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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de Médico Veterinario Y Zootecnista. AUTORA: Valeria Sofía Poma Vivanco TUTOR: Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc. Quito, Diciembre, 2014 ii DEDICATORIA Dedico este proyecto de tesis a Dios y a mis padres. A Dios por su incondicional amor y la fortaleza que me ha dado en cada paso. A mis padres, por todo el amor y apoyo que me han brindado a lo largo de mi vida, por enseñarme a no rendirme y siempre dar mi mejor esfuerzo. Valeria Poma iii AGRADECIMIENTO Agradezco a mis padres, Joselito y Zonia, que siempre me han alentado para cumplir mis sueños, por todo lo que han hecho cada día para mi bienestar, por apoyarme en mi carrera y nunca dejarme rendir. A las empresas que colaboraron en este proyecto, por la apertura que nos dieron al realizar esta investigación. A mi tutor el Dr. Christian Vinueza, y a la Dra. María Belén Cevallos Directora del laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria (UCE), quienes me permitieron ser parte de esta investigación y confiaron en mí para la elaboración de este proyecto. A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, y al Centro Internacional de Zoonosis, por facilitar sus instalaciones durante la elaboración de este proyecto. A Nathaly y Sofía por los momentos compartidos durante la elaboración de nuestras tesis, que sin su colaboración este proyecto no hubiera sido posible. A mis amigos, mi segunda familia quienes han sido mi pilar en los momentos difíciles, que me ayudaron a levantarme cuando más lo necesite y aunque a veces la distancia nos separe, me han demostrado su apoyo incondicional. iv ACEPTACIÓN DEL TUTOR Por la presente dejo constancia que he leído el Proyecto de Trabajo de Grado, presentado por la señorita Valeria Sofía Poma Vivanco para optar el Grado de Médico Veterinario y Zootecnista cuyo título tentativo es: “AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA”, y en tal virtud, acepto asesorar al estudiante, en calidad de Tutor, durante la etapa del desarrollo del trabajo de grado hasta su presentación y evaluación. En la ciudad de Quito a los dos días del mes de Diciembre de 2013. FIRMA Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc. C.C.: 1713266227 [email protected] v AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL Yo, VALERIA SOFÍA POMA VIVANCO, en calidad de autora del trabajo de investigación o tesis realizada sobre “AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter CONTENIDO CECAL DE jejuni POLLOS y Campylobacter FAENADOS EN coli EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que nos pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autores no corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a nuestro favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley Intelectual y su Reglamento. Quito, a 12 de Noviembre de 2014. _____________________________ FIRMA Valeria Sofía Poma Vivanco C.C.: 1724036510 [email protected] vi APROBACIÓN DE TRIBUNAL “AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA” El tribunal constituido por: Presidente: Dra. María Belén Cevallos Vocal Principal: Dr. Marco Cisneros Vocal Principal: Dra. María Inés Baquero Vocal Suplente: Dr. Richard Rodríguez Luego de receptar la presentación del trabajo de grado previo a la obtención del grado de Médico Veterinario y Zootecnista presentado por la Srta. Valeria Sofía Poma Vivanco. Con el título: “Aislamiento y tipificación molecular de Campylobacter jejuni y Campylobacter coli en contenido cecal de pollos faenados en camales industriales en la provincia de Pichincha” Ha emitido el siguiente Veredicto: APROBADO Quito 1 de Diciembre de 2014 Por constancia de lo actuado firman: Presidente: Dra. María Belén Cevallos Vocal Principal: Dr. Marco Cisneros Vocal Principal: Dra. María Inés Baquero Suplente: Dr. Richar Rodríguez vii ÍNDICE GENERAL CONTENIDO pp DEDICATORIA ............................................................................................... ii ÍNDICE DE CUADROS ................................................................................ viii ÍNDICE DE GRÁFICOS ................................................................................. ix RESUMEN......................................................................................................x INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1 CAPÍTULO I................................................................................................... 2 EL PROBLEMA ............................................................................................. 2 Planteamiento del Problema ....................................................................... 2 Justificación ................................................................................................ 4 Objetivos .................................................................................................... 6 CAPÍTULO II.................................................................................................. 7 MARCO TEÓRICO ........................................................................................ 7 Antecedentes de la investigación ............................................................... 7 Fundamentación Teórica ............................................................................ 8 CAPÍTULO III............................................................................................... 34 METODOLOGÍA .......................................................................................... 34 Determinación de Métodos a utilizar ......................................................... 34 Diseño de la investigación ........................................................................ 34 Descripción de la zona de estudio ............................................................ 34 Técnicas e instrumentos de recolección de información ........................... 37 Técnicas de Procesamiento y análisis de datos ....................................... 43 CAPÍTULO IV .............................................................................................. 44 RESULTADOS ............................................................................................ 44 Presentación de Resultados ..................................................................... 44 Discusión de Resultados .......................................................................... 48 CAPÍTULO V ............................................................................................... 53 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................... 53 Conclusiones ............................................................................................ 53 Recomendaciones .................................................................................... 54 viii REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS .............................................................. 55 ANEXOS ..................................................................................................... 67 ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Clasificación científica de Campylobacter..................................... 9 Cuadro 2. Especies de Campylobacter, sus fuentes y espectro de enfermedades que causan en seres humanos ............................................ 12 Cuadro 3. Diferenciación de las especies termófilas de Campylobacter ..... 30 Cuadro 4. Ubicación y código de las Plantas de faenamiento industriales de aves en la Provincia de Pichincha. .............................................................. 35 Cuadro 5. Cálculo del mater mix para una reacción .................................... 41 Cuadro 6. Programa para termociclador ..................................................... 42 Cuadro 7. Resultados de aislamiento de Campylobacter spp. del contenido cecal de pollos faenados en seis plantas de faenamiento ........................... 45 Cuadro 8. Especies de Campylobacter encontradas en las empresas muestreadas. ............................................................................................... 47 Cuadro 9. Grupos farmacológicos usados en granja previo al faenamiento en las aislamientos positivos a Campylobacter spp. ......................................... 48 ix ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1. Patogénesis de Campylobacter jejuni en el tracto gastrointestinal de seres humanos y aves. ............................................................................. 17 Gráfico 2. Estructuras de la superficie de C. jejuni. ....................................... 23 Gráfico 3. Mecanismos de resistencia antimicrobiana de Campylobacter spp.25 Gráfico 4. Repique positivo a Campylobacter spp. sembrado en MCCDA y tinción Gram modificada de Campylobacter spp. ........................................... 44 Gráfico 5. PCR múltiple para C. coli y C. jejuni. Se identifica C. coli por presentar bandas específicas de 364pb y C. jejuni con 773 pb. .................... 46 Gráfico 6. Identificación de especies de Campylobacter mediante la PCR múltiple. ......................................................................................................... 46 x UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA Autor: Valeria Sofía Poma Vivanco Tutor: Dr. Christian Vinueza M.Sc. Fecha: Noviembre, 2014 RESUMEN La campylobacteriosis es una enfermedad entérica en seres humanos, que en la mayoría de casos se asocia a Campylobacter jejuni y Campilobacter coli como agentes causales de esta enfermedad, siendo las aves el principal reservorio de estas bacterias. El objetivo de este estudio fue aislar y tipificar molecularmente C. jejuni y C. coli en contenido cecal de pollos faenados en camales industriales en la provincia de Pichincha, Ecuador, mediante métodos microbiológicos y moleculares. Durante el sacrificio de los pollos se tomó al azar 25 ciegos por cada muestra. Finalizado los 6 meses de muestreo, se obtuvo 181 muestras. Las muestras fueron aisladas en agar modificado carbón cefoperazona desoxicolato (MCCDA). De las 181 muestras 130 (71,8%) fueron positivas a Campylobacter spp. Los resultados de la PCR múltiple para identificar las especies de C. jejuni y C. coli fueron: 88 muestras (67,69%) C. coli, 23 muestras (17,69%) C. jejuni, 18 muestras (13,85%) consistieron en muestras mixtas de C. coli y C. jejuni y 1 (0,77%) no pudo ser identificada mediante esta PCR. En conclusión, en este estudio se obtuvo un alto número de aislamientos de Campylobacter de contenido cecal de pollos faenados en plantas industriales en la provincia de Pichincha. Por esta razón, se recomienda realizar otros estudios que permitan obtener más datos sobre esta enfermedad en el Ecuador. Descriptores: Campylobacter coli/ Campylobacter jejuni/ POLLOS BROILER/ PICHINCHA/ AISLAMIENTO/ TIPIFICACIÓN MOLECULAR/ PCR MÚLTIPLE. xi ISOLATION AND MOLECULAR TYPING OF Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in FECAL CONTENT OF CHICKEN SLAUGHTERED IN INDUSTRIAL SALUGHTERHOUSES IN THE PROVINCE OF PICHINCHA ABSTRACT Campylobacteriosis is an enteric infection of humans, which in most cases is associated with Campylobacter jejuni and Campylobacter coli as causative agents of this disease. Birds are the main reservoir of these bacteria. The aim of this study was to isolate and characterize molecularly C. jejuni and C. coli in fecal contents of chickens slaughtered in industrial slaughterhouses in the Province of Pichincha, Ecuador, by microbiological and molecular methods. During the slaughter of chickens, 25 chickens were chosen randomly for each sample. Once the six-month sampling ended, 181 samples were obtained. The samples were isolated in Modified Charcoal Cefoperazone Desoxycholate Agar (mCCDA). Out of the 181 samples, 130 (71.8%) were positive for Campylobacter spp. The results from the multiplex PCR to identify species of C. jejuni and C. coli were as