del DOPAC: aproximadamente el
60% del DOPAC se convierte en HVA, mientras que el 100% de la 3-MT
es transformado en HVA (Westerink 1985).
Por otra parte, Cumming et al. (1992) estudiaron los efectos de la
administración conjunta de un IMAO y un ICOMT sobre los niveles de
dopamina y sus metabolitos. La pargilina (i.p.) y la tolcapona (subcutánea)
fueron administrados sistémicamente en unas concentraciones de 75
220
DISCUSIÓN
mg/kg y 40 mg/kg, respectivamente. La administración de pargilina
produjo un incremento de dopamina estriatal de 5,3 veces con respecto al
basal, acompañada de una disminución exponencial de DOPAC y HVA.
En cambio, la administración de tolcapona produjo un incremento de los
niveles de DOPAC, disminución de los niveles de HVA y no produjo
modificaciones de los niveles de dopamina. La coadministración de
ambos inhibidores no alteró los niveles de dopamina, mientras que ambos
metabolitos descendieron. Resultados similares fueron obtenidos por
otros autores utilizando tropolona y pargilina (Dedek et al. 1979).
Tanto para el DOPAC como para el HVA Cumming et al. (1992)
indican que solo un pequeño porcentaje de los metabolitos es captado por
la sonda en su forma libre, no conjugada o metilada. En lo referente al
DOPAC se considera que este debe ser formado antes de la liberación de
la dopamina nuevamente sintetizada o subsecuente a su recaptación. El
estudio de estos autores indica que el DOPAC puede ser afectado por la
inhibición de la COMT, mientras que el HVA es dependiente del DOPAC.
Además, se debe tener en cuenta la ubicación de la COMT, ya que algunos
autores sugieren una escasa presencia en las fibras dopaminérgicas. Según
estos investigadores, la O-metilación no debe jugar un papel muy
importante en la metabolización de la dopamina, por lo que la MAO
realiza un papel más importante al incrementar los niveles de la dopamina
(Cumming et al. 1992).
Asimismo, la tendencia que se observó a incrementar la dopamina en
los estudios descritos previamente tras administrar un ICOMT sugiere que
una proporción de dopamina extracelular es metabolizada por la COMT
siguiendo la ruta de la 3-MT. En nuestro caso, al aplicarse una dosis mayor
y al ser un tratamiento in situ, se pudo observar un incremento de
dopamina con los ICOMT.
221
DISCUSIÓN
Por otra parte, otros estudios muestran resultados similares a los
obtenidos en este trabajo, así la administración i.p. de tolcapona produjo
una tendencia al aumento de la dopamina, un descenso significativo del
HVA y un incremento del DOPAC, analizados en dializados estriatales.
La entacapona por vía sistémica produjo las mismas modificaciones
estriatales pero solo en la dosis más elevadas, ya que es un inhibidor
principalmente periférico (Kaakkola y Wurman 1992). Sin embargo, en
estos casos, la coadministración de selegilina con la tolcapona produjo
variaciones en los niveles de la dopamina que no difirieron de las
variaciones producidas por la tolcapona sola.
Igualmente, en otros estudios la administración conjunta de
nitecapona y clorgilina han mostrado un incremento de los niveles de
dopamina acompañado de un descenso de ambos metabolitos (Männistö
et al. 1990).
De forma similar, Männistö y Tuomainen (1991) estudiando las
modificaciones producidas por la coadministración de clorgilina y
pargilina con diversos ICOMT en ratas tratadas con L-DOPA/carbidopa
(administrando dichos compuestos por vía i.p) observaron que el Ro 410960 (ICOMT con actividad central) mostró una potenciación del efecto
de la clorgilina, observándose un incremento mayor de dopamina y una
disminución de HVA con respecto al grupo control.
De acuerdo con los datos expuestos previamente (Kaakkola y Wurman
1992), se podrían explican los datos observados en el presente estudio del
siguiente modo: cuando se administró isatina, la actividad de la COMT
sobre el metabolismo dopaminérgico podría verse incrementado, por lo
que su coadministración con tropolona y dinitrocatecol potenció los
efectos de ambos sobre la dopamina y los metabolitos.
222
DISCUSIÓN
Como conclusión de este apartado, se puede decir que la sinergia de
isatina con ICOMT podría resultar beneficiosa, aunque sería necesario
tener en cuenta las posibles interacciones negativas.
5.4.2.
