PROTOCOLO T-RFLP BACTERIAS (16S) Por Montserrat Aldunate 1

PROTOCOLO T-RFLP BACTERIAS (16S)
Por Montserrat Aldunate
1. Dilución ADN
Las alícuotas para la obtención del templado deben estar a una concentración de 15
ng/µL, las cuales se dializan (filtros Millipore cat nº VSWP02500) bajo campana por
aproximadamente 2 horas.
2. Master Mix Reacción de PCR (oscuridad).
Reactivo
Buffer
Mg +2
dNTPs
27 F *
519 R
H20 HPLC
BSA
DNATaq Pol
Templado
Total
Concentración
5X
25 mM
10 mM
5 µM
5 µM
-20 µg/uL
5U/ µL
--
Volumen
10
3
1
2
2
25.8
2
1.2
3
50 µL
por 8 Rx
80
24
8
16
16
206.4
16
9.6
--
3. Digestión con enzimas o endonucleasas de restricción (oscuridad).
En un tubo de 0.5 mL agregar 17 µL del producto de PCR, 2 µL de buffer y 1 µL de
enzima de restricción. Para esto se puede hacer una mix para el total de reacciones con 2
µL de buffer y 1 µL de enzima por muestra. Esta mix se mezcla y se agrega 3 µL de la
mezcla a cada tubo con producto de PCR.
Reactivo
Producto de PCR
Buffer
Enzima
Total
Volumen
17 µL
2 µL
1 µL
20 µL
por 10 Rx
-20
10
Dejar los tubos dentro de una caja o gradilla cubierta para evitar el contacto con la luz e
incubar en la estufa a 37ºC “overnight”.
4. Precipitación (oscuridad).
a)
Al día siguiente, hacer un mix para el total de reacciones como indica la tabla:
Acetato de sodio
3M
Etanol
100%
0,1
volúmenes
2,5
volúmenes
Por 30 Rx
60 µL
1500 µL
Por lo general son 20 µL de reacción de digestión, por lo que serían 2 µL de acetato de
sodio 3M y 50 µL de etanol 100% por muestra.
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
Añadir a cada reacción de digestión el volumen correspondiente (52 µL) y
mezclar
Incubar a -80ºC en una caja cerrada (oscuridad) por 1 hora.
Centrifugar por 20 a 13000 rpm.
Descartar el sobrenadante con cuidado de no arrancar el pellet y agregar 30 a 50
uL de etanol 70% (frio) y repetir paso “d”.
Sacar nuevamente el sobrenadante con cuidado de no sacar el pellet y dejar secar
por algunas horas (~2 h) a temperatura ambiente hasta que se haya evaporado el
etanol.
Luego agregar 20 µL de agua HPLC tibia y mezclar en vortex unos segundos,
dejar resuspender a 40ºC por 1 hora, después dejar 2 horas a 4ºC .
Cuantificar.
Almacenar en caja protegida de la luz a -20°C.
NOTA: En el paso “g”, entre cada cambio de temperatura, mezclar los productos de
digestión con vortex por algunos segundos.