ES 2 104 845 T3

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A61K 47/48
11 Número de publicación:
6
51
ESPAÑA
k
2 104 845
C07H 19/01
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 92309368.6
kFecha de presentación : 14.10.92
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 538 011
kFecha de publicación de la solicitud: 21.04.93
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Composiciones lipófilas de sales de antibióticos oligosacáridos.
k
73 Titular/es: Schering Corporation
k
72 Inventor/es: Patel, Mahesh;
k
74 Agente: Dı́ez de Rivera y Hoces, Alfonso
30 Prioridad: 16.10.91 US 777864
2000 Galloping Hill Road
Kenilworth New Jersey 07033, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.10.97
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 104 845 T3
16.10.97
Aviso:
k
k
Gullo, Vincent P.;
Hare, Roberta;
Loebenberg, David;
Morton, James B.;
Miller, George H. y
Kwon, Heewon Y.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 104 845 T3
DESCRIPCION
Antecedentes de la invención
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Esta invención se refiere a nuevas composiciones de materia que comprenden un antibiótico oligosacárido lipófilo, y a formulaciones farmacéuticas que contienen tales composiciones de materias y a usos
de tales composiciones farmacéuticas para tratar y/o prevenir infecciones microbianas en animales, especialmente mamı́feros tales como seres humanos.
Los antibióticos oligosacáridos lipófilos que incluyen, por ejemplo, everninomicinas, curamicinas, avilamicinas y flambamicinas son miembros de la familia de ortosomicinas de antibióticos que contienen al
menos un átomo de hidrógeno fenólico ácido, y dos enlaces ortoéster asociados con residuos de carbohidratos. Véase, por ejemplo, A.K. Ganguly en “Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology”, (1978),
Volumen 2, pag. 205-209, Tercera Edición, John Wiley and Sons y W.D. Ollis et al., Tetrahedron (1979),
Volumen 35, pag. 105-127. Estos antibióticos oligosacáridos lipófilos exhiben una actividad biológica de
amplio espectro frente a bacterias gram-positivas y algunas gram-negativas en diversos ensayo in vitro,
y actividad in vivo en modelos de animales tales como ratones, pero hasta la fecha no ha estado disponible ninguna formulación farmacéuticamente aceptable de tales antibióticos útil para la administración
in vivo. Por tanto, se ha observado que la inyección de estos antibióticos oligosacáridos lipófilos provoca
un sı́ndrome de reacción adversa. La expresión “sı́ndrome de reacción adversa”, tal como se usa en la
presente memoria descriptiva, significa sı́ntomas del siguiente tipo, observados en animales tales como
ratones tras la administración parenteral de antibióticos oligosacáridos lipófilos: descoordinación, ataxia,
posición yacente lateral, urinación, rigidez de las extremidades posteriores, respiración laboriosa y parada. Por tanto, en resumen, no hay composiciones farmacéuticamente aceptables de estos antibióticos
oligosacáridos lipófilos para el uso seguro y eficaz de estos potentes antibióticos en animales, incluidos
mamı́feros tales como los seres humanos.
Las ciclodextrinas son almidones modificados preparados a partir de unidades de glucopiranosa e incluyen α -ciclodextrina que consiste en seis unidades de glucopiranosa, β-ciclodextrina que consiste en
siete unidades de glucopiranosa y γ-ciclodextrina que consiste en ocho unidades de glucopiranosa. Las α-,
β- y γ-ciclodextrinas y sus derivados tienen una superficie interior o cavidad que es lipófila y una superficie
exterior que es hidrófila. Esta combinación de una cavidad hidrófoba y una superficie externa hidrófila
ha conducido al uso de ciclodextrinas y sus derivados para la complejación molecular o encapsulación
de muchos fármacos hidrófobos y/o inestables de dimensiones adecuadas, mejorando ası́ la solubilidad,
estabilidad y biodisponibilidad de tales fármacos. Los derivados de las α-, β- y γ-ciclodextrinas, por
ejemplo, hidroxipropil-β -ciclodextrinas se ha descrito por Jozsef Szejtli en Pharmaceutical Technology,
Junio de 1991, 36-40.
Los complejos de α- β- y γ-ciclodextrinas, sus mezclas y derivados se describen, por ejemplo, por N.
Bodor en el documento USP 4.983.586. El documento USP 4.983.586 de Bodor describe un método para
disminuir la incidencia o precipitación de un fármaco lipófilo o inestable en agua que se produce en el sitio
de la inyección o cerca de él y/o en los pulmones después de la administración parenteral, administrando
por vı́a parenteral dicho fármaco en una solución acuosa que contiene una gran cantidad, es decir, 20 a
aproximadamente 50 por ciento en peso de hidroxipropil-β -ciclodextrina.
Josef Pitha en el documento USP 4.727.064 y en The International J. of Pharmaceutics, (1986),
29, 73-82, describe el uso de una solución acuosa concentrada, es decir, 40-60 por ciento en peso de
hidroxipropil-β-ciclodextrina para solubilizar diversos fármacos tales como acetaminofen, esteroides sexuales, glicósidos cardı́acos tales como digoxin, ası́ como ácido retinoico y sus sales. Véase también el
documento USP 4.596.795 de Pitha que describe la administración de las hormonas sexuales, testosterona,
progesterona y estradiol en forma de complejos con poli-β-ciclodextrina o hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Las referencias de Bodor y Pitha no hacen referencia a fenoles o antibióticos oligosacáridos lipófilos.
55
60
La solicitud de patente internacional de Janssen Pharmaceutica N.V. n◦ PCT/EP84/00417 publicada
bajo el n◦ de publicación internacional WO 85/02767 el 4 de julio de 1985 describe composiciones farmacéuticas que comprenden complejos de fármacos que son inestables o solamente escasamente solubles
en agua con β-ciclodextrina parcialmente eterificada (“β-CD”) de fórmula (β-CD)-OR en la que el residuo
R es hidroxietilo, hidroxipropilo, dihidroxipropilo y una parte del residuo R puede ser opcionalmente los
grupos alquilos, especialmente metilo o etilo.
Si la molécula de fármaco tiene grupos básicos o ácidos que se puedan usar posiblemente para aumentar la solubilidad en agua por formación de sales, la publicación internacional de Janssen n◦ WO
2
ES 2 104 845 T3
85/02767 expone que la formación de sales como norma da lugar a una eficacia disminuida o una estabilidad quı́mica deteriorada y, por tanto, no se estimula la formación de sales para solubilizar compuestos
ácidos y básicos escasamente solubles en agua. No hay descripción de antibióticos oligosacáridos lipófilos
o las composiciones de la presente invención.
5
Diversas cepas de bacterias tales como cocos gram -positivos, por ejemplo, estreptococos y enterococos
ası́ como estafilococos resistentes a meticilinas y susceptibles a meticilinas se han hecho resistentes a los
antibióticos disponibles en el comercio, por ejemplo, vancomicina.
10
15
Por tanto, hay una necesidad de composiciones farmacéuticamente aceptables para tratar infecciones
bacterianas que incluyan estafilococos resistentes a meticilinas y susceptibles a meticilinas y bacterias
resistentes a vancomicinas. Hay también una necesidad de composiciones farmacéuticamente aceptables que contengan un antibiótico oligosacárido lipófilo activo frente a una amplia gama de infecciones
de bacterias susceptibles gram-positivas y gram-negativas, especialmente composiciones farmacéuticas
adaptadas para uso parenteral que eviten la producción del sı́ndrome de reacción adversa.
Breve sumario de la invención
20
25
30
Sorprendentemente, se ha descubierto un medio mediante el cual antibióticos oligosacáridos lipófilos
que tienen una buena actividad antibacteriana frente a infecciones de bacterias susceptibles gram-positivas
y/o gram-negativas puede ser suministrados a animales, especialmente mamı́feros tales como el hombre,
afectados con infecciones de bacterias susceptibles gram-positivas o gram-negativas para proporcionar
un tratamiento eficaz y/o su prevención al mientras evitan simultáneamente la producción del sı́ndrome
de reacción adversa. Este medio comprende combinar un antibiótico oligosacárido lipófilo con al menos
aproximadamente una cantidad estequiométrica de una base especificada y una cantidad de un agente
tal como hidroxipropil-α-, β- o γ-ciclodextrina que tenga aproximadamente 2 a 15 grupos hidroxipropilo
por molécula de ciclodextrina, suficiente para conseguir un suministro eficaz del antibiótico oligosacárido
lipófilo al suero de un animal, mientras se evita simultáneamente el sı́ndrome de reacción adversa.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una composición de materia que comprende:
(a) un antibiótico oligosacárido lipófilo representado por la Fórmula I:
35
40
45
50
55
60
3
ES 2 104 845 T3
en la cual:
5
10
15
X=NO2 , NO, NH2 , NHCOCH3 , NHOH, NH(C2 H5 ), N(C2 H5 )2 , OH o H;
R2 =CH3 , COCH(CH3 )2 , COCH3 , CO(CH2 )3 CH3 , COCH2 CH3 o H;
R3 =CH3 o H;
R4 =COCH3 , CH(OCH3 )(CH3 ), CH(OH)CH3 , CHO o H;
20
25
30
35
40
45
R6 =CH3 o H;
R7 = CH3 o H;
R8 = CH3 , CH2 OH o H;
R9 =CH3 o H;
Y=OH, CH3 o H;
W=Cl o H; y
Z=Cl o H.
(b) al menos aproximadamente una cantidad estequiométrica de una base capaz de formar una sal
farmacéuticamente aceptable con un antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula I;
(c) una cantidad de un hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en la que el número medio de sustituyentes hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente 2
a aproximadamente 15, y dicha cantidad es suficiente para conseguir un suministro eficaz de dicho antibiótico oligosacárido lipófilo al suero de un animal, mientras se evita simultáneamente el sı́ndrome de
reacción adversa; y
(d) 0 a 6,0 % en peso (base: dicho antibiótico de Fórmula I) de un tensioactivo no iónico farmacéuticamente aceptable.
