AMINOÁCIDOS PÉPTIDOS Y PROTEINAS

AMINOÁCIDOS
PÉPTIDOS
Y
PROTEINAS
M. EN C. ISRAEL VELÁZQUEZ MARTÍNEZ
1
AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS.
Los aminoácidos, como su nombre lo indica, son bifuncionales. Contienen un grupo amino básico y un
grupo carboxílico ácido.
NH2
H
O
OH
R
N
H
OH
O
Un α-aminoácido primario
L-Prolina
Un α-aminoácido secundario
Con fines de clasificación, las cadenas con menos de 50 aminoácidos se llaman polipéptidos, mientras
que el término proteína se reserva a cadenas mas largas.
O
O
O
O
H3C
+
OH
H3C
H2N
NH
OH
OH
NH2
NH2
Alanina
Glicina
un dipéptido (un enlace amida)
Un polipéptido (muchos enlaces amida).
Estructura de los aminoácidos.
Como los aminoácidos contienen un grupo ácido y un grupo básico, experimentan una reacción ácidobase intramolecular y se encuentran principalmente en la forma de un ión dipolar, o Zwitterion (del
alemán zwitter, híbrido):
O
O
H3C
H3C
OH
H2N
H
Alanina (sin carga)
O
+
H3N
-
H
(zwitterion)
2
Los iones dipolo (zwitterions) de los aminoácidos son sales internas y por ello tienen muchas de las
propiedades físicas asociadas con las sales. Poseen momentos dipolares grandes, son solubles en agua
e insolubles en hidrocarburos, y son sustancias cristalinas con puntos de fusión altos. Además los
aminoácidos son Anfóteros: pueden reaccionar como ácidos o como bases, dependiendo de las
circunstancias.
En solución ácida
En solución básica
En la siguiente tabla se representan las estructuras de los 20 aminoácidos que se que encuentran en las
proteínas. Todos son α-aminoácidos. Diecinueve de los 20 aminoácidos son aminas primarias, RNH2,
y sólo difieren en la naturaleza del sustitúyete unido al carbono α, llamado Cadena lateral.
Cadena lateral
Un α-aminoácido primario
Prolina,
Un α-aminoácido secundario
Además de los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas, hay otros aminoácidos que no son
proteínas y que tienen importancia biológica.
O
O
-
I
O
O
+
H3N
HO
-
Ácido γ-aminobutírico
+
NH3
HS
O
O
I
+
NH3
Homocísteina
-
I
O
I
Tiroxina
3
ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS.
Nombre
Abreviaturas PM
Estructura
pKa pKa pKa PI
Sol. P.f.
COOH NH3+ cad. lat.
H2O, g/dL
a 25°C
Aminoácidos Neutros.
O
H3C
OH
Alanina
Ala (A)
NH2
89
2.34
9.69
---
6.01
17
297 d
2.02
8.80
---
5.41
2.4
236
1.96
10.28 8.18
5.07
2.17
9.13
---
5.65
3.6
186
2.34
9.60
---
5.97
25
233 d
2.36
9.60
---
6.02
4
284
2.36
9.60
---
5.98
2
337
2.28
9.21
---
5.74
3
283
O
H2N
OH
Asparagina
Asn (N)
132
O
NH2
O
HS
Cisteína
Cys (C)
OH
121
NH2
NH2
O
O
Glutamina
Gln (Q)
Muy --Soluble
OH
146
NH2
O
Glicina
Gly (G)
75
H2N
OH
CH3
O
H3C
OH
Isoleucina
Ile (I)
131
NH2
O
H3C
OH
Leucina
Leu (L)
CH3
131
NH2
O
S
H3C
Metionina
Met (M)
149
OH
NH2
4
Nombre
Abreviaturas PM
Estructura
pKa pKa pKa PI
Sol. P.f.
COOH NH3+ cad. lat.
H2O, g/dL
a 25°C
Aminoácidos Neutros cont…
O
OH
Fenilalanina
Phe (F)
NH2
165
1.83
9.13
---
5.48
3
283
1.99
10.60 ---
6.30
162
220
2.21
9.15
---
5.88
5
228
2.09
9.10
---
5.60
2.83
9.39
---
5.89
2.20
9.11
2.32
9.62
O
H
N
OH
Prolina
Pro (P)
115
O
HO
Serina
Ser (S)
OH
105
NH2
CH3
O
HO
Treonina
Thr (T)
119
OH
NH2
Muy 257
Soluble
O
OH
Triptofano
Trp (W)
NH2
204
NH
1
289
10.07 5.66
0.04
344
---
9
315
O
OH
Tirosina
Tyr (Y)
181
NH2
HO
CH3
O
H3C
Valina
Val (V)
117
OH
NH2
5.96
5
Nombre
Abreviaturas PM
Estructura
pKa pKa pKa PI
Sol. P.f.
+
COOH NH3 cad. lat.
H2O, g/dL
a 25°C
Aminoácidos ácidos.
O
Ácido
aspártico
HO
Asp (D)
133
OH
O
O
Ácido
glutámico
Glu (E)
147
1.88
9.60
3.65
2.77
0.4
269
2.19
9.67
4.25
3.22
0.7
247
2.17
9.04
12.48 10.76 15
230 d
1.82
9.17
6.00
287
2.18
8.95
10.53 9.74
NH2
O
HO
OH
NH2
NH2
O
Aminoácidos básicos.
HN
Arginina
Arg (R)
NH
174
OH
NH2
O
H
N
Histidina
His (H)
155
N
OH
NH2
7.59
0.4
O
H2N
OH
Lisina
Lis (K)
146
NH2
Muy 255
Soluble
Problema 1. ¿Cuántos de los aminoácidos que se muestran en la tabla contienen anillos aromáticos?
