ANEXOS Anexo 1 Solución Reguladora de Acetato

ANEXOS
Anexo 1
Solución Reguladora de Acetato 0.1 M, pH 4.0 y metanol al 2% (v/v).
1. Tomar 6.011mL de ácido acético y aforar a 1L de agua HPLC.
2. Pesar 13.609 g de acetato de sodio y aforar a 1L de agua HPLC.
3. Mezclar 820/180 mL de ácido acético y acetato respectivamente.
4. Ajustar el pH con los mismos amortiguadores, filtrar.
5. Desgasificar y poner al 2% de metanol (20mL de metanol para 980mL de buffer).
Anexo 2
Solución Reguladora de Fosfato 0.1 M, pH 6.0 y metanol al 5% (v/v).
1. Pesar 12.12 g de fosfato de sodio monobásico y aforar a 500 mL con agua HPLC.
2. Pesar 14.2 de fosfato dibásico, disolver, aforar a 500 mL con agua HPLC.
3. Hacer una mezcla de 877 mL de monobásico y 123mL de dibásico.
4. Medir el pH y ajustarlo con las mismas soluciones reguladoras.
5. Filtrar, desgasificar y poner al 5% de metanol (50mL de metanol para 950 de buffer).
Anexo 3
Solución Reguladora de Fosfato 0.1M, pH 2.0.
1. Pesar 12.12 g de fosfato de potasio monobásico.
2. Diluir y disolver en 500 mL de agua HPLC.
3. Ajustar el pH a 2.0 con ácido clorhídrico concentrado.
Solución Reguladora de Fosfato 0.1M, pH 3.5.
1. Pesar 12.12 g de fosfato de potasio monobásico.
2. Diluir y disolver en 500 mL de agua HPLC.
3. Ajustar el pH a 3.5 con ácido clorhídrico concentrado.
Solución Reguladora de Fosfato 0.1M, pH 2.1
1. Pesar 12.12 g de fosfato de potasio monobásico.
2. Diluir y disolver en 500 mL de agua HPLC.
3. Ajustar el pH a 2.1 con ácido fosfórico concentrado.
Anexo 4
Diagrama de la Determinación de Homocisteína Total
A 500 µL de plasma, añadirles 50 µL de TBP al 10% (en DMF)
↓
Reposar el plasma con TBP durante 30 min a 4° C
↓
Añadir 500 µL de TCA al 10%, con Na2EDTA 1 mM, frío y agitar en vórtex
vigorosamente durante 10 segundos
↓
Centrifugar la solución a 1,000 g durante 5 min.
↓
Tomar una alícuota de 200 µL del sobrenadante y mezclarla vigorosamente con
400 µL de amortiguador de borato 0.25 M, pH 10.5 con Na2EDTA 4 mM, y 200
µL de SBD-F (El SBD-F debe ser preparado con borato 0.25 M, pH 9.5 a una
concentración de 1 mg/mL)
↓
Incubar la mezcla en un baño de agua durante 60 min a 60° C
↓
Enfriar la solución en un baño de hielo
↓
Filtrar la solución en un filtro Millipore de 0.45 µm
↓
Tomar una alícuota de 20 µL e inyectarla al HPLC
Araki y Sako, 1987.
Anexo 5
Preparación del Estándar de Homocisteína
Tomar 200 µL de la homocisteína en solución de 1 µg/mL y mezclarla
vigorosamente con 400 µL de amortiguador de borato 0.25 M, pH 10.5 con
Na2EDTA 4 mM; 200 µL de SBD-F; y10 µL de de TBP al 10% v/v en DMF
(El SBD-F debe ser preparado con borato 2.5 M, pH 9.5 a una concentración de 1
mg/mL)
↓
Incubar la mezcla en un baño de agua durante 60 min a 60° C
↓
Enfriar la solución en un baño de hielo
↓
Filtrar la solución en un filtro Millipore de 0.45 µm
↓
Tomar una alícuota de 20 µL e inyectarla al HPLC
Araki y Sako, 1987.
Anexo 6
Recomendaciones Técnicas para la Preparación de la Muestra en la Determinación
de Homocisteína
• Antes de empezar con la preparación de la muestra hay que poner a calentar el baño
maría para asegurar que esté listo al momento de incubar.
