tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE
COLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLdGfCAS
YAGROPECUARIAS
“CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y FUNCIONAL
DE TIROCITOS DE EXPLANTES TIROIDEOS
DE RATA SPRAGUE - DAWLEY’
T E S I S
QUE
PRESENTA:
PARA OBTENER EL GRADO DE :
MAESTRO EN CIENCIAS
ÁREA:
BIOTÉCNOLOGíA
LíNEA
HERENCIA
DE INVESTIGACIÓN:
Y
ADAPTACIÓN
DI
DR.
SERGIO
DR.
TECOMÁN,
RECTORES
HUGO
JAME
COLIMA,
:
SA’NCHEZ
MOLINA
MÉXICO,
ANIMAL
R O D R ÍGUEZ
OCHOA
SEPTIEMBRE
DE
1999
Tesis elaborada bajo la dirección de los Doctores:
Dr. Sergio Hugo Sánchez Rodrígue
Dr. Jaime Molina Ocho
Y por el comitC particular de asesores,
por los Doctores:
Dr. Javier Farías Lario
Dr. Oscar Rebolledo Domíngue
Dr. Roberto Lezama Gutiérrez
Dr. Rafael Herrera Esparza
Quienes manifestamos que hemos revisado y aceptado el informe final de investigación,
mismo que reúne los requisitos académicos para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias
Especialidad: Biotecnologia.
Linea de Investigación Herencia y Adaptación Animal.
Facultad de Ciencias Biológicas y Ag ropecuarias
C. EDUARDO MANZANARES ACUÑA
ALUMNO DEL POSGRADO DE LA FGBA
PRESENTE
titulada
En base a los dictámenes emitidos a su tesis
“CARACTERIZACI6N MORFOLÓGICA Y FUNCIONAL DE TIROCITOS DE
EXPLANTES TIROIDEOS DE RATA SPRAGUE-DAWLEY” por el cuerpo
académico de la Facultad y el asesor externo, me permito informar a usted, que
habiendo cumplido el documento con los requisitos académicos de forma y
fondo, se autoriza la impresión de misma para ser presentada ante un jurado, con
el fin de obtener el titulo de “MAESTRO EN CIENCIAS, ÁREA
BIOTECNOLOGÍA, en la línea de investigación “Herencia y Adaptación
Animal”.
Dicho trabajo fue realizado bajo la dirección de los Doctores Sergio Hugo
Sánchez Rodríguez de la Universidad Autónoma de Zacatecas (UAZ) y Jaime
Molina Ochoa y los asesores Drs. Roberto Lezama Gutiérrez, Oscar Rebolledo
Dominguez, Javier Farias Larios de la Universidad de Colima y Dr. Rafael
Herrera Esparza del Centro de Biología Experimental de la UAZ.
ATENTAMENTE
Tecomán, Col. a 09
ÍNDICE
Agradecimientos ............................................................................................................ i
Dedicatorias ................................................................................................................... ii
...
Resumen ........................................................................................................................ 1 1 1
Abstract ......................................................................................................................... iv
Lista de Figuras.. ........................................................................................................... v
I.- INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..~........... 1
II. REVISIÓN DE LITERATURA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...*...................................................
7
2.1 Glhdula tiroides ......................................................................................................................................
2.1.1.2 Fisiologia de las chlas tiroideas ....................................................................................................
2.1.2 Hormonas tiroideas TI y T, .................................................................................................................
2.1.3 Tiroglobulina ........................................................................................................................................
2.2 Hormona estimulante de la tiroides (TSH) ..........................................................................................
2.3 Citoesqueleto.. .........................................................................................................................................
2.4 Cultivo celular.. .......................................................................................................................................
7
10
10
14
15
18
20
III. MATERIALES Y MÉTODOS ......... ..*.............................*.....,......................*................. 2 3
3.1 Panorama general ...................................................................................................................................
3.2 Sujetos experimentales ...........................................................................................................................
3.3. Obtención de las cklulas tiroideas.........................................................................................................
3.3.1 Explante tiroideo.. ................................................................................................................................
3.3.2 Disociación celular ...............................................................................................................................
3.3.3 Cultivo celular ......................................................................................................................................
3.4 Determinación de la viabilidad celular.. ...............................................................................................
3.5 Lisis celular .............................................................................................................................................
3.6 Determinación de proteinas en extractos totales.. ................................................................................
3.7 Electroforksis (F’AGE-SDS) ..................................................................................................................
3.8 Transferencia de proteinas a membrana de nitrocelulosa ..................................................................
3.9 Bloqueo de la membrana de nitrocelulosa ............................................................................................
3.10 Inmunodetección ..................................................................................................................................
3.11 Determinación de tiroglobulina ..........................................................................................................
3.12 Inmunoflorescencia indirecta para detectar receptores a TSH, filamentos de Actina y
microtúbulos .................................................................................................................................................
3.13 Anhlisis estadlstico.. ............................................................................................................................
23
23
24
24
24
25
26
26
27
.27
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28
.28
.28
29
.29
IV. RESULTADOS.................................................................................................................. 3 1
4.1 Viabilidad celular ...................................................................................................................................
31
4.1.1 Concentración de suero fetal de ternera.. ..........................................................................................
4.2 Caracterización morfológica ..................................................................................................................
4.3 Determinación de Tiroglobulina.. .........................................................................................................
4.4 Expresión de receptores a TSH ............................................................................................................
32
33
.35
.36
V. DISCUSIÓN ......*.......,..........,..,...............,...................*....................................................... 4 1
5.1 Tkcnicas de disociación, a partir del explante tiroideo y medición de la viabilidad celular.............4 1
43
5.1.1 Condiciones del cultivo ........................................................................................................................
45
5.2 Caracterización morfológica ..................................................................................................................
.47
5.3 Caracterización funcional .....................................................................................................................
5.4 Expresión de los receptores a TSH y componentes del citoesqueleto.. .............................................. .48
VI. CONCLUSIONES ................ .......... .................................... ..*....................*....................... 5 2
53
VII. LITERATURA CITADA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...*...................................................................
AGRADECIMIENTOS
Al cuerpo de Asesores Internos de la Universidad de Colima: Facultad de Ciencias
Biológicas y Agropecuarias.
Dr. Jaime Molina Ochoa.
Dr. Oscar Rebolledo Domínguez.
Dr. Javier Farías Larios
Dr. Roberto Lezama Gutierrez.
A la Universidad Autónoma de Zacatecas, en especial para el director y asesor de la tesis
respectivamente:
Dr. Sergio Hugo Sánchez Rodríguez.
Dr. Rafael Herrera Esparza.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por su apoyo mediante la beca 121262,
muchas gracias.
A PROMEP, por su apoyo complementario.
DEDICATORIAS
En memoria de mi abuelo: Don José Manuel Acuna de Santiago.
A mis padres, Teresita del NiAo Jesús Acuña Félix y Lic. J. Jesús Manzanares Jacobo
A Mis Hermanos: Teresa Eugenia, José de Jesús, María Rosaura, Miguel Angel, Sergio,
Ernesto Manuel, Héctor Martín, Gustavo Adolfo, Edmundo y María del Rocío.
A mi esposa Laura Josefina, por su gran apoyo, comprensión e impulso para alcanzar ésta
meta.
A mis hijos: Luis Eduardo, Alejandro y Laura Karina, por su amor y apoyo.
Al Dr. Miguel Arenas Vargas y al Dr. Luis Felipe Bojalil Jaber, por haberme motivado y
mostrarme otra gran faceta del proceso enseñanza-aprendizaje.
A mis amigos, por sus acertados consejos: Héctor René Vega Carrillo, Sergio Hugo
Sánchez Rodríguez, Rómulo Bañuelos Valenzuela, Miguel Angel Salas Luévano, Carlos
Moran Rodríguez y Héctor Alfredo Robles Martínez.
Al Dr. Rafael Herrera Esparza, por sus muy atinados consejos y guía.
A mis compañeros del CREN, por su estímulo y tolerancia.
A mis compañeros de la FCBA.
Para aquellos a los que omití involuntariamente.
RESUMEN
En el presente trabajo se realizó la estandarización de un modelo biológico in vitro
para llevar a efecto estudios fisiológicos de la glandula tiroides. Se efectuó la digestión
enzimática del explante tiroideo, y se determinó la viabilidad celular. Se utilizaron
diferentes concentraciones de hormonas y 5% de suero fetal de ternera. La caracterización
morfológica de las células tiroideas se realizó comparándolas contra las de la línea célular
FRTLS. La caracterización funcional se determinó por la presencia de tiroglobulina por
RIA, posteriormente las células tiroideas en monocapa
se procesaron para IFI y se observó
la expresión de receptores a la TSH y a los componentes del citoesqueleto tubulina y actina.