Efecto de la isatina en animales tratados con atropina
En estudios previos se ha observado que los receptores muscarínicos
de acetilcolina influencian la neurotransmisión dopaminérgica estriatal
(Giorguieff et al. 1977; Raiteri et al. 1982) Además, Xu y Kato (1988)
observaron que la administración intraestriatal de oxotremorina (agonista
muscarínico) incrementa los niveles de DOPAC y HVA en dializado
estriatal, especificando que en el estriado in vivo la mayoría de receptores
muscarínicos indirectamente incrementan el turnover de dopamina por
medio de la vía nigroestriatal.
Previamente
se
ha
establecido
que
la
isatina
inhibe
la
acetilcolinesterasa (Kumar et al. 1993). Sin embargo, otros investigadores
han observado que la administración de isatina incrementa los niveles
estriatales de acetilcolina, pero se considera que lo realiza por medio de
un mecanismo independiente a la acetilcolinesterasa, ya que en algunas
regiones cerebrales se incrementó la colina (metabolito de la acetilcolina)
y la inhibición de acetilcolinesterasa fue solo del 5%, con dosis en las
cuales se inhibe más del 90% de la MAO. Este incremento de acetilcolina
se ha asociado al incremento de la dopamina que estimula receptores D2
y produce dicha liberación (Hamaue et al. 1999a; Hamaue et al. 1999b).
Nuestros resultados muestran que el pretratamiento con atropina
produce una disminución significativa del efecto producido por la isatina
(descenso del 69,3 % del efecto máximo), lo que indica que el efecto de
la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica podría estar mediado,
en parte, por la activación de receptores muscarínicos de acetilcolina
(Figura 4.13).
223
DISCUSIÓN
Anteriormente se ha descrito que la administración de antagonistas
muscarínicos M1 produjo un descenso de los niveles estriatales de
dopamina, mientras que los antagonistas M2 producen un incremento de
tipo dosis-dependiente de dopamina, sin observarse alteraciones en los
metabolitos. La administración de un agonista muscarínico no selectivo a
dosis bajas produce descenso en los niveles de dopamina y una dosis
elevada incrementa los niveles de neurotransmisor (Klippel et al. 1993).
Puesto que la atropina es un antagonista M1, en nuestro estudio resulta
lógico que el pretratamiento con atropina disminuyera el efecto de la
isatina sobre los niveles de dopamina, por lo que a priori, la
coadministración de ambos compuestos no resulta factible a nivel
neuroquímico.
Por otro lado, también se observó que la administración sistémica de
dosis elevadas (10 mg/kg) de atropina no produjo modificaciones sobre
los niveles estriatales dopamina y sus metabolitos. Igualmente, la
administración de otros antagonistas muscarínicos tampoco produjo
efectos sobre la neurotransmisión dopaminérgica estriatal (Damsma et al.
1988). Por este motivo, en base a sus resultados, los autores concluyen
que los compuestos anticolinérgicos en la EP podrían actuar por otros
mecanismos diferentes a la modulación de la actividad dopaminérgica
estriatal produciendo beneficios sintomatológicos, aunque también es
posible que modifiquen la actividad neuronal sin modificar los niveles
extracelulares de dopamina.
En este sentido, aunque la coadministración de isatina y atropina no
mostrara un efecto sinérgico sobre los niveles estriatales de dopamina, no
se debe descartar una interacción beneficiosa por medio de otros
mecanismos, ya que los compuestos anticolinérgicos pueden mejorar la
sintomatología parkinsoniana sin alterar los niveles de dopamina.
224
DISCUSIÓN
5.4.3.
Efecto de la isatina en animales tratados con ropinirol
El ropinirol es un agonista dopaminérgico no ergólico que presenta
mayor afinidad por los receptores D3. La afinidad por este subtipo de
receptores es unas 20 veces mayor que por otros subtipos de la familia D2
(Eden et al. 1991).
Por otra parte, estudios previos han investigado la interacción de
IMAOs con agonistas dopaminérgicos observando que los IMAOs
podrían desplazar a los agonistas de su lugar de unión (Culver et al. 2002;
Levant et al. 2002).
En nuestro estudio la administración intraestriatal de ropinirol no
modificó significativamente el efecto de la isatina sobre los niveles
extracelulares de dopamina, aunque el ropinirol administrado de forma
aislada incrementó los niveles de dopamina 3,7 veces (Figura 4.14).
En estudios previos se observó que los agonistas dopaminérgicos
incrementan los niveles de dopamina, aunque en bajas dosis pueden
presentar un efecto bifásico y disminuir los niveles de la misma
(Timmerman et al. 1989; Kurata y Shibata 1990).
En trabajos anteriores se demostró que, en el núcleo estriado de rata,
la selegilina potenciaba la respuesta neuronal a agonistas dopaminérgicos
sin inhibir el metabolismo de la dopamina, por lo que pueden existir otros
mecanismos de interacción diferentes que sean independientes al
incremento de los niveles de dopamina (Paterson et al. 1991; Berry et al.