follows: 88 samples (67.69%) of C. coli, 23 samples (17.69%) of C. jejuni, 18 samples (13.85%) consisted of mixed samples of C. coli and C. jejuni, and one sample (0.77%) could not be identified by this PCR. In conclusion, in this study a large number of isolations of Campylobacter were obtained from the fecal content of slaughtered chickens in industrial plants in the Province of Pichincha. Therefore, it is recommended to carry out further studies to learn more about this disease in Ecuador. Descriptors: Campylobacter coli / Campylobacter jejuni / Broiler chickens / Pichincha/ isolation / molecular typing / multiplex PCR. INTRODUCCIÓN Campylobacter jejuni y Campylobacter coli son microorganismos Gram negativos, termófilos y microaerófilos que colonizan la mucosa intestinal de muchos animales de sangre caliente, incluyendo las aves de abasto. Estos microorganismo son los más asociadas a campylobacteriosis en seres humanos, esta enfermedad pertenece al grupo de enfermedades transmitida por los alimentos (ETA), siendo una de las causas más frecuentes de diarrea aguda desde su identificación como productora de esta patología en 1975 (WHO, OIE, FAO, Universiteit Utrecht, 2012). La carne de pollo es considerada uno de los vehículos alimentarios más importantes en la transmisión de la bacteria, por lo que el estudio de la presencia de Campylobacter spp. en aves es indispensable para poder monitorear la enfermedad de una manera adecuada (Habib et al.,2012). Los primeros aislamientos en Latinoamérica se dieron en Brasil, en el año 1979, en niños con diarrea; posterior a esto esta bacteria ha sido aislada en todos los países de Sudamérica (Fernández, 2011). Aunque los estudios que existen en su mayoría no son actualizados tanto en seres humanos como en pollos de engorde. El presente estudio aplicó las técnicas microbiológicas y moleculares establecidas en el laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia para la identificación de C. coli y C. jejuni en contenido cecal de pollos faenados en seis plantas de faenamiento industriales en la provincia de Pichincha. 1 CAPÍTULO I EL PROBLEMA Planteamiento del Problema La campylobacteriosis es considerada uno de los agentes causales de la diarrea del viajero (Villa et al., 2011). El diagnóstico de campylobacteriosis indica que alrededor del 95% de las infecciones son causadas por C. jejuni seguido por C. coli (Wagenaar & Jacobs, 2014). La aplicación de técnicas mejoradas para su aislamiento han podido comprobar que la incidencia de Campylobacter spp. en muchos países es superior a Salmonella spp. (FAO & WHO, 2009). Sin embargo, no se le ha dado la importancia debida, al ser considerada una enfermedad autolimitante (Lapierre, 2013). Entre las formas de transmisión, la más común se da por contaminación cruzada, siendo la carne de pollo un factor importante (OMS, 2011). La carne de pollo se contamina con Campylobacter spp. durante el desplume y la evisceración, existiendo contaminación cruzada entre lotes de pollos positivos y negativos contribuyendo a la contaminación de las canales (Habib et al., 2012). Aunque información sobre Campylobacter spp. en aves de corral es limitada, se considera que el riesgo de contaminación varía en función de las medidas y las prácticas de control implementadas a lo largo de la cadena, desde la producción primaria hasta la preparación final para el consumo (FAO & WHO, 2009). 2 En los pocos estudios que se han realizado en Sudamérica, se ha asilado C. coli con mayor frecuencia, representando cerca del 25% de los casos de diarrea producidos por este género, a diferencia de países industrializados donde solo representa entre el 5 y 10% de todos los casos (Fernández, 2011). Dado que campylobacteriosis es la zoonosis más frecuente a nivel mundial y la principal causa es el consumo de carne de pollo (OMS, 2011), consideramos de gran interés su estudio, sobre todo al no existir en Ecuador trabajos previos sobre aislamiento de Campylobacter spp. en contenido cecal de pollos en las plantas de faenamiento. 3 Justificación Campylobacter spp. es una de las principales bacterias que causa enfermedades diarreicas transmitidas por los alimentos (ETA) en el ser humano, provocando más casos de diarrea que Salmonella (OMS, 2011), siendo el primer agente de diarrea en seres humanos en países desarrollados y el segundo o tercero en países subdesarrollados (Fernández, 2011). La campylobacteriosis humana es causada principalmente por C. coli y C. jejuni, aunque Campylobacter lari también se ha asociado como causante de la enfermedad (Torralbo, 2013). Su importancia se debe a su elevada incidencia, baja dosis infectante y duración, además de que está asociada a neuropatías periféricas como el síndrome de Guillain-Barré, síndrome Miller Fisher y enfermedades funcionales del intestino como el síndrome de intestino irritable (WHO et al., 2012), afectando con mayor frecuencia a niños menores de dos años, que algunas veces culmina con la muerte del paciente (OMS, 2011). El principal reservorio de Campylobacter spp. son las aves de corral (Wagenaar & Jacobs, 2014). En estos animales la bacteria es un comensal del tracto intestinal, por lo que la presencia de la misma en la carne de pollo es un factor de riesgo para la transmisión de la enfermedad a seres humanos (García, Valenzuela, Rodríguez, León, & Fernández, 2009), dicha transmisión se da con mayor frecuencia por contaminación cruzada y consumo de carne de pollo mal cocida contaminada con este patógeno zoonótico durante el proceso de faenamiento (Martín de Santos, Cepeda, Herrera, & Martínez, 2012). El consumo per cápita de pollo a nivel mundial ha ido incrementando con el pasar de los años, y Ecuador no ha sido la excepción según CONAVE el consumo de pollo promedio por habitante es de 35 Kg por persona, 4 aumentando considerablemente el consumo en relación a los últimos 10 años (CONAVE, 2013). En el Ecuador no se ha reportado la presencia de Campylobacter spp. en las plantas de faenamiento de pollos. Por esta razón es indispensable una investigación que permita tener una visión más clara sobre la presencia de Campylobacter spp. en el tracto intestinal de los pollos. Existen distintas técnicas para detección de Campylobacter spp.; en esta investigación como metodología se utilizó el aislamiento por siembra directa en MCCDA, y la tipificación molecular se realizó mediante la PCR múltiple para C. coli y C. jejuni. La PCR múltiple es un método rápido de detección de las distintas especies de Campylobacter con alta sensibilidad y especificidad, por lo cual se la considera una alternativa efectiva a los métodos tradicionales de identificación de estas bacterias. (Méndez Álvarez & Pérez Rotha, 2004). Los resultados obtenidos al culminar el presente trabajo de investigación, otorgaron datos actualizados sobre estas bacterias en las plantas de faenamiento industriales en pollos en la provincia de Pichincha, permitiendo utilizar estos datos para estudios epidemiológicos posteriores. Además, estos datos serán de gran utilidad para las empresas que colaboraron en el proyecto, para que mejoren sus procesos productivos. 5 Objetivos En el presente estudio se planteó los siguientes objetivos: General Aislar y tipificar Campylobacter jejuni y Campylobacter coli en contenido cecal de pollos faenados en camales industriales en la Provincia de Pichincha, mediantes métodos microbiológicos y moleculares. Específicos o Aislar Campylobacter spp. en contenido cecal de pollos en el medio selectivo MCCDA. o Identificar y tipificar Campylobacter jejuni y Campylobacter coli de los aislamientos obtenidos por sus fenotípicas, por medio de pruebas moleculares. 6 características CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO Antecedentes de la investigación En Ecuador se ha realizado pocos estudios sobre Campylobacter spp. debido a que las enfermedades diarreicas en nuestro país no se reportan a las entidades de salud. El primer reporte en Ecuador de enfermedad diarreica en humanos fue en diciembre de 1984, donde se examinó 100 niños de 1 a 24 meses de edad que sufrían de diarrea aguda, aislando Campylobacter fetus en el 23% de las muestras (Guderian, Ordoñez, & Bossano, 1987). En 1994, se examinó 177 niños menores de cinco años, reportando que el 3,37 % de las muestras fueron positivas a Campylobacter spp. (Vasco et al., 2014). En la provincia de Esmeraldas, en el 2005, se analizó 160 muestras de heces de personas de distintas edades en las cuales no hubo crecimiento de Campylobacter spp. (Gaitán, 2007). En la ciudad de Quito se muestreó 80 carcasas de pollos de las cuales el 3,75% fueron positivas a Campylobacter jejuni, se concluyó que existe contaminación por esta bacteria en carne de pollo vendida en la ciudad de Quito; el 2,5% de las muestras positivas se obtuvo de carcasas de pollos vendidas en supermercados y el 1,25% de las muestras positivas provenían de ferias libres (Durango, 2007). 7 Por lo expuesto, en Ecuador no se posee información actualizada sobre la campylobacteriosis humana, sus reservorios animales y formas de transmisión, siendo necesario investigaciones que permitan tener una base de datos actualizada de la enfermedad. Fundamentación Teórica Historia del Campylobacter En 1886, el bacteriólogo alemán Theodor Escherich, describió en heces de bebés con diarrea (Cholera infantum) un microorganismo espiriláceo, no cultivable, al que domino vibrio felinus, por su parecido morfológico a otros vibrios (Henry, 2013). En 1913 McFaydean y Stockman encontraron “espirilos” en fetos de abortos bovinos, recibiendo la denominación de Vibrio fetus. Jones, en 1931, identifico Vibrio jejuni en diarreas de ganado vacuno, en 1944 Doyle aisló Vibrio coli en disentería porcina (Torralbo, 2013). La conexión de la enfermedad con el consumo de alimentos se asoció a un brote de gastroenteritis en Illinois, por el consumo de leche cruda en un establecimiento penitenciario (Levy, 1946). En 1947, Vicent y colaboradores aislaron Vibrios fetus en el hombre (Vinzent, Dumas, & Picard, 1947). Diez años después se observó en muestras sanguíneas de mujeres embarazadas (King, 1957) distinguiendo dos grupos por sus características bioquímicas y serológicas: Vibrio fetus y otro grupo termófilo o “related Vibrio” (Campylobacter jejuni y Campylobacter coli) (Torralbo, 2013). En 1963, Sebald y Veron proponen la creación del género Campylobacter (Silva et al., 2011). Posterior a esto en los años setenta se desarrollaron medios de cultivo que permitieron aislar estos microorganismos con mayor facilidad. En 1973, Butzler y Dekeyser aislaron los microorganismo de heces de personas con enteritis por medio de filtración (Orietta, 2009), Skirrow en 1977 describió una técnica sencilla para el aislamiento de C. coli y C. jejuni a partir de heces de humanos (Fernández, 2011). Estos estudios permitieron lograr grandes avances en el estudio epidemiológico de la enfermedad. 