Se analizó la expresión del receptor contra TSH, en extractos celulares de tirocitos, células
HeLa, hepatocitos, y linfocitos. En la digestión enzimática con tripsina-EDTA y colagenasa
1, se encontró que el rendimiento es igual usando tiempos de digestión de 30 y 60 min; y se
encontró que fue mas eficiente (PcO.05) en comparación con tripsina-verseno. Al medir los
niveles de tiroglobulina, se encontró una elevación importante en la tercera semana de 7.04
ng/mI, en comparación a la cifra basal de 1.47 ng/ml. Los cultivos primarios de tirocitos,
expresaron los receptores a la TSH, y al citoesqueleto de actina y tubulina, mientras que en
las células HeLa (control), se observó dicho fenómeno sólo para tubulina y actina, más no
para el receptor a la TSH. La presencia de los receptores a la TSH en los tirocitos, se
demostró ademas por medio de inmunodetección. Los resultados indican que el método
utilizado, permite la obtención y mantenimiento de cultivos primarios de células tiroideas.
Palabras clave: Cultivo celular, tripsina, colagenasa, tirocitos.
ABSTRACT
In this research work, the standarization a in vifro biological model, has been
carried out, in order to fi.trther physiological studies in the thyroid gland. Enzimatic
digestion, followed by the ce11 viability determination. Cell culture was performed with
different hormones concentrations and 5% calf serum was used.
Morphological
characterization of cultured thyroid cells was compared with the cell line FRTLS.
Functional
characterization was performed through the measurements of thyroglobulin by
Radioimmunoassay method. Using indirect
immunofluorescence, thyrotropin receptors and
cytoskeleton components were observed, meanwhile actin and tubulin. During the ce11
disgregation with trypsin - EDTA and collagenase was found that the enzimatic digestion,
was more effrcient (PcO.05) than using trypsin-verseno. Yield using tripsyn - EDTA, for
30 and 60 min was statistical similar. Measure of thyroglobulin showed a bigger leve1
during the third week, 7.04 ng/ml, in comparison with basal leve1 of 1.47 @ml. Thyroid
cells in the primary culture, expressed the thyrotropin receptors (TSHr), and the
cytoskeleton componer& as the actin and tubulin, meanwhile in the HeLa cells (control)
only the tubulin and actin were observed. The presente of TSHr was observed by
immunodetection. The method developed here allows us to obtain and maintain primary
thyroid ce11 cultures.
Keywords: Ce11 Culture, Trypsin, Collagenase, Tbyrocytes.
LISTA DE FIGURAS
Figura
1 .-
Página
Porciento de viabilidad obtenida con el método de Rapoport, a las 2 h
(barraly2)yalas3h(barra3y4) ..* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2 .-
Datos obtenidos en la viabilidad celular de acuerdo al método de
Ambesi-Impiombato, a tiempos de 30 min (barras 1-4) y 60 min
(barras 5-8) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2
3 .-
Microfotografia de cultivo de tirocitos después de 21 días, donde se muestra a
las células tiroideas obtenidas en cultivo primario (izquierda) y las células
tiroideas de la línea celular FRTLS (derecha) tomadas con un objetivo 40)3.........33
4 .-
Microfotografía de los tirocitos obtenidos después de 15 días de cultivo primario
(izquierda) comparando contra la línea celular de tirocitos FRTLS (derecha)
utilizando un objetivo 40X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
5 .-
Microfotografía en donde se muestra la morfología adoptadas por los tirocitos
en cultivo primario obtenida con un objetivo 10X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
6 .-
Comportamiento de la producción de tiroglobulina desde la 1’ a la 5” semana
y donde se observa que la primera barra es la concentración basal del medio de
cultivo, y las 5 siguientes son las cifras determinadas cada semana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
7 .-
Microfotografía de los tirocitos obtenidos después de 15 días de cultivo primario
tomada por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia para la
detección de los receptores a la TSH (derecha) con objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
8 .-
Microfotografia de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo
observados
por medio de contraste de fases (izquierda) y por IFI para
detectar a la or-tubulina (derecha) utilizando un objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
9 .-
Microfotografla
de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo,
observados por medio de contraste de fases (izquierda) y por IFI para detectar
filamentos de actina (derecha) utilizando el objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
lO.-
Microfotografía de los tirocitos a los 15 días de cultivo, por contraste de fases
(izquierda) y por inmunofluorescencia para detectar filamentos de actina
(derecha) por medio de un objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1 l.-
Microfotografia
de los tirocitos cultivados en cubreobjetos a los 15 días de
cultivo, por contraste de fases (izquierda) y por IFI para detectar
p - tubulina (derecha) por medio de un objetivo 100X. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
12.-
Microfotografía de las células HeLa, observadas por contraste de fases
(izquierda) e IFI para detectar filamentos de actina (derecha) tomada con un
objetivo 100X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
13.-
Inmunodetección de receptores a TSH, en la que se presentan en primer lugar,
a los extractos de células hepáticas (H), tiroideas (T), células HeLa (He) y
linfocitos respectivamente, se observa la presencia del receptor a TSH en
hepatocitos, tirocitos y linfocitos, pero no en las células HeLa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
vi
I.-
INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo, se utilizaron los métodos de Rapoport (1976), y de AmbesiImpiombato (1980), para lograr el desarrollo de células en cultivo primario, a partir de
explantes tiroideos de rata Sprague-Dawley, cuyo comportamiento fuera lo mas aproximado a
las de la línea celular FRTLS. En los cultivos celulares, un fenómeno observado, es el de una
respuesta celular completamente anormal, al proceso que ocurre in vivo. La modificación del
medio ambiente in vitre propuesto por Eagle (1955), permitió el desarrollo de las diversas
líneas celulares. Koningsberg, (1963) Mostró que las deficiencias en las técnicas de cultivos
celulares, son perfectibles, ya que muestran limitaciones intrínsecas, que no se han satisfecho,
ademas realizó una revisión de los problemas más frecuentes en el cultivo de tejidos,
tendientes a la diferenciación celular y a las propiedades supracelulares. Ham (1965) y Conn
(1966) reportan la fabricación de medios sintéticos para el cultivo de células de mamíferos.
Sato (1975) propuso agregar suero a los medios de cultivo, con la idea de que éste es una
importante fuente fisiológica por el contenido de hormonas, contribuyendo potencialmente a la
tecnología de cultivos.
La tiroides, es una glándula de secreción interna, considerada la mas grande del
organismo (Wolf et al., 1989). Tiene gran influencia sobre el crecimiento y desarrollo de los
organismos vertebrados. Sintetiza tiroxina o tetraiodotironina (Td),
y triiodotironina (TJ),
es
controlada por un mecanismo de retroalimentación negativo por la hormona estimulante de la
tiroides (TSH) y ésta a su vez por la hormona liberadora de TSH (TRH) y éstas por el nivel de
hormonas tiroideas (Grossmann et al., 1997).
Los primeros estudios acerca del crecimiento y alteración de la tiroides fueron
realizados por De Vijdler
et al., (1979) en modelos animales utilizando la vaca africana y la
cabra danesa. Wollman desarrolló un método para el cultivo de células tumorales de tiroides
en rata Fisher en 1963 (Grollman et al., 1977), posteriormente Knopp et al., (1970) y Burke et
al., (1973) aislaron células tiroideas bovinas y mostraron que la TSH activa la vía de la
adenilatociclasa produciendo incremento del cAMP. Rapoport (1976) cuya aportación al
aislamiento de células en cultivo, fue el utilizar un sistema mecánico y la enzima tripsina para
realizar la digestión de tejidos, por períodos de 2 a 3 horas. Grollman et al., (1977)
encontraron evidencias de la interacción de la TSH con un receptor específico de la
membrana. Ambesi-Impiombato et al., (1980) desarrollaron una línea de células tiroideas
normales de rata a la que denominaron FRTLS, basada en la clonación de células, adición de
seis hormonas o factores de crecimiento (6H), y una concentración inicialmente baja (0.1 a
0.5%) de suero fetal de ternera.
A través del modelo biológico FRTLS se realizaron estudios con el fin de establecer la
relación entre el crecimiento celular y el cAMP (Valente et al., 1983a), los promotores de
crecimiento (Valente
et al., 1983b); estudios sobre las alteraciones de las células irradiadas
utilizando Láser (Andreoni et al., 1983),.
Otras líneas de investigación se hicieron sobre los
mecanismos de transporte y síntesis de proteínas (Weiss et al., 1984), mecanismos de control
hormonal en células diferenciadas (Tramontano et al., 1986), propiedades y regulación del
receptor a TSH (Tramontano e Ingbar, 1986), así como sobre la regulación de la membrana
celular por la TSH (Beguinot et al., 1987). Por sus caracteristicas las células FRTLS fueron
consideradas ideales para realizar trabajos investigación, por lo que son comúnmente
utilizadas (Dumont et al., 1992).
