Determinación de ácidos orgánicos mediante la técnica de

Determinación de ácidos orgánicos mediante la técnica de cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC)
La columna analítica Supecogel C-610 H, esta diseñada para la determinación de ácidos
orgánicos, el suplidor de esta columna (Supelco, Inc.) recomienda el uso de ácido
fosfórico 0.1% (H3PO4) como fase móvil, la cual antes de llegar al equipo debe ser
filtrada (filtro de membrana 0.45 m) y desgasificada.
Antes de pasar la muestra es necesario preparar las curvas de calibración las cuales nos
permiten determinar la concentración de los ácidos presentes en la muestra. (Dado que
este proceso conlleva tiempo no es factible en tres horas de laboratorio pasar todos los
estándares de los ácidos por lo tanto solo se podría pasar el estándar de un solo acido).
1. Preparación de curva de calibración
a. A partir del ácido a identificar preparar soluciones y diluciones estándar.
estas soluciones deben ser llevadas a volumen con fase móvil.
i. Preparación de la solución stock
Pesar 1.0 g del acido llevar a matraz volumétrico de 100 mL con la
fase móvil.
Concentración solución stock = 1000 mg = 10000 ppm
0.100 L
ii. Preparación de la solución working
A partir de la solución stock preparar la solución working de 1000
ppm. Llevar a volumen con fase móvil.
V1C1=V2C2
iii. Preparación de las soluciones estándar.
A partir de la solución working prepara las soluciones estándar de
100, 80, 60, 40, 20 ppm. Llevar a volumen con fase móvil.
b. El estándar debe ser filtrado a través de filtro de 0.2 µm de nylon previo a
la inyección.
c. Medir 25 µL con la jeringuilla para HPLC
d. Realizar 3 inyecciones por dilución (estándar de 20, 40, 60, 80,100 ppm)
2. Determinación del analito en la muestra
a. A partir de jugo de fruta tomar 4 g
b. Adicionar 2 mL de acido metafosfórico
c. Adicionar 8 mL de agua grado HPLC
d. Centrifugar de10 a 15 min.
e. Extracción del analito de interés
i. Usando un cartridge SCX (Varian Inc.) activar con 1 mL de
metanol HPLC y lavar con 10 mL de agua grado HPLC. (Es muy
importante este lavado ya que no puede entrar metanol al equipo
pues produciría un daño en el mismo) Lo que salga durante este
tratamiento debe ser rotulado como desperdicio.
ii. Pasar la muestra (1 mL) a través del cartridge previamente tratado y
lavar con agua HPLC (2 mL) lo que sale aprox. 3 mL, debe
depositarse en un tubo de centrifuga o matraz volumétrico de 10
mL.
iii. Llevar la muestra a volumen de 10 mL con fase móvil
iv. Realizar dilución 1 en 10
f. Inyección de la muestra
i. Previo a la inyección de la muestra, la misma debe ser filtrada a
través de filtro de 0.2 µm de nylon
ii. Medir 25 µL con la jeringuilla para HPLC
iii. Realizar 3 inyecciones por dilución (muestra)
g. Adecuación del equipo, el equipo debe operarse de acuerdo a las
condiciones en las cuales se desea evaluar la muestra, la fase móvil debe
ser recomendada por la compañía suplidora de la columna
i. Para ácidos orgánicos se recomienda trabajar a 214 nm a 30°C con
un flujo de 0.5 mL y un tiempo de 35 min.