CytoJournal Editor ejecutivo: Coeditores en jefe: Vinod B. Shidham, MD, FIAC, FRCPath Richard DeMay, MD (Universidad de Chicago, Chicago, EE. UU.) Martha Pitman, MD (Escuela de Medicina de Harvard, Boston, EE. UU.) B. Shidham, MD, FIAC, FRCPath (Escuela de Medicina WSUS, Detroit, EE. UU.) Escuela de la Universidad Estatal de Wayne Vinod de Medicina, Detroit, MI, EE. UU. Para consultar el Consejo Editorial completo, visite: http://www.cytojournal.com/eb.pdf ACCESO ABIERTO PDF GRATIS para miembros (visite http://www.cytojournal.com/CFMember.asp) Formato HTML Artículos de metodología Establecimiento de un protocolo de tinción inmunocitoquímica y cromogénica. en el lugar hibridación de frotis citológicos pretintados Giemsa y Diff-Quick Elsa Beraki, Maestría, Thale Kristin Olsen, Stud.Med1, Torill Sauer, MD, PhD, FIAC * Dirección: Departamento de Patología, Hospital Universitario de Oslo Ulleval y Universidad de Oslo, Facultad de Medicina e Instituto de Medicina Clínica, 1Universidad de Oslo, Facultad de Medicina, Oslo, Noruega Correo electrónico: Beraki Elsa - [email protected] ; OlsenThale Kristin - [email protected] ; SauerTorill * - [email protected] * Autor correspondiente Publicado: 29 de marzo de 2012 Recibido: 03 de enero de 2012 CytoJournal 2012, 9:8 Aceptado: 22 de febrero de 2012 Este artículo está disponible en: http://www.cytojournal.com/content/9/1/8 © 2012 Beraki, et al .; licenciatario Cytopathology Foundation Inc. Este artículo puede citarse como: Beraki E, OlsenTK, SauerT. Establecimiento de un protocolo para la tinción inmunocitoquímica y la hibridación cromogénica in situ de frotis citológicos preteñidos de Giemsa y Diff-Quick. CytoJournal 2012; 9: 8. Disponible GRATIS en acceso abierto desde: http://www.cytojournal.com/text.asp?2012/9/1/8/94518 Resumen Fondo: Protocolos para tinción inmunocitoquímica (ICC) y en el lugar hibridación (ISH) de Diff-Quick secado al aire o May-Grünwald Los frotis teñidos con Giemsa (MGG) han sido difíciles de establecer. La creciente necesidad de poder utilizar portaobjetos preteñidos para ICC e ISH en casos específicos llevó a este estudio, con el objetivo de encontrar un protocolo sólido para ambos métodos.Materiales y métodos:El material consistió en frotis teñidos con MGG y Diff-Quick. Después del diagnóstico, se almacenaron uno o dos frotis de diagnóstico en el departamento. Para este estudio se utilizó cualquier frotis adicional que contenga material de diagnóstico; la mayoría fueron aspirados con aguja fina (FNAC) de la mama, que comprenden materiales de fibroadenomas, enfermedad fibroquística y carcinomas. Unas pocas fueron lesiones metastásicas (carcinomas y melanomas malignos). Hubo 64 frotis teñidos previamente, 10 frotis fueron teñidos con Diff-Quick y 54 fueron teñidos con MGG. Los anticuerpos usados para probar ICC fueron Ki-67, ER y PgR, CK MNF116 (pancitoqueratina) y cadherina E. Se usó HER-2 Dual SISH para probar ISH. Se probaron tampones de citrato, TRS y TE a pH6 y pH9 , así como diferentes tiempos de calentamiento, potencias de microondas y concentraciones de anticuerpos. El ICC se realizó en el DakoAutostainer (Dako ,Glostrup, Dinamarca) y HER-2 Dual SISH se realizó en la máquina Ventana XT (Ventana / Roche®, Estrasburgo, Francia). Resultados:Se obtuvieron resultados óptimos con el tampón TE a pH 9, tanto para ICC como para ISH. Las concentraciones de anticuerpos generalmente tenían que ser más altas que en la inmunohistoquímica (IHC). El tratamiento térmico óptimo con microondas incluyó una ebullición inicial de alta potencia seguida de una ebullición a baja potencia. No fue