Para estudiar el comportamiento de los diferentes modelos biológicos, así como los
mecanismos responsables de las alteraciones de la tiroides. Se han realizado varias
investigaciones, asi se ha estudiado el funcionamiento de la TSH en la transformación de
folículos a monocapas en células tiroideas porcinas (Yap el al., 1986), la exposición de las
células tiroideas a anticuerpos contra los receptores de la TSH, que se presentan en las
enfermedades de Graves y Hashimoto (Madec et al., 1988). Se cultivaron células tiroideas
humanas a las cuales se transfectó con el virus de simio DNA 40, y se les denominaron células
epiteliales tiroideas humanas inmortalizadas, que son factibles para la manipulación genética,
manteniendo sus características tiroideas diferenciadas, y en comparación con otras células,
éstas no requieren suero para su proliferación (Lemoine et al., 1989). Por otro lado, se ha
descrito el transporte de iones y la regulación del volumen folicular tiroideo en células
tiroideas porcinas (Yap et al., 1991).
Para denotar la importancia del citoesqueleto y de las uniones celulares, estructuras y
componentes, que son de primordiales durante el crecimiento y diferenciación celular, se
abordó el estudio de la histoarquitectura folicular y la regulación de los diferentes substratos
de adhesión célula - célula y el balance entre las diferentes fuerzas de unión que actúan en las
2
células tiroideas (Yap et
al.,
1992). La activacion
del transporte de yodo y la regulación del
volumen folicular ha sido estudiada en respuesta a medios hipotónicos mediada por la
absorción de sodio a través del epitelio (Yap et
contactos
al.,
1993a). La TSH en el sinergismo en
célula - célula y para la adhesión al sustrato, manteniendo los agregados
multicelulares, inhibiendo la expansión celular, pero no la adhesión celular (Yap y Manley,
1993b). Yap y Mamey (1994), encontraron que la TSH inhibe la locomoción intrínseca de las
células tiroideas organizadas como folículos en cultivo primario, y tiene importancia
determinante en la histoarquitectura folicular.
Estos mismos investigadores continuaron con los tipos de adhesión focal, los
microfilamentos de actina y la actividad de la tirosina cinasa, y sugirieron una relación entre la
presencia de la TSH y la formación de los folículos (Yap
et al.,
1994a), además analizaron
una serie de parámetros mecánicos para los distintos estados de formación y crecimiento de las
células tiroideas (Yap
et al.,
1994b); también caracterizaron algunas de las moléculas de
adhesión, como la caderina en las uniones célula - célula, y 20-l (Proteína asociada a las
uniones estrechas), y señalaron que la polarización del epitelio tiroideo es crucial en la
formación del lumen folicular, con el agregado celular tridimensional (Yap et al., 1995a).
Encontraron una relación entre los filamentos de actina y la sensibilidad de las uniones a la
citocalasina D, sefialando que las células tiroideas en cultivo y la asociación entre los
filamentos de actina y las uniones celulares difiere, dependiendo de la forma en que se haya
cultivado (Yap et
al.,
1995~).
La tiroglobulina es una proteína, producida exclusivamente por las células tiroideas. Su
presencia en un cultivo sugiere que las células cultivadas son del tipo tiroideo. La
tiroglobulina es una matriz proteica sobre la cual se sintetizan las hormonas tiroideas (Glinoer,
1997). La producción de tiroglobulina ocupa el 50% de la síntesis proteica de la tiroides. Esta
síntesis forma un grupo de polisornas unidos a la membrana y son dirigidos por un RNA
mensajero @RNA) para el ensamble de las subunidades. Durante su traslado, del retículo
endoplásmico
al aparato de Golgi, la tiroglobulina sufre glicosilación, donde un complejo de
azúcar es transferido del fosfato dolicol unido a la membrana y al nitrógeno amina de los
residuos de aspargina. Al salir del sistema Golgi, es incluida en vesículas que se unen a la
membrana apical de la célula, para su posterior liberación al lumen folicular por exocitosis. La
síntesis y secreción de tiroglobulina son reguladas por la TSH (Glinoer, 1997).
Las hormonas tiroideas circulan unidas a las proteínas plasmáticas, cuya fracción libre
es la parte mas útil de las hormonas tiroideas, ya que mientras permanezcan unidas a su
proteína transportadora no son funcionales. El 70% de la TJ va unida a la globulina
transportadora de la tiroxina (TBG), el 20% a la prealbúmina fijadora de tiroxina (TBPA) y el
10% a la albúmina, mientras que la mayor parte de la T3 se encuentra unida a la TBG. La
fracción libre de las hormonas tiroideas se sitúa en torno al 0.003% de la
T4
y al 0.3% de la T3.
La proporción de unión durante el embarazo es mayor, y obedece al estimulo estrogénico. La
vida media de la TBG es aproximadamente de 5 días, y su concentración varía de 10 a 22 mg/l
(Glinoer, 1997).
En el estudio de la disociación del explante
tiroideo, se utilizaron las enzimas tripsina y
colagenasa. La tripsina, es una enzima proteasa pancreática con especificidad al sustrato se
basa en cargas positivas de las cadenas de lisina y arginina. La tripsina ha sido aislada de
diferentes fuentes como: el pez perro, alces, ballenas, elefantes marinos, Streptomyces
griseus,
perros, cerdos, ratas y humanos, entre otros. La tripsina tiene un peso molecular de 23,800
daltons, produce autólisis limitada de otras formas activas que tienen dos o mas cadenas
- peptídicas unidas por puentes disulfuro,
sus formas predominantes son dos cadenas peptídicas
de 01 - tripsina y una de p - tripsina. La tripsina hidroliza específicamente a los péptidos
unidos a
los terminales carboxilos de los residuos de lisina y arginina
(httu://www.promega.comítbs/tb5
12/tb5 12.html).
Existen condiciones que se deben de cumplir para que la tripsina sea mas eficiente: La
temperatura debe ser de 37’C, el pH debe ser > 4, estar libre de suero fetal de ternera,
compuestos organofosforados, soya, lima, huevo, plata iónica y calcio. La disociación de las
células, se inicia con el lavado de las monocapas de los cultivos, con una solución con bajas
concentraciones de calcio y magnesio, para remover el suero fetal de ternera, para abatir los
inhibidores de la tripsina. (http://www.worthington-biochem.com/manuaVT/TRY.html).
Otra enzima utilizada para la disociación celular es la colagenasa, cuya función es
degradar las fibrillas nativas helicoidales de colágena.
Esta es el mayor componente fibroso
A
del tejido conectivo extracelular como la piel, tendones musculares, vasos sanguíneos, hueso,
entre otros. La colágena consiste de fibrillas compuestas por agregados de moléculas de
tropocolágena. Cada tropocolágena consiste en 3 helices
de cadenas alfa alrededor del eje. La
secuencia de aminoácidos es característica del tejido de origen.
Las enzimas atacan
simultáneamente las 3 cadenas y son importantes en el metabolismo del tejido conectivo y son
producidas por las células encargadas de los procesos de remodelación. Bajo condiciones
normales, las enzimas se encuentran unidas a la ct-2-macroglobulina
y antiproteasas del
suero. La primera colagenasa fue estudiada de tejido de cola de rana en 1966. Se reporta la
colagenasa de plaquetas en 1974, y la colagenasa en la parte pancreático hepática procedente
del cangrejo violinista. También existe colagenasa en las bacterias, utilizada durante la
invasión del huésped. Esas enzimas difieren de las colagenasas de mamífero. La colagenasa
del Clostridium
histolyticum
ha sido la mas estudiada, igualmente la procedente del
Achromobacter iophagus, Pseudomonas aeruginosa y la de bacterias marinas
(http://www.worthington-biochem.com/manualKXLS.html).
La disponibilidad de las colagenasas ha permitido el desarrollo de cultivos primarios de
riîrón humano en 1973 y a partir de entonces se dio para el cultivo de múltiples tejidos como
los pancreáticos, hígado, células suprarenales y de tejido graso. Se han descrito cuatro tipos de
colagenasa: el tipo 1 (contiene colagenasa, caseinasa y clostripaína) recomendada para tejido
graso, glándula suprarenal y células hepáticas. El tipo II (contiene gran actividad de
clostripaina)
utilizada para corazón, hueso, músculo, tiroides, cartílago y células hepáticas. El
tipo III [contiene baja actividad proteolítica) utilizada en células mamarias y fetales. El tipo IV
(contiene baja actividad triptica) es comúnmente utilizada en islotes y donde la integridad de
los receptores es crucial (http://www.worthington-biochem.com/manualK/CLS.html).
Una vez abordado el origen, morfología y funcionamiento del modelo biológico, se
puede observar la gran diversidad de modelos utilizados y las vías involucradas. Debido a que
las hormonas tiroideas ejercen su acción directamente sobre la función general del organismo,
con el desarrollo de los cultivos primarios de células tiroideas funcionales, utilizadas como
modelo biológico, se puede apoyar a los diferentes trabajos de investigación tendientes al
estudio y comprensión de los factores celulares y moleculares que originan las alteraciones de
la tiroides.
Basados en la revisión de la literatura se plantea la siguiente pregunta ¿Cómo lograr el
aislamiento y reproducción de las c6lulas tiroideas in vitro? Con el fin de tener un modelo in
vitro, que permita conservar las características morfológicas y funcionales de las células
tiroideas in vivo.