¿Cuántos contienen azufre? ¿Cuántos contienen alcoholes? ¿Cuántos contienen cadenas laterales
hidrocarbonadas?
Con excepción de la glicina, los carbonos de los α-aminoácidos son centros quirales. Por lo tanto, son
posibles dos formas enantioméricas, pero la naturaleza sólo utiliza una para la construcción de las
proteínas. En las proyecciones de Fischer, los aminoácidos que se encuentran en forma natural se
representan colocando el grupo COOH en la parte superior y la cadena lateral abajo, como se dibuja
un carbohidrato, y luego se coloca el grupo –NH2 a la izquierda. Debido a la similitud estereoquímica
con los azúcares L, llamamos a los α-aminoácidos que se encuentran en forma natural como
aminoácidos L.
6
COOH
CHO
H
H
OH
CHO
NH2
HO
R
CH2OH
D-gliceraldehído
COOH
H
H2N
CH2OH
D-aminoácido
H
R
L-gliceraldehído
L-aminoácido
Problema 2. Dieciocho de los 19 L-aminoácidos tienen configuración S en el carbono α. La císteina
es el único L-aminoácido con una configuración R. Explique la razón.
Problema 3. El aminoácido Treonina, ácido (2S, 3R)-2-amino-3-hidroxibutanoico tiene dos centros
quirales. Dibuje una proyección de Fischer para la Treonina. ¿Cuántos estereoisómeros podrían
existir? Dibuje las proyecciones de Fischer e identifique los centros quirales como R o S.
Problema 4. Dibuje formulas con enlaces de cuña (tetraédricas) y proyecciones de fischer que
representen la configuración de los átomos de carbono de la L-valina, L-leucina y L-isoleucina.
Aminoácidos esenciales.
Son aminoácidos que el organismo no puede sintetizar.
Reacción de transaminación.
COOH
COOH
COOH
COOH
Enzimas transaminasas
H
H2N
R
Aminoácido
Antiguo
O
+
O
(muchos pasos)
R1
R
cetoácido
antiguo
cetoácido
nuevo
H2N
+
H
R1
aminoácido
nuevo
Fenilcetonuria.
O
O
OH
NH2
OH
Enzimas
NH2
HO
7
REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN.
Un interesante el papel de las iminas como intermediarios es el de la reacción de transaminación, de
importancia biológica. La transaminación es un proceso por el cual se transfiere un grupo amino de
una molécula a otra. En los sistemas biológicos el grupo amino de un aminoácido se transfiere al
grupo carbonilo de otra molécula. La secuencia, es promovida por una enzima, la transaminasa, es un
método de formación de nuevos aminoácidos.
NH2
O
O
O
H3C
+
HO
glutamato
transaminasa
OH
OH
O
Alanina
Ácido-α-cetoglutárico.
O
O
O
H3C
O
HO
OH
HO
+
NH2
Ácido pirúvico
Ácido glutámico
Todas las transaminasas importantes parecen compartir la misma coenzima, el fosfato de piridoxal.
Las coenzimas son pequeños constituyentes no proteínicos de las enzimas, con frecuencia
indispensables para la actividad enzimática.
H
O
OH
O
P
HO
HO
N
O
CH3
Fosfato de piridoxal.
La transaminación biológica no es la simple transferencia de un grupo amino de una molécula a otra.
El grupo carbonilo de la coenzima piridoxal forma primero una imina con el grupo amino del
aminoácido “donador”. La reacción subsiguiente de este aducto con el compuesto carbonílico
“receptor” conduce a la formación de un nuevo aminoácido, regenerándose el fragmento de piridoxal.
El piridoxal es el transportador del grupo amino de un reactivo a otro. La secuencia, de numerosos
pasos, supone una serie de adiciones e isomerizaciones reversibles.
8
Mecanismo general de una reacción de transaminación.
O
PRP
PRP
OH
R
N
+
H
H2N
R
O
H2O
+
H
O
OH
PRP
N
PRP
R
N
R
O
OH
H
H
H
O
OH
O
N
PRP
PRP
R
+
H
H2O
NH2
+
H
OH
OH
O
PRP
PRP
NH2
N
R1
+
H
+
R1
N
O
PRP
H
O
OH
R1
PRP
+
H
O
OH
N
R1
O
OH
H
H
N
H2O
H
OH
PRP
R1
H
O
H
PRP
O
H
H
O
R
OH
H2N
O
R1
+
H2O
H
O
OH
PRP = fosfato de piridoxal.
9
Reacción de transaminación catalizada por la Aspartato aminotransferasa.
H3C
CH3
H3C
CH3
B:
N
-
O
O
O
P
OH
O
-
O
H
-
O
-
O
+
N
H
O
CH3
O
H
-
O
NH2
+
O
NH
-
O
O
OH
P
O
-
O
+
CH3
N
H
H3C
CH3
B
+
aldimina
O
O
-
O
+
NH
O
OH
O
O
O
+
O
-
O
NH3
-
+
CH3
N
H
O
H2O
OH
P
O
-
O
NH
-
P
-
-
+
O
O
O
-
O
-
O
O
-
O
-
O
H
O
paso lento
-
O
O
CH3
N
H
O
OH
P
O
-
O
quinoide
+
H3C
+
B:
NH3
-
O
O
O
-
O
O
H
OH
P
H3C
O
O
-
O
H3C
+
N
H
CH3
N
H
CH3
O
CH3
-
+
NH
-
O
O
OH
P
-
O
O
H3C
+
CH3
B
+
O
H3C
H3C
-
O
+
+
NH
NH
O
-
O
CH3
OH
P
O
N
H
+
NH3
CH3
O
O
-
O
-
O
H3C
-
OH
H3C
-
O
-
P
O
O
H
O
CH3
N
H
NH2
H3C
CH3
+
O
NH
-
+
N
H
CH3
O
O
OH
P
-
O
O
+
N
H
CH3
10
ACIDEZ, BASICIDAD Y pKa.