8 Taxonomía de Campylobacter El género Campylobacter según la décima edición del Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology, pertenece al reino bacteria (Cuadro 1), que a su vez pertenece al filo Proteobacteria en las que se encuentran todas las Gram negativas, clase Epsilon de las proteobacterias junto con Arcobacter y Helicobacter (Torralbo, 2013). Cuadro 1. Clasificación científica de Campylobacter Dominio: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Epsilonproteobacteria Orden: Campylobacterales Familia: Campylobacteraceae Género: Campylobacter Tomado de: Lapierre (2013) Elaboración: La Autora El género Campylobacter consiste de 17 especies y seis subespecies, de las cuales las más frecuentes son C. jejuni (subespecie jejuni) y C. coli. Otras especies como C. lari y Campylobacter upsaliensis se ha asilado en pacientes con enfermedades diarreicas (OMS, 2011). Recientemente, se han incluido especies adicionales dentro del género llegando 24 especies potenciales del género: Campylobacter fetus, Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter lanieane, Campylobacter sputorum, Campylobacter mucosalis, Campylobacter concisus, Campylobacter curvus, Campylobacter rectus, Campylobacter gracilis, Campylobacter showae, Campylobacter hominis, C. Campylobacter jejuni, C. coli, canadiensis, C. lari, Campylobacter Campylobacter peloridis, insulaenigrae, Campylobacter subantarticus, C. upsaliensis y Campylobacter helveticus (Debruyne, Gevers, & Vandamme, 2008), sumándose Campylobacter avium (Rossi et al., 2009) y Campylobacter cuniculorum (Zanoni, Debruyne, Rossi, Revez, & Vandamme, 2009) en el año 2009, así como Campylobacter ureolyticus, en el 2010, por la 9 reclasificación de Bacteroides ureolyticus (Vandamme, Dewhirst, De Brandt, & Falsen, 2010) y Campylobacter troglodytis en el 2011 (Kaur et al., 2011). Morfología Las bacterias del género Campylobacter son bacilos pequeños curvos de 0,2–0,8 μm × 0,5–5 μm, Gram negativos, espiralados o en forma de S, con un flagelo polar en uno o ambos extremos curvado, lo que le confiere la característica de motilidad de sacacorchos (Silva et al., 2011). Generalmente son bacterias microaerofílicas, requiriendo: 5% de oxígeno, 10% de dióxido de carbono y 85% de nitrógeno (Lapierre, 2013). Algunas especies requieren una atmósfera anaeróbica, aunque también pueden crecer en condiciones microaeróbicas (OMS, 2011). La mayoría de especies crecen a 37°C, aunque la temperatura optima de crecimiento de C. jejuni, C. coli y C. lari es a 42 °C por lo cual se las conoce como termófilas. Son oxidasa positiva a excepción de C. gracilis y catalasa positiva. No fermentan ni oxidan carbohidratos pero obtienen su energía de aminoácidos, o intermediarios del ciclo de ácidos tricarboxílicos; la mayoría de las cepas son resistentes a la cefalotina (Lapierre, 2013). Campylobacter spp. es incapaz de crecer con un pH menor a 4,9 y mayor de 9,0, su pH óptimo está entre 6,5 y 7,5 (Silva et al., 2011). Se destruyen en condiciones subóptimas, congelación, deshidratación e irradiación. En cultivos envejecidos predominan las formas esféricas, cocoides o cocobacilares (FAO & WHO, 2009), no son cultivables en esta forma por su menor nivel de péptidos, ácidos nucleicos, superoxidodismutasa y por su menor integridad celular (Ikeda & Karlyshev, 2012). Epidemiología Campylobacter spp. es una bacteria patógena, que se ubica en el colón y afecta al hombre causando diarrea, asociado a otras enfermedades como septicemia, meningitis o complicaciones, como artritis reactivas y el 10 Síndrome de Guillian Barre. Los síntomas se presentan después del período de incubación de 1 a 7 días, la severidad varía desde diarrea acuosa a sanguinolenta, con fiebre y dolor abdominal, la enfermedad es autolimitante en la mayoría de casos (Lapierre, 2013). Su dosis infectante es baja en relación a otras bacterias, se necesita un inoculo de 104 para producir la enfermedad (Orietta, 2009), aunque se ha comprobado que 500 bacterias pueden instaurar la enfermedad en seres humanos (Hernández, Aguilera, & Castro, 2013). En las aves Campylobacter spp. no produce enfermedad y es un comensal del intestino de las aves, siendo el sitio primario de colonización las criptas del ciego, en el cuál se puede encontrar alrededor de 106 a 108 UFC/g (Meade et al., 2009). Solo se necesita 35 UFC para la colonización exitosa del tracto intestinal de las aves (Hermans et al., 2011). Campylobacter spp. se establece en el ciego a las 24 horas de haber ingresado al ave y aproximadamente el 94% de las aves serán positivas a las 72 horas después de la colonización. La colonización de Campylobacter spp. en las aves empieza a partir de las dos a cuatro semanas de edad (van Gerwe et al., 2009), probablemente por la presencia de anticuerpos maternales en pollos jóvenes que impide la colonización y las medidas de bioseguridad que se implantan en las granjas durante las primeras semanas de vida de las aves. En el cuadro 2 se puede observar algunas especies de Campylobacter y las enfermedades que pueden producir a los seres humanos (Forbes, Sahm, & Weissfeld, 2009). 11 Cuadro 2. Especies de Campylobacter, sus fuentes y espectro de enfermedades que causan en seres humanos Fuente Espectro de enfermedades en los seres humanos C. concisus, C. curvus, C. rectus, C.showae Seres humanos Enfermedad periodontal; gastroenteritis. C. gracili Seres humanos Infecciones de los tejidos profundos de la cabeza, cuello y las vísceras: surcos gingivales Microorganismo C. coli C. jejuni subesp, jejuni C. jejuni subesp, doylei C. lari Cerdos, aves de corral, ovejas, toros, pájaros Aves de corral, toros, perros, gatos, pájaros y otros animales Gastroenteritis,* septicemia Gastroenteritis,* septicemia, meningitis; proctitis Seres humanos Gastroenteritis,* septicemia Pájaros, aves de corral, otros animales; agua de ríos y mares Gastroenteritis,* septicemia; infección de prótesis articulares C. hyointestinals Cerdos, vacas, subesp, hamsters, ciervos hyointestinalis C. upsaliensis Perros, gatos C. fetus subesp. Vacas, ovejas Fetus C. fetus Vacas subesp.venerealis C. sputorum Seres humanos, biovar. Spoutorum vacas, cerdos *Forma clínica más común. Gastroenteritis Gastroenteritis; septicemia, abscesos Septicemia, gastroenteritis; aborto; meningitis Septicemia Abscesos, gastroenteritis Tomado de: Forbes et al. (2009) Elaboración: La Autora Distribución geográfica y reservorios Campylobacter spp. es uno de los agentes bacterianos que con mayor frecuencia está asociado a gastroenteritis. La incidencia de gastroenteritis causada por Campylobacter spp. es poco conocida sobre todo en países de bajos y medianos ingresos, estudios en países desarrollados han estimado que el índice anual se encuentra entre 4,4 y 9,3 por cada 1000 habitantes. (WHO et al., 2012). El principal reservorio de Campylobacter spp. Es el trato gastrointestinal de mamíferos salvajes, domésticos y aves. Debido a esto muchos países 12 poseen programas de monitoreo para determinar la prevalencia de Campylobacter spp. en alimentos procedentes de animales y pájaros (FAO & WHO, 2009). En países industrializados la especie más comúnmente asociada a infecciones gastrointestinales en humanos es C. jejuni seguido por C. coli y C. lari (Fernández, 2011). En 2012, El número de casos reportados de campylobacteriosis humana en la Unión Europea fue 214.268, que fue un descenso del 4.3% comparado con el 2011. La tasa de notificación de la Unión Europea fue 55.49 por 100.000 habitantes en 2012. (EFSA & ECDC, 2014). En este mismo año, algunos países de la Unión Europea proporcionaron información sobre la presencia de Campylobacter spp. en parvadas de pollos de engorde, lotes de sacrificio o animales individuales basado en un tamaño de muestra ≥ 25. La prevalencia en parvadas fue alta en Eslovenia 63,4% y 83,6% en Hungría. En lotes de sacrificio la prevalencia oscilo del 1,6% en Finlandia a 62,1% en España. En Alemania la prevalencia fue de 9,2% de pollos de engorde. Finlandia proporcionó información sobre distintos periodos de muestreo con diferentes estrategias de muestreo registrando mayor prevalencia de Campylobacter spp. en lotes de aves de abasto muestreadas durante junio a octubre (5.3%) que en los muestreos durante enero, mayo, noviembre y diciembre (1,6%) (EFSA & ECDC, 2014). En el año 2013, la incidencia en Estados Unidos estimada de la infección por Campylobacter spp. por cada 100.000 habitantes fue 13,82% (Crim et al., 2014). De la misma forma en África se ha aislado Campylobacter spp., en países como Kenia, se ha aislado de pollos, cerdos, cabras, ganado vacuno, ovejas, patos y perros domésticos (Turkson, Lindqvist, & Kapperud, 1988). En 13 Etiopía, se identificó en pollos y cerdos; en ovejas en Nigeria (Raji, Adekeye, Kwaga, & Bake, 2000). En Asia, se identificó Campylobacter spp. en broiler en países como China y Japón (Chen et al., 2010), en Tailandia y en Malasia se ha aislado de broiler, patos y aves silvestres (Torralbo, 2013). En Irán se aisló en aves, vacas, caballos y camellos (Baserisalehi, Bahador, & Kapadnis, 2007). Campylobacter spp. se aisló en Australia de perros, gatos, bovinos, ovejas y aves (Bailey et al., 2003) y de aves domésticas en Nueva Zelanda (Bates, Hiett, & Stern, 2004). En Sudamérica, C. coli ha sido aislado con mayor frecuencia, representando cerca del 25% de los casos de diarrea producidos por Campylobacter spp. Esto se debe a que C. coli se ha aislado a partir de diversos reservorios, como material fecal de pollos, carne de aves, aguas servidas, animales silvestres y domésticos. Otra diferencia de los países sudamericanos en relación a países industrializados es el hallazgo frecuente en seres humanos de portadores sanos (Fernández, 2011). Campylobacter spp. también ha sido asilado en pingüinos de la Antártida (Griekspoor, Olsen, & Waldenström, 2009). La prevalencia de campylobacteriosis ha sido estimada entre 7,6 y 100 veces más alta que los valores oficiales declarados en cada país (Gilliss et al., 2013). Como resultado al alto número de casos que no se notifican. Todos estos datos proporcionados, dan una idea generalizada de la difusión que tiene Campylobacter spp. a nivel mundial, así como la variedad de hospedadores, siendo su principal hospedador las aves domésticas. Transmisión En las aves la transmisión horizontal es la principal forma de diseminación del Campylobacter spp, factores potenciales como el agua de bebida no 14 tratada, alimentos, otros animales en la granja, aves silvestres, mosquitos, trabajadores, maquinaria, entre otros, son diseminadores de Campylobacter spp. en granja (Zhang & Saif, 2011). Una vez que un ave se contagia, Campylobacter spp. se difunde a partir del agua, alimento y la cama (Sánchez, Serrano, Marfil, & Jodral, 2009). La transmisión vertical no está totalmente comprobada, se ha aislado en huevos en pocas ocasiones y en su mayoría se atribuye a contaminación fecal de la cáscara de los huevos; además, que Campylobacter spp. tiene una tasa de supervivencia baja en la albumina de los huevos (FAO & WHO, 2009). La principal ruta de contaminación de los alimentos por Campylobacter spp. es durante el proceso de faenamiento y evisceración de animales de abasto por contaminación fecal. El faenamiento de animales como ganado vacuno y porcino es generalmente más higiénico que el faenamiento de broiler, por lo tanto la carne de bovinos y porcinos generalmente se contamina menos con Campylobacter spp. que la carne de pollo (FAO & WHO, 2009). Se considera que entre el 50-80% de todos los casos de campylobacteriosis humana, asocian al pollo como reservorio de esta bacteria (Bahrndoff, Rangstrup, Nordentoft, & Hald, 2013). C. coli y C. jejuni son las especies con mayor frecuencia asociadas a infecciones humanas transmitidas por los alimentos; no se multiplican en los alimentos a diferencia de otros agentes causantes de gastroenteritis transmitida por alimentos (Forbes et al., 2009). La mayor parte de campylobacteriosis humana está asociada con la manipulación de la carne cruda de pollo, inadecuada cocción de la carne, contaminación cruzada con otros alimentos y la poca higiene al momento de preparar alimentos (Hadush & Pal, 2013). 15 Patogenia y Factores de Virulencia La causa por la cual Campylobacter spp. es patógeno en humanos y se establece como comensal en las aves no está muy clara, pero la diferencia de temperatura corporal entre las aves y seres humanos puede ser un factor significativo. Se ha observado diferencias entre la expresión de algunos genes a temperatura de 37°C comparada con 42°; a 42°C se expresan mayormente los genes indispensables para la quimiotaxis y motilidad en comparación a la expresión de los mismos genes a 37°C (Alemka, Corcionivoschi, & Bourke, 2012). En el ser humano puede ser patógeno por la baja dosis infectante que se requiere para producir la enfermedad (Hernández et al., 2013). Como se puede observar en el Gráfico 1, algunos estudios han demostrado que Campylobacter spp. al ingresar al tracto gastrointestinal de los seres humanos evade la capa de moco del intestino e interactúa con las células epiteliales, causando la producción de interleucina (IL) 8, al ingresar la bacteria a la célula epitelial y haber inducido la producción IL-8 provoca el reclutamiento de células dendríticas, macrófagos y neutrófilos, que interactúan con el Campylobacter spp. (Young, Davis, & DiRita, 2007). Esta interacción origina la respuesta inflamatoria masiva y el aumento de citoquinas. Sin embargo, en las aves Campylobacter spp. solo reside en la capa mucosa en el intestino especialmente el ciego; en algunos estudios se demostró que Campylobacter spp. estimula la producción de IL-1beta y IL-6, pero la respuesta del huésped no suele conducir a la diarrea inflamatoria en pollos, los factores que influyen en la disminución de la respuesta inmune y permiten la tolerancia no están muy bien definidos (Young et al., 2007). 