50
La presente invención proporciona más preferentemente una composición de materia que comprende:
55
60
4
ES 2 104 845 T3
(a) un compuesto representado por la Fórmula II:
5
10
15
20
25
30
en la cual X=NO2 , NO, NHOH, NH2 , NHCOCH3 , NHC2 H5 , N (C2 H5 )2 , OH o H
Y=OH, CH3 o H
R2 =H o CH3
35
R3 =H
R4 =H o CH(OCH3 ) (CH3 )
40
y
45
50
55
60
(b) al menos aproximadamente una cantidad estequiométrica de una base capaz de formar una sal
farmacéuticamente aceptable con un antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula II;
(c) una cantidad de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en la que el número medio de sustituyentes hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente 2
a aproximadamente 15, y dicha cantidad es suficiente para conseguir un suministro eficaz de dicho antibiótico oligosacárido lipófilo al suero de un animal mientras se evita simultáneamente la producción del
sı́ndrome de reacción adversa; y
5
ES 2 104 845 T3
(d) 0 a 6,0 % en peso (base: dicho antibiótico de Fórmula II) de un tensioactivo no iónico farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona adicionalmente una composición de materia que comprende
5
(a) el compuesto antibiótico representado por la Fórmula III
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(b) al menos aproximadamente dos equivalentes e una base (por mol del compuesto de Fórmula III)
capaz de formar una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de Fórmula III (c) una cantidad
de hidroxipropil-α-, -β- o -γ -ciclodextrina que tenga aproximadamente 2 a aproximadamente 15 grupos
hidroxipropilo por molécula de dicha -α-, -β- o -γ-ciclodextrina y en donde dicha cantidad de dicha ciclodextrina es suficiente para conseguir un suministro eficaz de dicho antibiótico oligosacárido lipófilo al suero
de un animal mientras se evita simultáneamente la producción del sı́ndrome de reacción adversa; y (d) 0
a 6,0 % en peso (base: dicho antibiótico de Fórmula III) de un tensioactivo no iónico farmacéuticamente
aceptable.
Se proporcionan también farmacéuticas formadas mezclando una composición de materia que comprende un compuesto representado por las Fórmulas I, II o III y al menos aproximadamente una cantidad
estequiométrica de una base capaz de formar una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y una cantidad de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina con un vehı́culo farmacéuticamente aceptable, ası́
como los métodos de usar tales composiciones farmacéuticas para tratar o prevenir infecciones de bacterias susceptibles gram-positivas y gram-negativas en animales, especialmente mamı́feros, que necesitan
tal tratamiento o prevención.
Como una forma preferida de la invención, las composiciones farmacéuticas anteriormente mencionadas se pueden aplicar particularmente a administración parenteral, especialmente administración in vivo
a seres humanos mediante la vı́a intravenosa (IV).
La invención proporciona también:
60
el uso de un compuesto de Fórmula I, II o II como se define en las reivindicaciones 1 a 3, en la
elaboración de una composición farmacéutica en una terapia para tratar una infección, mientras se evita
simultáneamente la producción del sı́ndrome de reacción adversa, en donde dicha terapia comprende adicionalmente administrar una cantidad de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en la que el número
6
ES 2 104 845 T3
medio de sustituyentes hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 15; y
5
el uso de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en la que el número medio de sustituyentes
hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, en la elaboración de una composición farmacéutica para administrar en combinación con un
compuesto de Fórmula I, II o II, como se define en la reivindicación 1, en una terapia para tratar una
infección, siendo administrada dicha hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en una cantidad que dé lugar
a que se evite el sı́ndrome de reacción adversa.
10
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra gráficamente la progresión, con el tiempo, de una fermentación tı́pica de Micromonospora carbonacea var. africana, NRRL 15099, ATCC 39149.
15
Las Fórmulas I, II y III se exponen en una escala aumentada en las Figuras 2, 3 y 4 que se acompañan.
Descripción detallada de la invención y de las realizaciones preferidas
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Los antibióticos oligosacáridos lipófilos, por ejemplo, antibióticos de everninomicina, exhiben una actividad antibacteriana in vitro útil pero no forman fácilmente soluciones acuosas completas adecuadas para
una administración in vivo segura y eficaz (es decir, sin la producción del sı́ndrome de reacción adversa).
Además de ello, las sales de estos antibióticos formadas mezclando al menos aproximadamente una cantidad estequiométrica de una base útil en esta invención, por ejemplo, la base N-metilglucamina (“NMG”)
no forman soluciones acuosas completas a valores útiles del pH. Cuando dichas sales se añadieron a agua a
concentraciones útiles de sal, se observó que solamente se formaban dispersiones coloidales. Estas dispersiones coloidales tendı́an a agregarse, y eventualmente gelificaban, especialmente en presencia de dióxido
de carbono absorbido y cuando el pH de tales dispersiones coloidales era menor que aproximadamente
9,3. Se observó que se formaban soluciones acuosas completas aumentando la relación en moles de NMG
a compuesto de Fórmula III de 2:1 o 3:1 hasta 12:1, pero que la solución ası́ formada con la relación
en moles 12:1 tenı́a un pH indeseablemente elevado, estaba altamente tamponada y era irritante. Por
tanto se observó que la inyección parenteral en ratas o primates superiores, tal como monos, de una
formulación acuosa que contuviera 12 moles de NMG por un mol del compuesto de Fórmula III no dio
lugar al sı́ndrome de reacción adversa (presumiblemente provocado por la gelificación y precipitación
del compuesto del Fórmula III). La formulación produjo irritación tras la inyección, irritación que está
presumiblemente provocada por la gran cantidad de base de NMG y dio lugar a un pH elevado en el sitio
de la inyección. Sin embargo, la administración parenteral de una composición que contiene 3 ó 5 moles
de NMG por mol del compuesto de Fórmula III dio lugar al sı́ndrome de reacción adversa. Mientras se
conoce que diversos agentes de ciclodextrina ayudan a conseguir soluciones de fármacos especı́ficos (por
ejemplo, como los de las referencias de Bodor y Pitha anteriormente mencionadas), el uso de agentes representativos de esta clase por sı́ mismos no consiguió el resultado deseado para antibióticos oligosacáridos
lipófilos. Por tanto, por ejemplo, el uso de un derivado especı́fico de ciclodextrina, y una hidroxipropil-β
-ciclodextrina por mol de antibiótico de tipo everninomicina de Fórmula III no consiguió producir una
verdadera solución acuosa cuando se usó en la relación de 6 moles de la hidroxipropil-β-ciclodextrina por
mol del antibiótico de tipo everninomicina de formulación III. Sorprendentemente, se ha encontrado que
una composición de materia que comprende un compuesto antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula
III, una cantidad especificada un una base especı́fica, por ejemplo, NMG y un agente especificado, por
ejemplo, hidroxipropil-β-ciclodextrina en cantidades especificadas proporciona, cuando se mezcla con un
vehı́culo farmacéuticamente aceptable, especialmente agua, una formulación que se puede usar de forma
segura y eficaz para administración in vivo. Sorprendentemente, se ha encontrado que cuando se mezcla
1 mol de un antibiótico oligosacárido lipófilo, por ejemplo, el compuesto de Fórmula III, con al menos 2
a aproximadamente 2 moles de una base adecuada, por ejemplo, NMG, en agua y con 6 moles de una
hidroxipropil-β -ciclodextrina, por ejemplo, una que tenga aproximadamente 3 a 7,5 grupos hidroxipropilo por molécula de β-ciclodextrina, se formó una solución transparente del complejo (según se medió
mediante nefelometrı́a de dispersión de luz y mediciones del ancho de lı́neas en la RMN protónica; véase
el Ejemplo 4) y la inyección parenteral de tales complejos en animales no provocó un sı́ndrome de reacción
adversa excesivo incluso a dosis elevadas, es decir, 800 mg de tal complejo por kg de peso corporal. Véase
la Tabla 4.
Como será evidente a partir de los resultados in vivo resumidos en la Tabla 1, las inyecciones parenterales de las dispersiones acuosas de sales, por ejemplo, la sal de NMG del antibiótico de tipo everninomicina
de Fórmula III en ratones y monos, dio lugar al sı́ndrome de reacción adversa. Solamente cuando las so7
ES 2 104 845 T3
5
luciones acuosas de una de las composiciones de materia de esta invención, tal como una que contenga un
agente complejante especificado, por ejemplo, hidroxipropil-β-ciclodextrina que tenga aproximadamente
3 a 7,5 grupos hidroxipropilo por molécula de β-ciclodextrina con el antibiótico de tipo everninomicina
NMG de sales de Fórmula III fueron inyectadas en los animales, se evitó completamente la producción
del sı́ndrome de reacción adversa.
10
La Tabla 2 muestra que el sı́ndrome de reacción adversa puede ser reducido o completamente evitado
mediante la inyección parenteral en ratones de soluciones acuosas transparentes de sales de NMG del antibiótico de tipo everninomicina de Fórmula III con los agentes especificados, por ejemplo, hidroxipropilβ-ciclodextrina de esta invención.
La Tabla 3 ilustra que el aumento de la relación en moles de base a antibióticos de tipo everninomicina de Fórmula III de 2:1 a 9:1 elimina completamente la producción del sı́ndrome de reacción adversa
a todas las concentraciones ensayadas tras inyección parenteral en ratones.
15
Ejemplo comparativo
TABLA 1
20
La producción del sı́ndrome de reacción adversa después de la administración de formulaciones acuosas
de un mol del compuesto de fórmula III y de 2 moles de NMG con y sin HP-β-CD1
Ratones
% de Sı́ndrome de reacción adversa
(Concentración de III inyectado: 80 mg/ml)
25
III4 : 2 NMG
III: 2NMG: 6 HPβCD5
30
35
40
1003
2003
5003
8003
–
0
–
0
–
0
–
0
Monos Cinomolgus
(Concentración de III inyectado: 50 mg/ml)
III: 2NMG
III: 5NMG
III: 2NMG: 6 HPβCD5
106
406
806
50
–
–
–
33
0
–
50
0
Notas a pie de la Tabla 1
1. HP-β-CD es hidroxipropil-β-ciclodextrina que contiene 7,4 grupos hidroxipropilo por molécula de βCD.
45
2. Se observaron sı́ntomas del sı́ndrome de reacción adversa en los animales con 2 minutos después de la
inyección IV (dosis única).
3. MPK es mg de fármaco por kg de peso corporal de los ratones (grupos de 5 a 10, CF-1, peso medio
20 g, Harlan Sprague-Dawley en ayunas 18 horas).
50
4. III es el compuesto antibiótico de tipo everninomicina representado por la Fórmula III.
5. Complejo formado. Véanse los Ejemplos 3 y 4.
55
6. MPK es mg de fármaco por kg de peso corporal de mono cinomolgus (intervalo de peso de 2,9 a 9,6
kg, Schering Corporation Colony, en ayunas 18 horas). Se usaron 3 monos en el experimento 40 MPK,
5NMG; se usaron 2 monos en los otros dos ensayos.
