i5. Interacción Ag

Pruebas de laboratorio para la determinación
de antígenos y anticuerpos.
ANTICUERPOS
MONOCLONALES
• KOHLER Y MILSTEIN 1975
• LB + CELULA MIELOMICA
• ANTICUERPOS CONTRA UN SOLO
DETERMINANTE ANTIGENICO
Las células de mieloma pierden la capacidad de sintetizar
nucleótidos
Hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa
Síntesis de novo
Hipoxantina
Guanina
Aminopterina
Análogo Ac fólico
Mieloma
pierden
HGPRT
Purinas
Nucleótidos
AMPLIFICACION DE HIBRIDOMAS
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Poblacion de anticuerpos con isotipo e idiotipo idéntico,
generados por un clon único
•Purificar moléculas
•Estudio de la estructura y diversidad de los anticuerpos
•Identificar antígenos: Definir subpoblaciones celulares
•Función celular: Detección de citocinas intracelulares
•Cuantificar: Células que expresan un antígeno o cantidad
de moléculas por célula
Este es un anticuerpo monoclonal o policlonal?
Especificidad
Capacidad de discriminar entre dos moléculas relacionadas,
el antígeno frente al cual está dirigido. ANTICUERPO
Reactividad cruzada
Capacidad de reaccionar con ligandos relacionados con el
Antígeno.
ANTICUERPOS CATALITICOS
Algunos acps tienen la capacidad de acelerar reacciones
enzimáticas porque al unirse a una molécula puede
disminuir la E necesaria para un cambio de estado.
ACPS BIESPECIFICOS Y BIFUNCIONALES
Redireccionar la actividad de las células citolíticas.
ANTICUERPOS HUMANIZADOS
Fusión de células humanas con mielomas animales o con cells
tumorales humanas. Combinación de regiones variables de
ratón con regiones ctes de humano.
APLICACIONES CLINICAS
• Eliminación de células T de MO antes de transplante (con C’)
• Anti-CD3 en pacientes con transplante de riñón como
tratamiento para reacciones de rechazo.
• En cancer para eliminación de células tumorales.
• Anti LPS para el tratamiento de sepsis.
• Anti IL-6 para TTo de mieloma múltiple
• Anti IgE para tto de alergia
• Anti TNFα para el to de artritis
• Anti VSR en niños
• Anti R- de IL-2 para la prevención del rechazo a los injertos.
• Anti idiotipo en linfoma B
Afinidad
Número de interacciones no covalentes en el sitio de interacción
entre el epítope y el idiotipo.
Avidez
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Poblacion de anticuerpos con isotipo e idiotipo idéntico,
generados por un clon único
•Purificar moléculas
•Estudio de la estructura y diversidad de los anticuerpos
•Identificar antígenos: Definir subpoblaciones celulares
•Función celular: Detección de citocinas intracelulares
•Cuantificar: Células que expresan un antígeno o cantidad
de moléculas por célula
Que es un conjugado?
Marcador que permite revelar la
reacción antígeno -anticuerpo
Ag
PRUEBAS DE INTERACCIÓN PRIMARIA:
Requieren un sistema de visualización
FLUOROCROMOS
FLUORESCENCIA
ENZIMAS
ELISA
RADIOISOTOPOS
RIA
PARTICULAS DE ORO
MICROSCOPIA
ELECTRONICA
¿Qué es un fluorocromo?