16 Gráfico 1. Patogénesis de C. jejuni en el tracto gastrointestinal de seres humanos y aves. C. jejuni evade a la capa de moco del intestino en seres humanos, e interactúa con las células intestinales, estimulando la producción de IL-8, que provoca el reclutamiento de células dendríticas, neutrófilos y macrófagos. Este proceso induce a la respuesta inflamatoria. Al contrario, en aves C. jejuni reside en la capa mucosa del intestino. Los factores por los que la respuesta inmune es disminuida o se redirige a la tolerancia son desconocidos. Tomado de: Young et al. (2007) Otros estudios han demostrado que la mucina del tracto gastrointestinal de las aves puede afectar la invasión de Campylobacter spp.; al ser muy sulfatada en comparación a la mucina de los seres humanos, haciendo posible que esta sulfatación module la virulencia de Campylobacter spp. y sus manifestaciones clínicas en los distintos hospedadores (Alemka et al., 2012). C. jejuni tiene tres fenotipos de colonización en las aves, en el fenotipo uno se encuentran cepas que no son capaces de colonizar las aves hasta el día 14 de edad, el fenotipo dos corresponde a cepas que se eliminan rápidamente es decir cepas transitorias y el fenotipo tres pertenece a cepas 17 eficientes para colonizar y mantener la colonización. Estos fenotipos son estables, independientes del nivel de inóculo y de los pasajes en el tracto gastrointestinal de las aves, además que las cepas aisladas en seres humanos tienen menor eficacia al colonizar aves (Hermans et al., 2011). Aunque la patogénesis de Campylobacteriosis no está totalmente comprendida, investigaciones recientes se han concentrado en el análisis genómico siendo una alternativa para identificar genes de virulencia (Quinn et al., 2013). La descripción de la patogenia de Campylobacter spp. se centra en el C. jejuni por ser la especie más estudiada (Torralbo, 2013). Los factores de virulencia más relevantes son la quimiotaxis, motilidad por la presencia de flagelos, la capacidad de adherencia e invasión a la célula eucariota y la producción de citotoxinas (Lapierre, 2013). Quimiotaxis La quimiotaxis es un sistema de transducción de señales por la cual la bacteria detecta los estímulos ambientales y responde a ellos con acciones como el desplazamiento, en el caso de Campylobacter spp. la quimiotaxis se realiza mediante la rotación flagelar y quimiotaxis positiva hacia la mucina, Lfucosa y la bilis, (Klotz, Garcés, Romero, & Ramírez, 2012), siendo importantes componentes del tracto gastrointestinal y mucus de aves y seres humanos (Fernández & Alonso, 2010). En la quimiotaxis de Campylobacter spp. intervienen múltiples receptores de transmembrana de metil-aceptación de las proteínas (MCP), que detectan sustancias como: aminoácidos (aspartato, cisteína, serina y glutamato), sales de ácidos orgánicos (citrato, fumarato, a-ketoglutarato, malato, piruvato y succinato), L-asparagina, formiato y D-lactato (Hermans et al., 2011). Existen diversos genes implicados en la quimiotaxis de Campylobacter spp. entre los que están: cheA, cheW, cheV, cheY, cheR y cheB, todos estos participan en la aceptación al receptor (Bouwman & van Putten, 2012); 18 aunque, el gen cheY es uno de los principales reguladores de respuesta en la rotación flagelar, crucial para la virulencia (Torralbo, 2013). Mutaciones en los genes cheB y cheR reducen la habilidad de colonización de los ciegos de las aves (Malagón, García, & Heredia, 2010). Otros genes como el gen B (docB o Tlp10) están implicados en la capacidad de colonización y codifica al MCP, el gen docC (Tlp4) es importante para obtener altos niveles de colonización. El gen Tlp1 es indispensable para la colonización y su mutación disminuye la habilidad de colonización, siendo estos tres genes muy importantes para la invasión (Vegge, Brondsted, Li, Bang, & Ingmer, 2009). El factor accesorio de colonización (acfB), codifica probablemente una proteína MCP, siendo transcendente en las primeras etapas de colonización y está presuntamente implicado en la persistencia de C. jejuni en el ciego de pollo en presencia de la flora intestinal (Hermans et al., 2011). Otros genes que intervienen durante la colonización y energía de quimiotaxis de Campylobacter spp. son: cetA y cetB (Elliott & DiRita, 2008). Motilidad Bacteriana y Flagelos Las bacterias del género Campylobacter son móviles con dos flagelos bipolares que les facilita la colonización de células humanas. Los flagelos son necesarios para la colonización del intestino delgado y para que el patógeno pueda trasladarse hasta el colón, está formado por tres estructuras: el cuerpo basal, el gancho, y el filamento. El filamento está compuesto por una flagelina mayor FlaA y una menor FlaB (Cróínin & Bakert, 2012), ambas codificadas por dos genes que son la flaA y flab (Solís, 2011). Algunos estudios han demostrado que el flagelo posee un rol complejo en la patogenicidad, incluyendo la secreción de proteínas ya que las especies de Campylobacter no poseen sistemas de secreción tipo 3 o tipo 4 (SST3 y SST4) indispensables en otros agentes patógenos entéricos (Lapierre, 2013). 19 La flagelina de Campylobacter spp. es una estructura altamente glicosilada, su glicosilación es muy importante para que se pueda ensamblar el flagelo. Por otra parte la formación de biofilms se mide por la cantidad de glicanos en la flagelina y se supone que la formación de biofilms permite la sobrevivencia de la bacteria en agua y medioambiente (Lapierre, 2013). La adhesión e invasión son dependientes de la motilidad y expresión flagelar, así cuando existen mutaciones que disminuyan la motilidad también disminuirán la capacidad de adhesión e invasión (Fernández & Alonso, 2010). Adhesión e invasión La adhesión de Campylobacter spp. desempeña un papel temprano en el proceso infeccioso uniéndose a receptores específicos de las células del hospedador, Campylobacter spp. tiene predilección por los receptores de superficie apical o basolateral de los enterocitos (Torralbo, 2013). La adhesión e invasión están correlacionadas con el grado de severidad de los síntomas clínicos en pacientes infectados (Dasti, Tareen, Lugert, Zautner, & Gross, 2010). Campylobacter spp. puede ingresar en la célula epitelial a través de la invasión o mediante uniones estrechas que permite que la bacteria se mueva en la superficie basolateral, para poder invadir la célula epitelial o ser capturado por un macrófago, pudiéndose replicar dentro de estos e inducir la apoptosis (Fernández & Alonso, 2010). La interacción que puede darse entre células epiteliales, células dendríticas y macrófagos puede liberar citosinas y quimiocinas que contribuyen a la diarrea e infección (Fernández & Alonso, 2010). Una de las principales proteínas de adhesión de C. jejuni y C. coli es la proteína de adherencia de Campylobacter spp. a la fibronectinia (cadF) de la matriz celular (Lapierre, 2013), la diferencia de secuencia de inserción de 39 pb entre C. jejuni y C.coli demuestra que la adhesión de C.jejuni en las 20 células epiteliales intestinales es más eficiente que C. coli (Dasti et al., 2010). Al cumplir cadF la función de adhesión tipo “tiggers” con la célula hospedera también activa a GTPasas Rac1 y Cdc42 que inducen la internalización de la bacteria en la célula hospedadora (Dasti et al., 2010). Debido a que Campylobacter spp. no posee otros sistemas de secreción como otras bacterias, en la invasión participan las proteínas Cia A-H secretadas por el filamento del flagelo, de estas proteínas la CiaB es fundamental para la internalización de la célula epitelial (Fernández & Alonso, 2010). Polisacárido capsular (CPS) La cápsula de Campylobacter spp. está compuesta por unidades repetitivas de oligosacáridos permitiendo la unión débil a la superficie celular, la capsula cumple las funciones de colonizar, invadir y evasión en el intestino además de que le confiere resistencia al suero (Fernández & Alonso, 2010). En la cápsula se encuentra el polisacárido capsular (CPS), este factor le confiere a la cápsula sus funciones y algunos estudios han demostrado que la composición de CPS en C. jejuni es alta (Bouwman & van Putten, 2012). Lipo-O-ligosacarido (LOS) Como se puede observar en el Gráfico 2, la mayor parte de la superficie externa de la membrana de C. jejuni está constituida por LOS (Bouwman & van Putten, 2012), en esta bacteria posee una alta variación por la diferencia entre los monosacáridos y su composición (Fernández & Alonso, 2010), el LOS muestra mimetismo molecular con los gangliósidos de los nervios periféricos en seres humanos, pudiendo generar una condición autoinmune como el síndrome de Guillain-Barré (González, Huaracán, García, & Figueroa, 2013). El gen cst-II que la bacteria requiere para la generación de estructuras de LOS es similar al implicado en la biosíntesis de los gangliosidos GM1 en seres humanos, por lo que el organismo del ser humano genera anticuerpos que actúan tanto contra LOS y los gangliósidos, 21 afectando la estructura bacteriana y los gangliósidos de los nervios periféricos en el ser humano, desencadenando la degeneración axonal y desmielinización de los nervios periféricos (Nyaty & Nyaty, 2013). Por otro lado el gen cst-II está vinculado a la invasión de C. jejuni a las células del epitelio intestinal (González et al., 2013). Además, los antígenos O de C. jejuni poseen en sus estructuras ácido siálico, el cual es parecido al observado en los gangliósidos humanos (Louwen et al., 2008). Sistema N- glycosilación Este sistema modifica algunas proteínas periplasmáticas y de la membrana externa, tal como se observa en el Gráfico 2. Siendo importante para la colonización, adherencia e invasión de las células epiteliales (Hernández et al., 2013); algunas proteínas que conforman este sistema son responsables por la post-translación de la bacteria; su rol biológico se asocia a la virulencia de la bacteria (Fernández & Alonso, 2010). Al mutar el sistema Nglycosilación produce la reducción de la competencia natural, reducción del inmunoreactividad con el suero humano y reduce la colonización en pollos (Bouwman & van Putten, 2012). 22 O-glicano N-glicano Cápsula LOS Membrana Externa Periplasma Peptidoglicano Membrana Interna Citoplasma Gráfico 2. Estructuras de la superficie de C. jejuni. La superficie de la célula de C. jejuni posee varias estructuras, que cumplen un papel importante en la interacción huésped-bacteria. La cápsula, es un polisacárido importante para la virulencia, adhesión e invasión. El LOS es variable y cumple un papel importante en la adhesión e invasión y está relacionado con el síndrome de Gullain-Barreé. El flagelo es importante para la colonización, virulencia y adhesión, actúa como un aparato de secreción para los antígenos de invasión, y en este se encuentra el sistema de O-glicosilación esencial para el ensamblaje de flagelina y la motildad. El sistema de N-glicosilación modifica algunas proteínas periplasmáticas y de membrana externa, importante para la colonización, adhesión e invasión. Tomado de: Young et al. (2007) O- glycosilación El sistema de O-glycosilación es el responsable de la glicosilación flagelar, así como se observar en el Gráfico 2. Es esencial para el correcto ensamblaje de la flagelina y motilidad, por lo tanto influye en la adhesión, invasión y virulencia (Fernández & Alonso, 2010). Tanto C. jejuni como C. coli poseen una alta concentración de O-glycanos (Bouwman & van Putten, 2012). 