1994).
Estos resultados se ajustan a los datos obtenidos en esta investigación,
en los que el ropinirol no modificó el efecto de la isatina sobre la
liberación de dopamina. Aunque no se observó un efecto sinérgico de
ambos compuestos sobre el incremento de los niveles de dopamina, no se
225
DISCUSIÓN
pueden desconsiderar una interacción positiva por medio de otros
mecanismos.
Asimismo, aunque el ropinirol no potenció el efecto de la isatina sobre
los niveles estriatales de dopamina, es necesario considerar que los
agonistas dopaminérgicos producen variaciones en los niveles de
dopamina por medio de la estimulación de los autorreceptores del subtipo
D3, mientras que el efecto sobre la motricidad sería por estimulación
postsináptica sobre el subtipo D2 (Ozaki et al. 1989; Kuczenski et al.
1990; Santiago y Westerink 1991; Kehr et al. 2007).
En esta línea, los datos obtenidos en nuestro grupo experimental
indican que el efecto de la isatina no se ve modificado por la estimulación
de receptores dopaminérgicos por la administración de un agonista
dopaminérgico, aunque desconocemos las implicaciones positivas a nivel
motriz en EP que dicha coadministración pueda producir.
5.4.4.
Efecto de la isatina en animales tratados con
amantadina
La amantadina es un compuesto utilizado en la EP que presenta
diversos mecanismos de acción: antagoniza los receptores NMDA de
glutamato, facilita la liberación de dopamina y bloquea la recaptación de
dopamina. Actualmente, el mecanismo de acción de este compuesto no se
conoce por completo (Huang et al. 2014).
La administración de amantadina por medio de la sonda de
microdiálisis produjo un incremento significativo de los niveles de
dopamina (12,8 veces en relación a los niveles basales). La
coadministración de amantadina e isatina supuso un incremento de los
niveles de dopamina 2,4 veces superior al efecto máximo de la isatina sola
(Figura 4.15).
226
DISCUSIÓN
En estudios previos se ha observado que la amantadina incrementa los
niveles estriatales de dopamina en ratas, por medio de la inhibición de la
recaptación de dopamina y del antagonismo NMDA (Mizoguchi et al.
1994; Danysz et al. 1997). Además, también se ha observado que
incrementa la síntesis y la liberación de la dopamina estriatal (Scatton et
al. 1970; Heikkila y Cohen 1972) y potencia el efecto de L-DOPA en ratas
parkinsonizadas (Skuza et al. 1994; Arai et al. 2003).
Nuestros resultados concuerdan con estudios previos de microdiálisis
en los que se observó que la administración de amantadina incrementa los
niveles extracelulares de dopamina, siendo dicho incremento dosisdependiente (Quack et al. 1995; Takahashi et al. 1996).
Considerando la amantadina como un compuesto liberador de
dopamina, en nuestro caso (como fue descrito en grupos experimentales
previos) la isatina, por medio de la inhibición de la MAO, incrementaría
los niveles de dopamina disponible para la liberación por acción de la
amantadina. Aunque, considerando el conocimiento actual sobre la
amantadina, no se puede establecer el mecanismo por el cual se
incrementa la liberación de dopamina al coadministrarla con isatina.
El incremento de dopamina observado al coadministrar la isatina y la
amantadina sugieren que a nivel neuroquímico la sinergia de ambos
compuestos puede resultar beneficiosa.
5.4.5.
Efecto de la isatina en animales tratados con L-DOPA
La administración intraestriatal de L-DOPA produjo un incremento
significativo de los niveles de dopamina de 20,7 veces. La administración
conjunta de L-DOPA e isatina produjo un incremento de los niveles de
dopamina de 2 veces mayor que el producido por la isatina sola (Figura
4.16). Igualmente, la administración sistémica de L-DOPA (500 mg/kg
227
DISCUSIÓN
i.p.), con pretratamiento con benserazida (80 mg/kg), incrementó 17,9
veces los niveles estriatales de dopamina. La administración i.e. de isatina,
en el momento que la L-DOPA produjo un mayor incremento de
dopamina, aumentó 7,4 veces el efecto de la isatina sola (Figura 4.17).
Los resultados obtenidos en esta investigación están en consonancia
con otros trabajos publicados anteriormente, en los cuales se observó un
incremento de dopamina con la combinación de L-DOPA y un IMAO.