60
8
ES 2 104 845 T3
TABLA 2
1
Sı́ndrome de reacción adversa (ARS) tras la administración de formulaciones acuosas de un mol del
compuesto de Fórmula III y 2 moles de NMG y aditivos seleccionados
5
% de ARS a las dosis siguientes (MPK2 ) de fármaco de Fórmula III (20 mg/ml) en ratones
“Fármaco de Fórmula III
inyectado”
100
200
250
300
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
Tween3
(concentración)
0
0,1 %
0,25 %
0,5 %
1%
2%
3%
10
10
80
100
100
–
0
100
100
100
100
100
0
0
0
0
100
100
100
100
100
40
0
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
DMSO4
(Concentración)
0
1%
5%
10 %
0
0
0
0
90
40
10
0
100
20
10
100
100
50
50
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
Glicerol
(Concentración)
0
5%
10 %
0
0
0
100
90
60
90
100
100
100
100
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
Dextrano 405
(Concentración)
0
1%
10 %
0
20
0
100
100
50
70
–
–
100
III:2NMG
Dextrano 706
(Concentración)
6%
0
90
100
–
100
0
200
100
0
0
0
0
250
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
III:2NMG
HPβCD7
(Relación en moles)
0
1:0,5
1:1,5
1:2,5
1:3
1:3
1:6
300
100
50
60
30
10
10
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Notas a pie de la Tabla 2
60
1. Sı́ntomas de sı́ndrome de reacción adversa observados en los ratones (grupos de 5 a 10, CF-l, peso
medio 20 g, Harlan Sprague Sawley en ayunas 18 horas) en 2 minutos después de inyección IV (dosis
única).
2. MPK es mg de sustancia del fármaco de Fórmula III por kg de peso corporal del animal.
9
ES 2 104 845 T3
3. Tween es sorbatan-mono-9-octadecanoato-poli(oxi-1,2-etanodiilo) o como Polisorbato 80, disponible
en la empresa ICI Americas Inc., Wimington Delaware bajo la marca registrada Tween 80.
5
4. DMSO es dimetil-sulfóxido.
5. Dextrano 40 es un polı́mero de peso molecular elevado (40.000) de glucosa disponible en la empresa
Sigma Chemical.
10
6. Dextrano 70 es un polı́mero de peso molecular elevado (70.000) de glucosa disponible en la empresa
sigma Chemical.
7. HPβCD es hidroxipropil-β-ciclodextrina que tiene 7, 4 grupos hidroxipropilo por molécula de CD.
TABLA 3
15
Efecto de la concentración de sal de NMG de antibióticos oligosacáridos lipófilos y relación en moles de
NMG a antibiótico sobre el sı́ndrome de reacción adversa1 en ratones
% ARS1 a las dosis
siguientes (MPK2 ):
Fármaco de Fórmula III
(Concentración de fármaco)
20
50
100
200
300
400
–
–
50
–
–
–
20
100
–
–
70
100
–
–
–
–
–
0
0
20
–
–
0
15
40
–
–
100
–
–
III:5NMG
(20 mg/ml)
III:5NMG
(50 mg/ml)
–
–
0
0
–
–
–
0
–
40
III:9NMG
(20 mg/ml)
III:9NMG
(40 mg/ml)
III:9NMG
(80 mg/ml)
–
–
0
0
0
–
–
0
0
0
–
–
0
–
0
III:2NMG
(10 mg/ml)
III:2NMG
(20 mg/ml)
III:2NMG
(50 mg/ml)
25
30
III3 :3NMG
(20 mg/ml)
III:3NMG
(40 mg/ml)
III:3NMG
(80 mg/ml)
35
40
45
50
Notas a pie de la Tabla 3
55
60
1
Sı́ntomas de sı́ndrome de reacción adversa observados en ratones (grupos de 5 a 10, CF-1, peso medio
20 g, Harlan Spargue Sawley, en ayunas 28 horas) en 2 minutos después de inyección IV.
1
MPK es mg del fármaco de Fórmula III por kg de peso corporal.
3
III es compuesto antibiótico de tipo everninomicina representado por la Fórmula III.
Quizás incluso más sorprendentemente, se observó que las concentraciones inhibitorias mı́nimas
(“MIC”) en los modelos in vitro, y los valores de las dosis protectoras en 50% (“PD50 ”) en un modelo
de protección de ratones in vivo del complejo de 3 a 6 moles de hidroxipropil-β -ciclodextrina “HPβCD”
10
ES 2 104 845 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
en combinación con un mol del compuesto de Fórmula III y 2 ó 3 moles de NMG fueron esencialmente
los mismos que los valores de MICs y PD50 para el compuesto de Fórmula III y para los de la sal de
NMG del compuesto de Fórmula III con HPβCD en dichos modelos. Los valores de unión de proteı́nas
para el complejo de 2 ó 3 moles de NMG por mol del compuesto de Fórmula III con 6 moles de HPβCD
permanecieron a 96-98 % de los valores de unión que se observaron para la sal del compuesto de Fórmula
III con 2 moles de NMG.
Por tanto, se han descubierto sorprendentemente composiciones farmacéuticamente aceptables de materia que contienen un antibiótico oligosacárido lipófilo que permite el suministro eficaz de tal antibiótico
al suero de un animal tal como un mamı́fero, especialmente un hombre, afectado con una infección bacteriana susceptible de tratamiento con tal antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula I, II y III.
Los derivados de 2-hidroxipropilo de α-, β- y γ-ciclodextrina útiles en la presente invención tienen
aproximadamente 2 a 11 grupos hidroxipropilo por molécula de ciclodextrina y se preparan fácilmente
haciendo reaccionar una α-, β- o γ-ciclodextrina con óxido de 1,2-propileno en presencia de una base
de manera que se produzcan mezclas amorfas multicomponentes tal como se describe por J. Pitha en el
documento USP 4.727.064, J. Pitha et al. en International Journal of Pharmaceutics (1986), 29, 73-82
o por Muller en el documento USP 4.870.060. Los productos de autocondensación de óxido de propileno se separan y el grado de sustitución, es decir, el número de grupos hidroxipropilo por molécula
de ciclodextrina se determina convenientemente mediante resonancia magnética nuclear protónica y/o
espectroscopı́a de masas de acuerdo con los métodos descritos por Pitha en el documento USP 4.727.064
y en International Journal of Pharmaceutics (1986) 29, 73-82 o por C.T. Ras et al., en Pharmaceutical
Research (1990) 7, (n◦ 6) 612-615. Las 2-hidroxipropil-α-, -β- y -γ -ciclodextrinas que tienen aproximadamente 2 a 15, preferentemente de forma aproximada 3 a 9, más preferentemente de forma aproximada
5-7,5 grupos hidroxipropilo por molécula de α-, β- y γ-ciclodextrina se preparan fácilmente mediante
procedimientos convencionales y están disponibles también en el comercio en la empresa Cyclolab, que es
propiedad completa subsidiaria de CHINOIN, Pharmaceutical and Chemical Works Ltd., 1325 Budapest,
Hungrı́a; Walker-Chemie GmbH, Division L. Biotechnology Prinzregentestraβe 22 D-8000 Munchen 22
Alemania; American Maize, Hammond, Indiana; Pharmatec Inc, P.O. Box 730, Alachua FL 32615 y
Janssen, Biotech N.V. Lammerdries 55, B-2430 Olen, Bélgica.
Las cantidades de tales hidroxipropil-α-, -β- y -γ-ciclodextrinas suficientes para conseguir un suministro eficaz del antibiótico oligosacárido lipófilo al suero de un animal, especialmente un ser humano, sin
provocar el sı́ndrome de reacción adversa tras la inyección de una composición farmacéutica que contiene
un antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula I, II o III, al menos una cantidad estequiométrica de
una base seleccionada y una cantidad de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina de acuerdo con esta
invención se proporcionan en el párrafo que figura a continuación.
Tal cantidad de hidroxipropil-α-ciclodextrina (“HP-α -CD”) es aproximadamente 5 a 15 moles de
HP-α-CD por mol de un antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula I. Tal cantidad de hidroxipropil-βciclodextrina (HP-β-CD) es aproximadamente 1-9, preferentemente de forma aproximada 2-6 moles de
HP-β-CD por mol de un antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula II o III; tal cantidad de hidroxipropil
-γ-ciclodextrina (“HP-γ-CD”) es aproximadamente 2-8 moles, preferentemente de forma aproximada 3-5
moles de HP-γ-CD por mol de un antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula I. Las sales del antibiótico
oligosacárido lipófilo representado por la Fórmula III son únicamente adecuadas para formar soluciones
completas en agua con una amplia gama de hidroxipropil-α-, -β- y -γ-ciclodextrinas que tienen de aproximadamente 2 a 15 grupos hidroxipropilo por molécula de HP-α-CD o HP-β-CD o HP-γ-CD. Como se
muestra en la Tabla 4, una amplia gama de HP-α-CDs que contienen de 3,9 a 7,5 grupos hidroxipropilo
por molécula de HP-β-CD evitaron esencialmente el sı́ndrome de reacción adversa tras inyección parenteral en un modelo de ratón de un complejo de un mol del compuesto de Fórmula III y 2 moles de NMG
y 6 moles de HP-β-CD.
55
60
11
ES 2 104 845 T3
TABLA 4
5
10
15
20
25
Sı́ndrome de reacción adversa tras inyección parenteral (800 MPK, 80 mg del compuesto de fórmula III
por ml) en ratones de unos complejos en solución acuosa de un mol del compuesto de Fórmula III y dos
moles de NMG y seis moles de HP-β -CD que tienen de 3,9 a 7,5 grupos hidroxipropilo
Números de grupos hidroxipropilo
por molécula de HP-β-CD
% de sı́ndrome de reacción
adversa
Sin HP-β-CD
7,4
7,5
7,4
7,4
7,2
6,9
6,7
6,3
6,2
5,2
4,5
4,4
4,1
3,9
90
0
0
0
0
0
0
10
0
0
0
0
0
10
0
1
Sı́ndrome de reacción adversa observado en ratones (grupos de 10 CF-1, peso medio 20 g, Harlan Spargue Dawley, en ayunas 18 horas) en 2 minutos después de inyección IV (dosis única).
