PROCEDIMIENTO PARA LA EMISION DE DOCUMENTOS

DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL
Basado en Validation of an HPLC analytical
method coupled to a multifunctional clean-up
column for the determination of deoxynivalenol.
Sugita-Konsihi et.al. Mycopathologia (2006)
161:239-243.
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
1.
Emisión:
09-08-2007
Versión: 4
Actualización:
26.05.2016
Página 1 de 5
ME - 711.04-187
OBJETIVO
Detectar y cuantificar la presencia de deoxinivalenol en alimentos.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
El método es aplicable en matrices trigo, arroz, maíz y sus productos derivados para la
determinación de deoxinivalenol (DON), en su forma. La Cantidad mínima de muestra
requerida para el análisis 5 gramos.
3.
FUNDAMENTO
Extracción de la muestra con una mezcla de acetonitrilo y agua, purificación con columna
multifuncional y cuantificación por HPLC con detector UV.
4.
4.1
5.
5.1
DOCUMENTOS DE REFERENCIAS
Validation of an HPLC analytical method coupled to a multifunctional clean-up
column for the determination of deoxynivalenol. Sugita-Konsihi et.al. Mycopathologia
(2006) 161:239-243.
TERMINOLOGÍA
Deoxinivalenol: Micotoxina producida por hongos del género Fusarium. Causa
vómitos, dolor de cabeza, fiebre y náuseas.
6.
REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todos los materiales,
insumos y reactivos mencionados a continuación están disponibles.
REACTIVOS
6.1.1
Estándar de deoxinivalenol*
6.1.2
Estándar de nivalenol
6.1.3
Acetonitrilo, grado HPLC*
6.1.4
Solución extractante acetonitrilo-agua 85:15
6.1.5
Agua desionizada*
6.2
INSUMOS
6.2.1
Columnas multifuncionales Multisep 227 Romer®.*
6.2.2
Frasco schott ámbar con tapa de 250 mL
DUEÑO DE PROCESO:
Encargada
Laboratorio Toxinas
Marinas y Micotoxinas
APROBADO:
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE
“DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL
Basado en Validation of an HPLC analytical
method coupled to a multifunctional clean-up
column for the determination of deoxynivalenol.
Sugita-Konsihi et.al. Mycopathologia (2006)
161:239-243.
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
Emisión:
09-08-2007
Versión: 4
Actualización:
26.05.2016
Página 2 de 5
ME - 711.04-187
6.2.3
Matraz Erlenmeyer ámbar de 250 mL
6.2.4
Tubos de centrífuga plásticos de 50 mL.
6.2.5
Pipetas Pasteur plásticas.
6.2.6
Tubos de centrífuga de 15 mL.
6.2.7
Pipetas de 10 mL.
6.2.8
Propipeta.
6.2.9
Viales ámbar de 2 mL.
6.2.10
Viales ámbar de 4 mL.
6.2.11
Papel Whatman glass filter GF/B o equivalente.
6.2.12
Micropipetas de 200 y 1000 µL.
6.2.13
Matraces volumétricos de 1, 5 y 10 mL.
6.3
EQUIPOS
6.3.1
Balanza de precisión 0.01 g.
6.3.2
Agitador.
6.3.3
Juguera o Blender.
6.3.4
Centrífuga para tubos de 50 mL capaz de lograr 3000 rpm.
6.3.5
Evaporador de N2.
6.3.6
Equipo HPLC con detector UV.
(*) Insumos críticos
7.
DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
A continuación se describe el método analítico, es crucial si no se dispone de práctica con el
método, leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar.
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de la limpieza de su lugar de
trabajo y que todo lo mencionado en punto materiales, insumos y reactivos esté disponible.
Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad.
7.1
MUESTREO / MUESTRA:
 Chequear que los antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los
rotulados en la muestra. Registrar la recepción de la muestra en la planilla “Registro
DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL
Basado en Validation of an HPLC analytical
method coupled to a multifunctional clean-up
column for the determination of deoxynivalenol.
Sugita-Konsihi et.al. Mycopathologia (2006)
161:239-243.
Sección Química de
Alimentos y Nutrición