En estudios previos, se observó que la administración sistémica de
clorgilina produjo un incremento de dopamina estimulada por L-DOPA
i.e.
y una disminución del DOPAC y HVA, mientras
que la
administración de selegilina presentó pocos efectos sobre los niveles de
dopamina. Los autores atribuyen este resultado a una actividad
predominante de la MAO-A en ratas (Waldmeier et al. 1976; Buu y
Angers 1987; Finberg et al. 1995). Por otro lado, Brannan et al. (1995)
consideran que en estos animales la MAO-B adquiere mayor relevancia
en la metabolización dopaminérgica cuando se administra L-DOPA
exógena. Esto se debe a que los autores observaron que la selegilina solo
incrementó los niveles de dopamina y disminuyó los metabolitos en ratas
tratadas con L-DOPA, mientras que en ratas sin L-DOPA la selegilina no
alteró los niveles de dopamina.
Por otra parte, en ratas reserpinizadas la administración de L-DOPA
exógena no produce incremento de dopamina, pero sí modifica los niveles
de sus metabolitos (Wong et al. 1993; Kannari et al. 2000). Lo que indica
que la dopamina liberada por L-DOPA procede del reservorio vesicular
liberable y en caso de que el empaquetamiento vesicular no fuera posible,
la dopamina formada quedaría expuesta a la metabolización por la MAO.
Adachi et al. (2006) sugieren que la dosis de L-DOPA puede controlar
la liberación estriatal de dopamina en ratas pretratadas de forma crónica
228
DISCUSIÓN
sistémicamente con selegilina, lo que les ha llevado a sugerir que
controlando la dosis de L-DOPA se puede conseguir una respuesta estable
a la inhibición de la MAO-B.
Watchtel y Abercrombie (1994) observaron que L-DOPA (50 mg/kg)
no modificó los niveles de dopamina en estriado de ratas normales, pero
sí en las ratas parkinsonizadas con 6-OHDA. Además, la administración
de un IMAO-B en ratas pretratadas con esta dosis L-DOPA produjo un
incremento de dopamina.
A pesar de que en estudios previos la administración i.p. de L-DOPA
en diferentes dosis, con pretratamiento con benserazida, produjo un
incremento de los niveles de dopamina estriatal (Pani et al. 1990), en otras
publicaciones se muestra que la administración de L-DOPA (50 mg/kg
i.p.) en ratas normales produce inicialmente una disminución de los
niveles estriatales de dopamina (Kannari et al. 2000).
Esta disminución inicial de dopamina se considera que puede ser
debida a mecanismos autorregulatorios dopaminérgicos, por medio de
receptores presinápticos tipo D2. Esta disminución se acompañó de un
incremento de los metabolitos, por lo que se hipotetiza que la dopamina
nuevamente sintetizada a partir de la L-DOPA es metabolizada en el
citoplasma. El incremento de dopamina se ve restringido puesto que la
recaptación y la modulación de la liberación por D2 están operativos en
animales no tratados, mientras que en animales con 6-OHDA la L-DOPA
incrementa los niveles de dopamina (Kannari et al. 2000).
Estudios previos indican que la administración de L-DOPA sistémica
podría modificar los niveles de los metabolitos dopaminérgicos sin
modificar los niveles de dopamina, en este caso se incrementan la síntesis
y el metabolismo sin modificarse el estado basal de dopamina (Wong et
al. 1993).
229
DISCUSIÓN
En la misma línea, en experimentaciones previas la administración i.p.
de L-DOPA produjo un pequeño incremento en los niveles de dopamina
en dializado (Miller y Abercrombie 1999).En este caso la misma dosis en
animales control el incremento de los niveles de dopamina fue de 1,3
veces, frente a las 50,7 veces observadas en animales con 6-OHDA que
recibieron la misma dosis. Este efecto puede ser debido a que el estriado
intacto es capaz de eliminar de forma muy eficiente la dopamina derivada
de la L-DOPA externa. Por otra parte, en el estriado denervado el
incremento podría derivar de una substancial contribución de la neuronas
residuales y estar mediada por neuronas no dopaminérgicas.
Antecedentes previos describen en ratas normales un sistema que
regula los niveles de dopamina por medio de receptores y a través del
metabolismo, lo que hacen que la concentración dopaminérgica se
mantenga estable (Wong et al 1993; Miller y Abercrombie 1999; Kannari
et al. 2000). Además, en animales intactos el incremento de dopamina
extracelular derivada de L-DOPA es moderada debido a que existe un baja
difusión de dopamina al espacio extracelular. Igualmente, la dopamina
que se libera por la administración de L-DOPA no alcanza en gran medida
la sonda de microdiálisis debido a la recaptación por el DAT (Miller y
Abercrombie 1999).
Todos estos datos explicarían por qué en el grupo experimental con LDOPA i. p. fue necesario utilizar una dosis elevada de L-DOPA y esperar
2 horas para observar un elevado incremento de los niveles de dopamina
estriatal.