23 Lipopolisácarido (LPS) LPS también se encuentra en la membrana externa de la bacteria, posee actividad endotóxica al contener el antígeno O contiene ácido siálico y al igual que LOS está relacionado con el síndrome de Guillain-Barré (Lapierre, 2013). Toxina de distención citoletal (CDT) La CDT es considerada como un factor importante de virulencia de Campylobacter spp., esta toxina causa que las células eucariotas se detengan en fase G2 de la mitosis (Torralbo, 2013), provocando la muerte celular y subsecuentemente la respuesta inflamatoria (Fernández & Alonso, 2010). Está compuesta por tres subunidades codificadas por los genes cdtA, cdtB y cdtC, estos genes permiten la unión a la membrana celular del hospedador, produciendo daño en el ADN celular (Lapierre, 2013). La cdtB es la subunidad activa y la cdtA y cdtC son los componentes de unión. La cdt también induce a la célula epitelial a secretar la IL-8 que interviene en el proceso inflamatorio (Fernández & Alonso, 2010). Resistencia a Múltiples Fármacos Los antibióticos dependiendo de sus propiedades químicas y estructura entran en la bacteria y pueden tomar distintas rutas (Jeon, Muraoka, & Zhang, 2010), el primer obstáculo para el antibiótico es la permeabilidad de la membrana, el LOS y CPS contribuyen a la naturaleza hidrófila de la superficie de la bacteria, reduciendo la permeabilidad a antibióticos hidrofóbicos (Jeon, Muraoka, Scupham, & Zhang, 2009). Algunos antimicrobianos al atravesar la membrana citoplasmática son extruidos por la bomba de eflujo de múltiples fármacos conocida en sus siglas en inglés como Cme, la cual reduce la concentración intracelular del fármaco, siendo el segundo mecanismo de defensa de la bacteria contra los antibióticos (Jeon 24 et al., 2010) y media la resistencia a metales pesados (Hermans et al., 2011). El Cme está compuesto por el operón cmeA, cmeB y cmeC; el CmeA consiste en una proteína periplasmática, CmeB es un transportador de flujo de membrana interna y el CmeC es una proteína de la membrana externa (Wieczorek & Osek, 2013). Otro mecanismo utilizado por la bacteria es la modificación de la diana, como sucede en las mutaciones espontáneas del gen GyrA en la región determinante de resistencia a quinolonas (QRDR) (Jeon et al., 2010), reduciendo la afinidad de las fluoriquinolonas a la DNA gyrasa y como resultado la resistencia a este tipo de fármacos (Notario et al., 2011). En el Gráfico 3 se puede observar algunos de los mecanismos de resistencia a antibióticos que posee Campylobacter spp. Gráfico 3. Mecanismos de resistencia antimicrobiana de Campylobacter spp. LOS reduce la absorción de antibióticos hidrófobos como los macrólidos. Las bombas de eflujo como CmeABC y otros transportadores de salida no caracterizados, disminuyen la concentración intracelular de antibióticos. Las mutaciones espontáneas reducen la afinidad de los antibióticos a la diana. Tomado de: Jeon, Muraoka, & Zhang, 2010. 25 En relación a las tetraciclinas, la resistencia de Campylobacter spp. está dada por el gen tet(O), este gen codifica a la proteína de protección ribosamal (RPPs), confiriendo a la bacteria altos niveles de resistencia a las tetraciclinas (Wieczorek & Osek, 2013). Los macrólidos, en especial la eritromicina son antibióticos de amplio espectro que actúan tanto contra Gram positivos y Gram negativos (Wieczorek & Osek, 2013), incluyendo a Campylobacter spp. La resistencia de Campylobacter spp. se da por la modificación del sitio de unión del ribosoma de destino por mutación de 23S ARNr y otras proteínas ribosamales (Iovine, 2013). La resistencia de Campylobacter spp. a aminoglucósidos está mediada por la modificación enzimática que disminuye la afinidad de los aminoglucósidos para el sitio A del ARNr (Wieczorek & Osek, 2013). Estas enzimas son: aminoglucósidos acetiltransferasas, aminoglucósidos adeniltransferasas y aminoglucósidos fosfotransferasas, cada enzima posee su propio sistema de modificación de las características y sustrato. En C. jejuni y C. coli, estas tres enzimas poseen un mecanismo similar mediante la producción de una fosfotransferasa 30-O-aminoglucósido (Pollett et al., 2012). La resistencia a betalactámicos no está totalmente definida, pero la mayoría de especies de Campylobacter spp. son resistentes a betalactámicos, especialmente a penicilina y cefalosporinas de espectro reducido (Orietta, 2009). Tanto C. jejuni como C. coli producen betalactamasas que inactivan la molecula del betalactámico por hidrolisis del anillo de lactama estructural (Iovine, 2013). Resistencia a la bilis Las enterobacterias poseen mayor resistencia a la bilis que otras bacterias, esta adaptación es indispensable para la supervivencia de Campylobacter spp. en el intestino, proporcionándole una mayor ventaja competitiva sobre otras bacterias al colonizar el intestino (Stef et al., 2013). La resistencia a la 26 bilis en Campylobacter spp. está mediada por la Cme ABC que regula la resistencia a múltiples fármacos (Wieczorek & Osek, 2013). Técnicas de Diagnóstico de Campylobacter spp. Aislamiento e Identificación de la bacteria Para poder aislar Campylobacter spp. a partir de heces o alimentos, se utiliza medios de cultivos selectivos que contengan eliminadores de oxígeno, como la sangre, hierro ferroso o piruvato, entre otros, y agentes selectivos como antibióticos (Silva et al., 2011). Sin embargo, no está establecido un método estandarizado para el aislamiento de Campylobacter spp. a partir de heces, alimentos o muestras ambientales, no obstante algunas instituciones han establecido algunos métodos como el propuesto por la Organización Internacional de Estandarizacion (ISO) que estableció la ISO 10272:2006 para enumeración de Campylobacter termotolerante en alimentos, en el cuál el primer medio selectivo que se utiliza es el agar modificado carbón cefoperazona desoxicolato (mCCDA) (Habib, Uyttendaele, & De Zutter, 2011), entre otros métodos. Toma y Transporte de Muestra Las muestras tomadas de heces en aves vivas, contenido cecal de los pollos después del proceso de evisceración y piel de cuello se deben transportar de forma aséptica y en temperaturas entre 4 y 2°C (Wagenaar & Jacobs, 2014), siendo 25 gramos de heces suficiente para la detección de Campylobacter spp. (Torralbo, 2013), en el caso de realizar hisopado rectal o de la superficie de la canal se debe colocar la muestra en un medio de transporte como: Cary-Blair, Cary-Blair modificado, medio Stuart modificado, entre otros (Wagenaar & Jacobs, 2014). Las muestras se pueden procesar no más de 3 días después de la toma de muestra (Wagenaar & Jacobs, 2014). 27 Aislamiento de Campylobacter spp. El aislamiento de Campylobacter spp. de muestras fecales de ciego o intestinales se puede realizarse directamente en el medio selectivo o por medio de filtración sobre un medio selectivo (Wagenaar & Jacobs, 2014). Aunque muchas técnicas utilizan el enriquecimiento para aumentar la sensibilidad del cultivo o en bajos niveles de microrganismos en heces (Silva et al., 2011). Para el enriquecimiento se utiliza caldos selectivos como: el caldo Bolton (BB), Caldo de enriquecimiento Campylobacter (CEB) y el caldo Preston. Como ya se ha mencionado Campylobacter spp. es una bacteria exigente, y por esta razón los medios de cultivo se han desarrollado para satisfacer las necesidades de esta bacteria, así como el proporcionar las condiciones adecuadas de microaerofilia, temperatura (42°C en el caso de C. jejuni y C. coli) y tiempo (48 horas), favorecen el crecimiento de la bacteria. Los medios de cultivos se dividen básicamente en dos grupos: los que contienen sangre y los que contienen carbón (Wagenaar & Jacobs, 2014), la sangre y el carbón sirven como eliminadores de derivados tóxicos de oxígeno (Silva et al., 2011). La principal diferencia entre los medios de cultivo es el grado de inhibición de la flora contaminante, la mayoría de medios utilizan cefalosporinas y a veces en combinación con otros antibióticos (Wagenaar & Jacobs, 2014). Entre los medios sólidos con sangre están: Agar Preston, Agar Skirrow, Campy-Cefex. Y entre los medios sólidos con carbón están: mCCDA uno de los medios más utilizados (Gharst, Oyarzabal, & Hussain, 2013), Agar Karmali, medio de carbón selectivo (CSM), entre otros (Wagenaar & Jacobs, 2014). Entre las técnicas de diagnóstico directo se encuentran: el método Gram directo, la microscopia de contraste de fases y tinciones de Hooker y Vagó, las dos primeras tienen un valor predictivo de 60 y 85,7% 28 respectivamente; mientras que la tinción de Hooker tiene sensibilidad del 37% y especificidad de 100% (Fernández, 2011). En estas técnicas se puede observar bacilos finos en espiral o curvados que se mueven en forma de sacacorchos, característico de Campylobacter spp. (Wagenaar & Jacobs, 2014). La filtración pasiva es un método desarrollado por Steele y McDermott (Wagenaar & Jacobs, 2014), en el cual no se utiliza medios selectivos. Esta técnica no permite el paso de microorganismos grandes a través del filtro; Campylobacter spp. al tener alta motilidad y forma delgada pasa fácilmente por la membrana (Gharst et al., 2013). Identificación de especies de Campylobacter La identificación de Campylobacter spp. se puede realizar mediante varias técnicas entre las más importantes están: Pruebas bioquímicas, Prueba de aglutinación en latex, Detección molecular y recientemente se ha empezado a utilizar ELISA como prueba serlógica. Pruebas bioquímicas: Las características fenotípicas específicas de cada especie de Campylobacter, permite diferenciarlas e identificarlas a cada una. En el caso de C. jejuni y C. coli, se utiliza un grupo de pruebas para poder diferenciarlas, como se puede observar en el Cuadro 3, usualmente C. jejuni se diferencia de otras especies porque es positiva a la hidrólisis de hipurato y también es sensible al ácido nalidíxico al igual que C. coli (Wagenaar & Jacobs, 2014). Este tipo de identificación se ha tornado poco útil, como resultado a la mutación bacteriana, ocasionando variación de resultados a las pruebas bioquímicas ya establecidas, por lo cual no es una prueba totalmente certera y se debe utilizar métodos más precisos (Winn et al., 2013) 29 C. coli + - + + - SULFURO DE HIDRÓGE NOTRIPLE AZÚCAR HIERRO - C. jejuni + - + + - - 25° C 42° C Glicina 1% NaCl 1,5% SENSIBILIDAD Ácido Nalidíxico Cefalotina V R - + V R + + V= Variable; R= Resistente; (+) Positivo; (-) Negativo Tomado de: Winn et al., 2013; Quinn et al., 2013 Elaboración: La autora Pruebas de aglutinación en látex: Es una prueba de rápida identificación de Campylobacter spp., se utiliza anticuerpos policlonales para detectar proteínas flagelares y de membrana (Gharst et al., 2013). Las partículas de látex son recubiertas con inmunoglobulinas que se levantan contra los antígenos de algunas especies de Campylobacter, especialmente C. jejuni y C. coli (Gharst et al., 2013). Detección Molecular: Los métodos de identificación molecular son rápidos y específicos para identificar las especies de Campylobacter, estos métodos amplifican segmentos específicos de ADN o ARN (Gharst et al., 2013). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR múltiple son la más utilizada, algunas técnicas utilizan protocolos de enriquecimiento para incrementar la cantidad de bacterias. Este tipo de prueba tiene un umbral de detección entre 103 UFC por ml en cultivos puros (Gharst et al., 2013). La PCR múltiple permite identificar varias especies con una misma muestra, por la amplificación de varios segmentos de ADN. Como ventajas de esta técnica se puede mencionar su alta sensibilidad y especificidad (Fernández & Alonso, 2010). 