Se considera que con la combinación de enzimas proteolíticas en la disociación celular
y la concentración de suero fetal de ternera, permiten la obtención de tirocitos normales en
cultivos primarios, sin alterar las características funcionales y morfológicas. El objetivo
general de este estudio fue estandarizar una técnica para el cultivo in vitro de tirocitos
morfológica y fisiológicamente diferenciados en cultivos primarios de glándula tiroides de rata
Sprague - Dawley.
Objetivos
específicos:
1 .- Aislar las células de explantes de glándula tiroides de rata.
2.- Caracterizar morfológicamente las células tiroideas de los cultivos primarios.
3.-
Caracterizar funcionalmente determinando la tiroglobulina.
4.- Determinar sí las células tiroideas obtenidas expresan los receptores de la TSH, y a los
componentes del citoesqueleto actina y tubulina.
6
II. REVISIÓN DE LITERATURA
Dado que el propósito del presente trabajo fue generar información para estandarizar
una tecnica para el cultivo in vifro
de tirocitos morfológica y fisiológicamente diferenciados,
obtenidos de cultivos primarios de explantes de glándula tiroides de rata. Es fundamental pasar
en revisión todas las características del modelo biológico, por tal motivo se revisan las
características anatómicas, embriológicas, funcionales y de cultivo; así como las diversas
interrelaciones
que se suceden.
2.1 Glándula tiroides
La glándula tiroides, produce las hormonas T3 y T4 las cuales tienen influencia
preponderante en el crecimiento, diferenciación y desarrollo de todas las células del organismo
de los vertebrados. La importancia biológica de la glándula tiroides fue reconocida hace
siglos. En el siglo XIX se definió el cretinismo y el mixedema como el resultado de una
disminución de la función tiroidea (Lazar, 1993), desde entonces la Sociedad Clínica de
Londres seÍíaló la importancia de la glándula tiroides en el desarrollo del cerebro
(Oppenheimer, 1997). Harrington (1926) sintetizó la T4. La T3 se obtuvo por desiodinación
periférica de T4 en 1960, siendo ademas la iodotironina mas activa, biológicamente (Roti ef
al., 1993). Enseguida fueron descritos los receptores nucleares a T3 (TRs) (Lazar, 1993).
La glándula tiroides consiste en dos lóbulos situados a los lados de la traquea e
interconectados por el istmo a nivel del 2” o 3er anillo traquéales, inmediatamente por debajo
de la piel y los delgados músculos cutáneos del cuello, usualmente el lóbulo derecho es más
grande que el izquierdo. La dimensión vertical es de 3 a 5 cm. Una tercera parte de los
individuos portan una proyección de tejido que nace en el istmo y se le denomina lóbulo
piramidal. La circulación es importante, con un gasto de 1 ml/min por gramo de tejido
comparado
con
otros
que
(<http://www.fhere.org/science/phs/htds/4nf-thdx.html/,
tiroideo,
órganos
es
muY
1997; Dumont et al., 1992)
alta
Es muy importante conocer la microestructura del tejido tiroideo, para seleccionar las
enzimas para la disociación y calcular el rendimiento celular. El tejido tiroideo esta compuesto
por tirocitos en un 70%, células endoteliales en un 20% y fibroblastos en un lo%, todo es
soportado por tejido mesenquimatoso (Dumont et al., 1992). Los folículos de la tiroides
normal son alrededor de 3 millones y varían de 50 a 500 pm de diámetro. Una capa simple de
esas células rodea un lumen que contiene un fluido llamado coloide. Están rodeados por un
extenso plexo capilar. El espacio interfolicular contiene fibras reticulares, una red linfática que
provee canales para la comunicación intraglandular, y fibras nerviosas simpáticas. También
contiene a las células parafoliculares o células C, que producen la calcitonina, cuya acción es
la de regular el metabolismo del calcio (Dumont et al., 1992).
2.1.1. Anatomía comparada y desarrollo
Es fundamental analizar, que otras especies pueden producir prohormonas tiroideas,
como las yodotirosinas y yodotironinas. En la evolución de la función tiroidea, la atención fue
enfocada a los protocordados, como el anfíoxo y sobre el más primitivo de los vertebrados, la
lamprea y el pez brujo (ciclostomas). En los procordados, el yodo puede ser concentrado e
incorporado‘ en yodoproteinas por el endostilo, un órgano situado en la línea media de la
glándula suprafaríngea cuya función es la formación de moco. La larva de la lamprea o
ammocoetes, tiene una estructura como la tiroides, la glándula suprafaríngea, cuyos conductos
son vaciados en la faringe, ésta glándula sintetiza yodoproteínas y son liberadas como
yodotironinas al tracto digestivo, éstas acciones permiten especular que la función inicial de
las yodotironinas fue digestiva (Su et al., 1997).
En los homeotermos como los mamíferos y las aves, las hormonas tiroideas tienen una
íunción común, la de regular el metabolismo, son esenciales en el crecimiento y desarrollo
normal y éste aspecto es similar al desempefiado
hormonas tiroideas envían las sefíales
en la metamorfosis de los anfibios, donde las
para inducir los cambios morfológicos y funcionales.
Las hormonas tiroideas tienen una función similar en algunas especies de peces y reptiles
(Sing-Yung y Visser, 1994; Su et al., 1997).
2.1.1.1 Embriología
Es primordial el conocer la evolución de la tiroides durante el desarrollo humano,
desde la concepción
hasta el nacimiento y en la edad adulta, puesto que los tejidos
embrionarios pueden ser una fuente viable de tejidos. La tiroides es visible durante la tercera
semana de desarrollo, como una evaginación en la faringe ventral, migra hacia abajo y al
8
frente de la faringe, y en este descenso se observa como una estructura bilobulada conectada
por el conducto tirogloso. Este conducto posteriormente se reabsorbe, pero si persiste, se
observa en la base de la lengua en el denominado foramen Secar. Durante la séptima semana
se fusiona tejido de la porción ultimobraquial del cuarto arco braquial de donde se originan las
células parafoliculares. Las células epiteliales tiroideas proliferan y se diferencían
en folículos.
La capacidad para sintetizar tiroglobulina y formar el coloide, es manifiesta alrededor de la
décima semana; ademas se inicia la capacidad para acumular y organificar yodo. En el
segundo trimestre se pueden detectar cantidades de T4 y de TSH, lo que sugiere que la
actividad de la tiroides esta bajo el control de la hipófisis (Dumont et al., 1992).
Durante la diferenciación fetal, el tejido crece al paralelo del peso corporal y
permanece así hasta la vida adulta. La tiroides fetal pesa 0.2 g, mientras que en el adulto su
peso varía de 16.7 a 28.0 g (Pankow et al., 1985), este crecimiento requiere de 6 a 7 divisiones
celulares. Las células tiroideas humanas se dividen alrededor de 5 veces en la etapa adulta, con
lo que se demuestra que tienen una constante de crecimiento lenta (Su et al., 1997). En el
adulto, la tiroides mantiene su tarntio con un lento crecimiento, pero retiene su capacidad a
crecer por hipertrofia celular y proliferación en respuesta a un estímulo (Dumont et al., 1992).
Por medio de cordocentesis, desde las 12 semanas, se ha observado un incremento de T4, T3,
TSH y Tiroglobulina (tg), que reflejan la madurez del hipotálamo, hipófisis, tiroides e hígado
(Porterfield y Hendrich, 1993).
El tejido tiroideo hipertrofiado extraído quirúrgicamente se puede convertir en fuente
potencial de células tiroideas. El bocio se manifiesta, como un crecimiento de la glandula
tiroides y puede ser debido a agentes bocibgenos, seguido de un incremento progresivo del
peso tiroideo, con mesetas después de 3 meses (hasta 12 veces el volumen original). El primer
signo en los tejidos involucrados es la disminución del espacio luminal de los folículos, del
estroma avascular y un aumento en las células epiteliales y espacios de los vasos sanguíneos
(Dumont et al., 1992). La proliferación de células endoteliales va precedida de los tirocitos, y
la vascularización varía mas que la masa celular folicular con el nivel de estimulación de la
tiroides. El incremento global en el espacio de las células epiteliales es seguido de hipertrofia
(Studer y Derwahl, 1995) y multiplicación celular, todos los tipos de células, proliferan
durante este estadio (Dumont et al., 1992).
La tiroides es un epitelio de transporte que separa el espacio coloidal del lumen
folicular, del líquido extracelular y la sangre. Las cClu1a.s epiteliales tiroideas median las
formas de transporte vectorial que son necesarios para la función tiroidea normal, en especial
el movimiento transepitelial de yodo, de hormonas tiroideas y de sus precursores. Posee un
sistema bidireccional de transporte de iones, que contribuye al control del tama.iIo de los
folículos tiroideos, determinando el flujo neto de líquidos al lumen folicular (Yap y Stevenson,
1995).