30
35
40
45
50
55
60
En el curso del desarrollo de las composiciones de materia de esta invención, se prepararon tales
composiciones mediante la adición de un antibiótico oligosacárido lipófilo, por ejemplo, el compuesto
representado por la Fórmula III hasta al menos una cantidad estequiométrica, por ejemplo, aproximadamente 2 a 3 moles de la base preferida, N -metil-glucamina, y una cantidad suficiente de dimetilsulfóxido
o glicerol o de derivados de mono-9-octadecenoato -poli(oxi-1,2-etanodiilo) de sorbitán, por ejemplo, polisorbato 80 o Tween 80, o un dextrano tal como las marcas Dextranos 40 ó 70 de polisacáridos [producidos
por la acción de bacterias que crecen en un sustrato de sacarosa que contiene una cadena principal de unidades de D-glucosa unidas predominantemente por α-D (1 *1 6)]. Los Dextranos 40 y 70 (peso molecular
medio 40.000 y 70.000, respectivamente) son polisacáridos producidos por la acción de L. mesenteroxides
sobre sacarosa; tales cantidades suficientes de dimetilsulfóxido, glicerol. Polisorbato 80 o dextrano se
encontró que conseguı́an un suministro eficaz de dichos antibióticos oligosacáridos lipófilos al suero de un
animal, mientras reducı́an o evitaban simultáneamente la producción del sı́ndrome de reacción adversa.
Se hace referencia a los resultados en la Tabla 2. El aumento de la cantidad de DMSO y glicerol [hasta 10
por ciento en peso] redujo la producción del sı́ndrome de reacción adversa; las cantidades suficientes de
DMSO y glicerol eran aproximadamente 5 a 10 por ciento en peso y aproximadamente 10 por ciento en
peso, respectivamente. El aumento de la cantidad de Dextranos 40 y 70 redujo también la producción del
sı́ndrome de reacción adversa; tales cantidades de Dextrano 40 y Dextrano 70 son aproximadamente 2-10,
y al menos aproximadamente 6 por ciento en peso, respectivamente. Cantidades de Tween 80 de aproximadamente 0,1 por ciento en peso a aproximadamente 1 por ciento en peso aumentaron la producción
del sı́ndrome de reacción adversa, pero cantidades de Tween 80 mayores que 1 por ciento disminuyeron la producción del sı́ndrome de reacción adversa, mientras que cantidades de Tween 80 mayores que
aproximadamente 2 a aproximadamente 2 por ciento en peso dieron lugar a una evitación completa del
sı́ndrome de reacción adversa. Cantidades de Tween 80 mayores que 2 a aproximadamente 3 por ciento en
peso se consideran suficientes (todos los porcentajes en peso están basados en el peso total de la composición). Sin embargo, se prefiere el uso de hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrinas para las composiciones
farmacéuticamente aceptables de esta invención. Véase la Tabla 2 expuesta con anterioridad.
Las bases que se encuentra que son adecuadas para ser usadas en la presente invención son
aquellas que forman sales farmacéuticamente aceptables de los antibióticos oligosacáridos lipófilos
de Fórmulas I, II o III, e incluyen bases orgánicas e inorgánicas adecuadas. Bases orgánicas adecuadas incluyen alquil-aminas, alcanolaminas, aminas aromáticas, (alquil aromático)aminas y aminas cı́clicas primarias, secundarias y terciarias. Ejemplos de aminas orgánicas incluyen las bases
farmacéuticamente aceptables seleccionadas entre cloroprocaı́na, procaı́na, piperazina, glucamina, N12
ES 2 104 845 T3
5
10
15
20
metilglucamina, N,N-dimetilglucamina, etilendiamina, dietanolamina, diisopropilamina, dietilamina, Nbencil 2-feniletilamina, N,N’-dibencietilendiamina, colina, clemizol, tris(hidroximetil)aminometano o Dglucosamina. Las bases orgánicas preferidas incluyen N-metil-glucamina (“NMG”), dietanolamina y
tris(hidroximetil)aminometano (“TRIS”). En esta invención es más preferido el uso de NMG. Véanse las
Tablas 2 y 3. Las bases inorgánicas adecuadas incluyen hidróxidos de metales alcalinos tal como hidróxido
de sodio. Las bases que se encuentra que son útiles en la preparación de las composiciones de materia de
la presente invención producen soluciones acuosas que tienen un pH de al menos aproximadamente 9,3.
La lisina forma soluciones acuosas que tienen un pH de menos de 9,3 y, por tanto, la lisina no es una
base adecuada para la presente invención. Los hidróxidos de metales divalentes tales como los hidróxidos
de metales alcalino-térreos, hidróxido de calcio e hidróxido de bario, no formaron soluciones acuosas de
los antibióticos oligosacáridos lipófilos de Fórmulas I, II o III en presencia de 6 moles de HP-β-CD que
tenı́a un pH de al menos aproximadamente 9,3, y fueron inaceptables como bases para ser usadas en la
presente invención.
La expresión “al menos aproximadamente una cantidad estequiométrica” tal como se usa en la presente
memoria descriptiva en referencia con las bases útiles en esta invención significa la cantidad de base
necesaria para reaccionar de forma sustancialmente completa (es decir, que da lugar a una reacción
completa en más de 99 %) con los átomos de hidrógeno fenólicos ácidos de los antibióticos oligosacáridos
lipófilos de Fórmulas I, II o III que tienen uno, dos o tres átomos de hidrógeno fenólicos. (El compuesto
de Fórmula III tienen tres átomos de hidrógeno fenólicos, de los que solamente dos son ácidos). Para
los compuestos de Fórmula I y II en las que R5 = H, hay solamente un átomo de hidrógeno fenólico
por molécula, y la cantidad estequiométrica de las bases farmacéuticamente aceptables de esta invención
tienen aproximadamente de un mol de tal base hasta 12 moles de tales bases. Para los compuestos
representados por la Fórmula I y II, en las que
25
30
35
40
y para los compuestos de Fórmula III hay dos átomos de hidrógeno fenólicos ácidos por mol de tales
compuestos, la cantidad estequiométrica de base requerida para reaccionar completamente con los dos
átomos de hidrógeno fenólicos ácidos es al menos 2 hasta aproximadamente 12 moles de las bases farmacéuticamente aceptables útiles en esta invención. Para los antibióticos oligosacáridos lipófilos preferidos
de Fórmula I y II, en las que
45
50
55
60
y los de fórmula III, se prefiere usar aproximadamente 2 a 6 moles, y es más preferido usar aproximadamente 2,0 a 3,5 moles y lo más preferido es usar aproximadamente 2 a aproximadamente 3 moles de
una base farmacéuticamente aceptable tal como NMG para mantener el pH de una solución acuosa de la
misma a un valor de aproximadamente 9,3, al contrario que las soluciones que tienen un pH superior, y
cuyas soluciones fueron altamente tamponadas cuando se usaban 6-12 moles de NMG.
13
ES 2 104 845 T3
La expresión “antibiótico oligosacárido lipófilo”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva,
significa miembros lipófilos seleccionados del grupo de antibióticos de ortosomicina, más particularmente
flambamicina, las everninomicinas, los antibióticos de tipo everninomicina, curamicina y los antibióticos
de avilamicina A-N.
5
La flambamicina, un antibiótico oligosacárido lipófilo producido por Streptomyces higoscopicus DS
23230, cuya Fórmula estructural es la Fórmula I en la que R1 =R5 =H, Y=OH, R2 =COCH(CH3 )2 ,
R3 =R6 = R7 =R8 =R9 =CH3 , R4 =COCH3 y W=Z=Cl se describe por W.D. Ollis en Tetrahedron, (1979),
35, 105-127.
10
La curamicina A es un antibiótico de flambamicina (que tiene una Fórmula estructural representada
por la Fórmula I en la que R1 , R3 R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , R9 , W y Z son iguales que para la flambamicina,
con la excepción de que R2 =COCH3 e Y=H. Véase las publicaciones de O.L. Galamarine et al., Tetrahedron (1961), 15, 76 y V. Deulofer et al., Anales de Quı́mica (1972), 68, 789.
15
20
25
30
35
40
Los antibióticos de avilamicina A-N son antibióticos oligosacáridos lipófilos aislados a partir de un
complejo de antibióticos producidos por cultivos del organismo Streptomyces viridochromogenes, NRRL
2860. Véase la publicación de J.L. Mertz et al. The Journal of Antibiotics (julio de 1986) Vol. 39 (n◦ 7)
877-887. Las Fórmulas estructurales para los antibióticos de avilamicina A-N están representadas por la
Fórmula I en la que R1 =R5 =H, Y=H, R2 =COCH3 o H, R3 =CH3 , R4 =COCH3 , CH(OH)CH3 o CHO y
R6 =CH3 o H; R7 =CH3 o H; R8 =CH3 , CH2 OH o H; R9 =CH3 o H y W=H o Cl y Z=Cl.
Los antibióticos de everninomicinas útiles en esta invención incluyen las everninomicinas B, C y D
aisladas a partir del complejo de antibióticos producido por el organismo Micromonospora carbonacea
var. carbonacea NRRL 2972 y una variedad del mismo M. carbonacea var. aurantiaca NRRL 2997, como
se describe en el documento USP 3.499.078. Los derivados de everninomicina que tienen un resto nitroso,
hidroxilamino o amino en lugar del resto nitro en las everninomicinas B, C y D se pueden obtener por
reducción del resto nitro en las everninomicinas B, C y D de acuerdo con el procedimiento del documento
USP 4.006.225. Una everninomicina preferida es N-acetilaminoeverninomicina-D y está representada
por la Fórmula II en la que X=NHCOCH3 , Y=H; R4 =CH (OCH3 ) (CH3 ); R3 =R5 =H y R2 =CH3 . La
N-acetialminoeverninomicina D y su sal de di-N-metilglucamina se pueden preparar mediante los procedimientos del documento USP 4.129.720, que describe la reducción del resto nitro de las everninomicinas B,
C y D para producir los derivados aminados que se convierten posteriormente en los derivados de N-acilo,
por ejemplo, N-acetilo, N-alquilo, por ejemplo, NH(C2 H5 ) o N,N-dialquilo, por ejemplo, N(C2 H5 )2 . Se
describe también la preparación de derivados de N-acil-N -hidroxilamino-everninomicina B, C y D y sus
sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de everninomicina 7 representada por la Fórmula II
en la que X=OH, Y=H, R4 =CH(OCH3 ) (CH3 ), R5 =H y R2 =CH3 se describe por A.K. Ganguly et al.
en J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1980, 56-58.