30 ACETATO DE INDOXILO CATALASA CRECIMIENTO HIPURATO ESPECIES DE CAMPYLOBA CTER Cuadro 3. Diferenciación de las especies termófilas de Campylobacter Ensayo por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA): es un método serológico de diagnóstico rápido de campylobacteriosis (Murray, Rossenthal, & Pfaller, 2009), tiene un umbral de detección de 104 UFC por ml-1 (Oyarzabal & Battle, 2012). Lo resultados que se obtienen deben ser confirmados con métodos de cultivo (Gharst et al., 2013). Entre estas pruebas se encuentran la ProSpecT TM Campylobacter en heces la cual tiene sensibilidad entre 97-100% y especificidad de 98-100% (Oyarzabal & Battle, 2012). En alimentos una de las más usadas es VIDAS CAM, que posee una sensibilidad entre 88-94% (Oyarzabal & Battle, 2012). Enfermedades relacionadas Campylobacter spp., como ya se lo ha mencionado, está relacionado con otras enfermedades como es el síndrome de Guillain-Barré, artritis reactiva y el síndrome de intestino irritable. Guillain-Barré se asocia a Campylobacter spp., porque muchos casos de personas con este síndrome presentan infección con Campylobacter spp. (WHO et al., 2012); la desmielinización de los nervios periféricos se da porque LOS de Campylobacter spp. muestra mimetismo molecular con los gangliósidos de los nervios periféricos en seres humanos (Nyaty & Nyaty, 2013). En países poco desarrollados se reportó en el 2011, que en el 57% de casos de personas con este síndrome se atribuyó a Campylobacter spp. (WHO et al., 2012). La artritis reactiva se produce en 1-5 % de las personas infectadas con Campylobacte spp. (WHO et al., 2012). El síndrome de intestino irritable es otra enfermedad considerada como secuela de infecciones con Campylobacter spp., este síndrome se produce por el incremento de los linfocitos y la regulación de citosinas en la mucosa rectal, lo que indica la activación del sistema inmune, después de la infección el síndrome hace que aumente la permeabilidad intestinal, que puede 31 incrementar la carga antigénica y aún más la activación del sistema inmune (WHO et al., 2012). Algunos estudios han reportado que el 36% de personas con campylobacteriosis aguda desarrollaron este síndrome después de 1 o 2 años de la infección (WHO et al., 2012). Prevención Las medidas para prevenir la colonización de los pollos en las granjas de broillers, así como la contaminación de las canales en el matadero son fundamentales en la prevención de la infección en seres humanos (EFSA, 2013). Es decir, la adecuada implementación medidas de bioseguridad en granja pueden contribuir a la disminución o retraso de la colonización de los pollos (O´Mahony, Buckley, Bolton, Whyte, & Fanning, 2011). Administrar antibióticos en las aves para prevenir o disminuir la colonización del tracto gastrointestinal de las aves, puede producir resistencia a antimicrobianos, en especial porque se trata de animales destinados al consumo humano (Torralbo, 2013). Debido a esto, se recomienda el empleo de aditivos químicos o biológicos en el alimento y el agua (EFSA, 2011), entre los cuales, el uso de probióticos ha demostrado la reducción significativa de Campylobacter spp., por la exclusión competitiva que se produce entre las bacterias (Torralbo, 2013). Un método novedoso para disminuir la colonización de esta bacteria en el tracto gastrointestinal de los pollos, es el uso de bacteriocinas (FAO & WHO, 2009), las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos (AMPs) producidos por las bacterias para inhibir el crecimiento de otras bacterias (Jeon et al., 2010), se ha demostrado que el uso de bacteriocinas en el agua de bebida elimina a Campylobacter spp. en un 90% de los casos (Riazi et al., 2013), las bacteriocinas que han demostrado un efecto antagonista significativo contra Campylobacter spp. son OR-7 del Lactobacillus salivarius y E-760 de Enterococcus (Jeon et al., 2010). 32 Además, se ha considerado el uso de bacteriofágos por su actividad lítica (Siringan, Connerton, Cummings, & Connerton, 2014). Los bacteriofágos se unen a la bacteria por medio de receptores de proteína o lipooligosacáridos, penetrando en ella para multiplicarse, produciendo lisis de la bacteria por multiplicación de los fagos (Torralbo, 2013). Tratamiento Campylobacter spp. al ser un comensal del tracto gastrointestinal de las aves, no se realiza ningún tratamiento (Hermans et al., 2011). En los seres humanos la enteritis que se produce es de corta duración y autolimitante, pero cuando los síntomas son prolongados o muy graves el antibiótico de elección es la eritromicina, pues muchas especies de Campylobacter son resistentes a una amplia gama de antibióticos (Fernández, 2011). Vacunación Hasta el momento no se ha desarrollado una vacuna efectiva contra campylobacteriosis en seres humanos y se sospecha que la inmunidad frente a Campylobacter spp. puede ser específica de cada cepa (Torralbo, 2013). En animales existe una vacuna contra C. fetus, pero no existe una vacuna para C. jejuni (Nielsen et al., 2011). Las vacunas que se han desarrollado para aves pueden reducir y hasta prevenir la infección (EFSA, 2011), aunque los resultados obtenidos hasta ahora no han sido satisfactorios ya que la mayoría de estudios son poco reproducibles y la protección inducida por la vacuna no disminuye la infección en las aves (Torralbo, 2013). Entre los factores que interfieren en una vacuna efectiva contra Campylobacter spp. están: la poca compresión que se tiene sobre los mecanismos de patogenia, el no tener un modelo animal adecuado y la respuesta inmunológica de las distintas especies (Hernández et al., 2013). 33 CAPÍTULO III METODOLOGÍA Determinación de Métodos a utilizar Tipo de investigación El tipo de investigación del cual se sustentó el presente proyecto es cualitativo no experimental, no probabilístico. Diseño de la investigación En el presente proyecto se utilizó un diseño transversal descriptivo, porque no se manipuló deliberadamente las variables. Este estudio nos permitió identificar las especies de C. jejuni y C. coli presentes en el contenido cecal de pollos en seis plantas de faenamiento industriales en la provincia de Pichincha, mediante el aislamiento bacteriano y aplicación de la PCR múltiple. Descripción de la zona de estudio El trabajo de campo se realizó en seis plantas de faenamiento industrial de pollos, ubicados en la Provincia de Pichincha, en las siguientes parroquias: Carcelén, Pintag, Puembo, San Antonio, Tababela pertenecientes al cantón Quito y la parroquia Ascázubi perteneciente al cantón Cayambe. 34 El trabajo de laboratorio se realizó en el laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, y en el laboratorio de Biología Molecular del Centro Internacional de Zoonosis, ambas instituciones parte de la Universidad Central del Ecuador. Población y muestra La población objeto de estudio estuvo conformada por las parvadas de aves faenadas en seis plantas de faenamiento industriales en la Provincia de Pichincha, las empresas proporcionaron al laboratorio una muestra por cada granja faenada durante cada ciclo productivo. Los nombres de estas empresas se mantuvieron en absoluta reserva, ya que se estableció un acuerdo de confidencialidad con dichas empresas, por lo cual para identificar las muestras se estableció un código alfanumérico. Cuadro 4. Ubicación y código de las Plantas de faenamiento industriales de aves en la Provincia de Pichincha. Empresa Ubicación 1CT Pintag 2CT San Antonio de Pichincha 3CT0 Carcelén 4CT0 Ascázubi 5CT0 Puembo 6CT0 Tababela Fuente: Investigación Directa Elaboración: La Autora Muestra El tipo de muestreo que se aplicó en la investigación es un muestreo no probabilístico aleatorio, porque en el estudio se estableció la presencia o ausencia de C. coli y C. jejuni en un periodo de tiempo de seis meses 35 establecido por el “Estudio de Prevalencia y Resistencia a los antibacterianos de Campylobacter spp., Escherichia coli BLEE y Salmonella spp. en muestras gastrointestinales de pollos faenados en camales industriales de la Provincia de Pichincha-Ecuador”, al cual pertenece el presente proyecto. Se tomó 25 gramos de contenido cecal por muestra, un gramo de heces por ciego de pollo; según la norma ISO 6579:2002 para la detección de Salmonella spp. móviles en fecas. Esta metodología se utilizó ya que paralelamente se realizó el aislamiento de Salmonella spp. y Eschericha coli BLEE. . El muestreo se realizó de forma aséptica después del eviscerado en las plantas de faenamiento, por cada muestra se tomó 25 ciegos y se transportó en refrigeración al laboratorio de bacteriología de la FMVZ. En el laboratorio, se pesó 1 gramo de heces por cada ciego, se realizó un pool de heces y se sembró en agar MCCDA, después de la confirmación por tinción Gram modificada se repicó seis colonias en dos agares MCCDA, y se guardó tres de estás cepas en sangre desfibrinada de cordero y una en caldo brucella con glicerol, estas cepas se almacenaron a 80°C. Del primer repique que se almacenó en sangre, se tomó una asada para su posterior lisis e identificación molecular mediante la PCR múltiple. Procedimiento de la Investigación Se realizó en dos etapas: a. Recolección de la información Las plantas de faenamiento proporcionaron la información sobre las granjas que se faenaban por día. Una persona encargada en cada planta de faenamiento facilitó la información para el registro de cada muestra. Se tomó por cada muestra 25 ciegos de pollos después del eviscerado. 36 Se identificó y almacenó la muestra de forma adecuada. b. Procesamiento de la información y muestras en el laboratorio Se aisló Campilobacter spp. utilizando el medio MCCDA y se confirmó mediante tinción Gram modificada. Se repicó en MCCDA para obtener cepas aisladas. Se realizó un lisado del repique de la primera cepa almacenada en sangre para su posterior análisis molecular. Se tipificó molecularmente mediante la PCR múltiple para C. jejuni y C. coli, según el protocolo establecido por Vandamme et al. (1997). Técnicas e instrumentos de recolección de información Registro de muestreo de Campylobacter spp.: La recolección de información de la muestra se obtuvo mediante un cuestionario, el cual proporcionó datos importantes de los animales muestreados (Anexo A). Registros de Laboratorio: La datos obtenidos durante el procesamiento de las muestras se registraron de acuerdo a los dos procesos de laboratorio que se realizaron: Registro de Laboratorio de Bacteriología para aislamiento de Campylobacter spp. Registro de Laboratorio de Biología Molecular para identificar C. jejuni y C. coli. Técnicas de Laboratorio Técnica de procesamiento de la muestra El procesamiento de la muestra se dio de la siguiente forma: Colocar los ciegos en alcohol al 70% durante 5 minutos, a continuación se quita el exceso de alcohol. 37 Cortar los ciegos en la parte distal, realizar un pool de heces para esto se pesa 1 gramo de heces por cada ciego y se homogeniza. Técnica de Aislamiento de Campylobacter spp. Siembra en el medio MCCDA OXOID® CM0739 Procedimiento de cultivo El pool de heces de contenido cecal se siembra en MCCDA por estriación simple, de la siguiente forma: Tomar una asada de heces y realizar el inoculo primario, en el primer cuadrante de la caja Petri. Esterilizar el asa, y en el segundo cuadrante rozando el inoculo primario realizar estrías hasta la otra esquina, con movimientos de atrás hacia delante. Realizar el mismo procedimiento con los dos cuadrantes restantes, realizando estrías más separadas en cada cuadrante para poder obtener colonias aisladas. Incubación Incubar en microaerofilia (5-6% de Oxígeno, 10% CO2 y 84-85% Nitrogeno) por 48 horas a 42°C. Identificación de la morfología de colonias Las colonias de Campylobacter spp. son colonias pequeñas, redondas, planas, mucoides, plateadas y con brillo metálico (Forbes et al., 2009). Confirmación de Campylobacter spp. Tinción Gram modificada La tinción modificada de Campylobacter spp. utiliza solo la safranina como colorante. 