488 nm
HO
O
530 nm
CO2H
Luz
Incidente
Molécula de
Luz
Fluorescente
Emitida
Fluoresceína
• El fluorocromo absorbe la luz del láser
• El fluorocromo emite un rayo luminoso de diferente
longitud de onda
INMUNOFLUORESCENCIA
Utilizada para investigar la presencia y ubicación de
antígenos presentes en las células
IF DIRECTA
DETECCIÓN DE ANTÍGENO
Se busca detectar el antígeno
presente en la célula
IF INDIRECTA
DETECCIÓN DE ANTÍCUERPO
Se busca detectar el anticuerpo
específico para el antígeno
presente en la célula
Los lavados permiten la eliminación de anticuerpos que no reaccionan
Microscopio de fluorescencia
Citómetro de flujo
Microscopio confocal
Inmunoensayo ligado a enzimas
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
ELISA
Evans y Perlman en 1971
ELISA
LAVADOS
LAVADOS
Ag
LAVADOS
Ag
BLOQUEO
MUESTRA
• Sobrenadante de cultivos
– Libre de células
• Fluidos Biológicos
– Plasma, suero, orina, materia fecal, saliva,
lágrimas, líquido ascítico, LCF, etc.
– Libre de detritos
– Libre de contaminantes (hemoglobina)
CONSERVACIÓN, PROTEASAS
EXPRESIÓN Y ANÁLISIS DE
RESULTADOS
Absorbancia
• Determinar la concentración (µg/ml)
CURVAS DE CALIBRACIÓN
1.0
10
20 30 40 50 60 70
Concentración µg/ml
(patrón)
EXPRESIÓN Y ANÁLISIS DE
RESULTADOS
• Punto de corte
– Muestras de individuos sanos
– X+2S
Valor de absorbancia al PC=positivo
Absorbancia al PC= negativo
Abs + ó – el 10% del PC = repetir
• Unidades arbitrarias de absorbancia
• Diluciones
RESULTADOS ANTICIPADOS
Un ensayo de ELISA sandwich es generalmente la configuración
más sensible de la prueba de ELISA y se espera la detección de
antígenos proteicos con concentraciones entre:
100 pg/ml – 1 ng/ml
Las ELISAS que utilizan antígeno directamente unido a la
placa son generalmente un orden de magnitud menos
sensibles que las pruebas en sandwich.
PRUEBAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA
Visible macroscópicamente
PRECIPITACION: Requieren un soporte
1. Se realiza la determinación de IgM específica
por diferentes técnicas de ELISA y se encuentran
niveles superiores al punto de corte frente a Virus
de a Rubéola, antígenos de grupos sanguíneos,
virus de hepatitis A.
PREGUTA:
•
Que es el punto de corte en las pruebas
de ELISA y como se interpretan los resultados
para cada uno de los antígenos evaluados.
2. Se realiza la determinación de IgM e IgG específica para
Toxoplasma gondii y se encuentran los siguientes casos:
a. Niveles de IgM negativos y de IgG positivosb. Niveles
negativos de IgM cuantificados por
b. ELISA sándwich y positivos por ELISA de captura
c. Niveles de IgM positivos e IgG negativos
d. IgG positivo débil en la primera muestra, aumento de 4 veces e
título en la segunda muestra (15 días después de la primera)
PREGUNTAS:
• Cual es el significado en la clínica y en la respuesta inmune en
cada uno de los casos
• Como se explican los resultados divergentes en el punto b
• A que se refiere la seroconversión
3. En diferentes individuos se detectan niveles
altos de IgG frente al parásito trypanosoma
cruzi, el virus del SIDA, el hongo C. albicans y la
bacteria E. coli.
PREGUNTA: Que Significa este hallazgo en
cada uno de los casos
4. Se realizó la determinación de IgG específica al
virus de sarampión en niños nacidos de madres de la
era prevacunal en el año 1997 y posvacunal en el
año 2004. La edad de cuantificación en los niños fue
6, 9 y 12 meses de edad. Los resultados mostraron
menores niveles de IgG específica en los hijos de
madres de la era posvacunal e inclusive un alto
porcentaje de negatividad en los niños de 9 y 12
meses. Posterior a la vacunación de los niños
(recomendada al año de edad), se encontró una
buena seroconversión en todos os casos.
PREGUNTA: Que significan estos resultados y de
que forma podrían impactar la toma de decisiones en
salud púbica.