Los antibióticos de “tipo everninomicina” son los antibióticos oligosacáridos lipófilos representados
por la Fórmula II en la que X=NO2 , NO, NH2 , OH, NHCOCH3 , NHC2 H5 , N(C2 H5 )2 , NHOH o H,
Y=OH, R2 =CH3 o H; R3 =H, R4 =CH(OCH3 ) (CH3 ) o H y
45
50
55
60
14
ES 2 104 845 T3
Los compuestos de Fórmula II en la que X=NO2 o NH2 , Y=OH, R2 =R3 =R4 =H y
5
10
15
20
25
30
se aı́slan a partir de un complejo antibiótico 13-384 producido por fermentación del organismo Micromonospora carbonacea var. africana, NRRL 15099, ATCC 39149. Los componentes antibióticos 1 (Fórmula
II, X=NO2 e Y, R2 , R3 , R4 y R5 son cada uno como se define con anterioridad en referencia al antibiótico
13-384) descritos en el documento USP 4.597.968 y 4.735.903 tienen las Fórmulas estructurales descritas
por AK Ganguly et al. en Heterocycles (1984) Vol. 28 (n◦ 1) pag. 83-84. Los antibióticos de tipo
everninomicina de Fórmula II en la que X=H, NHOH, NHCOCH3 y sus derivados de acilo y alquilo se
describen en los documentos USP 4.622.314 y 4.767.748.
Las composiciones preferidas de materia de esta invención incluyen compuestos de Fórmula II en la
que R3 =H y
X
Y
R4
R5
R2
NO2
OH
NO2
NO2
NHCOCH3
OH
H
H
H
H
CH (OCH3 ) (CH3 )
”
H
CH (OCH3 ) (CH3 )
”
H
”
”
”
”
CH3
”
”
”
”
NO2
OH
H
H
NHOH
NHCOCH3
NH2
NHC2 H5
N(C2 H5 )2
”
”
”
”
”
”
”
”
”
”
”
”
35
H
40
45
50
55
60
”
”
”
”
”
”
”
”
”
”
”
”
El más preferido antibiótico de tipo everninomicina se denomina 56 - desacetil - 57 - desmetil - 45 - O
- des(2 - metil - 1 - oxopropil) - 12 - O - (2,3,6 - tridesoxi - 3 - C - metil - 4 - O - metil - 3 - nitro - α - L
- arabino - hexopiranosil) - flambamicina 56 - (2,4 - dihidroxi - 6 - metilbenzoato) que tiene la Fórmula
molecular de: C70 H97 NO38 Cl2 y el peso molecular de 1629 y está representado por la Fórmula III.
El compuesto preferido de la Fórmula III se puede obtener mediante fermentación de Micromonospora carbonacea var. africana NRRL 15099, ATCC 39149 o, más preferentemente, mediante una cepa
mejorada de la misma, obtenida como se describe con posterioridad.
Utilizando la cepa SCC 1413 del cultivo NRRL 15099, ATCC 39/49, el compuesto preferido de Formula III se puede obtener de forma adecuada mediante los procedimientos indicados en el ejemplo I del
15
ES 2 104 845 T3
5
10
15
20
documento USP 4.597.968. En un ejemplo especı́fico, de acuerdo con este procedimiento, el inóculo de
la etapa inicial para la fermentación de la cepa SCC 1413 se preparó transformando 2,5 ml de caldo
completo congelado de 50 ml del medio de germinación en matraces Erlenmeyer de 250 ml. El medio de
germinación consistı́a en extracto de ternera, 0,3 %; triptona, 0,5 %; dextrosa, 0,1 %; almidón de patata,
2,4 %; extracto de levadura, 0,5 % y carbonato de calcio, 0,2 %. El pH del medio se ajustó a 7,5 antes
de la esterilización. Los matraces se incubaron a 30◦C en un agitador rotatorio a 250 r.p.m. durante
48 horas. Para la segunda etapa de germinación, matraces Erlenmeyer de 2 litros que contenı́an 500 ml
del mismo medio fueron inoculados con un 5 % de volumen de la germinación de la primera etapa. Las
condiciones para la incubación fueron las mismas que antes. Se empleó una tercera etapa del inóculo
para todas las fermentaciones en depósitos agitados y se preparó mediante una incubación de 24 horas
del cultivo bajo las mismas condiciones empleadas para la segunda etapa.
Se llevaron a cabo inicialmente fermentaciones de diez litros en fermentadores de Laboratorio NBS de
14 litros en un medio de fermentación que contenı́a extracto de levadura, 0,5 %; hidroxilato de caseı́na,
0,5 %, cerelosa, 1 %; almidón soluble, 2,0 %; carbonato de calcio, 0,4 % y cloruro de cobalto, 0,24 mg. El
pH del medio se ajustó a 6,7 antes de esterilizar y 7,0 antes de inocular. Se usó el inóculo de la tercera
etapa (2,5 %) para iniciar la fermentación que se realizó a 30◦ C con 0,35 vvm de aire y agitación de 350
rpm.
Durante el curso de la fermentación, la producción de antibiótico se verificó cada 24 horas mediante
bioensayo del caldo completo frente a Staphylococus aureus 209P (pH del agar, 7,0) y Escherichia coli
ATCC 10536 (pH del agar, 8,0). Se determinaron también el crecimiento del organismo productor (volumen celular envasado), el pH y los niveles de oxı́geno disuelto de forma intermitente o bien continua. El
curso de una fermentación tı́pica en depósito de 10 litros se ilustra en la Fig. 1.
25
30
35
40
45
50
Se ha desarrollado una cepa mejorada de SCC 1413, NRRL 15099, ATCC 39149 usando agentes
estándar de mutagénesis y se obtuvieron cepas que producı́an rendimientos mejorados del compuesto antibiótico preferido de tipo everninomicina de Fórmula III. En un ejemplo especı́fico, la cepa parental SCC
1413, NRRL 15099, ATCC 39149 se expuso a una cantidad de agente de mutagénesis, N-nitrosoguanidina
(NTG) suficiente para destruir un 90 % de un cultivo de SCC 1413, ATCC 39149, NRRL 15099. Quinientos aislamientos sobrevivientes fueron examinados en cuanto a la actividad biológica frente a S. aureus
y E. coli para determinar qué aislamientos exhibı́an una producción mejorada del antibiótico deseado de
Fórmula III. El procedimiento de ensayo empleado para determinar la actividad aumentada fue como
sigue: aislamientos de colonias sencillas fueron germinados en tubos de ensayo que contenı́an 10 ml de
medios de germinación del ejemplo 1 del documento USP 4.598.968 y se agitaron a 250 r.p.m. en un
agitador rotatorio a 30◦C durante 48 horas. Los estudios de fermentación se iniciaron transfiriendo 2,5
ml de la semilla a matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenı́an 50 ml de medios de fermentación e incubando a 30◦C durante 96 horas a 250 r.p.m. en un agitador rotatorio. El antibiótico obtenido después de
la fermentación fue seguidamente sometido a ensayo en cuanto a la producción memorada de antibiótico
valorando la actividad frente a S. aureus y E. coli y se identificaron los aislamientos que proporcionaron
rendimientos mejorados del antibiótico deseado. Los resultados para un aislamiento mejorado representativo, denominado en la presente memoria descriptiva cepa SCC 1631, se proporcionan en la Tabla 5.
El procedimiento de desarrollo de cepas que antecede se repitió sometiendo el aislamiento mejorado
representativo, SCC 1631, a una exposición adicional a NTG, nuevamente en una cantidad suficiente para
destruir un 90 % de los cultivos, a lo que siguió una selección de los aislamientos en placas de agar que
contenı́an 150 µg/ml de everninomicina D. Los aislamientos que proporcionaron una producción aumentada del antibiótico deseado fueron nuevamente seleccionados valorando su actividad biológica frente a S.
aureus y E. coli. Uno de tales aislamientos, denominado en la presente memoria descriptiva SCC 1756,
se utilizó seguidamente para producir el antibiótico preferido de Fórmula III.
Adicionalmente, la mutagénesis en NTG de SCC 1756 produjo al actual cepa de producción, SCC
2146.
55
60
En los procedimientos de mutación que anteceden, los protocolos para ambos estudios fueron como se
describió con anterioridad en la presente memoria descriptiva. Para los dos últimos estudios de mutación,
se extrajeron caldos de fermentación con acetato de etilo y los concentrados se cromatografiaron en placas
de capa fina Whatman LKGDF en un sistema disolvente que consistı́a en cloroformo:metanol (9:1 v/v),
lo que estuvo seguido de bioautografı́a frente a S. aureus y E. coli para confirmar la producción de todos
los componentes del complejo antibiótico. Para seguir los tı́tulos aumentados del compuesto de Fórmula
III, se examinaron placas de capa fina usando el escáner de placa TLC Shimadzu CS-930 y cuantificando
los extractos de producciones más elevadas usando HPLC. Los tı́tulos combinados se definen como la
16
ES 2 104 845 T3
suma del compuesto de Fórmula III (antibiótico 13-384, componente 1 del documento USP 4.597.968) y
el análogo de nitroso de dicho componente 1, es decir, el antibiótico 13-384, componente 1a.
5
10
15
20
25
Observaciones tempranas indicaron que aunque la cepa parental SCC 1413 creció rápidamente a 34◦ C,
la producción de antibiótico fue óptima de la temperatura era inferior. El fenómeno se investigó como un
medio de optimización de la fermentación. Los resultados del estudio de la temperatura indicaron que la
producción óptima se obtuvo cuando la temperatura se rebajó de 34◦ C a 30◦ C después de 24 horas de
incubación. Todo el trabajo posterior en depósitos agitados siguió el protocolo de incubar la fermentación
a 34◦ C durante 24 horas, lo que fue seguido de rebajar la temperatura a 30◦ C durante la duración del
experimento de fermentación.
Se realizaron estudios de medios conjuntamente con el aislamiento de las cepas mejoradas de producción. Se investigaron sustituciones de las fuentes de carbono y nitrógeno, ası́ como la adición de
minerales y otros nutrientes complejos. La sustitución de hidrolisado de caseı́na con peptona de carne
o bien de pescado y la sustitución del almidón soluble con dextrina de patata (PDP 650) aumentó la
producción de antibiótico usando cepas SCC 1413 y SCC 1631. Se observaron posteriores aumentos en la
producción del compuesto de Fórmula III con la adición de licor concentrado de maı́z y cloruro de nı́quel
(II) en estudios con la cepa SCC 1756. Los actuales medios de fermentación de producción (4I + 1/2
Ni) optimizados para el compuesto de Fórmula III contienen glucosa, 2,2 % en peso; dextrina PDP 650,
4,0 % en peso; extracto de levadura, 0,5 % en peso; peptona de carne, 0,6 % en peso; licor concentrado de
maı́z, 0,5 % en volumen; cloruro de nı́quel, 2,5 x 10−6 M; y carbonato de calcio, 0,4 % en peso. El pH del
medio se ajustó a 6,7 antes de la adición de carbonato de calcio. La Tabla 6 muestra una comparación
de los tı́tulos para las cepas SCC 1413, SCC 1631, SCC 1756 y SCC 2146, obtenidos en los estudios en
matraces agitados (50 ml del actual medio de producción en matraces Erlenmeyer de 250 ml, a 30◦ C,
durante 96 horas, a 300 r.p.m.). Se demuestra claramente la marcada mejora del tı́tulo (1,5 veces sobre la
cepa parental original, SCC 1413). Se han conseguido tı́tulos de 555-750 µg/ml (suma del compuesto de
Fórmula III y su derivado nitroso) en fermentaciones de 100 litros usando el actual medio de producción
con la mejor cepa de producción, SCC 2146. (Tabla 7).