Por otra parte, se puede constatar un buen efecto sinérgico con ambos
compuestos. La L-DOPA incrementó los niveles estriatales de dopamina
y sus metabolitos, la administración de isatina en ratas tratas con isatina
230
DISCUSIÓN
potenció el efecto de L-DOPA sobre los niveles de dopamina y provocó
una disminución de los niveles de los metabolitos.
Además, como en grupos experimentales previamente discutidos, se
puede sugerir la hipótesis de que la isatina actuó por medio de la inhibición
de ambas isoformas de la MAO.
Corroborando dicha hipótesis, Männistö y Kaakkola (1990) señalan
que cuando se administra L-DOPA ante el bloqueo de una vía degradativa
pueden surgir rutas metabólicas alternativas. Por tanto, la inhibición de
una isoenzima provocaría la activación de la otra. También, Green et al.
(1977) observaron que no se producían modificaciones en los niveles de
dopamina estriatal en ratas por medio de L-DOPA i.p. hasta que no se
producía una elevada inhibición de ambas isoformas de la MAO.
Por tanto, si la isatina realizase una inhibición de una sola isoenzima
actuaría la otra y los niveles de dopamina evocada serían menores.
Igualmente, estudios previos indican que dosis no selectivas de
selegilina mejoran la respuesta dopaminérgica a la L-DOPA en registros
electrofisiológicos (Mercuri et al. 1998), por lo que se sugerimos que el
abordaje clínico por dosis no selectivas de un I-MAOB, como en nuestro
caso, podría ayudar a disminuir los requerimientos diarios de L-DOPA en
pacientes, aunque se deben evaluar los posibles efectos secundarios de la
inhibición de la MAO-A.
5.4.6.
Sumario
de
la
coadministración
de
isatina
y
compuestos de acción antiparkinsoniana
En nuestro paradigma experimental todos los compuestos evaluados
con
acción
antiparkinsoniana
mostraron
una
buena
respuesta
neuroquímica al incrementar el efecto de la isatina sobre la liberación de
dopamina, a excepción de la atropina y del ropinirol.
231
DISCUSIÓN
De las coadministraciones realizadas destaca la realizada con el grupo
de los ICOMT, ya que se observó un incremento de los niveles de
dopamina y un descenso de ambos metabolitos.
5.5. MEDIACIÓN
DE
LOS
RECEPTORES
GLUTAMATÉRGICOS EN EL EFECTO DE LA ISATINA
SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
La substancia negra y el núcleo estriado reciben proyecciones
glutamatérgicas y se ha observado que la administración de agonistas
glutamatérgicos incrementa la liberación de dopamina (Westerink et al.
1992; Keefe et al. 1992; Keefe et al. 1993; Opazo 2010).
Igualmente, se considera que el glutamato regula la liberación
espontánea y evocada de dopamina en el estriado (Kulagina et al. 2001;
Borland y Michael 2004). En este efecto, se observó que los receptores
ionotrópicos pueden modular la neurotransmisión dopaminérgica estriatal
(Krebs et al. 1991; Zigmond et al. 1998; Borland y Michael 2004).
En la EP se han descrito alteraciones en la interacción entre el
glutamato y la dopamina en neuronas estriatales, que contribuyen a la
aparición de síntomas motores. De este modo, la sensibilización de
receptores NMDA y AMPA altera el input glutamatérgico cortical en el
estriado y modifica el output GABAérgico, lo que altera la función
motora. Por este motivo, antagonistas de los receptores NMDA son
investigados como dianas farmacológicas en la EP y son utilizados
actualmente para el control de las discinesias en esta patología (Danysz et
al. 1997; Lange et al. 1997; Ko et al. 2014; Tronci et al. 2014).
Este grupo de experimentos se realizó con la finalidad de evaluar la
posible mediación de receptores NMDA en la liberación de dopamina
232
DISCUSIÓN
inducida por isatina. Para ello se utilizó el antagonista competitivo AP-5
y el antagonista no competitivo MK-801.
En ambos grupos experimentales el pretratamiento con antagonistas
de receptores NMDA produjo un descenso significativo del efecto de la
isatina sobre los niveles estriatales de dopamina. El AP-5 produjo un
descenso del 55,6 % del efecto máximo de la isatina (Figura 4.18) y el
descenso producido por el MK-801 fue del 57,3% (Figura 4.19).
La disminución del efecto de la isatina producido por los antagonistas
NMDA se puede explicar por el hecho de que estos compuestos podrían
estar bloqueando un circuito liberador de dopamina dependiente de
impulso, que es producido por glutamato. Como no se produce dicha
liberación exocitótica por glutamato no se liberada la dopamina, aunque
se inhiba la vía degradativa por la isatina (Moghaddan et al. 1994). Sin
embargo, algunos estudios indican que la liberación de dopamina
estimulada por glutamato es independiente de impulso (Krebs et al. 1991).