Lewis.
Ácido: acepta electrones.
Base: cede electrones.
Brosnted-Lowry.
Ácido: cede protones
Base: recibe protones.
H-A
Ácido
+
H2O
Base
H3O+
+ Aácido
base
conjugado conjugada
Keq = [H3O+][A-]
[HA][H2O]
La concentración del agua permanece casi constante. [H2O]= 55.6 M a 25°C.
Ka = Keq [H2O] = [H3O+][A-]
[HA]
log Ka = log [H3O+][A-]
[HA]
log Ka = log [H3O+] + log [A-]
[HA]
- log Ka = - log [H3O+] - log [A-]
[HA]
pKa = pH – log [A-]
[HA]
pH – pKa = log [A-]
[HA]
pH = pKa + log [A-]
[HA]
Ecuación de Henderson – Hasselbalch.
11
™ Un ácido más fuerte (de mayor Ka) tiene pKa menor.
™ Un ácido más débil (de menor Ka) tiene mayor pKa.
™ Compuesto en una solución de pH por debajo del pKa se encuentra protonado (ionizado).
™ Compuesto en una solución de pH por encima del pKa se encuentre no protonado (no ionizado).
Factores que afectan el pKa:
™ Efecto resonante.
™ Efecto inductivo y electrostático.
™ Efecto estérico.
™ Puentes de hidrógeno intramoleculares.
™ Hibridación.
™ Efecto inductivo.
O
O
O
Cl
4.5
1.68
2.8
F 3C
OH
Cl
Cl
Cl
pKa:
OH
OH
OH
OH
OH
O
Cl
Cl
O 2N
H3C
O
O
1.3
0.9
0
™ Efecto resonante
+
O
NH3
NH3
O
H3C
H3C
+
+
NH3
O
O
R1
OH
OH
R1
R
O
O
R
NO2
+
O
pKa: 4.5
16
11
-
19.20
N
O
1.11
2.5
4.60
™ Efecto estérico
O
H3C
H3C
OH
CH3
H3C
OH
CH3
H3C
H3C
pKa:
4.5
O
CH3
7.0
12
™ Puentes de hidrógeno.
O
O
OH
OH
HO
OH
pKa: 4.5
pKa: 9.3
3.0
13.4
™ Hibridación.
H3C
H3C
+
HN
H3C
pKa:
C
+
NH
+
N
H
CH3
9.8
5.2
- 10
AMINOÁCIDOS.
INFLUENCIA DE LA CADENA LATERAL.
O
O
H
N
O
H
N
OH
OH
OH
NH2
NH
pKa: 1.99
pKa: 10.60
pKa: 2.83
pKa: 9.39
pKa: - - -
pKa: 1.82
pKa: 9.17
pKa: 6.00
NH2
O
HO
OH
O
HN
O
NH
OH
NH2
NH2
pKa: 1.88
pKa: 9.60
pKa: 3.65
NH2
N
pKa: 2.17
pKa: 9.04
pKa: 12.48
13
Problema 5. Pronostique los productos de reacción de: (a) prolina, (b) tirosina, (c) arginina y (d)
triptofano con un exceso de HCl; y con un exceso de NaOH.
Problema 6. Escriba las formulas estructurales para las siguientes ecuaciones:
(a) fenilalanina con un equivalente de NaOH.
(b) Producto de (a) con un equivalente de HCl.
(c) Producto de (a) con dos equivalentes de HCl.
PUNTO ISOELÉCTRICO.
pH bajo
(protonado)
pH alto
(desprotonado)
Punto Isoeléctrico
PI = pKa1 + pKa2
2
Zwitterion neutro.
El punto isoeléctrico (PI) de un aminoácido depende de su estructura; y es el promedio de las dos
constantes de disociación ácida que incluyen el zwitterion neutro. En cuanto a los aminoácidos con
una cadena lateral que sea un ácido fuerte o un ácido débil, el PI es el promedio de los dos valores de
pKa más bajos. En el caso de los aminoácidos con una cadena lateral básica, el PI es el promedio de
los dos valores de pKa más altos.
Aminoácido ácido
Ácido aspártico.
Aminoácido neutro
Alanina
Aminoácido básico
Lisina
14
Así como los aminoácidos tienen sus PI, las proteínas también tienen un PI global debido a los
numerosos residuos ácidos o básicos que pueden contener.
Aprovechamos la ventaja de las diferencias de puntos isoeléctricos para separar una mezcla de
aminoácidos (o una mezcla de proteínas) en sus constituyentes puros mediante la técnica de la
Electroforesis.
Tira de papel a pH = 6.02
Cuando se aplica un potencial eléctrico, los aminoácidos con cargas negativas (los que se han
desprotonado a causa de que el pH del buffer es más alto que sus PI) migra lentamente hacia el
electrodo positivo. Al mismo tiempo que los aminoácidos con cagas positivas (los que se han
protonado porque el pH del buffer es menor que su PI) migran hacia el electrodo negativo.
Los diferentes aminoácidos migran a diferentes velocidades, lo que depende de sus puntos
isoeléctricos y del pH del buffer acuoso. Así es posible separar una mezcla de diversos aminoácidos.
Problema 7. Para las siguientes mezclas de aminoácidos, prediga usted la dirección y la velocidad
relativa de migración de cada componente:
(a)
(b)
(c)
(d)
valina, ácido glutámico e histidina a pH= 7.6
glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.7
glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.5
glicina, fenilalanina y serina a pH= 6.0
Problema 8. La glicina, al igual que la alanina tiene un punto isoeléctrico de 6.0. Trace estructuras de
las formas predominantes de la glicina a pH= 2.0, 6.0 y 10.0.