TABLA 5
30
Comparación de cepas SCC 1413 y SCC 1631 en fermentaciones que muestran zonas de inhibición
(mm) en placas de agar1
Ensayo 1
35
40
Ensayo 2
Cepa
SCC
S. aureus pH 7
Sin diluir 1:20
E. coli pH 8
Sin diluir
S. aureus pH 7
Sin diluir
1:20
1631
1413
28,7, 28,7
28,7, 28,7
20, 17,5
12 H3 , 12 H3
28,1, 28,8
23,8, 23,1
22,0
19,0
23,3, 23,1
20,5, 19,8
E. coli pH 8
Sin diluir
4,8 C2 , 15,0 C2
12 H3 , 12 H3
1. Determinaciones duplicadas cuando sea apropiado
45
2. Zona transparente
3. Zona turbia
TABLA 6
50
Comparación en matraces de cepas SSC’s 1413, 1631, 1756 y 2146 de Micromonospora Carbonacea var.
africana NRRL 15099, ATCC 39149
Tı́tulo del compuesto de Fórmula III y su análogo nitroso (1A) (µg/ml)
55
60
Cultivo
SCC
SCC
SCC
SCC
1413
1631
1756
2146
1 (NO2 )
1a (NO)
combinado (1 + 1a)
5
14
17
39
3
4
16
85
8
18
33
124
17
ES 2 104 845 T3
TABLA 7.
Fermentaciones de 100 litros de SCC 2146
Tı́tulo de la Fórmula III y su análogo de NO (1A) (µg/ml)
5
10
15
Medios
1 (NO2 )1
1a (NO)2
combinado (1 + 1a)
4I
4I
4I + 1/2 Ni3
4I + Ni4
4I + 1/2 Ni3
4I + 1/2 Ni3
105
135
55
150
100
130
315
170
500
575
650
470
420
305
555
725
750
600
Notas a pie de la Tabla 7
1. El antibiótico de tipo verninomicina de Fórmula III.
2. El análogo nitroso del antibiótico de Fórmula III.
20
3. Concentración de nı́quel (1/2 Ni) = 2,5 x 10−6 M.
4. Concentración de nı́quel Ni = 5 x 10−6 M.
25
30
35
40
45
El aislamiento del complejo antibiótico oligosacárido lipófilo que contiene el compuesto de Fórmula III
y su análogo nitroso se realizó mediante el uso de los procedimientos de los Ejemplos 1C del documento
USP 4.597.968. El caldo de fermentación se ajustó a pH 7 y se extrajo dos veces con un volumen de
acetato de etilo de dos veces el volumen del caldo de fermentación. Los extractos combinados de acetato
de etilo se concentraron y las cantidades del compuesto de Fórmula III y su análogo nitroso se determinaron mediante HPLC. El análogo nitroso se convirtió en el compuesto nitro de Fórmula III mediante el
uso de un agente oxidante tal como hidroperóxido de butilo terciario (t-BuO2 H) con acetilacetonato de
vanadilo disuelto en un disolvente orgánico aprótico a temperatura ambiente. El curso de la reacción se
verificó mediante, por ejemplo, HPLC. La mezcla de reacción se inactivó con trialquilfosfito y el producto
en bruto se purificó mediante técnicas cromatográficas estándar, por ejemplo, cromatografı́a en columna
de gel de sı́lice (acetona/CH2 Cl2 ) o una columna que contenga un polı́mero polihidroxivinı́lico tal como
Fractogel (Toyo Pearl) disponible en la empresa Toyo Haas, Philadelphia, Pennsylvania.
La composición farmacéuticamente aceptable de materia de esta invención puede contener, además
de (a) un antibiótico de Fórmula I, II, II, (b) antibióticos y (c) una cantidad especificada de, por ejemplo, hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina que tienen 2 a 15 grupos hidroxipropilo por moléculas de
ciclodextrina, aproximadamente 0 a aproximadamente 6,0 por ciento en peso (basado en el antibiótico de
Fórmula I, II, III) de un tensioactivo no iónico farmacéuticamente aceptable. El tensioactivo no iónico
farmacéuticamente aceptable preferido, cuando se usa, es el derivado sorbitán-mono-9-octadecenoatopoli(oxi-1,2-etanodiilo) tal como Tween-80, pero cualquier otro tensioactivo no iónico produce composiciones farmacéuticamente aceptables, es decir, composiciones que cuando se disuelven en un vehı́culo
farmacéuticamente aceptable están sustancialmente exentas de turbiedad, nebulosidad o materia en forma
de partı́culas cuando se miden mediante técnicas analı́ticas estándar, por ejemplo, nefelometrı́a. Las composiciones particularmente preferidas de materia de esta invención contienen 2,85 a 5,70 % en peso de
Tween-80 y un compuesto antibiótico de Fórmula III.
50
Actividades biológicas
55
60
Se ha encontrado sorprendentemente que la composición de materia de esta invención, que comprende
un mol del compuesto representado por la Fórmula III, 2 moles de NMG y 6 moles de 2-hidroxipropil-βciclodextrina que tiene 7,4 grupos hidroxipropilo por molécula de β-ciclodextrina, tiene sustancialmente
las mismas MICs medias geométricas (GMM) frente a diversas bacterias, y sustancialmente los mismos
valores de unión a proteı́nas del suero que el compuesto de Fórmula III per se. Es de esperar que todas
las composiciones de materia de esta invención se comportarán análogamente.
Los ensayos de la actividad antibacteriana in vitro se realizaron mediante los métodos de dilución
en agar convencionales en agar Mueller-Hinton. Las GMMs para la composición de materia preferida
anteriormente citada de esta invención y para el compuesto de Fórmula III se determinaron frente a
18
ES 2 104 845 T3
5
10
diversas bacterias, por ejemplo, bacterias gram -positivas y gram-negativas. La expresión “infecciones
por bacterias gram-positivas y gram-negativas” significa una amplia gama de infecciones por bacterias
gram-positivas, por ejemplo, estafilococos resistentes a la meticilina y susceptibles a la meticilina, diversas
cepas de estreptococos y enterococos y algunas infecciones por bacterias gram-negativas, por ejemplo, E.
coli, Klebsiella, Salmonella y Pseudomonas. El compuesto de Fórmula III tenı́a una excelente actividad
(10 veces más potente que la vancomicina) tanto frente a estafilococos resistentes a la meticilina (GMM,
0,1 µG/ML) a estafilococos susceptibles a la meticilina (GMM, 0,5 µg/ml). El compuesto de Fórmula III
tenı́a también una buena actividad (2 veces más potente que la vancomicina) frente a Enterococcus faecalis
(GMM, 0,49 µg/ml) y una buena actividad (MICs ≤ 0,5 µg/ml) frente a diversas cepas de estreptococos
y enterococos resistentes a la vancomicina (MICs ≥ 128 µg/ml). El compuesto de Fórmula III era muy
activo frente a Borrelia burodorferi (MICs ≤ 0,49 µg/ml) y Legionella pneumophila y L. Iongbeacheae
(MICs 2,5 µg/ml) pero era solamente muy ligeramente activa frente a bacterias gram-negativas (GMM
≥ 760 µg/ml), Trichomonas vaginalis (MICs ≥192 µg/ml) y Mycoplasma sp. (MICs 200 µg/ml). No se
observó ninguna resistencia cruzada con otros antibióticos.
15
20
El compuesto de Fórmula III tenı́a una actividad bactericida moderada frente a diversas cepas clı́nicas
y de laboratorio de estafilococos. La actividad bactericida del compuesto de Fórmula III frente a estafilococos y enterococos era similar a la de la vancomicina. El compuesto de Fórmula III tenı́a una buena
actividad frente a estafilococos en ratones (PD50 varı́a en el intervalo de 0, 5 a 25, 0 mg/kg), similar a la
de la vancomicina (0,7 a 28,5 mg/kg).
Después de la administración IV (30 mg/kg) del compuesto de Fórmula III y 2 moléculas de NMG,
se observaron elevados niveles en suero en ratas (pico de aproximadamente 90 µg/ml) con una larga vida
media beta en suero.
25
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de materia de esta invención se espera que sean
activas frente a las bacterias susceptibles anteriormente citadas, ası́ como frente a espiroquetas que incluyen Treponema pallidum, anaerobios que incluyen Clostridium difficile ası́ como frente a Toxoplasma,
protozoos y helmintos.
30
Sobre la base de la actividad del compuesto de Fórmula III frente a Borrelia burgdorferi y Legionella
pneumophila y L. longbeacheae, se espera que las composiciones de materia que contienen el compuesto de
Fórmula III exhibirán actividad en un modelo humano frente a la enfermedad de Lyme y la enfermedad
de la legionella.
35
La presente invención proporciona un método para tratar o prevenir infecciones bacterianas grampositivas y gram-negativas susceptibles en animales administrando a tales animales, especialmente hombres afectados con tales infecciones, una cantidad de una composición farmacéutica de las composiciones
de materia de esta invención y un vehı́culo farmacéuticamente aceptable para las mismas.
40
45
50
55
60
Las composiciones de materia de esta invención se pueden combinar con cualquier vehı́culo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua esterilizada, etanol acuoso, aceites vegetales o polioles,
por ejemplo, polietilenglicoles y propilenglicol y se pueden administrar por vı́a oral, parenteral o tópica
en una diversidad de formulaciones. Se prefiere el uso de agua esterilizada como un vehı́culo. El agua
esterilizada puede contener opcionalmente sustancias farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, cloruro
de sodio, nitrato de potasio, glucosa, manitol, dextrosa, sorbitol, xilitol o tampones tales como fosfato,
acetato o citrato ası́ como conservantes.
