EFECTO DE PARÁMETROS HPLC EN CROMATOGRAFÍA α

EFECTO DE PARÁMETROS HPLC
EN CROMATOGRAFÍA
1. Flujo
tR
2. Polaridad de fase móvil
k’
3. pH

4. Tamaño de muestra
5. Dimensiones de
Columna:
largo, D.I., dp
N
R
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FLUJO (v)
1. tR es inversamente proporcional a v
doble v, corta a la mitad el tR
2. k’ es independiente de v
doble v, corta a la mitad el tR y tM
3.  es independiente de v
4. N, la ecuación de Van Deemter
relaciona v con HETP o la eficiencia de
columna:
Flujos bajos, más platos
5. RS = función de k’,  y N
En este caso, RS aumenta y v
disminuye
H
v
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POLARIDAD DE LA FASE MÓVIL
1. tR - FASE NORMAL Más polar, elución más rápida y, tR más corto
FASE REVERSA Más polar, elución más lenta, tR más largos
2. k – se comporta como tR
FASE NORMAL – Más polar, k’ disminuye
FASE REVERSA – Más polar, k’ aumenta
3.  – más difícil : En primera aproximación,  independiente
de tR pero una fase móvil diferente afecta 
4. N - En HPLC, menor tR,
ligeramente mayor N ;
5. RS - Como k’ aumenta, RS aumenta :
R
2 to 5
k’
k’
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EFECTO DEL pH
• Principio de Le Chatelier : HA
H +A
• pH afecta el equilibrio de ácidos débiles (HA) o bases débiles(B)
• pH no afecta a neutros o ácidos fuertes
• pH puede afectar a la muestra y al empaque
+
-
1. FASE NORMAL – Debe ser usada para moléculas neutras y
semi-polares; pH no es un factor relevante.
2. FASE REVERSA – Si aumenta el pH, HA más ionizado, tR
más largos, coleo. Si aumenta el pH, B menos ionizado, tR
más cortos, picos más simétricos.
3. INTERCAMBIO IÓNICO – El pH es un factor crítico.
Recuerde – Si el pH afecta tR, se trata de un HA o B.
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TAMAÑO DE MUESTRA
• Cada columna tiene una capacidad limitada; si se excede
ese límite y tR disminuye, la forma de pico empeora.
• Solución – diluya la muestra 1/10 y re-analice.
• Todos los resultados cromatográficos pueden cambiar.
100 mg
25 mg
5 mg
1 mg
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DIMENSIONES DE COLUMNA :
Largo
• Se debe asumir que la presión se incrementa al
incrementar el largo para mantener v.
• La presión requerida es proporcional al largo:
doble largo
doble presión.
• Si se duplica el largo de la columna :
1. tR - duplica
2.
k - sin efecto
3.  - sin efecto
4.
N - duplica
5. RS - 2 = 1.41 = 40% aumento
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•
•
•
•
DIMENSIONES DE COLUMNA: I.D.
Dimensiones :
4 o 4.6 mm I.D.
- normal
3, 2 o 1 mm I.D.
- disponible
0.53 o 0.32 mm
- capilar empacado
El flujo volumétrico [ml/min] es proporcional al cuadrado del
radio (i.e. área) :
4 mm - 1 ml/min
2 mm - 0.25
misma velocidad lineal (v)
1 mm - 0.06
tR, k’, , N y RS son independientes de DI si la columna está
bien empacada.
Pero menor DI. : 1. Menos disolvente (barato)
2. Mejor sensibili. - A = cl (Lambert-Beer)
Si la muestra es limitada
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DIMENSIONES DE COLUMNA :
Diámetro de partícula (dp)
• 5 y 10 m son normales
• 3 m disponibles y ganando aceptación
• Partículas más pequeñas generan mejores
columnas(N y R) pero aumentan la presión, por lo
que largos mayores no son posibles.
1. tR, k y  - independientes de dp
2. N inversamente proporcional a dp :
la mitad de dp, doble N
3. RS aumenta con N, 40% aumento
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RELACIÓN ENTRE
dp, p, LARGO Y tR (1)
dp [m]
p
Largo [cm]
tR [min]
10
5
1,000
4,000
25
25
10
10
Reduzca el largo para reducir presión y mantener:
N = 12,500
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RELACIÓN ENTRE
dp, p, LARGO Y tR (2)
dp [m]
p
Largo [cm]
tR [min]
10
5
2
1,000
2,000
5,000
25
12.5
5
10
5
2
Asumiendo N = 12,500 ; h = 2.0
p 
1
;
p

L
c
2
dp
Partículas más pequeñas más eficientes pero
mayor caída de presión
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COMO AUMENTAR LA RETENCIÓN
1. COLUMNAS LARGAS
(k’ no cambia)
2. FLUJOS MENORES
(k’ no cambia)
3. FASE MÓVIL MÁS DÉBIL
• Fase normal
• Fase reversa
- Menos polar
- Más polar (H2O)
4. MAS FASE ESTACIONARIA
• Sílica gel
- Más área superficial
• Fase reversa
- RP-18 en lugar de RP-8
5. INCREMENTAR EL COEFICIENTE DE PARTICIÓN
• Mayor solubilidad en fase estacionaria
• Menor temperatura en la columna.
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COMO DISMINUIR ENSANCHAMIENTO
• 1.
USE UNA COLUMNA MEJOR EMPACADA
partículas chicas, empacado compacto
• 2.
• 3.
OPTIMICE EL FLUJO
• 4.
REDUCCIÓN DE VOLUMEN MUERTO
usar conexiones de volumen muerto bajo
• 5.
REDUCIR LA CONSTANTE DE TIEMPO
REDUZCA EL TAMAÑO DE MUESTRA
para evitar sobrecarga
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