Problema 9. ¿Cómo podría explicar el hecho de que el triptofano tenga menor punto isoeléctrico que
la histidina, pese a que ambos tienen átomos de nitrógeno en el anillo de cinco miembros? ¿Cual
nitrógeno del anillo de cinco miembros de la histidina es más básico?
15
Un aminoácido reacciona con dos equivalentes del hidrato de ninhidrina, para dar el púrpura de
Ruhemann, un producto azul-violeta. Esta reacción se emplea como ensayo para detectar la presencia
de aminoácidos en una muestra desconocida.
O
O
O
R
OH
O
OH
+
H3N
O
H2O
ninhidrina
O
O
-
+
O
O
-
H
N
+
R
CO 2
+
H2O
O
O
O
+
púrpura de Ruhemann.
Si se conocen los valores exactos de pKa para los sitios ácidos de un aminoácido, se puede calcular los
porcentajes de las formas protonadas, neutra y desprotonadas en una solución a un pH dado utilizando
la estuación de Henderson-Hasselbalch:
pH – pKa = log [A-]
[HA]
pH = pKa + log [A-]
[HA]
Para ver como se utiliza la ecuación de Henderson-Hasselbalch, encontremos las especies que están
presentes en una solución 1M de alanina a pH= 9.00. de acuerdo a los valores antes mencionados, la
alanina protonada tiene un pKa1 de 2.34, y la alanina neutra tiene un pKa2 de 9.69:
H3C
H3C
OH
O
-
+
H3N
O
H3C
O
+
-
+
+
H3N
O
H3O
+
+ H2O
H3N
O
H3C
O
pKa1= 2.34
-
+
H2O
H2N
+
H3O
+
pKa2= 9.69
O
16
Como el pH de nuestra solución está mucho más cerca del pKa2 que del pKa1, necesitamos usar pKa2
para nuestros cálculos. De acuerdo a la ecuación de Henderson-Hasselbalch, tenemos:
log [A-] = pH – pKa = 9.0 – 9.69 = - 0.69
[HA]
De tal modo que
[A-] = antilog (-0.69) = 0.20
[HA]
Además, sabemos que:
[A-] + [HA] = 100% (1.0 M)
[HA]= 83% y [A-] = 17%
Se pueden efectuar cálculos similares a otro pH, con lo que se llega a la curva de titulación siguiente:
Problema 10. La Treonina tiene un pKa1 = 2.1 y un pKa2 = 9.1. Utilice la ecuación de HendersonHasselbalch para calcular la proporción de formas protonadas y desprotonadas a pH= 1.5 y pH = 10.0.
17
SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS.
1. Síntesis de Strecker.
α-aminonitrilo
aldehído
α-aminoácido
O
O
C
N
H3O
NH4Cl / KCN
H
NH2
H2O
Fenilacetaldehído
α-aminonitrilo
+
OH
NH2
(R,S)-fenilalanina (53%)
Problema 11. El aminoácido poco común conocido como L-Dopa (3,4-dihidroxifenilalanina) es un
fármaco útil contra el mal de Parkinson. Indique cómo podría sintetizarse a partir de 3,4dihidroxifenilacetaldehído.
2. Aminación de ácidos α-halogenados.
Uno de los métodos más antiguos comienza con la α-bromación de un ácido carboxílico por
tratamiento con Br2 y PBr3 (La reacción de Hell-Volhard-Zelinsky). La sustitución del α-bromo ácido
con amoniaco produce un α-aminoácido.
Ácido 4-metilpentanóico
Ácido 2-bromo-4metilpentanóico
(R,S)-leucina 45%
Problema 12. Indique como podrían obtenerse los siguientes aminoácidos a partir de los ácidos
carboxílicos apropiados:
(a) Valina
(b) Fenilalanina
(c) Alanina
(d) Serina
18
3. Síntesis de Gabriel.
Glicina
Cloroacetato de etilo
Ftalimida
potásica
Glicina
(85%)
Ácido ftálico
Fenilalanina
O
CH3
CH3
-
N
O
O
O
Br
O
O
Br
O
CH3
+
K
O
CCl4
O
O
CH3
DMF
Br
malonato de dietilo
O
O
CO2C2H5
1) NaOEt / EtOH
N CH
CO2C2H5
N
H3O
C
(CO2C2H5) 2
2) C6H5CH2Cl
+
calor
O
O
O
O
KOH / H2O
N CH
O
O
HO
o NH2NH2
OH
NH2
Fenilalanina
Ácido Glutámico
19
O
O
CO2C2H5
CH2CH2CO2C2H5
1) NaOEt / EtOH
N CH
N
(CO2C2H5)2
2) CH2=CHCO2C2H5
CO2C2H5
H3 O
C
+
calor
O
O
O
KOH / H2O
N CH
O
O
O
O
OH
OH
CH2CH2CO2C2H5
o NH2NH2
HO
NH2
4. Síntesis del amidomalonato
Ácido (R,S)-aspártico
(55%)
Acetamidomalonato
de dietilo
3 EtOH + CO2 + CH3COOH
Problema 13. Indique los halogenuros de alquilo necesarios para producir los siguientes αaminoácidos por el método de síntesis amidomalónica.
(a) leucina
(b) Histidina
(c) Triptofano
(d) Metionina
Problema 14. La serina puede sintetizarse por una simple variación del método amidomalónico
utilizando formaldehído en vez de halogenuro de alquilo. ¿Cómo podría lograrse esto?
5. Aminación reductiva de α-cetoácidos: Biosíntesis.
O
O
HO
O
OH
+
NH3
O
L-glutamato
deshidrogenasa
O
HO
OH
NADH
NH2
Ácido-α-cetoglutárico.