2.1.1.2 Fisiologia de las células tiroideas
Es fundamental el conocer como operan las diferentes vías en la fisiología normal, para
poder detectar las alteraciones, dichos factores son básicos para el crecimiento y
diferenciación de los tirocitos. La unidad funcional de la glándula tiroides es el folículo, que es
una estructura semiesférica compuesta de una capa de células rodeando un espacio llamado
lumen folicular, que secreta una proteína, llamada tiroglobulina. La síntesis de tiroglobulina se
da en el retículo endoplásmico rugoso, continúa en el aparato de Golgi, y concluye hasta pasar
al lumen folicular, con la yodinación de tirosina y el acoplamiento de yodotirosinas para
formar las yodotironinas. El yodo es captado en la célula por difusión y transporte activo
(bomba de Yodo). La per-oxidasa tiroidea, se encuentra localizada en la membrana apical,
oxida el yodo y une la tirosina a la tiroglobulina (Sing-Yung y Visser, 1994). La peroxidasa es
una enzima crucial en la síntesis de hormonas tiroideas, y se incrementa en la enfermedad de
Graves, carcinoma y tumores tiroideos benignos (Massini-Repiso
et al., 1994). El mayor
regulador para la secreción de las hormonas tiroideas es la TSH (Guksouma et al., 1998).
2.1.2 Hormonas tiroideas T4 y T3
En los organismos superiores (vertebrados), bajo condiciones normales, la tiroides
metaboliza el yodo y conduce la síntesis de las hormonas tiroideas. El mecanismo tiene lugar
en tres estadios secuenciales: a) transporte activo de yoduro hacia la tiroides, b) oxidación de
yoduro y yodación en forma oxidada de residuos tirosílicos dentro de la tiroglobulina, c)
acoplamiento de yodotirosinas para formar la 3,5,3’,5’ Tetrayodotironina o tiroxina (Th) y
3,5,3’ Triyodotironina (T3). Las hormonas así formadas se unen por enlaces peptídicos a la
tiroglobulina que es el componente más importante del coloide folicular (Sing-Yung y Visser,
1994).
Harrington en 1926 sintetizó la Ta, qué I en 1960, era considerada la fuente más
importante de TX por desyodinación periférica de la Tq, siendo la yodotironina mas activa
biológicamente. Aproximadamente el 80% de T3 es producida por conversión y el 20%
restante por producción directa de la tiroides en los sujetos normales (Chanoine et al., 1993;
Roti et al., 1993). El 80% de la producción de T3 a partir de la T4 ocurre en órganos perifericos
de los cuales los más importantes son el hígado, riííón, hipófisis y cerebro. En estos órganos el
proceso se lleva a cabo cuando la T4 se desyodina por medio de las enzimas llamadas
desyodinasas. El tipo 1, 1 ,S- desyodinasa (una seleno proteína), el tipo II, 5’- desyodinasa y el
tipo III 5- desyodinasa, encargadas de regir todos los pasos catabólicos en la conversión de Ta
hasta la T2 (Contempré et al., 1991). Las hormonas tiroideas están implicadas en grado
superlativo, en el crecimiento y desarrollo de la mayoría de los tejidos corporales (Galton, et
al., 1983),
1993),
principalmente del cerebral durante la edad fetal y neonatal (Porterfield y Hendrich,
ejercen su efecto catabólico y anabólico en el metabolismo de lípidos, carbohidratos y
proteínas mediante la interacción con proteínas receptoras específicas localizadas en el núcleo
de todas las células del organismo (Muller y Seitz, 1984a).
La entrada de las tironinas al compartimento celular se da por un proceso activo
conocido como potocitosis, que utiliza vesículas de la membrana celular llamadas caveolas.
Las caveolas se difunden por gradiente al citoplasma celular (Jones et al., 1994). En la célula
ambas hormonas se unen a las proteínas del citosol y al núcleo por medio de receptores que
tienen mayor afinidad para la T3, que para la T4, explicándose en parte el porqué la T3 es la
hormona más activa biológicamente. La interacción de la Ts con los receptores se inicia con
activación de genes y da como resultado cambios en la síntesis de proteínas (Ishii et al., 1982;
Sing-Yung y Visser, 1994).
Existen ademas receptores en la mitocondria, con los que se median cambios en la
cadena respiratoria y sobre la membrana plasmática para regular el transporte de nutrimentos
al interior de las células, proceso que no requiere de síntesis proteica. La mayor vía metabólica
de las hormonas tiroideas es por desiodinación de T4 formando T3 y rT3 (T3 reversa), y T2 a
partir de T3. En virtud de la gran potencia de la T3, la formación a partir de T4 es considerada
como un proceso de activación (Ishii et aZ,. 1982; Sing-Yung y Visser, 1994).
11
La desyodinasa tipo 1 se encuentra en el hígado y el riAón (Lee et al., 1993), la T3
formada por ésta enzima es rápidamente liberada a lakrculación y es la mayor fuente de T3 en
el organismo. La desyodinasa tipo II se ubica en el cerebro y la hipófisis (Tang et al., 1994),
cuya actividad se incrementa en hipotiroidismo y este mecanismo opera para conservar los
niveles de T3 en el sistema nervioso central, La desyodinasa tipo III, es la responsable de la
formación de la rT3 y de la T2, su acción es a nivel de sistema nervioso central, placenta y
durante el desarrollo fetal (Ishii et al., 1982; Sing-Yu y Visser, 1994).
En adición a la monodesyodinación, el hígado puede sintetizar conjugados de
yodotironinas con glucuronato y sulfamatos, los conjugados son excretados por la bilis. La
desaminación
oxidativa y la descarboxilación de las yodotironinas puede ocurrir en el hígado
y el rifión cuyo metabolito resultante es el ácido tetrayodotiroacético formador de la Tq (SingYu y Visser, 1994).
Las hormonas tiroideas regulan el metabolismo en los tejidos y la síntesis de muchas
enzimas involucradas en el metabolismo intermedio, generalmente favoreciendo la
movilización y ruptura de los nutrientes como son los ácidos grasos y los azucares. Estimulan
la frecuencia y fuerza de contracción del corazón, actúan sinérgicamente con las
catecolaminas, y la acción más importante es durante el crecimiento y la sobrevivencia de las
especies. Estimula la síntesis y secreción de hormona del crecimiento (GH) (Porterfield y
Hendrich, 1993; Oppenheimer y Schwartz, 1997) y ésta a su vez, el crecimiento celular. La
GH media este efecto regulando la síntesis y secreción de Insulina como factor de crecimiento
1 (IGF-1). Este es un factor de crecimiento p’leiotrópico sintetizado por muchos tejidos para
regular la división celular y la firncibn diferenciada (Wolf et al., 1989).
Los eventos de fosforilación en la célula son indispensables para la activación
transcripcional, vía isoformas del receptor de hormonas tiroideas, ciertas isoformas del
receptor pueden ser fosforiladas in vivo e in vitro (Jones et al., 1994).
2.1.2.1 Metabolismo extratiroideo del yoduro
El yodo es la materia prima para la síntesis de hormonas tiroideas, y sirve como
monitor para evaluar el metabolismo de la glándula tiroides. La tiroglobulina almacenada en la
tiroides contiene yodo suficiente para cubrir las necesidades hormonales temporalmente,
12
durante algunas semanas. Alrededor de las tres cuartas partes + yodo se encuentran en forma
de yodotirosinas. Del yodo remanente, un 90% esta en forma de T4, 8 al 9% de Tj, y el resto
como trazas de otras yodotironinas. La secreción de hormonas requiere que la tiroglobulina
sea ingerida por la célula; las vacuolas fagocíticas resultantes se fusionan con los lisosomas
para formar fagolisosomas, en los que la tiroglobulina es digerida por enzimas proteolíticas
liberando aminoácidos yodados. La monoyodotironina (MIT) y diyodotironina (DIT) pueden
desyodinarse completamente por acción de la tirosina deshalogenasa, y el yodo libre resultante
es reciclado. Existe evidencia que la T3 segregada por la tiroides es formada por
desyodinación periferica de Ta. El rango de T4 a T3 es de alrededor de 10: 1 en sujetos
normales (Arvan y Castle, 1998).
La tiroides contiene grandes cantidades de yodo orgánico, la actividad de la bomba de
yodo esta relacionada con la cantidad de yodo inorgánico almacenada y puede mantener
dichas cantidades sin que se provoquen variaciones de la TSH. La proporción del yodo
disponible para la síntesis hormonal varia con la captación de yodo, que usualmente es del
10% y bajo condiciones de deficiencia extrema de yodo la proporción captada puede alcanzar
hasta el 100%. El sistema de transporte, se lleva a cabo en la zona basal de los folículos, es
dependiente del metabolismo oxidativo (puede inhibirse por anoxia, cianuro y otros
inhibidores de la fosforilación oxidativa) y requiere del funcionamiento normal de Na+ - K’dependiente de adenosin trifosfato (ATPasa). El yodo difunde al interior por gradiente
electroquímico. El yodo derivado de la dieta, catabolismo periférico de hormonas tiroideas y
yodotironinas por desyodinación constituyen el concentrado inorgánico extratiroideo, que
entra en equilibrio dinámico principalmente en dos órganos, la glándula tiroides y el riñón. La
captación diaria de yodo en sujetos normales es de 150 pg, la disminución del yodo puede
conducir a la insuficiente producción hormonal (Glinoer, 1997).
