Inmunodiagnóstico y serología Dr. Camilo Larrazabal Reyes Departamento de Ciencias Veterinarias y Salud Pública Facultad de recursos naturales Universidad Católica de Temuco Antígenos y anticuerpos Antígeno → Cualquier sustancia exógena que pueda unirse a receptores específicos de linfocitos y así desencadenar una respuesta inmune adaptativa. Hapteno → Molécula (normalmente de tamaño pequeño) no inmunogénica por si sola → pueden unirse a otras moléculas y ↑ antigenicidad. Tamaño Estabilidad Antigenicidad Complejidad “Foreignness” Antígenos y anticuerpos Anticuerpo → Inmunoglobulina sintetizada bajo la exposición a un antígeno, la que puede unirse específicamente a este. Reconocen un área específica del antígeno denominada epítope Todos los anticuerpos se originan desde los receptores de antígenos de linfocitos B (BCR) Tipos de anticuerpos: • IgM • IgG (esquema) • IgA • IgE • IgD Antígenos y anticuerpos Anticuerpo policlonal: • Anticuerpos aislados tras la inoculación sucesiva de un antígeno a un animal (ej. Conejo, ratón, cabra). • Estimulación del sistema inmune genera diferentes clones de linfocitos B (proceso de expansión clonal) → diferentes “formas” de anticuerpo con variable especificidad hacia el antígeno. • Anticuerpos policlonales tienen menor costo, y son menos específicos Anticuerpo monoclonal: • Anticuerpos aislados desde cultivo celular → mieloma (célula neoplásica productora de anticuerpos) fusionada con poblaciones de células plasmáticas (linfocitos B). • Clones seleccionados producen la misma “forma” de anticuerpo con especificidad similar hacia el antígeno. • Anticuerpos monoclonales tienen mayor costo y son mas específicos Antígenos y anticuerpos Anticuerpo policlonal (expansión clonal): Antígenos y anticuerpos Anticuerpo monoclonal: Introducción Respuestas inmunes pueden usarse de dos formas: • Uso de anticuerpos para detectar antígenos → determinar infecciones u otras moléculas reconocidas por anticuerpos. • Uso de antígenos para detectar anticuerpos → determinar exposición de un animal a una determinada infección y/o caracterizar el nivel de respuesta humoral/tiempo desde la exposición. Tipos de técnicas inmunodiagnosticas: • Pruebas de unión primaria (ej. ELISA) • Pruebas de unión secundaria (ej. Precipitación complemento, inhibición de hemaglutinación) en gel, • Pruebas in vivo (ej. Seroneutralización in vivo, anafilaxis cutánea) fijación Pruebas de unión primaria Se basan en permitir la unión de el antígeno con el anticuerpo y luego medir los complejos Ag-At Ejemplos importantes son: • Inmunofluorescencia • ELISA • Radioinmunoensayos • Westen blot • Inmunocromatografía Inmunofluorescencia • Se basa en el uso de anticuerpos conjugados a moléculas fluorescentes (ej. FITC). • Una vez unidos a un antígeno, puede observarse un marcaje fluorescente en un microscopio de epifluoresencia. • Se puede usar para determinar presencia de microrganismos en muestras de origen animal → M. avium subs paratuberculosis en heces, Virus de rabia en cerebros de animales infectados. • Permite caracterizar señales en una localización determinada. • Se puede determinar títulos de anticuerpo de forma indirecta mediante diluciones seriadas (IFAT). • IF directa vs IF indirecta. • Requiere equipos especializados (desventaja) Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia Directa Inmunofluorescencia Indirecta Inmunohistoquímica Técnica con principio similar a la inmunofluorescencia Permite la identificación de antígenos histológicos→ localización de la señal! (principalmente) Usos amplios→ desde diagnostico hasta investigación en cortes ELISA Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay Corresponde a una de las técnicas mas comunes y usadas para detectar y/o cuantificar anticuerpos específicos. Generalmente realizado en placa de 96 pocillos → múltiples muestras procesadas al mismo tiempo. Técnica presenta diferentes modificaciones: • ELISA Sandwich → permite detectar antígenos • ELISA competitivo → permite detectar haptenos o antígenos (mas rápido y sensible) → señal es inversamente proporcional a cantidad de antigeno Principio básico → anticuerpo secundario se encuentra unido a una enzima → adición de un cromógeno (sustancia de color) → cambio de color dependiente a la cantidad de enzima presente en el pocillo. ELISA ELISA ELISA Sandwich ELISA Competitivo Radioinmunoensayo Principio similar a ELISA → en lugar de enzima, se usa un radioisótopo → detección permite mucha mayor sensibilidad. Uso de Radioinmuno para detección de antígenos frecuentemente usado para la cuantificación de hormonas. Requiere uso de equipo especializado y personal entrenado. (competitivo)→ Inmunocromatografía • Técnica basada en interacción Ag-Ac, caracterizada por alta simpleza y rápida interpretación. • Se basa en la incorporación de antígenos que difunden de forma pasiva por una banda porosa, dejando una marca (azul o violeta) de fácil lectura. • Múltiples test disponibles en medicina veterinaria Inmunocromatografía Ejemplo inmunocromatografía → test Covid Western blot Técnica clásica de biología celular y molecular Permite la identificación y cuantificación de proteínas con alta sensibilidad analítica Su importancia diagnostica se basa en la identificación de antígenos de un peso molecular específico: • Antígenos generados para ELISA normalmente son aislados de patógenos in vitro → diferentes antígenos con diferentes implicancias diagnosticas • Separación de antígenos por peso molecular permite diferenciar antígenos mas relevantes para el diagnostico de una enfermedad Técnica relativamente compleja que requiere equipo especifico y personal mas calificado Western blot Western blot Ejemplo: detección de diferentes antígenos de N. caninum en sueros fetales bovinos Inmunodiagnóstico y serología Dr. Camilo Larrazabal Reyes Departamento de Ciencias Veterinarias y Salud Pública Facultad de recursos naturales Universidad Católica de Temuco