Ácido glutámico
O
O
H3C
O
H2N
OH
NH3
H3C
OH
NaBH4
20
Ácido pirúvico
(R,S)-Alanina
Problema 15. Proponga una síntesis para cada uno de los siguientes aminoácidos partiendo del
malonato de dietilo: Valina, Metionina y ácido aspártico.
Problema 16. La prolina puede prepararse por una secuencia que utiliza ftalimida, malonato de dietilo
y 1,3-dibromopropano. Indique los pasos de esta síntesis.
Síntesis Enantioselectiva de aminoácidos.
La síntesis de α-aminoácidos a partir de un precursor aquiral por cualquiera de los métodos descritos
produce una mezcla racémica (una mezcla racémica en partes iguales de enantiómeros R y S).
Existen dos métodos para obtener aminoácidos enantoméricamente puros. Una manera consiste en
resolver la mezcla racémica en sus enantiómeros puros. Sin embargo un método mejor consiste en usar
una síntesis enantioselectiva para preparar directamente sólo el enantiómero S deseado.
Resolución de aminoácidos R, S.
La resolución puede hacerse al convertir el aminoácido en su amida y permitiendo que el aminoácido
racémico intervenga en una reacción ácido-base con un solo enantiómero de una amina quiral. Se
forman dos sales diasteroméricas que luego se separan y se vuelven a convertir en el aminoácido por
hidrólisis del grupo amida.
Mezcla de
enantiómeros de
aminoácidos
Mezcla de
enantiómeros de
aminoácidos
Mezcla de sales
diasteroméricas
Las enzimas catalizan selectivamente la hidrólisis de amidas formadas de L-aminoácidos (S).
Mezcla de
enantiómeros de
aminoácidos
Mezcla de
enantiómeros de
aminoácidos
Aminoácido S
Aminoácido R
21
Se utiliza una aminoacilasa obtenida de riñon de cerdo.
Síntesis enantioselectiva de aminoácidos.
Se utiliza un catalizador en una reacción quiral que contenga temporalmente una molécula de sustrato
en un ambiente asimétrico. Mientras se encuentra en este ambiente, el sustrato puede estar más abierto
a reaccionar de un lado que en el otro, lo que lleva a un exceso del producto enantiomérico sobre el
otro.
William Knowles descubrió hace algunos años que los α-aminoácidos pueden prepararse
enantioselectivamente mediante la hidrogenación de un ácido Z enamido con un catalizador de
hidrogenación quiral.
Ácido Z enamido
S-fenilalanina 98.7%
El catalizador más efectivo para la síntesis enantioselectiva son los complejos de coordinación de
Rodio (I) con ciclooctadieno (COD) y una difosfina quiral
como el (R,R)-1,2-bis(oanisilfenilfosfonio)etano, el llamado ligando DiPAMP.
22
PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS.
Las proteínas y los péptidos son polímeros de aminoácidos en los cuales las unidades individuales de
aminoácidos, llamados residuos, están unidas mediante enlaces amida, o uniones peptídicas.
Alanina (Ala)
Alanilserina (Ala-Ser)
Serina (Ser)
Aminoácido N terminal
Aminoácido C terminal
La larga secuencia repetida de enlaces peptídicos forman una cadena, la estructura primaria o
esqueleto de las proteínas. Por convencion siempre se escriben los péptidos con el aminoácido Nterminal a la izquierda y el aminoácido C-terminal a la derecha. El nombre del péptido se indica
utilizando las abreviaturas para cada aminoácido.
23
Bradiquinina
H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH
R-P-P-G-F-S-P-F-R
Problema 17. Nombre los seis posibles tripéptidos isoméricos con valina, tirosina y glicina. Utilice la
notación corta de tres letras para cada aminoácido.
Problema 18. Trace la estructura completa de H-Met-Pro-Val-Gli-His-OH
ENLACE COVALENTE EN LOS PÉPTIDOS.
Consecuencias de la resonancia:
• Estabilidad del enlace
• Menor basicidad del átomo de nitrógeno
• Rotación restringida del enlace C-N (carácter de doble enlace)
Configuración Trans.
24
En los péptidos se encuentra un segundo tipo de uniones covalentes cuando se forma un enlace
disulfuro RS-SR entre dos redisuos de Cisterna. El enlace disulfuro se forma con facilidad por medio
de la oxidación suave de los tioles RSH y se rompen con facilidad mediante una reducción suave.
Oxidación
moderada
Cistina
Císteina
Oxidación moderada de tioles con Bromo.
-
-
HO
R
R
SH
H2O
-
S
Br
S
Br
R
R
S
S
R
Br
R
S
Los enlaces disulfuro contribuyen a la forma (estructura) de un polipéptido.
Oxitocina
25
DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LOS PÉPTIDO:
ANÁLISIS DE LOS AMINOÁCIDOS
¿Cuáles aminoácidos están presentes? ¿Cuántos hay de cada uno? ¿Cuál es la secuencia de
aminoácidos de la cadena peptídica?
Las respuestas a las dos primeras preguntas se obtienen con un Analizador de aminoácidos.
William Stein y Standford Moore.
Mezcla
Estándar
equimolecular
de 17 αaminoácidos.
26
DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE UN PÉPTIDO.
1.- Hidrólisis de los enlaces disulfuro RS-SR con ácido perfórmico.
2.- Hidrólisis del péptido con HCl 6M por 24 horas.
3.- Analizador de aminoácidos.
2-mercaptoetanol
Ácido iodoacético
27
Ácido cisteico
Ácido cisteico
DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS EN PÉPTIDOS:
DETERMINACIÓN DE RESIDUOS N-TERMINALES.
DEGRADACIÓN DE EDMAN.