Las composiciones de materia de esta invención se preparan mezclando un antibiótico oligosacárido
lipófilo de Fórmula I, II o III con al menos aproximadamente una cantidad estequiométrica de una base
capaz de formar una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en un disolvente adecuado tal como
agua, y con una cantidad especificada de, por ejemplo, hidroxipropil-α-, -β- o -γ -ciclodextrina que tenga
aproximadamente 2 a 15 grupos hidroxipropilo por molécula de ciclodextrina. El orden de mezcladura no
es crı́tico, pero preferentemente una solución acuosa de la ciclodextrina especı́fica se mezcla con la base o,
alternativamente, se puede añadir después de que la base se mezcle con el antibiótico oligosacárido lipófilo.
La formación de las soluciones acuosas puede tener lugar a una temperatura entre 15◦ y 35◦ C. La solución
acuosa ası́ formada se filtra para producir una solución acuosa transparente del complejo, que puede ser
evaporada o preferentemente liofilizada para formar las composiciones de materia de esta invención en
la forma de un polvo liofilizado que se reconstituye fácilmente mediante la adición de una cantidad de
un vehı́culo farmacéuticamente aceptable tal como agua. El tensioactivo no iónico farmacéuticamente
aceptable, por ejemplo, Tween 80, cuando se usa, se añadirı́a a la solución acuosa antes de la filtración
y liofilización. Alternativamente, la solución acuosa puede ser congelada, descongelada y posteriormente
19
ES 2 104 845 T3
5
10
15
20
25
30
filtrada antes de ser usada, por ejemplo, en forma de una formulación IV. Es una caracterı́stica especial
de la presente invención que las composiciones farmacéuticas de la presente invención forman soluciones
acuosas y, sin embargo, contienen menos de aproximadamente 20 por ciento en peso, preferentemente
menos de 10 y más preferentemente aproximadamente 1,0 a 5,0 por ciento en peso de una cantidad
de hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina. El descubrimiento de que las composiciones farmacéuticas
útiles para suministrar de forma segura y eficaz antibióticos oligosacáridos lipófilos al suero de animales
afectados con infecciones bacterianas susceptibles, especialmente infecciones bacterianas gram-positivas
y gram-negativas susceptibles, podrı́an prepararse mediante el uso de menos de 20 por ciento en peso
de, por ejemplo, hidroxipropil-β -ciclodextrina es particularmente sorprendente teniendo en cuenta lo
expuesto en el documento USP 4.983.586 de Bodor que usa 40 a 60 por ciento en peso de hidroxipropil-β
-ciclodextrina para solubilizar diversos fármacos, incluidas sales de ácido retinoico.
Para administración oral, las composiciones de esta invención se pueden componer en forma de comprimidos, cápsulas, elixires o similares. Los comprimidos y cápsulas pueden contener excipientes tales
como almidón o lactosa; las formas lı́quidas pueden contener agentes colorantes o de sabores. Las preparaciones tópicas pueden estar en la forma de cremas, ungüentos hidrófobos e hidrófilos o lociones acuosas,
no acuosas o de tipo emulsión, ası́ como en forma de pesarios o polvos. Los vehı́culos tı́picos para tales
formulaciones son agua, aceites, grasas, poliésteres y polioles. Las formulaciones parenterales, por ejemplo, formas de dosificación inyectables, son habitualmente lı́quidas tales como soluciones o suspensiones,
siendo los vehı́culos tı́picos agua destilada y solución salina. Son preferidas las formulaciones parenterales.
Son más preferidas las formulaciones intravenosas (IV).
La dosis que va a ser administrada en cualquier forma de dosificación particular dependerá de diversos
factores, tales como el peso, edad y sexo del animal, especialmente un mamı́fero tal como un ser humano
que está siendo tratado, la susceptibilidad del organismo infectante al antibiótico oligosacárido lipófilo
y la etapa y gravedad de la infección. Generalmente, la dosificación de los antibióticos oligosacáridos
lipófilos de Fórmula I, II o III administrada es de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 15 mg
por kilogramos de peso corporal, preferentemente aproximadamente 5 mg por kilogramo de peso corporal
por dı́a en dosificaciones divididas, dejándose a la discreción del facultativo la dosificación especificada;
se prefiere la administración IV.
En el tratamiento de ciertos pacientes con las composiciones de esta invención, es posible incluir otros
ingredientes activos en la misma unidad de dosificación.
35
Ejemplos
Ejemplo 1
40
45
Se realizó una fermentación en 100 litros de la cepa SCC 2146 de Micromonospora carbonacea var.
africana NRRL 15099, ATCC 39149 mejorada como se describió con anterioridad, de acuerdo con los
procedimientos del Ejemplo 1B del documento USP 4.597.968, con la excepción de que se usó el siguiente
medio de producción (4I + 1/2 Ni) y de que la fermentación se realizó a 34◦ C durante 24 horas rebajando
la temperatura a 30◦C durante la duración del experimento de fermentación, es decir, durante otras 72
horas (tiempo total de fermentación de 96 horas). Las velocidades de aireación y agitación fueron 0,35
vvm y 350 rpm, respectivamente.
Glucosa
Dextrina PDP 650
Extracto de levadura
Peptona de carne
Licor concentrado de maı́z
Cloruro de nı́quel
Carbonato de calcio
Agua corriente, c.s. para
50
55
2,2 % (peso)
4,0 % (peso)
0,5 % (peso)
0,6 % (peso)
0,5 % (peso)
2,5 x 10−6 M
0,4 % (en peso)
1000 ml
B. Aislamiento
60
Se extrae el caldo de fermentación del Ejemplo 1A dos veces con 200 1 de acetato de etilo. Se combinan
los extractos de acetato de etilo y se concentran para proporcionar un complejo antibiótico concentrado
que contiene una mezcla del compuesto de Fórmula III y su análogo nitroso (según se determina mediante
HPLC).
20
ES 2 104 845 T3
Ejemplo 2
5
10
15
20
25
A) A 919 g de complejo antibiótico producido como se describe en el Ejemplo I y que contiene 294 g
(32 %) de una mezcla de 3,4 moles del análogo nitroso para un mol del compuesto de Formula III disuelto
en 4,6 l de acetato de etilo, se añadieron 68,8 g de NaHCO3 y 2,98 g de acetilacetonato de vanadilo 3 M
en 2,2,4-trimetilpentano disponible en la empresa Aldrich (0,06 eq.); a la mezcla ası́ formada se añadieron
394 ml de t-butilhidroperóxido 3 M después de un perı́odo de 1/2 hora. Se le añadieron porciones de 1,45
g (0,03 eq.) de acetilacetonato de vanadilo a las 0 y después de 1, 1/2, 2, 3 1/2 y 4 horas, se forma que
se añadieron 0,15 eq de acetilacetonato de vanadilo durante 4 horas. La mezcla de reacción se sumergió
en un baño de hielo y se le añadieron 203 ml (0,5 eq.) de trietilfosfito (C2 H5 O)3 P. La mezcla de reacción
ası́ formada se diluyó con una cantidad igual de acetato de etilo mientras se mantenı́a la temperatura
de la mezcla de reacción a ≤ 30◦ C. La mezcla de reacción diluida de acetato de etilo se lavó dos veces
con agua. Las capas acuosas se salificaron y se extrajeron con acetato de etilo. Los extractos orgánicos
combinados se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se concentraron. El residuo ası́ formado se disolvió
en una cantidad mı́nima de acetona y se precipitó en 7 l de 1:9 (v/v) de etiléter/hexano. El residuo se
filtró y se lavó con hexano, se secó bajo vacı́o y se calentó para proporcionar 928 g que contenı́an 30 %
(278 g) del compuesto nitro de Fórmula III.
B) El residuo del ejemplo 2A se purificó en 5 kg de gel de sı́lice en una columna. La columna se eluyó
con 12 litros de CH2 Cl2 que contenı́an sucesivamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % (v/v) de acetona. Las
fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron a ≤ 35◦ C. El residuo ası́ formado se disolvió en
acetona y se precipitó en 10 partes de 10 % de etil-éter/hexano. El producto se filtró y se secó bajo vacı́o
sin calor. La fracción principal contenı́a 147,5 g del compuesto de Fórmula III (98,7 % puro). Las otras
fracciones contenı́an producto en bruto y se sometieron a cromatografı́a repetida de gel de sı́lice hasta
que se obtuvo producto al menos 96-98% puro. La estructura se determinó mediante RMN y MS y se
encontró que era congruente con la de la Fórmula III.
Ejemplo 3A
30
35
40
45
Se preparó en 5 ml de agua una solución acuosa que contenı́a 23,97 mg de N-metil-glucamina (“NMG”)
y 570,90 mg de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (“HPβCD”) que tenı́a 7,4 grupos hidroxipropilo por
molécula de HPβCD.
A esta solución se añadieron 100 mg del compuesto de Fórmula III. Después de agitar suavemente, se
formó un complejo homogéneo que contenı́a 20 mg por ml del compuesto de Fórmula III. Las relaciones
en moles de los tres componentes fueron 1 mol del compuesto de Fórmula III a 2 moles de “NNMG” a 6
moles de HPβCD. La solución ası́ formada se filtró a través de una membrana de 0,45 µm y se liofilizó y
se almacenó en un entorno exento de humedad. Para la preparación de una composición farmacéutica,
se añadió un vehı́culo farmacéuticamente aceptable tal como agua. Se obtuvieron resultados similares
usando HPβCD que tenı́a 3,9 a 7,5 grupos hidroxipropilo por mol de β-ciclodextrina.
La formación de una solución acuosa transparente de un complejo homogéneo preparado de acuerdo
con este procedimiento de este Ejemplo se verifica mediante el uso de técnicas estándar, es decir, nefelometrı́a de dispersión luminosa y mediciones de ancho de lı́nea en una RMN protónica. La administración
segura y eficaz de la composición farmacéutica de soluciones acuosas transparentes del complejo homogéneo preparado de acuerdo con los procedimientos de esta invención se ensayó en diversos modelos
in vivo de animales, tal como se expresa en las Tablas 1-4.
Ejemplo 3B
50
55
60
Se sigue el procedimiento del Ejemplo 3A con la excepción de que se añadieron 1750 mg de HPβCD
que contenı́a 7,4 grupos hidroxipropilo por molécula a una solución acuosa de 126 mg de NMG y 350 mg
del compuesto de Fórmula III. Las relaciones en moles de los tres componentes en la solución homogénea
ası́ formada fueron 1 mol del compuesto de Fórmula III a 3 moles de NMG a 5 moles de HPβCD. A esta
solución se añadieron 500 mg de manitol granular, calidad USP, y 10 mg de Polisorbato-80 (Tween-80)
NF. El porcentaje en peso de Tween-80 es 2,85 % sobre la base del compuesto de Fórmula III. La solución
ası́ formada se filtró y se liofilizó como se describió en el Ejemplo 3A.