38 Procedimiento para la tinción a) Tomar una colonia del microorganismo y homogenizar con agua destilada estéril en una placa porta objetos. b) Secar al ambiente y fijar a la llama del mechero. c) Colocar safranina durante 1 minuto, lavar y dejar secar al ambiente. Interpretación: Campylobacter spp.: Bacilos curvos, pequeños, en forma de bastón o en “alas de gaviota” (Forbes et al., 2009). Otras bacterias Gram negativas: Bacilos largos, cocos, cocobacilos u otras formas. Repique de Campylobacter spp. Como el primer cultivo puede ser un cultivo mixto se realiza un repique de seis colonias que presenten la características de Campylobacter spp., sembrar en dos agares MCCDA incubar en microaerofilia, a 42°C durante 48 horas. Pasada las 48 horas revisar la morfología de las colonias y realizar otra tinción Gram modificada, si los repiques son cultivos puros se guarda como respaldo cuatro de estos repiques, tres en sangre desfibrinada de cordero o equino y uno en caldo brucella con 15% glicerol a -80°C. Procedimiento de crioconservación de Campylobacter spp. Sangre desfibrinada Procedimiento Tomar una asada del repique positivo y colocar en crioviales o tubo ependorf® con 1 ml de sangre desfibrinada, repetir el mismo procedimiento con los dos repiques positivos restantes. Y almacenar a -80°C. 39 Caldo brucella con glicerol Procedimiento Tomar una asada de uno de los repiques positivos y colocar en 1 ml de caldo brucella con 15% de glicerol sin disgregar la asada. Almacenar a - 80°C. Técnica de tipificación molecular de C. jejuni y C. coli Preparación de ADN Con una asa de 1 µl se recoge material del primer repique de cada muestra y se coloca en un tubo Ependorf ® con 300 µl de agua destilada estéril, se mezcla y se coloca en baño María a 90°C por 20 minutos. PCR múltiple Composición Los primers utilizados son: C. coli 1 (5´-AG GCA AGG GAG CCT TTA ATC-3´), C. coli 2 (5´-TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC-3´), C. jejuni 3 (5´-CA TCT TCC CTA GTC AAG CCT-3´) y C. jejuni 4 (5´-AAG ATA TGG CTC TAG CAA GAC-3´). Los primers de C. coli anidan en el gen homólogo de la glicerol-3fosfato deshidrogenasa y los primer de C. jejuni anidan en una secuencia teórica que codifica a la proteína putativa periplasmatica. Se utilizó el Kit Go Taq G2® Flexi DNA Polymerase de Promega, este Kit contiene dNTP Mix, MgCl2 y 5X Green GoTaq®. También se utilizó para la PCR la Nucleasa-free Water® y el dNTP Mix® de 10nM, marca Promega, que no están incluidos en el Kit. Las cantidades necesarias para una reacción están descritas en el Cuadro 5. 40 Cuadro 5. Cálculo del mater mix para una reacción Concentración inicial Reactivo Cantidad Unidad Concentración final Cantidad Volumen para una reacción Unidad Cantidad Unidad µl µl µl µl Agua Template Buffer dNTP Mix 5 10 X mM 1 0,3 X mM 15,2 1 5 0,75 MgCl2 Col 1 Col 2 Jun 3 Jun 4 Taq 25 100 100 100 100 5 mM mmol/µl mmol/µl mmol/µl mmol/µl U/µl 2 0,8 0,8 0,8 0,8 0,05 mM mmol/µl mmol/µl mmol/µl mmol/µl U/µl 2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,25 µl µl µl µl µl µl 25 µl Total Tomado de: Vandamme, 1997 Elaboración: La Autora Procedimiento PCR: Se utilizó un protocolo touchdown para esta PCR; en el Cuadro 6 se puede observar el programa que se utilizó en el termociclador. 41 Cuadro 6. Programa para termociclador Programa Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineación de Primers Extensión de la Cadena Desnaturalización Alineación de Primers Extensión de la Cadena Desnaturalización Alineación de Primers Extensión de la Cadena Desnaturalización Alineación de Primers Extensión de la Cadena Desnaturalización Alineación de Primers Extensión de la Cadena Desnaturalización Alineación de Primers Extensión de la Cadena Elongación final T° 94°C 94°C 64°C 72°C 94°C 62°C 72°C 94°C 60°C 72°C 94°C 58°C 72°C 94°C 56°C 72°C 94°C 54°C 72°C 72°C Tiempo Ciclos 5min 1 1min 1min 2 1min 1min 1min 2 1min 1min 1min 2 1min 1min 1min 2 1min 1min 1min 2 1min 1min 1min 30 1min 10min 1 Tomado de: Vandamme, 1997 Elaboración: La Autora Electroforesis Componentes Ultra PureTM Agarose, INVITROGENTM TBE 5 x, CHEM CruzTM SYBR®Safe, DNA gel Stain, INVITROGENTM Marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder INVITROGENTM Muestras a analizar. Controles positivos de C. jejuni y C. coli Control negativo 42 Procedimiento Preparar el gel de agarosa al 2% utilizando como disolvente TBE 0,5X. En los pocillos del gel colocar el marcador de peso molecular, los controles positivos, control negativo, y las muestras a analizar. Para la corrida electroforética, programar la fuente de poder a 30 minutos y a 100 voltios. Observar el gel mediante la utilización de luz ultravioleta y una cámara digital. La determinación se da por la observación de bandas específicas, si es C. coli (364 pb) y C. jejuni (773 pb). Técnicas de Procesamiento y análisis de datos La información proveniente de las plantas de faenamiento relacionada con las características, ubicación y estado sanitario de las aves de cada una de las granjas que se muestrearon se almacenó en una base de datos al igual que los resultados obtenidos, los cuáles se representaron en una tabla bidimensional, donde cada columna tiene un nombre único y en cada fila se introdujo la información de cada muestra recolectada dependiendo de lo que se solicitó en cada columna. Dicha tabla se registró en Microsoft Excel ®. Análisis de datos Los resultados obtenidos se analizaron porcentualmente en base al total de muestras procesadas hasta el final del periodo establecido de muestreo y los aislamientos positivos. Además de un análisis porcentual de los resultados obtenidos de tipificación molecular. Estos aislamientos también se analizaron conjuntamente con la información proporcionada por la plantas de faenamiento, para establecer características asociadas a la positividad. Para el análisis de los datos se utilizó Microsoft Excel®. 43 CAPÍTULO IV RESULTADOS Presentación de Resultados El aislamiento de Campylobacter spp. se realizó en el medio MCCDA, y se confirmó mediante tinción Gram modificada. En el óráfico 4, se puede observar un repique positivo a Campylobacter spp. con colonias de color plateado metálico, y la tinción Gram modificada, en la que se observa bacilos curvos, en forma de gaviota, característico de esta bacteria. Gráfico 4. Repique positivo a Campylobacter spp. sembrado en MCCDA y tinción Gram modificada de Campylobacter spp. Obsérvese los bacilos en forma de alas de gaviota, característicos de Campylobacter spp. Fuente: La Autora 44 Durante los seis meses de muestreo, se obtuvo 189 muestras de seis plantas de faenamiento. Del total de muestras procesadas durante esta investigación se eliminaron 8 muestras por problemas técnicos en el laboratorio en incubación inicial. De las 181 muestras analizadas 130 (71,8%) fueron positivas a Campylobacter spp. Los resultados de aislamiento por siembra directa se pueden observar en la Cuadro 7. Cuadro 7. Resultados de aislamiento de Campylobacter spp. del contenido cecal de pollos faenados en seis plantas de faenamiento RESULTADOS PLANTAS DE FAENAMIENTO Número de muestras procesadas #* %* 1CT 93 66 70,97 2CT 39 28 71,79 3CT 16 14 87,50 4CT 12 6 50 5CT 15 13 86,67 6CT 6 3 50 Positivo * # (Número de muestras positivas), % (Porcentaje de muestras positivas) Fuente: Investigación Directa Elaboración: La Autora El número de muestras procesadas por cada planta de faenamiento no fue homogéneo, debido a las características y tamaño de cada empresa, razón por la cual al final del muestreo, algunas plantas de faenamiento proporcionaron mayor número de muestras que otras, como se puede observar en el Cuadro 7. 45 Para poder identificar la especie de las muestras positivas se utilizó una PCR múltiple para C. coli y C. jejuni. Se identificó las bandas específicas de C. coli (364 pb) y C. jejuni (773 pb), como se muestra en el Gráfico 5. Gráfico 5. PCR múltiple para C. coli y C. jejuni. Se identifica C. coli por presentar bandas específicas de 364pb y C. jejuni con 773 pb. Se puede observar que en algunas muestras se identificó ambas especies de Campylobacter. Fuente: La Autora Al realizar la PCR múltiple a las 130 muestras positivas al cultivo bacteriológico, se obtuvo los siguientes resultados: C. coli 88 (67,69%), C. jejuni 23 (17,69%), aislamiento mixto de C. coli y C. jejuni 18 (13,85%) y negativo el restante 1 (0,77%). En el Gráfico 6 se puede observar los resultados obtenidos. 80% 70% 67,69% Porcentaje 60% 50% C. coli 40% C. jejuni 30% C. coli y C. jejuni 20% 17,69% Negativo 13,85% 10% 0,77% 0% Resultados de PCR múltiple Gráfico 6. Identificación de especies de Campylobacter mediante la PCR múltiple. Fuente: Investigación Directa Elaboración: La Autora 46 Los resultados de tipificación molecular obtenidos por cada empresa se puede observar en el Cuadro 8. Cuadro 8. Especies de Campylobacter encontradas en las empresas muestreadas. PLANTAS DE FAENAMIENTO C. coli C. jejuni C. coli y C. jejuni #* %* #* %* #* %* 1CT 50 75,76 9 13,64 7 10,60 2CT 14 50 8 28,57 5 17,86 3CT 9 64,29 4 28,57 1 7,14 4CT 5 83,33 0 0 1 16,67 5CT 7 53,85 2 15,38 4 30,77 6CT 3 100 0 0 0 0 Negativo** #* %* 1 3,57 * #= número de muestras identificadas, %= Porcentaje de muestras identificadas. ** Muestras que no se tipificaron mediante la PCR múltiple. Fuente: Investigación Directa Elaboración: La Autora Los aislamientos en los cuales se identificó dos bandas después de la electroforesis y la banda de 773 pb no era clara, fueron sometidos a una PCR con un set de primers para C. jejuni, como método de confirmación de resultados. Los antibióticos utilizados en las parvadas de aves que fueron positivas a Campylobaccter spp., fueron agrupados según grupos farmacológicos como se describe en el Cuadro 9. Aquí se puede observar que los grupos farmacológicos más utilizados fueron: quinolonas, nitrofuranos y fenicoles. 47 Cuadro 9. Grupos farmacológicos usados en granja previo al faenamiento en las aislamientos positivos a Campylobacter spp. Grupos farmacológicos Aminoglucósidos Resultados Generales #* %* 4 3,1 Betalactámicos 6 4,3 Estreptograminas 5 3,8 Fenicoles 35 26,9 Macrólidos 30 23,1 Nitrofuranos 61 46,9 Pleuromutilinas 10 7,7 Tetraciclinas 5 3,8 Quinolonas 82 63,1 Sulfonamidas 2 1,5 * #= número de parvadas positivas que usaron antibiótico, %= Porcentaje de parvadas positivas que utilizaron antibiótico. Fuente: Investigación Directa Elaboración: La Autora Discusión de Resultados El aislamiento en MCCDA por cultivo directo, ha demostrado ser un método eficaz para el aislamiento de C. jejuni y C. coli. Un estudio para la detección de C. jejuni y C. coli en contenido cecal de broilers usando algunos métodos de cultivo, demostró que el aislamiento por cultivo directo en MCCDA y en agar Karmali detectan entre 102 y 103 UFC g-1, indicando que estos métodos son apropiados para monitorear Campylobacter spp. en heces de pollos (Rodgers, Clifton, Marin, & Vidal, 2010). Al utilizar un modelo Bayesiano para determinar la sensibilidad de los métodos de cultivo para Campylobacter spp. en carne de pollo, se determinó que la sensibilidad del aislamiento bacteriano 48 utilizando pre enriquecimiento fue de 41% mientras que la siembra directa fue de 69% (Habib, Sampers, Uyttendaele, De Zutter, & Berkvens, 2008). En otro modelo Bayesiano se estimó que la sensibilidad del cultivo directo de muestras cecales de pollo en MCCDA está entre 64% y 66% (Woldemariam, Bouma, Vemooij, & Stegeman, 2008). Una investigación en la cual se utilizó PCR múltiple para la identificación de C. coli y C. jejuni de cultivos puros y directamente a partir de muestras de heces en seres humanos demostró que la sensibilidad de la PCR múltiple en muestras de heces en humanos fue de 105 células por ml de heces; mientras que cuando las mismas muestras fueron cultivadas en MCCDA previo a la PCR la sensibilidad fue de 100 células por ml de heces, determinando que el cultivo en MCCDA previo a la PCR es superior en comparación con la purificación directa de ADN al menos al analizar muestras frescas de heces en seres humanos (Persson & Olsen, 2005). Como