necesaria una postfijación para ICC, mientras que, 20 minutos después de la fijación en formalina (4%) fue necesaria para ISH.Conclusiones: El tratamiento térmico con microondas, con ebullición inicial a alta potencia seguida de ebullición a baja potencia y tampón ET a pH 9 fueron los pasos clave en el procedimiento. Las concentraciones de anticuerpos deben adaptarse para cada marcador ICC. La fijación posterior en formalina es necesaria para ISH. Palabras clave: Inmunocitoquímico, en el lugar hibridación, MGG, preteñido, Tris-EDTA INTRODUCCIÓN generalmente no requiere anestesia local en entornos superficiales. Un diagnóstico preliminar, "in situ" (ROSE = La investigación citológica es una primera opción valiosa en el evaluación rápida in situ), [1-6] es posible gracias a este método. diagnóstico de un tumor sospechoso, prácticamente en cualquier parte del cuerpo. La FNAC es un procedimiento rápido, simple y económico que Existe una demanda creciente de diagnósticos más específicos, 1 http://www.cytojournal.com/content/9/1/8 CytoJournal 2012, 9: 8 y un diagnóstico de "células malignas" o "carcinoma" en muchos casos no es suficiente para determinar el tratamiento primario óptimo del paciente. Por lo tanto, sigue una necesidad creciente de subtipificación de tumores y de análisis de marcadores pronósticos, predictivos y terapéuticos, antes de la eventual cirugía o quimioterapia preoperatoria. Tanto la inmunocitoquímica (ICC) como en el lugar La hibridación (ISH) se realiza cada vez más en sabíamos que las células tumorales deberían ser positivas. Las preparaciones citológicas, tanto en frotis directos, bloques celulares y preparaciones líquidas. [7-13] En las instituciones más grandes, es común que los citopatólogos o citotecnólogos asistan cuando se toman muestras de una lesión sospechosa con fines de diagnóstico. Entonces se puede obtener material adicional para ICC o ISH cuando sea necesario. Por una variedad de razones, el personal del Departamento de Patología puede no estar presente y los laboratorios reciben frotis sin fijar fijados con alcohol o secados al aire para el diagnóstico. Todos los frotis recibidos generalmente se tiñen para un estudio de diagnóstico anticuerpos. La sonda HER-2 Dual SISH se volvió a probar dos veces. primario. Por lo general, es posible utilizar materiales teñidos con ICCon Papanicolaou. [14-17] Sin embargo, ha resultado bastante difícil hacer ICC en May Grunwaald Giemsa (MGG) o Diff-Quick frotis teñidos. Recientemente, un artículo de Choiet al. [18] ha descrito un protocolo para la tinción Ki-67 en frotis teñidos con Diff-Quick de tumores de mama en perros. El objetivo de este estudio es desarrollar un protocolo sólido para ICC e ISH, que podría funcionar en frotis teñidos con MGG y DiffQuick secados al aire. una pancitoqueratina (CKMNF116, Dako , Glostrup, Dinamarca) para MATERIALES Y MÉTODOS El material consistió en frotis directos teñidos con MGG y DiffQuick. Después del diagnóstico, se almacenaron uno o dos frotis de diagnóstico en el departamento y se utilizó para este estudio cualquier frotis adicional que contenga material de diagnóstico. La gran mayoría fueron aspirados con aguja fina (FNAC) de la mama, que comprenden materiales de fibroadenomas, enfermedad fibroquística y carcinomas. Algunas eran lesiones metastásicas (carcinomas y melanomas malignos). Hubo 64 frotis preteñidos, 10 de ellos fueron teñidos con Diff-Quick y 54 fueron MGG. El material primario se recogió de forma consecutiva durante dos meses. Se eligieron diapositivas de diagnóstico adjuntas de los casos para simular el entorno en