Igualmente, Lonart y Zigmond (1991) indican que la liberación de
dopamina mediada por glutamato podría producirse por acción inversa del
DAT. Por tanto, aunque los niveles de dopamina citoplasmática se vieran
incrementados por isatina al inhibir el impulso excitador por dicho
antagonista no se produce liberación.
Desce et al. (1994) observaron en sinaptosomas que el glutamato por
medio de receptores NMDA podría inhibir la síntesis de dopamina y
estimular su liberación. Por tanto, en animales pretratados con
antagonistas de estos receptores, al administrar isatina se podría producir
una disminución de la liberación, aunque no se vea afectada la síntesis.
Igualmente, se ha observado que el MK-801 previene las alteraciones
motrices inducidas por L-DOPA en ratas (Marin et al. 1996).Además, en
233
DISCUSIÓN
ratas parkinsonizadas con 6-OHDA, el MK-801 potencia la liberación de
dopamina por administración de L-DOPA (Arfani et al. 2014).
Por otra parte, considerado el efecto observado con los antagonistas
de los receptores NMDA y la eliminación del Ca++ del medio Ringer, una
hipótesis sobre el mecanismo de acción de la isatina también podría ser
que la liberación de dopamina evocada por isatina está influenciada por el
influjo de Ca++ a través de los canales de Ca++ acoplados a receptores
NMDA (Takahashi et al. 1996).
Otro mecanismo que podría estar involucrado en este efecto del MK801, sería el bloqueo de los canales de Na+ dependientes de voltaje, efecto
observado en otros estudios con veratridina (Sitges et al. 2000). Este
resultado resultaría congruente con los datos obtenidos en el grupo de
pretratamiento con TTX.
Por otra parte, en estudios previos se observó que antagonistas
NMDA, como el MK-801, podrían ejercer efectos neuroprotectores ante
la excitotoxicidad neuronal. En este estudio un IMAO-B (la selegilina)
presentó un efecto neuroprotector similar, aunque por medio de la
regulación descendiente en cascada del receptor (Mytilineou et al. 1997).
En esta línea, resultaría interesante investigar si la interacción de la isatina
y los receptores NMDA podrían estar implicados en mecanismos
neuroprotectores.
Estos resultados indican que los receptores NMDA podrían participar
en la liberación de dopamina estimulada por isatina.
234
DISCUSIÓN
5.6. MEDIACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO EN EL EFECTO DE
LA ISATINA SOBRE LA LIBERACIÓN DE DOPAMINA
El NO, gas soluble inestable, es una molécula mensajera
multifuncional cuya señalización interviene en diversas regiones del
sistema nervioso y se considera un modulador de la actividad estriatal, así
como del control motor y conductual (Del Bel et al. 2005; Vincent 2010).
El NO activa la enzima guanilato ciclasa e incrementa los niveles de
GMP, este GMP incrementado por el NO juega un importante papel en el
ciclo del Ca++. La acción del NO requiere de la activación de receptores
NMDA de glutamato (Crespi et al. 2004; Hoque et al. 2010). Los
agonistas NMDA generan NO que difunde rápidamente por el tejido
neural. Se ha observad que el NO produce un incremento de la liberación
de dopamina estriatal (Hanbauer et al. 1992; Zhu y Luo 1992).
Igualmente, estudios previos in vivo muestran que el NO facilita la
liberación de dopamina por medio de un mecanismo dependiente de Ca++
(West y Galloway 1998; Rocchitta et al. 2004).
Por otra parte, IMAO e I-NOS han sido estudiados previamente como
posibles agentes neuroprotectores ante la generación de estrés oxidativo
en la EP (Youdim y Lavie 1994). Por lo que en este grupo experimental
podría acercarnos un poco más a la comprensión del efecto de ambos
compuestos.
Ya que se ha observado que la estimulación de receptores NMDA
produce NO (Cheramy et al. 1998) y en los grupos experimentales previos
se observó que los receptores NMDA podrían influenciar el efecto de la
isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica, en este grupo
experimental se pretendió determinar si el NO podría influenciar el efecto
235
DISCUSIÓN
de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica. Para ello se
utilizaron dos inhibidores de la NOS: L-NAME y 7-NI.
El pretratamiento con L-NAME y 7-NI produjo una disminución del
efecto máximo de la isatina sobre los niveles de dopamina del 59,9 % y
28,5 %, respectivamente (Figura 4.20 y 4.21). Por lo que el NO podría
intervenir en la liberación de dopamina producida por isatina.