El yodo utilizado en la síntesis de las hormonas tiroideas es extraído del yoduro
inorgánico que esta en el líquido extracelular (LEC). Este yoduro es parcialmente recuperado
cuando se libera por la desyodinación de las hormonas tiroideas en los tejidos periféricos. Sin
embargo, la dieta es la fuente más importante de yoduro, tanto en su forma inorgánica como
orgánica. El yodo inorgánico se absorbe rápidamente en el tracto gastrointestinal, perdiéndose
muy poco por las heces. Hasta que se unen los compuestos orgánicos (fundamentalmente
13
h
tirosina), el yoduro que entra en la tiroides por transporte activo forma parte del yoduro
extracelular, y como tal está en equilibrio con el del compartimento principal de yoduro. La
concentración de yoduro en el LEC normalmente es baja: de 1 a 1.5 pg/lOO ml, el contenido
en el torrente circulatorio es aproximadamente de 250 pg, el cual se recambia varias veces
durante el día (Sin@;-Yung y Visser, 1994).
Se pierden pequeiias cantidades de yodo por el aire espirado y a través de la piel. Es
importante considerar el mecanismo de depuración renal de yoduro, ya que puede modificar la
disponibilidad de yoduro. A pesar de que es completamente fíltrable en el glomérulo, la tasa
de depuración de yoduro en un adulto normal es de 30-40 ml/min, y es reabsorbido
fundamentalmente de forma pasiva. Normalmente se eliminan en la orina unos 500 ug de
yodo, casi todo en forma inorgánica. Esta cantidad es inferior a la que se ingiere con los
alimentos, reflejando pérdidas muy bajas del elemento por las otras vías como el tracto
gastrointestinal donde se pierden unos 12 ug, principalmente en forma orgánica (Sing - Yung
y Visser, 1994).
En el déficit familiar de deshalogenasa, se pierden por la orina tirosinas yodadas y la
eliminación fecal de yodo orgánico puede ser muy intensa en ei síndrome de malabsorción
intestinal, también por la acción de ciertos alimentos, como la soya (Rumsey el al., 1997). Se
pueden ademas producir perdidas notables de yodo durante el período de lactancia, de aquí
nació la propuesta de la Organización Mundial de la Salud para aplicar la suplementación de
yodo a mujeres gestantes, y durante el período de lactancia de 200 @día (Glinoer, 1997).
2.1.3 Tiroglobulina
La tiroglobulina es una matriz protéica sobre la cual las hormonas tiroideas son
sintetizadas en la glándula tiroides (Glinoer, 1997). Es una glicoproteína que pesa 660 kD, se
le conocen dos subunidades de 330 kD. La producción de tiroglobulina ocupa el 50% de la
síntesis protéica de la tiroides. Esta síntesis forma un grupo de polisomas unidos a la
membrana y son regidos por un RNA mensajero (mRNA) para el ensamble de las
subunidades, durante su traslado del retículo endoplásmico al aparato de Golgi, la
tiroglobulina sufre glicosilación, donde un complejo de azúcar es transferido del fosfato
dolicol unido a la membrana. El azúcar sufre un proceso multiestado que involucra el
1A
P
movimiento de glucosa, residuos de manosa y la adición de ácido siálico. Al salir la
tiroglobulina del sistema Golgi, es incluida en vesículas que se unen a la membrana apical de
la célula, para su posterior liberación al lumen folicular por exocitosis (Glinoer, 1997).
Las hormonas tiroideas son transportadas por la TBG por medio de uniones covalentes,
se adhieren a las proteínas plasmáticas, aproximadamente, el 70°/ de la T4 se fija a la
globulina fijadora de la tiroxina (TBG), el 20% a la prealbúmina fijadora de tiroxina (TBPA) y
el 10% a la albumina, mientras que la mayor parte de la T3 se encuentra unida a la TBG. La
vida media de la TBG es alrededor de unos 5 días, su concentración es de 10 a 22 mg/L
(Glinoer, 1997).
2.2 Hormona estimulante de la tiroides (TM-I)
La TSH es una de las señales extracelulares involucradas en el control de la
proliferación y diferenciación de las células tiroideas, tanto in vivo como in vitre. Es
considerada de manera general como el principal elemento controlador del crecimiento
tiroideo in vivo (Dumont et al., 1992). La historia de la TSH viene desde 1920 con el
descubrimiento de su actividad en la glándula hipófisis. En 1970 se determinó la secuencia de
aminoácidos de las subunidades de la TSH. En 1980, se realizó la descripción detallada de la
estructura de carbohidratos y la clonación de la unidad a y /3, facilitó el entendimiento de
algunos mecanismos moleculares de la TSH (Grossman et al., 1997). La TSH es una
glicoproteína de 20 a 30 kDa producida por las tirotropas de la hipófisis anterior. Esa síntesis y
secreción son estimuladas por la TRH e inhibidas por las hormonas tiroideas en un mecanismo
clásico de retroalimentación negativa (Dahl et al., 1994). La TSH controla el mecanismo de
activación del receptor y facilita el acoplamiento de la sefial a la familia de las proteínas G.
Este receptor estimula las diferentes cascadas de regulación como: la vía de la adenilato
ciclasa y la hidrólisis de fosfatidil inositol bifosfato por fosfolipasa C. El cAMP es estimulado
a bajas concentraciones de TSH (0.1 a 1 mU/ml), mientras que la fosfolipasa es de 1 a 10
mUVm1 (Allgeier et al., 1994).
La TSH regula la proliferación y diferenciación funcional de las células tiroideas, como
son la organificación de yodo, la síntesis de tiroglobulina, el metabolismo de las iodoproteínas
y la secreción de hormonas tiroideas (Tramontano e Ingbar, 1986). La TSH es un miembro de
15
la familia de glicoproteínas en las que se incluye la hormona folículo estimulante (FSH),
gonadotrofina coriónica (CG) y
hormona luteinizante (LH) se encuentran prácticamente en
todas las especies de mamíferos y en pequefios
glicoproteicas
vertebrados. Estructuralmente las hormonas
son heterodímeros afines, compuestos de una subunidad 01 común conteniendo
una apoproteína central de 92 aminoácidos incluyendo 10 medios residuos de cistina unidos
por puentes disulfuro. Es codificado por un gen localizado en el cromosoma 6 en humanos con
secuencia idéntica de aminoácidos. La subunidad p es distinta y puede estar alineada en 12
formas invariantes de residuos medios de cistina por 6 puentes disulfuro en humanos, y en
secuencia de aminoácidos es idéntica a la de otras especies (Grossman et al., 1997).
Los genes de la subunidad p de hormonas glicoprotéicas, difiere en longitud,
organización estructural y localización cromosómica. La subunidad p es una proteína madura
de 118 residuos de aminoácidos y es localizado en el cromosoma 1. Un importante
componente estructural de esas hormonas es la cantidad de carbohidratos constituyentes entre
el 15 al 35% por oligosacáridos unidos y la subunidad beta (1 en TSH y LH) o (2 en CG y
FSH) (Grossman et al., 1997).
2.2.1 Receptor a TSH
El proceso de reconocimiento y respuesta a estímulos es crítico para el crecimiento y
función de las células. La estimulación del receptor a la TSH, es sin duda la mayor vía de
transducción de sefiales desde la membrana celular, estimulando las vías de señalización
intracelulares. Las vías moleculares involucradas son mediadas por el cAMP y PKC en
respuesta al estímulo aplicado. Las vías de sefialización se dan a través de eventos de
mecanorecepción en la superficie celular, por medio de los receptores transmembranaks
(Wang et al., 1993).
El receptor a TSH, tiene un peso molecular de entre 30 a 200 kD (Misrahi et al., 1990),
y como todos los receptores a glicoproteínas constan de un dominio extracelular (394
aminoácidos), un dominio transmembranal consistente en siete segmentos (268 residuos) y un
dominio carboxilo terminal de aproximadamente 50 residuos. La transducción de señales se
hace a través de la unión a proteínas que unen GTP (proteínas Gs), que a su vez activan las
vías de la adenilatociclasa y fosfolipasa C, induciendo la hidrólisis de los fosfoinosítidos
16
(PIP2) y la liberación de Ca* de los reservorios intracelulares, dando como resultado la
activación del cAMP y PKC (Dallas et al., 1994).
La distribución del receptor a la TSH en tejido tiroideo normal, se localiza en la
superficie basolateral de la célula, y se sobreexpresa en la enfermedad de Graves. La TSH al
unirse a su receptor estimula la producción de T3 y T4 (Seetharamaiah et al., 1994),
mas aun,
el receptor a la TSH sirve como blanco antigénico, de aquí se desprende que al unir
autoanticuerpos antireceptor causen hipertiroidismo. Igualmente se han encontrado
anticuerpos antireceptor a TSH en la enfermedad de Hashimoto, los cuales inhiben la unión de
la TSH a su receptor (Madec et al., 1988). La enfermedad de Graves (GD) es un trastorno
endocrino caracterizado por hipertiroidismo, bocio y exofkhnos.