el que se utilizaría este método. Los portaobjetos solo se usaron una vez y no se realizó la tinción posterior en los portaobjetos de prueba negativos. Los frotis y los anticuerpos se emparejaron de acuerdo con la morfología, diagnóstico citológico y (eventualmente también) histológico. Al hacerlo, Acceda a este artículo en línea Código de Respuesta Rápida: Sitio web: www.cytojournal.com tinciones de prueba ICC negativas seper se falso negativo. Las células no epiteliales (linfocitos y células estromales) sirvieron como controles negativos internos para todos los marcadores excepto Ki-67. No se utilizaron controles positivos y negativos separados, pero son esenciales en un entorno de diagnóstico. Se volvió a probar el procedimiento óptimo para los cinco Además, el procedimiento ICC se probó dos veces en nuestro laboratorio de citología de rutina ICC. Estos últimos frotis (n = 10 carcinomas de mama) se recolectaron tres meses después de la misma manera que se indicó anteriormente. Los anticuerpos utilizados para probar ICC fueron Ki-67 (Dako , Glostrup, Dinamarca), ER (Laboratorios Novocastra , Newcastle, Reino Unido) y PgR (Novocastra Laboratories , Newcastle, Reino Unido), como representantes de epítopos nucleares, marcadores intracitoplasmáticos y E-cadherina (Dako , Glostrup, Dinamarca) como representante de un epítopo de membrana citoplasmática. Se utilizó HER-2 Dual SISH (Ventana INFORM HER2 Dual Color ISH, Roche®, Estrasburgo, Francia) para probar ISH. Se probaron diferentes tipos de tampones (Citrato, TE, TRS) y pH (6 vs 9), así como diferentes tiempos de calentamiento y potencias de microondas, así como la concentración de los anticuerpos. Los frotis se pusieron en xileno para quitar los cubreobjetos. La rehidratación se realizó utilizando etanol al 100, 96 y 70%. Se utilizó formalina para la fijación posterior al probar la ISH. No se utilizó fijación posterior para ICC. El ICC se realizó en el Dako Autostainer (Dako , Glostrup, Dinamarca) y HER-2 Dual SISH se realizó en la máquina Ventana XT (Ventana / Roche®, Estrasburgo, Francia). RESULTADOS Se observó algo de extracción de la mancha de los portaobjetos durante la rehidratación, visto como una decoloración azul claro del frasco que contenía etanol al 70%. Los detalles de los resultados de ICC se muestran en la Tabla 1. Hervir los portaobjetos teñidos con Ki-67 en tampón citrato en MW durante 2 × 5 minutos a alta potencia et al.), funcionó, pero fue subóptimo. Para los otros marcadores nucleares (ER y PgR) este protocolo no tuvo éxito. Probamos el mismo tampón con diferentes tiempos de ebullición y potencias de microondas para todos los demás anticuerpos. No hubo decoloración y el ICC fue negativo. El tampón TRS (pH 6.0) fue probado para diferentes tiempos de ebullición y potencias de microondas, con resultados negativos. Los tampones de citrato y TRS se utilizan para algunos anticuerpos primarios enRecuperación de epitop inducida por calor (HIER) DOI: pretratamiento, pero no fueron adecuados en nuestras pruebas. Ambos búferes 10.4103 / 1742-6413.94518 tienen un APH de 6. El búfer TE configurado a una potencia de microondas alta durante solo 2,5 minutos y luego a una potencia inferior 2 http://www.cytojournal.com/content/9/1/8 CytoJournal 2012, 9: 8 Tabla 1: Detalles de las diferentes variables probadas para ICC Preteñido Buffer pH Microondas de calor Anticuerpo Giemsa Citrato 6.0 2 x 5 minutos 750W Ki-67 1: 200 + Giemsa ---- -- ------ Ki-67 1: 100 + Diferenciar rápido ---- - // - ------ Ki-67 1: 100 + Giemsa TE 9.0 2 x 5 minutos 750W Ki-67 1: 100 _ Giemsa TE 9.0 3 minutos 750 W + 