Considerando los resultados en conjunto, la isatina podría actuar
indirectamente sobre los receptores NMDA, lo que conllevaría a una
activación de la NOS. A su vez, la activación de esta enzima sintética
produciría el NO que ayudaría a la liberación de dopamina.
La mayoría de los estudios concuerdan en que los compuestos que
estimulan la síntesis de NO incrementan la liberación de dopamina. Sin
embargo, el mecanismo por el cual lo realizan se desconoce (West et al.
2002).
En otra línea, la interacción de la isatina y el NO podría producirse por
medio de receptores dopaminérgicos tipo D1. Se ha observado que la
liberación fásica de dopamina, como la que ha mostrado la isatina en este
trabajo de investigación, puede activar los receptores D1 y provocar un
incremento de los niveles de NO en el núcleo estriado (Sammut et al.
2006), mientras que la activación de receptores D2 produciría efectos
opuestos (Sammut et al. 2007). Aunque se desconocen los mecanismos
exactos por los cuales los receptores dopaminérgicos influencian la
síntesis de NO, se ha evidenciado que la activación de los receptores D1
potencia las respuestas inducidas sobre las neuronas estriatales (Cepeda y
Levine 1998).
236
DISCUSIÓN
5.7. EFECTO DE LA ISATINA SOBRE AMINOÁCIDOS
NEUROTRANSMISORES EN EL NÚCLEO ESTRIADO
El glutamato y el aspartato se consideran los principales
neurotransmisores de las proyecciones corticales al estriado desde el área
motora y premotora (Yamamoto y Davy 1992). La interacción del
glutamato y dopamina en el estriado se considera relevante para el control
farmacológico de los ganglios basales (Morales et al. 2013).
Además, Castro et al. (1996) y Timmerman et al. (1998) indican que
el incremento de dopamina podría regular la liberación de aminoácidos
excitadores, así como, los aminoácidos excitadores podrían estimular la
síntesis y liberación dopaminérgica.
La administración intraestriatal de isatina produjo un ligero
incremento en los niveles extracelulares de aspartato y glicina de 1,9 y 1,4
veces, con respecto al basal, respectivamente. El aminoácido
neurotransmisor sobre el que se observó un mayor incremento por la
perfusión de isatina fue el glutamato, que se incrementó 4,6 veces, con
respecto a los niveles basales (Figuras 4.23-4.26).
La poca influencia de la isatina sobre el aspartato se puede explicar
por
limitaciones
metodológicas.
El
número
de
terminaciones
dopaminérgicas que están en contacto con los terminales excitatorios es
baja, por lo que es posible que eventos que acontecen en esas ubicaciones
no ejerzan gran influencia sobre el líquido extracelular recogido por
microdiálisis (Moghaddan et al. 1990).
Asimismo, la concentración de aminoácidos observados en el núcleo
estriado por
microdiálisis
es
discutible debido
a la elevada
compartimentalización de dichos neurotransmisores (Timmerman y
Westerink 1997). Además, Westerink et al. (1987) consideran que el
237
DISCUSIÓN
contenido de aminoácidos en dializados estriatales podría derivar de
procesos metabólicos y no provenir de la actividad neuronal.
En relación al incremento observado en los niveles de glutamato,
previamente Godukhin et al. (1984) observaron que la administración
intraestriatal de dopamina, apomorfina y feniletilamina incrementa los
niveles de glutamato en el estriado. Además, Yamamoto y Davy (1992)
observaron que una perfusión con alto K+ a nivel estriatal produjo un
incremento de glutamato, aspartato y taurina. Estos autores indican que la
dopamina actuando sobre receptores D2 podría modificar la liberación de
glutamato de los terminales corticoestriatales. En base a estos datos,
podríamos considerar que la isatina por medio del incremento de
dopamina y activación de receptores dopaminérgicos podría producir un
incremento de glutamato en el núcleo estriado.
Otro nexo que asocia el incremento en los niveles de glutamato y el
efecto producido por la isatina sobre la dopamina estriatal lo proporcionan
los resultados observados por Moghaddan et al. (1990). Estos
investigadores observaron que la administración i.e. de glutamato puede
provocar un incremento de la concentración extracelular de K+. Por tanto,
en nuestro estudio, un aumento de las concentraciones de este ion
producidas por el incremento de glutamato, podría incrementar la
liberación de dopamina estimulada por isatina. Estos datos podrían
corroborar los resultados obtenidos en grupos experimentales previos
donde describimos que un Ringer con alta concentración de K+
incrementó significativamente el efecto de la isatina sobre la dopamina.