El hipertiroidismo de la GD
es producido por autoanticuerpos que se unen al receptor a TSH y estimulan la
sobreproducción de hormonas tiroideas (Patibandla et al., 1987).
La clonación molecular y expresión funcional del receptor a TSH han mostrado rápidos
avances para el entendimiento de la estructura y función. Los sitios de unión de anticuerpos
contra receptor a TSH no parecen ser los mismos que para la TSH. Dos de los 6 sitios
potenciales de glicosilación en el dominio extracelular son importantes en la expresión del
receptor funcional. Los puentes disulfuro
contribuyen a mantener la estructura tridimensional
del receptor, en la región extracelular la homología de aminoácidos del TSHr entre humanos,
perros y rata es alta (8590%) (Nagayama y Rapoport, 1992).
2.2.3 El Hz02 como regulador de la yodinación y formacibn de hormonas tiroideas
El peróxido de hidrógeno (H202) es muy importante en la organificación, regulación de
la yodinación y formación de hormonas tiroideas, tanto en cultivos celulares, como en cClu1a.s
in vivo (Chen et al., 1993). Para sintetizar hormonas tiroideas, las reacciones de yodinación de
proteínas requiere la presencia de tiroglobulina, peroxidasa tiroidea (TPO) y yodo. El Hz02 es
un aceptador de electrones y un sustrato de TPO en la yodinación de proteínas y en las
reacciones de acoplamiento. El sistema de generación de Hz02 ha sido estudiado
extensivamente en células tiroideas porcinas, de perro y de rata. La TSH estimula la
yodinación y la generación de H202,
y media el transporte y organificación de yodo,
17
sugiriendo que hay una regulación de la reacción de yodinación en la generación de Hz02 intra
y extratiroidea (Chen ef al., 1993).
2.3 Citoesqueleto
Es muy importante en los cultivos celulares, puesto que son los constituyentes para
generar el huso mitótico durante la división celular, ademas son la estructura rígida y móvil de
las células. Ademas interviene a través de los microtúbulos, como vías para el transporte de
una gran cantidad de productos de exocitosis y endocitosis, y forman las estructuras de
crecimiento y unión de las células constituída por la llamada matriz extracelular. Las células
ejercen sus funciones, sólo después de adquirir una morfología específica, y la función del
citoesqueleto es importante para establecer y mantener ésta forma. Del citoesqueleto dependen
una variedad de procesos celulares como la movilidad celular, migración, transporte
intracelular de partículas, meiosis y mitosis, distribución espacial de los organelos celulares,
respuesta celular a los eventos de la membrana, comunicación intracelular incluyendo la
conducción de sefiales
eléctricas, localización del mRNA, síntesis de proteínas, y en el caso de
las hormonas, desde la síntesis, transporte, secreción, degradación y su influencia en las
células blanco. Ademas
median los efectos de las hormonas relacionadas con el crecimiento,
transporte transepitelial, esteroidogénesis, funcionamiento tiroideo y paratiroideo, movilidad y
maduración de los oocitos (De Loof eC al., 1996).
El citoesqueleto funciona como sistema de sostén y locomoción de las células, participan
en muchas de las funciones celulares, como el de adoptar una gran variedad de formas,
transportar mc.éculas de manera ordenada, moverse, unirse a un sustrato y dividirse entre
otras funciones (Hitt et al., 1994). Las diversas actividades del citoesqueleto dependen de tres
tipos de proteínas filamentosas que son: filamentos de actina, microtúbulos y filamentos
intermedios. Cada tipo de filamentos esta formado por diferentes subunidades de proteínas: a)
actina, por filamentos de actina, b) microtúbulos; a, p, y y tubulina, c) filamentos intermedios;
las relacionadas con la familia de las proteínas fibrosas tales como la vimentina, proteína glial
fibrilar, laminas celular y citoqueratinas. La actina y tubulina se han conservado durante la
evolución de los eucariotes; sus filamentos protéicos unen una gran variedad de proteínas
accesorias, las cuales hacen posible que los mismos filamentos participen en distintas
funciones, en diferentes regiones de la célula (Yap et al., 1995; Hollembeck et al., 1995).
18
Generalmente la diversidad del citoesqueleto es una parte esencial en la diferenciación
durante la embriogénesis. Todas las celulas constitutivas son descendientes de un mismo
cigoto y tienen el mismo genoma, pero los genes se expresan diferentemente, esto permite que
las celulas constituyan y adquieran diferentes morfologías y una gran variedad de funciones
(Schdit y Hall, 1998).
2.3.1 Actina
El citoesqueleto de actina es un compuesto de polímeros altamente dinámico y con una
gran variedad de proteínas asociadas. Las principales funciones del citoesqueleto de actina son
las de mediar la movilidad celular y los cambios en la morfología durante el ciclo celular en
respuesta a estímulos externos, para organizar al citoplasma y generar fuerza mecánica en la
célula. El cambio de morfología y funciones de la actina es regulado por las vías de
sefialización (Schidt y Hall, 1998). La movilidad celular basada en la actina tiene dos eventos
moleculares, la polimetización
regulada y los motores moleculares (Cooper y Mitchinson,
1995).
La actina existe en forma monomérica o globular (Actina G) o en forma polimérica o
filamentosa (Actina F). El arreglo de microfilamentos es muy dinámico, capaz de cambiar su
organización y orientación en respuesta a estímulos del receptor. Muchas proteínas forman
complejos con la actina, como con la tropomiosina y la dematina (Hitt y Luna, 1994; Luna y
Hitt, 1992),
participa ademas en la sefialización transmembrana, endocitosis y secreción (Luna
y Hitt, 1992).
2.3.2. Microtúbulos (MT)
Son polímeros de tubulina, que se encuentran en todas las células eucarióticas. Durante
la división celular, los arreglos dinámicos de microtúbulos llamados huso mitótico, funcionan
para la segregación y orientación de la fijación de los cromosomas. En células no divididas,
los microtúbulos están en el citoplasma, posicionan el núcleo y los organelos, sirven como un
elemento estructural de cilios
y flagelos. Los microtúbulos son polímeros robustos, con una
resistencia intrínseca para retraerse y comprimirse (Desai y Mitchinson, 1997).
19
En 1984 un mecanismo llamado inestabilidad dinámica fue propuesto para los MT
basada en un analisis
de la longitud de distribución de MT fijos. De acuerdo a éste modelo la
población de microtúbulos exhibe una gran masa en estado fijo, un solo microtúbulo que
nunca se estrecha, pero persiste en estados prolongados de polimerización y despolimerización
que frecuentemente SC interconvierten (Desai y Mitchinson, 1997),
y se define la ganancia y
pérdida de subunidades en el mismo extremo (sea polo positivo o negativo) de un MT durante
el crecimiento o acortamiento (Radionov y Borisy, 1997).
2.3.3 Filamentos intermedios
En contraste a los microfilamentos y microtúbulos, cuyos componentes están
evolutivamente conservados y son muy similares en todas las células, los filamentos
intermedios (FI) despliegan una gran diversidad en número, secuencia y abundancia. En los
humanos existen más de 50 diferentes genes de FI, quienes son expresados diferencialmente
en casi todas las células del organismo. Los FI constituyen generalmente el 1% del total de
proteína celular, y en algunas células como en los queratinocitos epidérmicos y neuronas, la
constitución alcanza hasta el 85%. La superfamilia de los FI tienen una estructura común, que
es un dímero compuesto de dos cadenas a helicoidales paralelas (Fuch y Weber, 1994; Fuchs
y Cleveland,
1998). Los filamentos
intermedios interactúan con microtúbulos y
microfilamentos, para reforzar el citoesqueleto. Las subunidades de microtilamentos, quizás
actúen como transmisores de seaales de la periferia celular hacia el núcleo (Schdit y Hall,
1998).
2.4 Cultivo celular
Es una de las mejores alternativas para generar un modelo biológico, si bien existen
modelos de tiroides, se ha observado que tienen funciones comunes, y algunos muestran
limitaciones, por lo que no se puede hablar de un modelo perfecto. Para evitar el sacrificio
sistemático y masivo, así como la interferencia de trabajar con el animal in vivo se inició el
cultivo primario de células, en éste caso para el estudio fisiológico y patológico de la glándula
tiroides (Tramontano et al., 1986). Los modelos animales han sido utilizados para estudiar la
influencia de las hormonas tiroideas en el desarrollo de los tejidos de mamíferos, tal es el caso
de las ratas, ovejas, bovinos, primates, porcinos y caninos (Porterfield y Hendrich, 1993).
El cultivo de tejidos comprende todos aquellos aspectos tendientes a estudiar los
diferentes mecanismos de reproducción celular así como las anomalías que presenta al
dividirse y originar nuevas células. El estudio de la morfología celular la inició Wilson en
1928, al observar las estructuras como arreglos lineales y la polarización de la célula, durante
el desarrollo de la división celular (Desai y Mitchinson, 1997). Los cultivos celulares se
iniciaron a finales de 1940 con Eagle, quién propuso algunos métodos y técnicas para
modificar el medio ambiente celular in vitro, y lograr de esta manera el desarrollo de células
bajo condiciones controladas.