7 minutos 160 W 2 Ki-67 1: 100 +++ Giemsa Citrato 6.0 x 5 minutos 750 W ER 1: 100 _ Giemsa Citrato 6.0 2 x 5 minutos 750W 2 ER 1: 200 _ Giemsa TE 9.0 x 5 minutos 750W ER 1: 200 _ Giemsa TE 9.0 2,5 minutos 750 W + 6 minutos 160 W 3 ER 1: 100 +++ Diferenciar rápido TE 9.0 minutos 750 W + 7 minutos 160 W 2 x 5 ER 1: 100 +++ Giemsa Citrato 6.0 minutos 750 W PgR 1: 200 _ Giemsa ------ - // - - - - - // / ---- PgR 1: 100 _ Giemsa TE 9.0 2 x 5 minutos 750W PgR 1: 100 _ Giemsa TE 9.0 2,5 minutos 750 W + 6 minutos 160 3 PgR 1: 100 +++ Diferenciar rápido TE 9.0 minutos 750 W + 7 minutos 160 2 x 5 PgR 1: 100 +++ Giemsa Citrato 6.0 minutos 750 W E-cadherina 1:50 Giemsa - - - // --- - // - 2 x 5 minutos 750W E-cadherina 1:30 _ Giemsa TE 9.0 2,5 minutos 750 W + 6 minutos 160 W 2 E-cadherina 1:30 +++ Giemsa Citrato 6.0 x 5 minutos 750 W MNF 1: 800 _ Giemsa ------ -- 5 minutos 750W MNF 1: 800 _ Giemsa - - - // --- -- - - - // --- MNF 1: 400 _ Giemsa TE 3 minutos 750W + 7 minutos 160 MNF 1: 800 _ Giemsa - - - // --- - - - // --- MNF 1: 600 _ Giemsa ------ 2 minutos 750W + 6 minutos 160 MNF 1: 600 _ Giemsa TE 9 2,5 minutos 750 W + 6 minutos 160 3 MNF 1: 200 _ Giemsa TRS 6 minutos 750 W + 7 minutos 160 MNF 1: 100 + Giemsa TE 9 2,5 minutos 750 W + 6 minutos 160 2 MNF 1: 100 +++ Giemsa TE 9 minutos 750 W + 6 minutos 160 MNF 1: 100 +++ 9.0 -- // - mantenerlo hirviendo durante seis minutos fue eficaz para la decoloración y el pretratamiento de los tres marcadores nucleares. Resultados de ICC _ dio resultados negativos para ER y PgR y positividad débil para Ki-67. Lo mismo sucedió con el marcador intracitoplasmático Cytokeratin MNF116 y el marcador de membrana E-Cadherin. Cuando se probó Para todos los marcadores ICC tuvimos que aumentar la en un laboratorio de rutina con un horno de microondas diferente, concentración de anticuerpos en comparación con la concentración fueron necesarios tres minutos y medio seguidos de siete minutos a utilizada en la práctica habitual de ICC y / o inmunohistoquímica baja potencia para obtener resultados equivalentes. El protocolo (IHC). La concentración de CytokeratinMNF116 resultó ser resultó ser igual para los epítopos en los tres compartimentos notablemente mayor, mientras que los otros anticuerpos celulares (nuclear, citoplasmático y membranico) y se muestra en la necesitaban una concentración algo mayor. Tabla 2. Los resultados de ICC para todos los anticuerpos analizados mostraron una tinción específica buena y fácilmente interpretable [Figuras 1-5]. Casi no hubo tinción de fondo. En algunos casos, la tinción de fondo se interpretó como una tinción del contenido citoplásmico de las células alteradas (citoqueratina MNF116 y Ecadherina) y, por tanto, probablemente como "específica". El mismo tampón TE, a solo una potencia alta de 750 W, durante un tiempo prolongado (2 × 5 minutos) de tratamiento con microondas Los resultados de la prueba para HER-2 Dual SISH se muestran en la Tabla 3. Los números de señal y el estado de HER-2 fueron idénticos a los resultados del examen histológico de rutina. La mejor intensidad de señal de las tinciones roja y plateada se obtuvo 20 minutos después de la fijación en formalina y tampón TE, con pH 9 [Figura 6]. Los pasos de hibridación específicos no se cambiaron. Aquí también, los detalles del tratamiento con microondas deben optimizarse localmente. 3 http://www.cytojournal.com/content/9/1/8 CytoJournal 2012, 9: 8 Tabla 2: Protocolo para ICC en frotis secados al aire, Diff-Quick o teñidos con MGG 1. Rehidratación Xylen: hasta cubreobjetos Etanol al 100% Etanol al 100% Etanol al 96% 70% de etanol Lave los portaobjetos en de diapositivas Tiempo caídas 2 minutos 2 minutos 2 minutos 2 minutos agua destilada Microonda* Enfriar los portaobjetos a Lavado de TBS temperatura ambiente durante 15 minutos. tampón 3 +/- 24 horas. 