Asimismo, teniendo en cuenta los grupos experimentales previos
sobre el posible efecto de la isatina sobre los receptores NMDA y el NO,
se ha observado in vivo que la estimulación de receptores NMDA y la
consecuente producción de NO podrían incrementar los niveles de
238
DISCUSIÓN
glutamato (Bustos et al. 1992; West et al. 2002). Igualmente, en trabajos
anteriores se ha observado que la estimulación de receptores NMDA
produce un incremento de los niveles estriatales de dopamina y glutamato,
siendo precedente el incremento de la dopamina (Morari et al. 1993).
Por tanto, la isatina podría estar activando o regulando los receptores
NMDA ubicados en las terminaciones dopaminérgicas y estos a su vez
podrían inducir la liberación de glutamato y aspartato. Adicionalmente, la
activación de estos receptores NMDA podría activar la NOS
incrementando los niveles de NO, que a su vez aumentaría los niveles de
dopamina liberada por isatina.
Otra hipótesis, para la explicación de nuestros resultados, consistiría
en que la isatina incrementa directamente los niveles estriatales de
glutamato. Este glutamato liberado por acción de la isatina podría actuar
sobre los receptores NMDA lo que produciría un incremento de dopamina
en el espacio extracelular.
Reforzando esta hipótesis, se considera que son necesarias
concentraciones elevadas de glutamato a nivel estriatal para incrementar
los niveles de dopamina (Moghaddam et al. 1990; Lonart y Zigmond
1991) y esto se produciría por medio de la activación de receptores
NMDA (Clow y Jhamandas 1989; Moghaddam et al. 1990).
Además, se ha postulado que los aminoácidos liberados de las
proyecciones
corticoestriatales
podrían
estimular
la
síntesis
dopaminérgica en condiciones en las cuales exista poca disponibilidad de
dopamina (Castro et al. 1996). Igualmente, el glutamato también podría
ejercer
acción
modulatoria
en
los
eventos
neurofisiológicos
compensatorios que suceden en la pérdida neuronal en procesos
neuropatológicos (Zigmond et al. 1998). Por lo que el incremento de los
239
DISCUSIÓN
niveles estriatales de glutamato observado en nuestra investigación, por
acción de la isatina, podría tener repercusiones beneficiosas sobre la EP.
Sin embargo, es necesario tener precaución en la interpretación de
estos resultados, ya que recientes estudios in vivo señalan que es posible
la generación de excitotoxicidad en regiones distantes al estriado,
provocada por el incremento de glutamato en este núcleo (Morales et al.
2013).
240
6
CONCLUSIONES
Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
estudio in vivo mediante microdiálisis cerebral.
CONCLUSIONES
1. La administración intraestriatal de isatina incrementa los niveles
de dopamina y disminuye los niveles de sus metabolitos en el
núcleo estriado de forma concentración-dependiente.
2. La liberación in vivo de dopamina estriatal estimulada por isatina
es de tipo exocitótico, ya que es dependiente de despolarización de
la membrana neuronal, de almacenamiento vesicular y de calcio
extracelular.
3. La isatina aumenta la liberación de dopamina estimulada por
despolarización con potasio.
4. La isatina, en la concentración utilizada, parece inhibir la MAO de
forma no selectiva, ya que la coadministración de clorgilina o
selegilina con isatina no modificó el efecto de ésta sobre la
liberación de dopamina en el núcleo estriado.
5. Los compuestos con acción antiparkinsoniana que presentan mejor
interacción neuroquímica con la isatina, considerando los
incrementos en los niveles de dopamina son: inhibidores de la
COMT,
amantadina
y
L-DOPA.
Además,
destaca
la
coadministración de isatina con inhibidores de la COMT porque
también disminuye los niveles de los metabolitos.
6. La administración intraestriatal de isatina potencia la liberación de
dopamina estimulada por L-DOPA administrada sistémicamente
en ratas.
243
CONCLUSIONES
7. La liberación de dopamina estimulada por isatina parece implicar
la participación de receptores NMDA de glutamato, ya que el
bloqueo de estos receptores afecta a la liberación de dopamina
estimulada por isatina.
8. El óxido nítrico también puede influir en la liberación in vivo de
dopamina inducida por isatina a través de la activación de
receptores glutamatérgicos de tipo NMDA. Esto indica una
implicación de la vía glutamatérgica y producción de óxido nítrico
en los efectos de la isatina sobre la neurotransmisión
dopaminérgica in vivo.
9. Además de la dopamina, la isatina parece actuar sobre otros
sistemas neurotransmisores en el núcleo estriado, aumentando los
niveles de aminoácidos neurotransmisores como el glutamato,
aspartato y glicina.
244
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Efectos de la isatina sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. Un
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