La composición liofilizada se almacenó en viales en un entorno exento de humedad. Para la preparación de una composición farmacéutica adecuada para administración i.v., se añadieron 20 ml de agua
estéril.
21
ES 2 104 845 T3
Ejemplo 4
5
10
15
Los siguientes ejemplos presentan el uso de la técnica de microtitulación quı́mica RMN para la determinación de las constantes de equilibrio para complejar el anillo 2,4-dihidroxi-6-metil-fenilo (anillo dicloroaromático) de la sal de NMG del compuesto de Fórmula III con 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD)
que tenı́a 7,4 y 3,4 grupos hidroxipropilo por mol de HPβCD y con 2-hidroxipropil-γ-ciclodextrina
(“HPγCD”) que tenı́a 4,4 grupos hidroxipropilo por mol de HPγCD. Las mediciones se hicieron usando
un aparato Varian XL 400 a 400 mHz a 20◦ C.
A. Se preparó una solución que contenı́a 10 mg del compuesto de Fórmula III por ml de D2 O y 3 equivalentes de N -metil-glucamina (“NMG”). A esta solución se añadieron porciones de mg de HPβCD que
tenı́a 7,4 grupos hidroxipropilo por molécula de HPβCD. Se midieron el cambio en los desplazamientos
quı́micos del grupos metilo 68 en la Fórmula III y 54 protones de metileno en la Fórmula III a medida
que se añadı́an cantidades crecientes de HPβCD. Las constantes de equilibrio para una complejación del
50 % se calcularon usando técnicas estándar. Se determinaron también los moles de HPβCD necesarios
para conseguir una complejación o unión del 90 % en los dos anillos aromáticos. Los moles de HPβCD
requeridos para conseguir una complejación del 90 % en los dos sitios aromáticos fue 6,6; se requirieron 2
moles de HPβCD para conseguir una complejación del 50 %. Las constantes de equilibrio se recogen en
la siguiente Tabla 8.
20
B. Se siguieron los procedimientos del Ejemplo 4A, con la excepción de que se usó HPβCD que tenı́a
3, 4 grupos hidroxipropilo por mol de HPβCD. Los resultados se expresan en la siguiente Tabla 8. Los
moles de HPβCD requeridos para conseguir una complejación del 90 % en los dos sitios aromáticos fue
6,6 moles.
25
C. Se siguieron los procedimientos del Ejemplo 4C con la excepción de que se usó HPγCD que tenı́a
4, 4 grupos hidroxipropilo por mol de HPγCD. Los moles de HPγCD requeridos para conseguir una
complejación del 90 % en los dos sitios fue 4,0; se requirieron 1,4 moles para conseguir una complejación
del 50 %. Los resultados se recogen en la Tabla 8 a continuación:
30
TABLA 8
Constantes de equilibrio (litros/mol) para complejos de 1 mol de Compuesto III: 3 moles de NMG con
HPβCD y HPγCD
35
40
Sitio de complejación
en compuesto III
HPβCD n1 =7,4
HPβCD n1 =3,4
HPγCD n2 = 4,4
Anillo aromático
sin cloro3
183±5
188±5
355±9
Anillo dicloroaromático4
953±18
983±34
315±28
1
n = número medio de grupos hidroxipropilo por molécula de HPβCD
2
n = número medio de grupos hidroxipropilo por molécula de HPγCD
45
50
3
Anillo aromático sin cloro en III =
55
60
22
ES 2 104 845 T3
5
4
Anillo dicloro-aromático en III =
10
15
Mediante el uso de la técnica de microtitulación quı́mica RMN, la cantidad complejante de HPβCD
que tiene 7,4 grupos hidroxipropilo por molécula de HPβCD requerida para un mol de la sal 3:1 de NMG
del antibiótico de Fórmula III se determinó que era 6,6 moles para conseguir una complejación del 90 %
(en los dos grupos aromáticos en la Fórmula III) y que era de 2 moles para conseguir una complejación
del 50 % en los dos grupos aromáticos en la Fórmula III.
20
25
30
35
40
45
50
55
60
23
ES 2 104 845 T3
REIVINDICACIONES
1. Una composición de materia, que comprende:
5
(a) un antibiótico oligosacárido lipófilo representado por la Fórmula I:
10
15
20
25
30
en la cual:
35
40
45
X=NO2 , NO, NH2 , NHCOCH3 , NHOH, NH (C2 H5 ), N(C2 H5 )2 , OH o H;
R2 =CH3 , COCH(CH3 )2 , COCH3 , CO(CH2 )3 CH3 , COCH2 CH3 o H;
R3 =CH3 o H;
R4 =COCH3 , CH(OCH3 )(CH3 ), CH(OH)CH3 , CHO o H;
50
55
60
24
ES 2 104 845 T3
R6 =CH3 o H;
R7 = CH3 o H;
R8 = CH3 , CH2 OH o H;
R9 =CH3 o H;
Y=OH, H o CH3 ;
W=Cl o H; y
Z=Cl o H.
5
10
15
(b) al menos aproximadamente una cantidad estequiométrica de una base capaz de formar una sal
farmacéuticamente aceptable con un antibiótico oligosacárido lipófilo de Fórmula I;
(c) una cantidad de un hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en la que el número medio de sustituyentes hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente 2
a aproximadamente 15, y dicha cantidad es suficiente para conseguir un suministro eficaz de dicho antibiótico oligosacárido lipófilo al suero de un animal, mientras se evita simultáneamente el sı́ndrome de
reacción adversa; y
(d) 0 a 6,0 % en peso (base, un antibiótico de Fórmula I) de un tensioactivo no iónico farmacéuticamente aceptable.
20
2. Una composición de materia, que comprende:
(a) un compuesto representado por la Fórmula II:
25
30
35
40
45
50
en la cual X=NO2 , NO, NHOH, NH2 , NHCOCH3 , NHC2 H5 , N(C2 H5 )2 , OH o H
Y=OH, H o CH3
55
R2 =H o CH3
R3 =H
60
R4 =H o CH(OCH3 ) (CH3 )
y
25
ES 2 104 845 T3
5
10
15
20
(b) al menos aproximadamente una cantidad estequiométrica de una base capaz de formar una sal
farmacéuticamente aceptable con un compuesto de Fórmula II;
(c) una cantidad de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en la que el número medio de sustituyentes hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente 2
a aproximadamente 15, y dicha cantidad es suficiente para conseguir un suministro eficaz de dicho antibiótico oligosacárido lipófilo al suero de un animal mientras se evita simultáneamente la producción del
sı́ndrome de reacción adversa; y
(d) 0 a 6,0 % en peso (base, un compuesto de Fórmula II) de un tensioactivo no iónico farmacéuticamente aceptable.
25
3. Una composición de materia, que comprende
(a) la composición representada por la Fórmula III
30
35
40
45
50
55
60
(b) al menos aproxima amen e os equivalentes de una base (por mol del compuesto de Fórmula III)
capaz de formar una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de Fórmula III (c) una cantidad de
hidroxipropil-α-, -β- o -γ -ciclodextrina que tenga aproximadamente 2 a aproximadamente 15 grupos hidroxipropilo por mol de dicha -α-, -β- o -γ-ciclodextrina y en donde dicha cantidad de dicha ciclodextrina
es suficiente para conseguir un suministro eficaz de dicho antibiótico oligosacárido lipófilo al suero de
un animal mientras se evita simultáneamente la producción del sı́ndrome de reacción adversa; y (d)
26
ES 2 104 845 T3
0 a 6,0 % en peso (base, un compuesto de Fórmula III) de un tensioactivo no iónico farmacéuticamente
aceptable.
5
10
4. La composición de la reivindicación 1, en la que los antibióticos oligosacáridos lipófilos representados por la Fórmula I se seleccionan entre flambamicina, las everninomicinas, los antibióticos de tipo
everninomicina, curamicina y los antibióticos de avilamicina A-N.
5. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la base se selecciona entre cloroprocaina, procaina, piperazina, glucamina, N-metilglucamina, N,N’-dimetilglucamina, etilendiamina,
dietanolamina, diisopropilamina, dietilamina, N-bencil-2-fenil -etilamina, N,N’-dibenciletilendiamina, colina, clemizol, tris(hidroximetil)aminometano, D-glucosamina o hidróxido de sodio.
6. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la base es N-metilglucamina.
15
7. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que se usa hidroxipropil-β-ciclodextrina.
8. Las composiciones farmacéuticas de cualquier reivindicación anterior, en las que la relación en
moles de (a):(b):(c) es 1:2-3:1-6.
20
9. Una composición de la reivindicación 3, que comprende un tensioactivo no iónico farmacéuticamente
aceptable.
10. Una composición de la reivindicación 9, en la que el tensioactivo no iónico farmacéuticamente
aceptable es un derivado de sorbitan-mono-9-octadecenoato-poli(oxi-1,2 -etanodiilo).
25
11. Una composición de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente manitol.
30
35
40
12. Una composición farmacéutica para tratar infecciones bacterianas susceptibles gram-positivas y/o
gram-negativas que comprende una cantidad antiinfecciosa de una composición de materia de cualquier
reivindicación anterior y un vehı́culo farmacéuticamente aceptable para la misma.
13. El uso de un compuesto de Fórmula I, II o III según se define en las reivindicaciones 1 a 3,
en la elaboración de una composición farmacéutica en una terapia para tratar una infección mientras
se evita simultáneamente la producción del sı́ndrome de reacción adversa, en el que dicha terapia comprende adicionalmente administrar una cantidad de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en la que
el número medio de sustituyentes hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de
aproximadamente 2 a aproximadamente 15.
14. El uso de una hidroxipropil-α-, -β- o -γ -ciclodextrina, en la que el número medio de sustituyentes
hidroxipropilo en dicha α-, β- y γ-ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, en la elaboración de una composición farmacéutica para administrar en combinación con un
compuesto de Fórmula I, II o III según se define en la reivindicación 1, en una terapia para tratar una
infección, siendo administrada dicha hidroxipropil-α-, -β- o -γ-ciclodextrina en una cantidad que dé lugar
a la evitación del sı́ndrome de reacción adversa.
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
27
ES 2 104 845 T3
28
ES 2 104 845 T3
29
ES 2 104 845 T3
30
ES 2 104 845 T3
31