2. Pretratamiento Coloque diapositivas en tarro que contiene tampón TE 3. Inmunocito- química (ICC) 2,5 - 3,5 minutos a 750W + 6 - 7 minutos 160W Bloquear endógeno Las diapositivas están listas para peroxidasa para ICC minutos 20 minutos El resto del procedimiento es el mismo que el ICC que se realiza habitualmente en el laboratorio, * debe optimizarse en cada laboratorio Figura 1: Tinción con cadherina E de células de carcinoma ductal de mama (aumento, x400) Figura 2: Tinción con citoqueratina MNF116 (pancitoqueratina) de células Figura 3: ER positivo, células ductales benignas (aumento, x400) Figura 4: Células ductales benignas, positivas para PgR (aumento, x400) DISCUSIÓN Los métodos de Romanowsky-Giemsa involucran mezclas de apocrinas benignas de enfermedad fibroquística (aumento, x400) colorantes ácidos y básicos. Según la ley de Coulomb, surgen fuerzas Nuestro objetivo era descubrir cómo manipular o descomponer las eléctricas entre estas tinciones iónicas y los constituyentes celulares. fuerzas de atracción de las células de tinción creadas por las afinidades (PO 4- , COO -, NH + 3) de cargas eléctricas opuestas. ENTONCES - , 4 de las células de tinción de MGG y Diff-Quick. Los orígenes de la afinidad Tinción de frotis teñidos con PAP en una solución que contiene de las células de tinción (la tendencia de una tinción a pasar de la solución de tinción a la célula) hacen posible que las células se tiñen. Tinciones HCL, etanol y H2Owith la recuperación de antígenos es eficaz. La tinción de Romanowsky-Giemsa implica una mayor citológicas como Papanicolaou (PAP) y química complicada y también lo hace la decoloración. Primero, 4 http://www.cytojournal.com/content/9/1/8 CytoJournal 2012, 9: 8 Tabla 3: Detalles de las variables probadas para Dual SISH HER-2 Conservado Giemsa Buffer pH - Citrato 6 HM - - - - // ---- Backgr. tinción - Fijación Microondas de calor * (HM) 2 minutos 750 W + 6 minutos 160 Probe Her-2 D. Resultados de la SISH TE 9 HM -------- Backgr. tinción Giemsa Formalina 20 minutos Citrato 6 - -------- Pocas señales rojas Giemsa Formalina 20 minutos TE 9 - -------- Pocas señales Giemsa Formalina 20 minutos Citrato 6 HM -------- Más de sig roja. Óptimo Giemsa Formalina 20 minutos TE 9 HM - - - - // ---- Diferenciar rápido para ambas señales * debe optimizarse en cada laboratorio Figura 5: Núcleos positivos para Ki-67 de carcinoma ductal de mama (aumento, x400) el colorante catiónico (derivado del azul de metileno Azure B) y el colorante aniónico (Eosina Y) están en la misma solución. En segundo lugar, se cree que la tinción púrpura (metacromática) de los núcleos se debe a la formación de una atracción de tinción-tinción del derivado del azul de metileno Azure B y el complejo de eosina Y a la cromatina celular. [19,20] Se evidenció algo de decoloración durante el último paso de rehidratación (etanol al 70%). Esto puede respaldar la teoría de que el agua es ligeramente básica y, por lo tanto, extrae el colorante ácido (anión). También puede ser que las células se hinchen y los tintes se agreguen más en solución acuosa que en Figura 6: SISH doble HER-2 de carcinoma de mama metastásico. Las células tumorales se amplifican con grandes grupos de señales de plata HER-2 y 2 señales (rojas) del cromosoma 17 (CEP17). Un linfocito revela dos señales tanto de laSU-2 genes y CEP17 (aumento, x400) para agregarse en