resultado a estos estudios se puede concluir que el uso de MCCDA para aislamiento de Campylobacter spp., previo a la PCR múltiple, puede mejorar la sensibilidad de la PCR múltiple. La PCR múltiple utilizada en el presente estudio, fue evaluada en una investigación con cepas ATCC, en la cual se determinó que la sensibilidad y especificidad para la identificación de C. jejuni es de 93% y 100% respectivamente, mientras que para C. coli estos valores son 100% (On & Jordan, 2003). Estos resultados soportan el uso de esta PCR como método eficaz para la tipificación de C. coli y C. jejuni. El aislamiento de Campylobacter spp. que se obtuvo en el presente estudio (71,8%), concuerda con resultados obtenidos en otros investigaciones. Así, se ha reportado que la prevalencia media de Campylobacter spp. en la unión Europea es 71,2% (EFSA, 2010), mientras que en Reino Unido es 75,8% (Powell et al., 2012). En Argentina, en un estudio se aisló 62,1% de Campylobacter spp. a partir de contenido cecal de pollos faenados en tres 49 plantas de faenamiento (Velilla, Terzolo, & Méndez, 2011). En la provincia de Shandong, China, la prevalencia de Campylobacter spp, en contenido cecal fue 35,9% (Chen et al., 2010). Mientras que en Estados Unidos, en un estudio se determinó la prevalencia en varias parvadas de pollos boiler de muestras fecales en 51,4% (Berghaus et al., 2013). Esta información obtenida en varios países sustenta los resultados obtenidos, al existir una alta prevalencia de Campylobacter spp. a nivel mundial. En la mayoría de estudios realizados en pollos, la frecuencia de aislamiento de C. jejuni es mayor que la de C. coli. En un estudio en Andalucía en muestras cloacales de pollos en granja, la prevalencia de C. jejuni fue 31,71% y C. coli 6,0% (Torralbo, 2013). Estos resultados concuerdan con resultados de otros autores en los que se ha encontrado 39,5% C. jejuni y 17,7% C. coli en lotes de broiler (Sasaki et al., 2010). En Europa se estimó que la presencia de C. jejuni fue 40,6% y C. coli 31,9% en pollos broiler (EFSA, 2010). Todos estos estudios contrastan con los resultados obtenidos en la presente investigación, sin embargo, en España se detectó mayor prevalencia de C. coli (61,4%) que C. jejuni (38,3%) (EFSA, 2010), la variación de este estudio con otros estudios en países de la unión Europea se puede asociar a los diferentes métodos de muestreo y detección de Campylobacter spp. En un estudio realizado en muestras de ciegos de pollos en Argentina, se identificó el 62,2% de positividad a C. coli y 37,8% a C. jejuni (Velilla et al., 2011). Estos últimos resultados son similares a los obtenidos en el presente estudio en el que se identificó el 67,69% de C. coli, 38,3% de C. jejuni y aislamientos mixtos de C. coli y C. jejuni 13,85%. En una investigación realizada en Thailandia se atribuyó mayor incidencia de C. coli a la contaminación de carne pollo con carne de cerdo en negocios minoristas (Suzuki & Yamamoto, 2009). Sin embargo, este factor no se puede atribuir a las muestras tomadas en este estudio, pues las plantas de faenamiento en las cuales se tomaron exclusivamente pollos broiler. 50 las muestras procesaban Fernández (2011) indica que C. coli ha sido aislado con mayor frecuencia en países Sudaméricanos tanto de seres humanos como de animales, representando el 25% de casos de diarrea en seres humanos producida por especies de Campylobacter. Esta información concuerdan con el alto porcentaje de aislamientos de C. coli obtenido en el presente estudio. Las diferencias reportadas por varios autores en las proporciones de los aislamientos de C. coli y C. jejuni en diferentes zonas geográficas se podría atribuir a variaciones climáticas, zootécnicas, genéticas bacterianas, etc. Sin embargo, al no existir explicaciones claras sobre estas variaciones, se necesitan estudios epidemiológicos complementarios para determinar los factores a los que se les puede atribuir estas diferencias. En la presente investigación los aislamientos mixtos de C. jejuni y C. coli representaron el 13,85% de las muestras, lo que concuerda con el rango descrito en otros estudios en los que se reporta infecciones mixtas entre el 11,7 al 19,1% de las muestras estudiadas (Torralbo, 2013; Al Amri, Senok, Yusuf, Al-Mahmeed, & Botta, 2007). Una de las muestras aisladas como Campylobacter spp, no pudo ser identificada por la PCR múltiple. Otros autores han reportado muestras de Campylobacter spp. que no pudieron ser identificadas como C. jejuni o C. coli (Sasaki et al., 2010). Esto se puede dar porque existen otras especies de Campylobacter termófilas como C. lari, cuya frecuencia de aislamiento en aves es rara. Por ejemplo en Italia se determinó la prevalencia de C. lari en 1,1% de las muestras aisladas de contenido cecal (Di Giannatale et al., 2010). Según la FAO el riesgo de Campylobacter spp. en pollos broiller, está altamente asociada a la edad de faenamiento (FAO & WHO, 2009). En diversos estudios se menciona que el pico máximo de colonización en aves está entre 42-45 días de vida, debido al estrés que provoca, el retiro de alimento previo al faenameinto, encierro en jaulas y transporte a la planta de 51 faenameinto (Velilla et al., 2011). Este dato concuerdan con La edad promedio de faenamiento de las parvadas positivas (44,67 días; S: 3,50) muestreadas en el presente estudio. En todas las parvadas positivas al aislamiento de Campylobacter spp. se utilizó algunos antibióticos, de los cuales los de mayor uso fueron: quinolonas en el 63,1% de muestras positivas, nitrofuranos en el 46,9% y fenicoles en 26,9%. En varios estudios en países sudamericanos se ha demostrado la existencia de cepas de origen humano y animal resistentes a eritromicina, tetraciclina, ampicilina y quinolonas, siendo la resistencia a quinolonas común en la mayoría de cepas de Campylobacter spp. Así, en Perú se identificó entre 63-78% de cepas resistentes a quinolonas, en Argentina entre 49,1-59,6%, en Bolivia 47%, en Brasil 72,2% y Chile 50% (Fernández, 2011). Probablemente las cepas de C. coli y C. jejuni aisladas en este estudio también presenten fenotipos resistentes a los antibióticos más utilizados, entre ellos las fluroqinolonas, por lo que posteriores estudios sobre la resistencia a antimicrobianos deben ser realizados para estimar el potencial riesgo de estas bacterias en la salud de la población. 52 CAPÍTULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Conclusiones El alto porcentaje de aislamiento de Campylobacter spp. en ciegos de pollos (71,8%) podría ser importante al representar un riesgo a la salud humana si estas bacterias sobreviven en la carne pollo. En el presente estudio la presencia de C. coli es mayor (67,69%) a C. jejuni (17,69%), lo que contrasta con países industrializados donde se ha aislado en mayor porcentaje C. jejuni. En este estudio se identificó un 63,1% de parvadas positivas, en las que se utilizó quinolonas en granja, lo que podría incurrir a la propagación de cepas resistentes a estos antibióticos usados también en medicina humana. 53 Recomendaciones Se requiere realizar estudios complementarios sobre la presencia y cuantificación de C. coli y C. jejuni en la industrialización de carne de pollo para evaluar el riesgo que estas bacterias pueden representar en la salud pública. Investigar sobre resistencia antimicrobiana en las cepas aisladas en estudios en granja y en carne de pollo, para obtener información que pueda ayudar a establecer el uso adecuado de antibióticos tanto en animales como en seres humanos. Identificar la variabilidad genética de las cepas de C. coli y C. jejuni encontradas a nivel de granja para poder determinar las posibles variantes que circulan en el país y su epidemiología. Realizar pruebas moleculares con la muestra que no pudo ser identificada mediante la PCR múltiple, para confirmar su género y posibles especies. 54 REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS Al Amri, A., Senok, A., Yusuf, A., Al-Mahmeed, A., & Botta, G. (2007). Multiplex pcr for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools. Journal of Medical Microbiology, 56(10), 1350-1355. doi: 10.1099/jmm.0.47220-0 Alemka, A., Corcionivoschi, N., & Bourke, B. (2012). Defense and adaptation: the complex inte-relationship between Campylobacter jejuni and mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2(15), 297-302. doi: 10.3389/fcimb.2012.00015 Bahrndoff, S., Rangstrup, L., Nordentoft, S., & Hald, B. (2013). Foodborne disease prevention and broiler chickens with reduced Campylobacter infection. Emerging Infectious Diseases, 19(3), 425-430. doi: 10.3201/eid1903.111593 Bailey, G., Vanselow, B., Hornitzky, M., Hum, S., Eamens, G., Gill, P., Walker, K., & Cronin, J. (2003). 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ISBN-13: 978-0-81380718-8 66 ANEXOS 67 ANEXO A Registro de muestras Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Identificación de muestras ID:…………………………………………… Fecha : Lote: Edad: Nombre de la granja: Ubicación de la granja: Número de galpones en la granja: Antibióticos usados al nacimiento en incubadora (dosis): Antibióticos usados en la recepción (dosis y número de días): Promotores de crecimiento usados en el alimento (dosis): Antibióticos usados en tratamientos 1 recepción (dosis y número de días): Antibióticos usados en tratamientos 2 recepción (dosis y número de días): Antibióticos usados en tratamientos 3 recepción (dosis y número de días): Enfermedades asociadas a bacterias Observaciones: 68 ANEXO B Descripción del Medio MCCDA OXOID® CM0739 Para poder sembrar en este medio de cultivo se debe adicionar el suplemento selectivo CCDA SR0155. Este medio sirve para el aislamiento de especies termófilas de Campylobacter (C. jejuni, C. coli y C. laridis). El medio MCCDA remplaza la sangre con carbón, conjuntamente con el desoxicolato de Sodio y sulfato Ferroso promueve el crecimiento de Campylobacter spp. Mientras que la cefoperazona inhibe el crecimiento de Gram negativos entéricos y Gram positivos, mejorando así la selectividad del medio. La Anfotericina B inhibe la contaminación con levaduras y hongos que probablemente ocurre a 37°C. Formula: MCCDA g /lt Caldo Nutritivo N°.2 25.0 Carbón bacteriológico 4.0 Caseina hidrolizada 3.0 Desoxicolato de Sodio 1.0 Sulfato Ferroso 0.25 Piruvato de Sodio 0.25 Agar 12.0 pH 7.4 ± 0.2 @ 25°C Suplemento Selectivo CCDA por vial por litro Cefoperazona 16mg 32 mg Anfotericina B 5 mg 10 mg * Cada vial es suficiente para 500 ml de medio. 69 Procedimiento: Suspender 22,75 g de MCCDA en 500 ml de agua destilada y hervir hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos. Enfriar a 50°C y asépticamente añadir 1 vial de suplemento selectivo CCDA previamente reconstituido con 2ml de agua destilada estéril. Mezclar bien y dispensar en cajas Petri estériles. Conservación: Las cajas Petri se almacenan hasta 2 semanas en fundas pláticas, en posición invertida a 2-8°C. 70 ANEXO C Procesamiento de muestras Campylobacter spp. Muestra 25 ciegos de pollos Colocar los ciegos en alcohol por 5 min Secar los ciegos en una superficie y cortarlos en su parte distal. Pesar 25 g de heces de los ciegos, un gramo por cada ciego. Homogenizar la muestra. Sembrar una azada de la muestra en agar MCCDA Incubar a 42° C, en microaerofilia durante 48 h. Tinción Gram modificada de colonias sospechosas (pequeñas de color plateado). Positivo Negativo Repique de seis colonias positivas en dos cajas de MCCDA. Esterilizar y desechar las cajas. Incubar a 42° C en microaerofilia durante 48 h. Tinción Gram modificada de las seis cepas. Positivo Negativo Respaldar tres de las cepas en tubos Ependorf con 1 ml de sangre de equino u ovino y una de las cepas se almacena en caldo brucella con 15% glicerol. En un tubo Ependorf con 300ul de agua destilada estéril, adicionar una azada de la primera cepa que se va a almacenar. Almacenar en el ultracongelador a 80°C. Poner en baño María a 90°C, durante 20 min. Almacenar en ultracongelador a -80°C. Realizar múltiple PCR 71 el