Isocianato de fenilo
Reactivo de Edman
derivado de
tiazolinona
péptido sin el amino ácido
N-terminal original
28
La transposición de la anilinotiazolinona en medio ácido acuoso
produce el derivado final N-feniltiohidantoina (PTH).
PTH se identifica por
cromatografía
Los péptidos de cadena acortada se vuelven a someter en forma automática a otro ciclo de la
Degradación de Edman.
La determinación de la secuencia completa de proteínas por este método es poco práctica a causa de la
formación de subproductos indeseables que limita el método a un máximo de 50 ciclos.
MÉTODO DE SANGER
N-aminoácidos
2,4-dinitrofluorobenceno
(DNFB)
polipéptido
Polipéptido marcado
Aminoácido N-terminal
marcado.
Separado e identificado
Mezcla de
resto de
aminoácidos
29
El método de Sanger no es tan utilizado como el de Edman.
Dadas las limitaciones de los métodos de Edman y Sanger; primero se rompe una cadena peptídica
larga por medio de una hidrólisis parcial en varios fragmentos más pequeños, se determina la
secuencia de cada fragmento y éstos se ajustan haciendo coincidir los extremos que se traslapan.
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICAS.
Enzima
Especificidad
Tripsina
Quimiotripsina
Elastasa
hidrólisis carboxilo de aminoácidos básicos: Arginina y Lisina.
hidrólisis carboxilo de aminoácidos arilo: Fenilalanina, Tirosina y Triptofano.
hidrólisis carboxilo de aminoácidos pequeños: Glicina y alanina.
Carboxipeptidasa A
Carboxipeptidasa B
Remueve el aminoácido C-terminal
Remueve los aminoácidos C-terminal Arginina y Lisina solamente.
Val – Phe – Leu – Met – Tyr – Pro – Gly – Trp – Cys – Glu – Asp – Ile – Lys – Ser – Arg – His
Quimiotripsina rompe estos enlaces
Tripsina rompe estos enlaces.
HIDRÓLISIS PARCIAL
1. Un análisis de los aminoácidos de la angiotensina II revelaría la presencia de ocho aminoácidos
diferentes: Arg, Asp, His, Ile, Fen, Pro, Tir y Val en cantidades equimoleculares.
2. Un análisis de extremos N-terminales por el método de Edman indicaría que la angiotensina II
tiene un residuo de ácido aspártico en el extremo N-terminal.
3. La hidrólisis parcial de la angiotensina II con ácido clorhídrico diluido produciría los siguientes
fragmentos, cuya secuencia puede ser determinada por Degradación de Edman:
a.
b.
c.
d.
e.
H-Asp-Arg-Val-OH
H-Ile-His-Pro-OH
H-Arg-Val-Tir-OH
H-Pro-Fen-OH
H-Val-Tir-Ile-OH
30
4. Traslapando las regiones que se superponen de los fragmentos se obtiene la secuencia completa de
aminoácidos en la angiotensina II:
a.
c.
e.
b.
d.
H-Asp-Arg-Val-OH
H-Arg-Val-Tir-OH
H-Val-Tir-Ile-OH
H-Ile-His-Pro-OH
H-Pro-Fen-OH
H-Asp-Arg-Val-Tir-Ile-His-Pro-Fen-OH
Problema 19. ¿Cual es la estructura de un pentapéptido que da los siguientes tripéptidos cuando se
hidroliza parcialmente?
Gli-glu-arg, glu-arg-gli, arg-gli-fen
Problema 20. ¿Qué fragmentos resultarían si se rompiera la Angiotensina II con tripsina en un caso, y
con quimiotripsina en otro?.
Problema 21. Dibuje la estructura del derivado PTH que se puede formar por la degradación de
Edman de la Angiotensina II.
Problema 22. Indique la secuencia de los hexapéptidos que producen los siguientes fragmentos por
hidrólisis parcial con ácido:
(a) Arg,Gli,Ile,Leu,Pro,Val forman H-Pro-Leu-Gli-OH, H-Arg-Pro-OH, H-Gli-Ile-Val-OH
(b) Asp,Leu,Met,Trp, Val2 forman H-Val-Leu-OH, H-Val-Met-Trp-OH, H-Trp-Asp-Val-OH
DETERMINACIÓN DE RESIDUOS C-TERMINALES.
carboxipeptidasa
31
Problema 23. Se encuentra que un hexapéptido con la composición Arg, Gli, Leu, Pro tiene prolina en
los extremos C y N. La hidrólisis parcial produce los siguientes fragmentos:
H-Gli-Pro-Arg-OH
H-Arg-Pro-OH
H-Pro-Leu-Gli-OH
¿Cuál es la estructura del hexapéptido?
Problema 24. Proponga dos estructuras para un tripéptido que por hidrólisis se descompone en Leu,
Ala, y Fen pero que no reacciona con carboxipeptidasa ni con fenilisotiocianato.
El bromuro de cianógeno hidroliza el enlace peptídico de la Metionina.
H – Ala – Lys – Phe – Asp – Met – Val – Arg – Trp – OH
BrCN rompe este enlace.
Mecanismo de la hidrólisis del enlace peptídico por bromuro de cianógeno.
32
SÍNTESIS DE PÉPTIDOS.
Aunque las amidas simples suelen formarse por la reacción entre aminas y cloruros de ácidos, la
síntesis de los péptidos es más difícil porque se deben de formar muchos enlaces amida diferentes en
orden específico y no aleatoriamente.
2 sitios de unión + 2 sitios de unión = 4 productos distintos.
La solución al problema de la especificidad es la protección.
33
Protección
NH2
1. Formación de
la amida
Alanina
2. Desprotección
Protección
COOH
Leucina
GRUPOS PROTECTORES EN LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS.