• Asegurarse de que los amortiguadores estén desgasificados para tener una buena
detección, ya que el oxígeno disuelto hace que la señal fluorescente disminuya.
• Preparar el estándar el día que vaya a ser utilizado; homogenizar muy bien al momento
de hacer las diluciones.
• El SBD-F debe prepararse en el momento en el que se vaya a utilizar. Se pesa 0.001g
en 1mL de amortiguador de borato 0.1 M, pH 9.5.
• La cantidad de TBP que se usará la determina el volumen de muestra del que se
disponga; la proporción por cada 100 μL de suero son 10 μL de TBP (ejemplo 300μL
de suero con 30 de TBP). Esta mezcla se incuba a 4 ºC por 30 min para asegurar la
reducción de la homocisteína.
• El TCA debe de estar muy helado (para hacer más eficiente la precipitación proteica
de la muestra) y hay que taparlo bien para que no se volatilice. Se agrega en una
proporción 1:1 (ejemplo 300 μL de suero con 300 de TCA). Agitar vigorosamente y
centrifugar a 1,000g por 5 mina 25 ºC.
• Del sobrenadante claro tomar 200 μL, o 100 μL si se quiere ahorrar reactivo,
asegurándose de no llevar residuos del precipitado blanco (proteínas).
• Los tubos (crioviales) en lo que se haga la reacción deben de estar perfectamente
cubiertos para evitar que se exponga demasiado a la luz, ya que afecta ala emisión de la
fluorescencia.
• Para preparar la muestra problema se toman los 100 μL del sobrenadante + 200 μL
de amortiguador de borato 10.5M y 100 μL de SBD-F. Tapar rápidamente (para evitar
la exposición a la luz) y agitar suavemente.
• Para preparar el estándar se toman 100 μL + 200 μL de amortiguador de
borato10.5M + 100 μL de SBD-F y 5 μL de TBP. Tapar rápidamente (para evitar la
exposición a la luz) y agitar suavemente.
• Después de la agitación de la muestra y el estándar hay que ponerlos rápidamente en
el baño maría y vigilar que la temperatura este constantemente a 60ºC por 1 h, en este
paso se da el proceso de derivatización de la muestra y solo con estas condiciones se
puede establecer la unión del complejo SBD-homocisteína.
• Al culminar la hora de incubación se tiene que tener listo un baño de hielo para
detener la reacción de las muestras, se enfría y se filtran a través de una membrana de
0.22 μm que se adapta a una jeringa. El filtrado se pasará a un tubo limpio que se cubre
con aluminio. Para
usar el filtro entre muestra y muestra hay que enjuagarlo
perfectamente con amortiguador de borato 0.25M, pH 10.5.
• Poner la muestra en hielo para ser transportada.
Recomendaciones Técnicas para la Separación por HPLC en la Determinación de
Homocisteína.
• Filtrar y desgasificar las soluciones reguladora antes de poner el acetonitrilo, ya que
este es un solvente muy volátil y se alteraría la composición de la solución.
• Antes de poner las soluciones reguladoras que vayamos a utilizar el equipo de HPLC
debe purgarse con agua filtrada y desgasificada para limpiar residuo que pudiera haber
quedado (sales), ya que estos se pueden acumular y tapar las tuberías produciendo altas
presiones dentro del sistema, además para eliminar cualquier burbuja que pueda estar
presente en las tuberías que conducen a las soluciones reguladoras.
• Las válvulas del equipo se tienen que abrir para purgar, debido a que se utiliza un flujo
de 10mL/min, para evitar que pase el agua por la columna y pueda dañar la fase
estacionaria.
• Después de purgar se cierran las válvulas para que pase la solución a través de la
columna, el flujo se va subiendo gradualmente y así evitamos lo cambios bruscos de
presión de sistema.
• Ya que se alcanza el flujo deseado, se activa el programa que establece las condiciones
cromatográficas que se utilizan (tiempos de equilibrio, tiempo de corrida, gradientes,
etc.)
y se enciende el detector poniendo atención en las longitudes de emisión y
excitación requeridas. Al momento de hacer la corrida hay que prender la lámpara.
• Después de equilibrar a la fase estacionaria por una hora se lava exhaustivamente el
inyector de la muestra con agua y después con el buffer de equilibrio. Así mismo, se
lava la jeringa que ayuda a introducir la muestra.