soluciones acuosas saladas, y esto podría conducir a una reactividad reducida. [22,23] Otros posibles factores que contribuyeron a la agregación del tinte podrían incluir las propiedades ácido-base, las interacciones hidrofóbicas, la posible interferencia de la formación de complejos metálicos, las fuerzas de van der Waals y los efectos de la entropía. Hay dos características que hacen del ácido alcohol puro. etilendiaminotetraacético (EDTA) un agente enmascarante. Como puede verse en la Tabla 1, el tipo de tampón de calentamiento mayoría de los iones metálicos. Su capacidad complejante y su pH tuvieron un efecto significativo en la decoloración del Forma complejos de quelatos estables, solubles en agua, con la depende del pH y el EDTA es un ligando fuerte a un pH alto. [24] portaobjetos y en la interacción adicional antígeno-anticuerpo en el Según Wittekind, [25] El azur B y la eosina están asociados en ICC. Hervir los portaobjetos en un horno microondas con tampón parte, debido a sus efectos hidrofóbicos, que pueden explicar la Tris-EDTA (tampón TE), pH 9,0, dio una retinción satisfactoria de ICC labilidad del complejo cuando se expone a solventes, que e ISH. El TE-buffer tiene tres ventajas. En primer lugar, podríamos alteran la estructura del agua o eliminan el agua por completo. [ suponer que el pH alto (superior a 6,5 en la tinción MGG) y el alto 25-27] contenido de sal de este tampón debilitan los enlaces de tinción. Los del EDTA puede reemplazar las moléculas de agua. En el caso de la tinción MGG o Diff-Quick, el efecto quelante iones negativos y positivos en el tampón podrían competir con las respectivas moléculas de colorante con carga negativa y positiva El tercer problema es el calentamiento por microondas. Cuanto mayor sea la para unirse a los componentes celulares. Las moléculas de colorante energía suministrada al sistema, es decir, cuanto mayor sea la temperatura, pueden ser expulsadas total o parcialmente y perder su sitio de más débil será la fuerza de unión. El tampón TE de pH 9,0 es el tampón de unión con los componentes celulares (PO4-, SO4-, COO-, NH3 +). [21] recuperación de antígeno de elección para muchos anticuerpos primarios que Se sabe que los tintes tienen tendencia requieren tratamiento previo. Determinación de la 5 http://www.cytojournal.com/content/9/1/8 CytoJournal 2012, 9: 8 Se ha realizado un tipo de tampón con un tiempo de ebullición y potencia de microondas respectivos después de pruebas comparativas con diferentes variables. El tampón TE pH 9,0 con un tiempo de ebullición corto (2,5 minutos) a alta potencia (750 W), con ebullición adicional a una potencia menor (160 W), durante seis minutos, dio una buena tinción ICC positiva y señales claras de ISH. Diferentes hornos de microondas pueden El autor ha participado suficientemente en el estudio y asume la responsabilidad pública de las partes apropiadas del contenido de este artículo. DECLARACIÓN COMPETENTE DE INTERÉS DE LOS FADRES requerir modificaciones a esto. No hay ningún interés en competencia que declarar por parte de ninguno de los autores. Las concentraciones de anticuerpos fueron generalmente más altas que en nuestros procedimientos de rutina y deben establecerse para cada anticuerpo utilizado. Los resultados positivos de ICC fueron DECLARACIÓN DE AUTORÍA DE TODOS LOS AUTORES confiables en cuanto a ser positivos o negativos, pero la intensidad de la tinción fue generalmente menor. El porcentaje de núcleos Elsa Beraki ha diseñado los protocolos para las pruebas y sus modificaciones, positivos fue menor que en las muestras de rutina y no se pueden ha