7.2




7.3

7.4


Emisión:
09-08-2007
Versión: 4
Actualización:
26.05.2016
Página 3 de 5
ME - 711.04-187
de análisis de Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas” RG-025-711.00 y el
análisis de ésta en el mismo registro.
Almacenar la muestra a temperatura ambiente y protegida de la luz, evitando
lugares húmedos para conservar características originales de la muestra.
Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo
permite, almacenar aproximadamente 10 g de muestra como contramuestra
Los desechos alimentarios en buen estado son eliminados por basura normal. Los
desechos expuestos a alguna contaminación biológica o química y desechos
producto del proceso, serán eliminados de acuerdo al procedimiento de Gestión de
Residuos (PR-644.00-002) e instructivo Manejo de Residuos peligrosos, especiales
y otros (IT-644.00-001).
PREPARACIÓN DE REACTIVOS:
Solución stock de 200 µg/mL de deoxinivalenol en acetonitrilo.
Solución stock de 100 µg/mL de nivalenol en acetonitrilo.
Solución intermedia de 20 µg/mL en acetonitrilo.
Solución extractante acetonitrilo-agua (85:15).
PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN:
Preparar soluciones de trabajo de deoxinivalenol de 2 a 0.1 µg/mL en fase móvil
HPLC a partir de las solución intermedia (20 µg/mL). Tomar las alícuotas
correspondientes evaporar bajo suave corriente de nitrógeno y reconstituir en fase
móvil correspondiente al HPLC.
PREPARACIÓN DE CONTROLES.
Se recomienda al menos preparar un fortificado a partir de una muestra como control
al nivel del límite de cuantificación y/o preparar un fortificado a partir de una muestra
o un material de referencia cada día de análisis.
7.5
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA
MEDICIÓN.
7.5.1
7.5.2
Homogeneizar la muestra.
Pesar 50 g de la muestra previamente molida en un matraz Erlenmeyer o frasco
schott ámbar de 250 mL. Si la cantidad de muestra es inferior a 50 g, pesar 5 g en
tubo de centrífuga de 50 mL.
A los 50 g, agregar 200 mL de la solución extractante acetonitrilo-agua (85:15). En
el caso de pesar 5 g, agregar 20 mL de la solución extractante anterior. Siempre
mantener la relación o proporción muestra:solvente de acuerdo al peso de la
muestra inicial para el análisis.
Agitar por media hora en agitador. En el caso de muestras de 50 g la extracción
también se puede realizar en juguera a alta velocidad por 3 minutos.
7.5.3
7.5.4
DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL
Basado en Validation of an HPLC analytical
method coupled to a multifunctional clean-up
column for the determination of deoxynivalenol.
Sugita-Konsihi et.al. Mycopathologia (2006)
161:239-243.
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
7.5.5
7.5.6
7.5.7
7.5.8
7.5.9
7.5.10
7.5.11
7.6
Emisión:
09-08-2007
Versión: 4
Actualización:
26.05.2016
Página 4 de 5
ME - 711.04-187
Para muestras de 50 g, filtrar a través de papel Wathman glass filter GF/B o similar y
recolectar el filtrado en material ámbar. En el caso de pesar 5 g, centrifugar el
extracto a 3000 rpm por 15 minutos.
Sobre un tubo de centrífuga de 15 mL graduado colocar columna multifuncional.
Pasar 10 mL del extracto por la columna multifuncional. Dejar eluir pasar por
gravedad.
Descartar los primeros 4 mL. Recolectar los 2 a 3 mL siguientes.
Transferir 2 mL (exactos) del extracto eluido purificado a un tubo silanizado y
evaporar con una suave corriente de nitrógeno en baño a una T° no superior a 40 °C.
Redisolver el residuo con 500 µL de fase móvil de HPLC.
Colocar en viales del autosampler para su determinación y cuantificación por HPLC.
ANÁLISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES
INSTRUMENTALES.
Condiciones cromatográficas:
 Fase móvil: CH3CN – H2O (12:88)
 Flujo: 1mL/min.
 Longitud de onda: 220 nm.
 Volumen de inyección: 20 µL.
 Columna C18 250 mm x 4.6, 5 µm.
7.7
CÁLCULO DE RESULTADOS:
Para obtener el resultado en ppb (ng/g) del analito en la muestra se debe utilizar la
siguiente fórmula:
ppb =ug /Kg deoxinivalenol = A*(b/ p)*C/v)
Donde:
ppb deoxinivalenol = Concentración del analito en ng/g.
(A)
= Concentración entregada por el HPLC en ng/mL.
(b)
= Volumen de solución extractante utilizada (idealmente 200 mL).
(p)
= Peso de la muestra en gramos (idealmente 50 g).
(C)
= Volumen final de reconstitución (idealmente 0.5 mL).
(v)
=Volumen evaporado luego de pasar por la columna
multifuncional (2 mL).
7.8
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO.
Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los
ensayos realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los
controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control:
DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL
Basado en Validation of an HPLC analytical
method coupled to a multifunctional clean-up
column for the determination of deoxynivalenol.
Sugita-Konsihi et.al. Mycopathologia (2006)
161:239-243.
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
Emisión:
09-08-2007
Versión: 4
Actualización:
26.05.2016
Página 5 de 5
ME - 711.04-187
a. Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia
certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad.
b. Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras
fortificadas por el analista.
c. Nivel III. Realizar carta control de los resultados de recuperación y la
pendiente del deoxinivalenol.
7.9
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS.
La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en ppb (ug/Kg)
de deoxinivalenol.

8.
CONTROL DE REGISTROS
No aplica
9.
CONTROL DE CAMBIOS
VERSION
FECHA
PRINCIPALES
PUNTOS
MODIFICADOS
3
24-05-2014
7
10.
CUADRO DE RESPONSABILIDADES
Ejecuta el método
Elabora el informe de Evalúa resultado Aprueba el informe de
resultados
del informe
resultados
Técnico de Laboratorio Profesional
y/o
encargado
Profesional Encargado Laboratorio
de Laboratorio
11.
RESUMEN DE MODIFICACIONES
Se agregan antecedentes respecto del
almacenamiento de la muestra y los controles del
análisis.
ANEXOS
No Aplica.
Jefatura
de Jefatura
de
Sub
del Sección Química departamento
de Alimentos
Alimentos y Nutrición