Determinacion cuantitativa de aminoácidos

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS
POR EL METODO DE LA NINHIDRINA
REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS.
Los aminoácidos participan en muchas reacciones en las cuales intervienen las funciones − amino, carboxilo
y los diversos grupos R. La revisión de todos estos tipos se encuentran fuera de los objetivos de un curso de
unas cuantas reacciones importantes:
DETECCION Y MEDICIÓN CUANTITATIVA.
La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de
aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la
determinación de aminoácidos. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuantra entre 4 y 8,
dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de
Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la
coloración original del aminoácido.
La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificación de todos los
aminoácidos primarios se evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de 540 nm.
Aminoácidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos; estos son amarillos t
tienen su máxima absorción a 440 nm. El cálculo de la concentración se basa en la relación de
Beer−Lambert.
El orto−ftaldehído (OPA, del ingles orto−ptaldehyde, también llamado fluoraldehído) es un nuevo reactivo
de revelado, más sensible, con el cual puede detectarse concentraciones de aminoácidos de orden de
picomoles (10E−12) a femtomoles (10E−15). Esta enorme diferencia en sensibilidad se debe a la productos
intensamente fluorescentes. Después de la reacción, la exposición a una radiación de 360 provoca una
emisión fluorescente a 445 nm, cuya intensidad se relaciona con la concentración del aminoácido. Esta
reacción ocurre con rapidez si se trata de aminoácidos primarios, pero no cuando son secundarios. No
obstante, la prolina puede detectarse oxidándola primero a una amina primaria.
Los derivados de la feniltiohidatoina que absorbe la luz ultravioleta, los derivados fluorescentes del densilo y
los derivados amarillos del dinitrofenilo son útiles no son solo para la detección cuantitativa de aminoácidos,
sino también para su identificación.
METODOS PARA DETERMINAR CUANTITATIVAMENTE A LOS AMINOACIDOS.
Hay diferentes métodos para determinar cuantitativamnete a los aminoácidos como lo son, las
cromatografias, electroforesis y otros métodos en el que participan tanto las cromatografias como reacciones
con dinitrofluorobenceno y fenilisotiocianato.
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
El cambio ionico sucede cuando los constituyentes ionicos de la manera se retienen selectivamente por
intercambio con sus iones sustituibles del empaque. Este fenomeno de iones puede definir como que posee
grupos ionicos fijos y grupos ionicos móviles. Estos últimos pueden ser sustituidos por otros, bajo
condiciones especificas.
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La cromatográfia de intercambio ionico consiste en intercambiar iones de la fase estacionaria, la cual es un
polímero con iones lábiles (cationes o aniones) de estructura porosa, insolubles, pero capaz de aumentar su
volumen al ser humedecidos.
CROMATOGRAFÍA CUANTITATIVA DE CAPA FINA
Existen varios métodos para medir la cantidad de un componente individual en una mancha. Un método
general es raspar el absorbente que rodea a cada mancha con una navaja o puede limpiarse con agua,
proceder a analizar el constituyente de la muestra por algún método espectrofométrico o colorimétrico.
También es posible usar un método microanalítico, como una microtitulación.
El segundo método consiste en analizar directamente el compuesto sobre la placa. Suele utilizarse un aparato
llamado densitómetro. Si el compuesto es fluorescente, puede utilizarse un tipo de fluorómetro para medir la
cantidad de fluorescencia que emite la mancha.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL.
Esta técnica se basa en el principio de que un compuesto se reparte o distribuye entre dos fases líquidas. En
un ambiente que contiene vapor de agua, el papel de cromatografía absorbe una cantidad de agua que
mantiene entre las fibras de la celulosa del papel. Esta agua se considera como uno de los disolventes y
constituye la fase estacionaria. Si se permite que un que un disolvente no acuoso ( la fase móvil) se traslade
por el papel impulsada por la acción capilar, tan pronto como el disolvente alcance a cualesquiera moléculas
de soluto en el papel, están se distribuirán entre las dos fases en una proporción característica de sus
coeficientes de reparto. Cuanto más soluble sea un soluto en la fase movil, tanto más se trasladara el
compuesto por el papel en la dirección del flujo del disolvente y viceversa
Podemos citar como ejemplo del procedimiento de cromatografía en papel la separación de aminoácidos en
fracciones por cromatografía descendente en papel Whatman No. 1, empleando la elución fenol saturado con
agua. Los aminoácido aparecen como manchas coloridas después de revelar el cromatograma rociándolo
con reactivo de ninhidrina.
Se desconoce con certera el mecanismo de la cromotagrafía en papel. Es probable que los constituyentes de
la muestra probablemente sean retenidos por el papel a causa de su solubilidad en el agua que el papel
absorbe, o por absorción de los propios constituyentes de la muestra o por una combinación de ambos.
REACCION CON DINITROFLUOROBENCENO.
Es una reacción que se usa para la medición y detección cuantitativa de los aminoácidos, la principal
aplicación sé encuantra en la determinación del residuo N−terminal de cadenas peptidicas.
El complejo formado es el dinitrofenil derivado (DNP) de color amarillo; cromatografía en papel o en capa
fina de un DNP− aminoácido desconocido contra estándares conocidos de DNP aminoácidos proporciona la
base para identificar al conocido.
REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.
Se le conoce también como reacción de Edman; se utiliza para la identificación de aminoácidos con la
aplicación principal de determinar la secuencia de cadenas peptídicas desde el extremo N−terminal.
REACCION CON FLUORESCAMINA.
Este es un reactivo aún más sensible para la determinación cuantitativa de aminoácidos, ya que puede
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detectar nanogramos de aminoácido, al igual que la ninhidrina, la fluorescamina forma un complejo con
aminas de otros compuestos además de aminoácidos.
METODOLOGIA DE LA PRACTICA.
Para preparar el reactivo de ninhidrina se disuelven 400 mg de cloruro estanoso en 250 ml de amortiguador
de citrato de 0.2 M ph de 5 (4.3 gr de ácido cítrico más 8.7 gr de citrato trisodico en 250 ml, se ajusta a pH 5
con NaOH o HCl). Se añade esta solución a 250 ml de metilén celosolve ( etilen glicol monometil éter), en los
que se ha disuelto previamente 10 gr de ninhidrina.
Después de añadir ninhidrina, se agita y se coloca en un baño de agua hirviendo durante de 20 minutos.
Terminado el calentamiento, se enfría en otro baño de agua y se añade 8 ml de n−propanol al 50 %. Se
vuelven a aguitar los tubos, y se deja en reposo durante 10 minutos para que aparezca el color y después se
lee a 570 nm.
CALCULOS.
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