realizado la búsqueda bibliográfica y la mayor parte de la redacción usar valores de corte conocidos / establecidos para Ki-67, ER o PgR. principal del manuscrito. Thale Kristin Olsen hizo el trabajo práctico, la Se debe tener cuidado con los resultados falsos positivos. Cuando el título de anticuerpos es muy alto, la inflamación excesiva en el fondo, la necrosis marcada y las células trituradas y degeneradas pueden causar una tinción falsa positiva. Siempre se deben aplicar controles positivos y negativos adecuados en un entorno de diagnóstico. En este estudio nos hemos centrado en establecer un protocolo de tinción en los casos en los que sabíamos que las células tumorales deberían ser positivas y, por tanto, eran sus propios controles positivos. Las células internas no epiteliales, como los linfocitos y las células estromales, sirvieron como control negativo. Dependiendo de la disponibilidad de material fresco, sería factible hacer frotis, teñir con Diff-Quick o Giemsa y usarlos como controles positivos y negativos. Otra alternativa es almacenar portaobjetos de diagnóstico con inmunoperfiles búsqueda bibliográfica y la mayor parte de la introducción del manuscrito. Torill Sauer fue el investigador principal responsable por la idea y por la versión enviada del manuscrito. DECLARACIÓN DE ÉTICA DE LOS AUTORES Este estudio se realizó con la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional (IRB) (o su equivalente) de todas las instituciones asociadas a este estudio, según corresponda. Los autores asumen la responsabilidad de mantener la documentación relevante en este respeto. REFERENCIAS 1. región de la cabeza y el cuello. 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DECLARACIÓN EDITORIAL / DE REVISIÓN POR PARES Para asegurar la integridad y la más alta calidad de las publicaciones de CytoJournal, el proceso de revisión de este manuscrito se llevó a cabo bajo un modelo doble ciego (los autores son cegados para los revisores y viceversa) a través del sistema automático en línea. 18. Choi US, Kim DY. Detección inmunocitoquímica de Ki-67 en frotis citológicos teñidos con Diff-Quik de tumores de glándulas mamarias caninas. Citopatología 2011; 22: 115-20. 19. Horobin RW, Walter KJ. Comprensión de la tinción de Romanowsky. I: El efecto Romanowsky-Giemsa en frotis de sangre. Histoquímica 1987; 86: 331-6. 20. Tuite EK, Kelly JM. La interacción del azul de metileno, el azul B y la tionina con el ADN: Formación de complejos con polinucleótidos y mononucleótidos como sistemas modelo. Biopolymers 1995; 35: 419-33. 21. Horobin RW, Bennion PJ. La interrelación del tamaño y la sustantividad de los El primero Acceso abierto revista de citopatología Publicar en CytoJournal y CONSERVAR tu derechos de autor para su propiedad intelectual Conviértase en miembro de la Fundación de citopatología para obtener todos los beneficios La cuota anual de membresía es de 50 dólares estadounidenses (1000 dólares de por vida) En caso de dificultades económicas es gratis Para obtener más información, visite http://www.cytojournal.com/CFMember.asp tintes; el papel de las atracciones de van derWaals y los enlaces hidrofóbicos en PubMed indexado la tinción biológica. Histochemie 1973; 33: 191-204. LIBRE Mundial procesamiento en línea de acceso abierto con un tiempo de respuesta rápido. 22. Bennion PJ, Horobin RW. Algunos efectos de las sales sobre la tinción: uso del equilibrio de Donnan para describir la tinción de secciones de tejido con tintes ácidos y básicos. Histoquímica 1974; 39: 71-82. 23. Coates, E. 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