Nombre
Estructura
Abreviatura Reactivo
Eliminación
Grupos Protectores de aminas.
O
O
Benciloxicarbonilo
R
Z- , CBZ-
O
Cl
CH3
H3C
O
tert-Butoxicarbonilo
R
H3C
Boc-
O
O
O
CH3
CH3
H2 / Pd-C
HBr, HF, HCl
O
O
H3C
O
O
O
O
H3C
H3C
Ciano-t-butoxicarbonilo
O
CH3
Cyoc-
CH3
CF3COOH
HCl gas
BF3 / Et2O / THF
H3C
CN
R
CH3
CN
Cl
O
CH3
NaOH / THF
34
O
O
9-Fluorenilmetoxicarbonil
Fmoc-
Piperidina
O
O
p-Toluensulfonilo
R
Tos-
CH3
S
Cl
Na / NH3
CH3
S
O
O
Grupos protectores de ácidos carboxílicos.
Ester
ROH / H+
R3O+X-
RO-
H2O / NaOH
H3O+
Preparación de Carbamatos para protección del grupo amino.
carbamato
O
Cl
OH
O
H2N
+
OH
- HCl
O
NH
O
O
O
del Cl2C=O y C6H5CH2OH
Glicina
Glicina-CBZ
O
O
ZBC
NH
OH
+
ZBC
- HCl
Cl
O
NH
CH3
O
O
Glicina protegida
O
CH3
O
Cloroformiato de etilo
grupo éster activado
O
O
O
O
O
NH
O
CH3
OH
+
NH2
O
35
O
fenilalanina
Gly-Phe con el grupo amino protegido
Eliminación del grupo protector carbamato
O
O
HN
H2, Pd / C
O
NH
OH
O
HN
CH3
CO2
H2N
OH
O
O
ter-butoxicarbonilamida (BOC)
Alanina
dicarbonato de di-ter-butilo
BOC-Ala
Fluorenilmetoxcarbonilamida
cloroformiato de
9-fluorenilmetilo
aminoácido. (cadena
lateral protegida si es
necesario)
aminoácido- FMoc
protegido (estable en ácidos)
36
(Grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo)
Desprotección. (ruptura del grupo FMoc)
piperidina
aminoácido libre
producto
secundario
Protección del grupo carboxilo de un aminoácido por formación de un éster.
Leucinato de metilo
Leucina
Leucina
Leucinato de bencilo
FORMACIÓN DEL ENLAC PEPTÍDICO.
Cloroformiato de bencilo
37
Anhídrido mixto de Ala-CBZ
EL USO DE AGENTES ACOPLANTES (ACTIVANTES DEL COOH).
a) Carbonildiimidazol (CDI)
O
O
O
O
O
R
OH
N
N
+
R1
R1
CO2
R
O
NH
N
NH2
N
NH-protegido
+
CH3
NH-protegido
O
N
calor
NH
CH3
b) Diciclohexilcarbodiimida (DCC)
O
O
O
R1
O
R
OH
+
N
C
N
NH2
CH3
NH-protegido
calor
R1
R
O
NH
+
NH-protegido
H3C
O
HN
NH
C
O
38
c) N-(3-dimetilaminopropil)-N´-etilcarbodiimida. (EDCI ó EDAC)
O
H3C
O
R1
N
R
OH
NH-protegido
O
H3C
N
+
C
NH2
N
R1
O
CH3
R
O
NH
CH3 calor
NH-protegido
H3C
+
O
O
H3C
C
N
NH
NH
CH3
CH3
d) Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-oxi)tripirrolidinfosfonio. (PyBOP)
O
R
O
F
N
N F
+
O
F
P-
R
F
CH3
H2N
F
OH
R
O
F
N
calor
R
O
NH
HN
O
protegido
HN
CH3
O
protegido
N
+
P
N
N
Resumen de 5 pasos para la síntesis de H-Ala-Leu-OH
1. Proteger el grupo amino de la leucina como su derivado BOC
H-Ala-OH
+
bicarbonato de di-tert-butilo
BOC-Ala-OH
2. Proteger el grupo carbonilo de la leucina como su éster metílico
39
H-Leu-OH
+
CH3OH
H-Leu-OCH3
3. Acoplar los dos aminoácidos protegidos usando DCC
BOC-Ala-OH
+
H-Leu-OCH3
BOC-Ala-Leu-OCH3
4. Retirar el grupo protector BOC por tratamiento ácido
BOC-Ala-Leu-OCH3
+ CF3COOH
H-Ala-Leu-OCH3
5. Retirar el éster metílico por hidrólisis básica:
H-Ala-Leu-OCH3
+ NaOH / H2O
H-Ala-Leu-OH
Problema 25. Indique el mecanismo de la formación de un derivado BOC para la reacción de Tirosina
con bicarbonato de di-ter-butilo.
Problema 26. Escriba los cinco pasos que se requieren para la síntesis de H-Leu-Ala-OH a partir de
alanina y leucina.
Problema 27. ¿Cómo podrían prepararse los siguientes tripéptidos?
(a)
(b)
(c)
H-Leu-Ala-Gli-OH
H-Gli-Leu-Ala-OH
H-Ala-Gli-Leu-OH
cadena A
21 aminoácidos
cadena B
30 aminoácidos
insulina
40
La insulina esta compuesta por dos cadenas que suman un total de 51 aminoácidos unidos pos dos
puentes disulfuro. Frederick Sanger determinó su estructura y recibió el premio Nobel en Química en
1958 por su trabajo.
SÍNTESIS DE PÉPTIDOS AUTOMATIZADA:
TÉCNICA DE FASE SÓLIDA DE MERREFIELD.
