UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA Centro Universitario de la Ciénega Práctica No. 4: “Separación de aminoácidos por cromatografía” Bioquímica ll, impartida por: Peter Knauth Alumna: Milagros Esmeralda García Lara Licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo Fecha en la que se realizó la práctica: 10 de Abril del 2019. Fecha de entrega del protocolo: 30 de Abril del 2019. Separación de aminoácidos por cromatografía Objetivo Separar los aminoácidos por cromatografía en capa fina con el fin de identificar estos aminoácidos en una mezcla y además conocer el principio de la técnica y sus aplicaciones. Introducción A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura de las proteínas. El uso de la cromatografía es adecuada para averiguar los diferentes aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo) La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla. En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). De todos los métodos, el más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos formando un compuesto de color purpura, a excepción de la prolina que da un color amarillo. Material Material Tubos capilares Vidrio de reloj Vaso de precipitado de 600 ml Equipos Agitador magnético con placa de calentamiento Reactivos Ninnhidrina al 1% en etanol (70%) Fase móvil: Butanol-ácido acético glacial- agua destilada [8:1:1] 5 muestras de aminoácidos conocidos 6 muestras desconocidas Fase estacionaria Placa de silica-gel Cantidad 6 1 1 1 20 ml 3 ml 1 ml c/una 1 ml c/una 1 Procedimiento Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina Vaciar al vaso de precipitado ~ 0,5 cm de fase móvil y taparla por 20 minutos con el vidrio de reloj Señalar suavemente con un lápiz de grafito No. 2 en la placa de silica-gel una línea recta a 1 cm de distancia del eje de las ordenadas. ¿Toco la placa con las manos descubiertas? No Ubicar 6 puntos de descarga sobre la línea trazada distribuyéndolos de tal manera que no estén muy cercanos entre ellos. Identificar los puntos de descarga con un símbolo para identificar a la muestra. 1=V, 2=R, 3=G, 4=D, 5=A, 6=Muestra. (Fig. 1) Aplicar con un tubo capilar gotas en cada punto correspondiente de los estándares y la muestra, y dejar secar. (Fig. 2) Contaminación de la placa Si Colocar la placa de silica-gel en el vaso de precipitado con la fase móvil. (Fig. 3) Dejar que corra la fase móvil hasta que llegue 1 cm antes del fin de la placa y dejar secar. Sacar la placa de silica-gel y marcar rápidamente con el lápiz hasta donde llego la fase mocil en la placa y dejar secar dentro de la campana de extracción. (Fig. 4) Rociar la placa de silica-gel con ninhidrina al 1% en la campana de extracción tomando las precauciones necesarias. (Fig. 5) Dejar secar y colocarla sobre la placa caliente del agitador magnético hasta observar la presencia de las coloraciones. (Fig. 6) Retirar con unas pinzas para crisol y dejar enfriar. Imágenes Fig. 1-Identificacion con símbolo de los puntos de descarga. Fig. 3-Placa de silica-gel en el vaso de precipitado. Fig. 2-Aplicación de las gotas con los tubos capilares Fig. 4- Marca con lápiz de la fase móvil. Fig. 6- Secado de la placa de silicagel en el agitador magnético. Fig. 5-Rociado con ninhidrina al 1% sobre la placa. Resultados Los posibles aminoácidos presentes en la muestra son: 2 (R) y 5 (A). De modo que la sustancia desconocida contiene los aminoácidos arginina y alanina, debido a que en el punto 6 (muestra) en la forma de separación se observan dos coloraciones en distintas posiciones similar a las que presentan el punto 2 y el 5. Factor de retención (𝑹𝒇 ) 𝑹𝒇 (1) = 2,8 = 0,31 9 𝑹𝒇 (2) = 0 9 =0 𝑹𝒇 (3) = No es posible su determinación debido a que se combinó con el aminoácido 4 al momento de aplicarlo. 𝑹𝒇 (4) = No es posible su determinación debido a que se combinó con el aminoácido 3 al momento de aplicarlo. 𝑹𝒇 (5) = Símbolo en la placa 1 2 3 4 5 6 Aminoácido Valina Arginina Glicina Aspartato Alanina MUESTRA Código de tres letras Val Arg Gly Asp Ala MUESTRA 1,5 9 = 0,166 Código de una letra V R G D A MUESTRA Discusión La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta. Así mismo la distribución que obtienen los aminoácidos en la placa de silica gel se debe a la interacción que tengan con el solvente, los aminoácidos apolares son los que mejor interaccionan y pueden ser arrastrados por este, tal es el caso de la valina y la alanina. Cuestionario 1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C], estado físico a 25 °C y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados. Reactivo Peso molecular (g/mol) Temperatura de ebullición (°C) Temperatura de fusión (°C) Estado físico a 25 °C Ninhidrina 178,04 NA 241,11 Solido Etanol 33,997 78,5 -114,1 Liquido Solubilidad NA Soluble en agua, éter y cloroformo Para la preparación de la ninhidrina al 1%, se coloca 1 gramo de este reactivo en un matraz aforado de 100 ml y se afora con etanol. 2. ¿Cuál es la diferencia entre los principios de separación: adsorción, intercambio iónico, exclusión y afinidad? En el caso de la adsorción el fenómeno tiene lugar sobre la superficie del sólido donde la mayor parte del soluto queda retenido. En el intercambio iónico el material tiene la propiedad de tomar partículas cargadas (iones positivos o negativos) que quedan retenidas y fijadas ya no como lo que ocurre con al adsorción en la superficie, sino en el interior. La adsorción ocurre preferentemente en la superficie, mientras que en el intercambio iónico, se produce sobre ciertas regiones preferenciales. Respecto a la afinidad sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva a un ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con la fase móvil. En la exclusión la muestra no interacciona químicamente con la fase estacionaria, ni con la fase móvil. 3. Esquematice los tipos de cromatografía de forma detallada Bibliografía Asociación escuela de estudiantes de ingeniería química. (2001). Termodinámica química. Colombia: RECITEIA. Luisot P (1982). “Bioquímica Estructural”, 2ª Ed. Editorial AC. Smith I, Feinberg JG (1965) “Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis”. Shandon Scientific Company Ltd. Hoja de seguridad de la ninhidrina Hoja de la seguridad del etanol M.C. Gutiérrez-Bouzán, A. Burdó, J. CegarraI. (2009). LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN: ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DE PESOS MOLECULARES EN SILICONAS POR GPC . -, de Boletin intexter Sitio web: https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099/13132/LA%20CROMATOGRAF%C3% 8DA%20DE%20EXCLUSI%C3%93N,%20AN%C3%81LISIS%20DE%20LA%20DISTRIBUCI%C3% 93N%20DE%20PESOS.pdf