La síntesis de péptidos se efectúa sobre esferas sólidas de poliestireno, preparado de un modo tal que
por cada 100 anillos de benceno uno lleve un grupo clorometilo:
CH3
CH3
CH
CH2
HC
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH3
CH
H3C
Cl
Cl
Síntesis de un tripéptido utilizando la Fase sólida de Merrifield.
Aminoácido N-protegido
41
2 Aminoácido N-protegido
2 Aminoácido N-protegido
y COOH activado
Dipéptido
protegido
Dipéptido-Resina
3 Aminoácido
N-protegido y
COOH
activado
3 Aminoácido N-protegido
Tripéptido protegido
42
Tripéptido-Resina
polímero
Tripéptido libre
Problema 28. La importancia del rendimiento en cada paso de la síntesis de un péptido es muy
grande. La preparación de un decapéptido puede implicar de 30 a 40 reacciones químicas. Suponiendo
que cada paso pueda realizarse con un rendimiento del 90%, calcule el rendimiento global de una
secuencia de 40 pasos.
PROTEÍNAS.
9
9
9
9
9
Estructura primaria y secundaria
Estructura terciaria y cuaternaria
Clasificación y funciones de proteínas
Enzimas
Desnaturalización de proteínas
ESTRUCTURA PRIMARIA.
Se refiere a la secuencia en la que están unidos los aminoácidos.
43
Estructura primaria de la bradiquinina:
H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH
OXITOCINA
VASOPRESINA
44
ESTRUCTRURA SECUNDARIA.
Es la orientación relativa de los átomos del
“esqueleto” (backbone): átomos que forman en
enlace peptídico.
Depende de:
• La región planar en cada enlace peptídico.
• La formación de puentes de hidrógeno.
• Separación adecuada de grupos R (cadenas
laterales de los aminoácidos)
HELICE ALFA α
Cada oxígeno está unido con un puente de hidrógeno al amino ácido del siguiente giro de la hélice.
(Prolina rompe las hélices alfa)
45
Vista lateral
vista superior
HOJA PLEGADA (LÁMINA) BETA β
Cada carbonilo en un enlace peptídico está unido con un puente de hidrógeno al grupo H-N de un
amino ácido de una cadena adyacente.
46
Dos o más cadenas peptídicas pueden alinearse formando la lámina
Orientación de los puentes de hidrógeno en las láminas Beta β
47
Tipos de Laminas Beta β
ESTRUCTURA TERCIARIA.
48
Describe el enrollamiento de toda la proteína en una forma tridimensional (3D).
Factores que determinan la estructura terciaria:
• Interacciones hidrófobos de las cadenas laterales.
• Puentes disulfuro.
• Puentes de hidrógeno.
• Grupos prostéticos.
Puede haber combinaciones de Hélices α y láminas β.
ESTRUCTURA CUATERNARIA.
49
Describe como se unen las moléculas de proteínas diferentes en grandes estructuras agregadas.
CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS (COMPOSICIÓN)
•
•
Proteínas simples
– Constituidas únicamente por amino ácidos
Proteínas conjugadas
Constituidas por amino ácidos y otros compuestos.
– Glicoproteínas (carbohidratos)
– Lipopoproteínas (grasas)
– Nucleoproteínas (ácido ribonucleico)
– Fosfoproteínas (ésteres de fosfato)
– Metaloproteínas (hierro)
PROTEÍNAS CONJUGADAS:
•
•
•
•
•
Globulina (glicoproteína)
Interferón (glicoproteína)
Caseína (fosfoproteína)
Ferritina (metaloproteína)
Hemoglobina (metaloproteína)
CLASES CONFORMACIONALES DE PROTÉINAS.
50
•
•
Proteínas fibrosas (insolubles)
– Colágeno: tejido conectivo, tendones
– Queratina: cabello, uñas, piel
– Elastina: tejido conectivo elástico
Proteínas globulares (solubles)
– Insulina: hormona reguladora del metabolismo de la glucosa
– Mioglobina: transporte de oxígeno
– Ribonucleasa: controla la síntesis del RNA
ALGUNAS FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LAS PROTEÍNAS.
•
•
•
•
•
•
Enzimas (catalizadores biológicos)
Hormonas (insulina)
Proteínas protectoras (anticuerpos)
Proteínas de almacenamiento (caseína)
Proteínas estructurales (queratina, elastina)
Proteínas de transporte (hemoglobina)
ENZIMAS.
•
•
•
Casi todas son globulares
Algunas son conjugadas:
– La parte no proteica se llama cofactor
– La parte proteica se llama apoenzima
– Cofactor + apoenzima = holoenzima
Son específicas
Posible mecanismo de acción de la quimiotripsina.
51
Posible mecanismo de acción de la tripsina.
52
DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS.
53
Es la alteración de la estructura terciaria. La estructura primaria no se altera.
ESTRUCTURAS DE PROTEÍNAS EN INTERNET.
Protein Data Bank
http://www.rcsb.org/pdb/
54
Problema 29. se cree que la descarboxilación de los α-cetoácidos catalizada por tiamina se inicia con
la eliminación de un átomo de hidrógeno ácido del anillo de tiazol de la tiamina.
H3C
H3C
H3C
CH3
+
H3C
N
CH3
+
N
-
S
C
+
+
H
S
H
a. ¿Por qué es ácido este hidrógeno?
b. Proponga un mecanismo para la descarboxilación del ácido pirúvico (CH3COCO2H) mediante
tiamina. Se sabe que el intermedio final es la especie A.
H3C
A=
H3C
CH3
+
N
S
H3C
C
OH
H
La vitamina ácido lipoico es una coenzima en la conversión de A y CoA en acetil coenzima A.
indique de que manera el intermedio A puede justificar la formación de acetil coenzima A a partir del
piruvato inicial.
S
S
(CH2)4 CO 2H
55