Las células foliculares tiroideas derivadas de tiroides de rata retienen muchas de las
funciones diferenciadas intrínsecas y despliegan una serie de respuestas metabólicas a la TSH
incluyendo el aumento en la actividad de la adenilato ciclasa y la síntesis y secreción de
tiroglobulina, captación de yodo. Este sistema experimental ha mostrado ser un modelo ideal
para estudiar el mecanismo de acción de la TSH en estas células blanco “in vitro”
(Tramontano et al., 1986).
La TSH tiene efecto mitógeno sobre las células derivadas de la glándula tiroides de rata
normal, y permite mantener las características morfológicas y metabólicas diferenciadas,
desarrollo y reproducción in vitre, requieren la presencia continua de 6H como parte esencial
para el crecimiento y la función diferenciada (Tramontano et al., 1986).
El desarrollo de nuevos procedimientos y medios de cultivo, han hecho posible el
desarrollo de algunos tipos de células diferenciadas en cultivo clonado.
La dediferenciacibn
emergió como una de las más notables generalizaciones de los estudios in vitre y ocasionó una
gran discusión acerca de la estabilidad del estado diferenciado. Algunos experimentos
muestran que las poblaciones celulares dediferenciadas, re expresa sus características
diferenciadas, bajo condiciones de cultivo adecuadas (Conn, 1966). La mayoría de los cultivos
que han sido adaptados para crecer in vitre y han sido clonados de cklulas mesenquimatosas o
células derivadas de tumores. Recientemente se han incrementado el numero de cultivos
amnióticos debido a que se ha generado una mejor defmición
en los requerimientos celulares y
en la disponibilidad de medios de cultivo. Muchas de las células cultivadas, especialmente los
fibroblastos
requieren cantidades relativamente elevadas de suero fetal de ternera (SFB) para
su crecimiento (520%). La adición del suero es considerada necesaria para proveer a la célula
71
“factores del suero” que son necesarios para que la célula se una al sustrato y se reproduzca
(Coon, 1966; Sato, 1975).
22
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Panorama general
Los métodos utilizados para el aislamiento de celulas tiroideas de rata SpragueDawley, fueron el obtener el explante de la glándula tiroides, el cual se fragmentó y se sometió
a disociacibn enzimática, una vez aisladas las celulas, se les cuantificó la viabilidad, por la
técnica de azul de tripano y posteriormente fueron sembradas en cajas de cultivo y en botellas
con medio Ham F12 adicionado con 6 hormonas y suero fetal de ternera, bajo condiciones
controladas a una temperatura de 37’C en un ambiente con 95% aire hrímedo y 5% de COZ. El
medio de cultivo fue cambiado cada 4 días y fue recolectado para realizar la determinación de
tiroglobulina por medio de RIA, utilizando al medio nuevo como estándar o nivel basal de Tg.
Se realizó una secuencia fotográfica a partir de la siembra, para observar y caracterizar la
morfología adoptada por las células en cultivo primario y compararlas contra células tiroideas
de la línea celular FRTLS. Asimismo se sembraron celulas sobre cubreobjetos fueron
sembradas y procesadas para inmunofluorescencia para inmunodetectar al receptor de la TSH,
y a los componentes del citoesqueleto de actina y tubulina. Como control, se utilizaron células
HeLa, luego fueron observadas en un microscopio invertido para fluorescencia y se
imprimieron en película fotográfica (Ambesi-Impiombato et al., 1980).
3.2 Sujetos experimentales
Las glándulas tiroides fueron obtenidas de ratas Sprague-Dawley de 24 semanas de
edad, con un peso promedio de 250 g, mantenidas con luz y temperatura controladas (12 hrs
luz/oscuridad a 23 +- 2OC de temperatura), alimento balanceado y agua ad livitum. Las ratas
fueron obtenidas del bioterio del Centro Regional de Estudios Nucleares (CREN), la parte
experimental fue realizada en el Laboratorio de Biología Celular del mismo Centro, en la
Universidad Autónoma de Zacatecas, en Zacatecas, Zac.
23
3.3. Obtención de las cdlulas tiroideas
3.3.1 Explante tiroideo
Este paso tuvo como propósito el obtener la glándula tiroides de la rata SpragueDawley, y a partir de éste tejido; aislar las células tiroideas, de acuerdo a la técnica propuesta
por Ambesi-Impiombato et al, (1980).
El proceso se realizó bajo condiciones de esterilidad en una campana de flujo laminar.
Las ratas (Sprague-Dawley) fueron anestesiadas en una cámara conteniendo cloroformo (J. T.
Baker), posteriormente se fijaron y se les realizó lavado de cuello con jabón líquido neutro
(Carboquim), asepsia con jabón quirúrgico (Dermocleen) y antisepsia con benzal (Temer). Se
utilizó un estuche de disecciones (Chrome, USA) para extraer cuidadosamente la glándula
tiroides utilizando, se utilizó un escalpelo No. 21 (Feather Safety) para la incisión de la piel y
otro para la disección de la glándula tiroides. Se siguió el mismo procedimiento para la
obtención de explantes de hígado, rifión, y linfocitos periféricos.
3.3.2 Disociación celular
En éste paso se utilizaron dos procedimientos, el propuesto por Rapoport (1976) y el de
Ambesi-Impiombato el al., (1980).
El primer método utilizado para la obtención del explante
y disociación celular fue el
propuesto por Rapoport (1976) consistente en la utilización de un homogenizador de tejidos y
la utilización de tripsina -verseno (0.075%) y colagenasa III, en solución de Hank’s, para la
disociación celular, con digestión de 2 y 3 hr, posteriormente se midió la viabilidad celular y
se sembró las células en botellas y cajas de cultivo, en medio de Ham F12 y 6H y con 0.5% de
suero fetal de ternera.
El segundo procedimiento fue realizado mediante la metodología sugerida por AmbesiImpiombato et al., (1980). Se extrajo el explante tiroideo, y se depositó en solución
amortiguadora de fosfatos (PBS) estéril para su lavado primario. Luego se seccionó en
fracciones de aproximadamente de lmm3 utilizando una caja de Petri y una hoja de escalpelo
estéril. Los segmentos de tiroides fueron lavados nuevamente en PBS estéril y se dejaron
sedimentar, se extrajo el PBS. Los segmentos de tiroides se sometieron a digestión enzimática
en un tubo cónico de polipropileno de 15 ml (Costar 33 18) en solución de Hank’s (Microlab,
Lote 5 Il) adicionada con 20 U/ml de Colagenasa tipo 1 A (Sigma C-2674), tripsina - EDTA
al 0.075% (Gibco, No. Cat. 15400 - 054) y suero de pollo al 2% (Gibco No. Cat. 1600 - 044),
la digestibn fue por 30 minutos, a 37’C en bailo María con agitación (Lab Line), una vez
concluido este paso, se dejó sedimentar por 5 minutos, se extrajo el sobrenadante y se
centrifugó a 1700 rpm (378 g) en una centrífuga clínica (Sorvall TC6).
3.3.3 Cultivo celular
Este paso se efectuó de acuerdo a la propuesta de Ambesi-Impiombato et al., (1980).
El sobrenadante fue eliminado, quedando el paquete celular, el cual se suspendió en medio de
cultivo de Ham F12 (Gibco, No. Cat. L 21700075) adicionado con insulina 10 pg/ml (Lilly),
transferrina 5 l.tg/ml (Sigma T-4382), somatostatina 10 ng/ml (Sigma S-9129), hidrocortisona
10 nM (Sigma H-0396), glicil histidil lisina 10 ng/ml (Sigma G-1887) y TSH 10 mU/ml
(Sigma T-8931) nominados en conjunto 6H, y 5% de suero fetal de ternera (Gibco No. Cat.
26170). 3 ml de la suspensión celular se sembró en 3 cajas de cultivo de 100 X 20 (Costar
3060) conteniendo 8 cubreobjetos (Corning), asi como en una botella de cultivo de 25 cm2
(Costar 3055).
Las cajas y botellas de cultivo conteniendo las células, se colocaron en una incubadora
(Scientific Form) con 95% de humedad y 5% de CO2 a una temperatura de 37°C. Los
fragmentos de tejido remanentes, fueron sometidos a digestión bajo las mismas condiciones
iniciales por otros 30 minutos y las células se obtuvieron bajo las condiciones seiialadas.
El
medio de cultivo se cambió cada cuatro días a partir de la siembra inicial.
Para analizar la función del suero fetal de ternera sobre el desarrollo celular, se montó
un experimento utilizando diferentes concentraciones desde 0.0, 0.1, 0.5, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0 y
15.0%, y se observó el desarrollo celular a las 48 horas, utizando un microscopio (Axiovert
25) con el objetivo 40X (Karl Zeiss), consistente en contar el número y tamaño de las colonias
en proceso de crecimiento (Ambesi-Impiombato et al., 1980).
3.4 Determinación de la viabilidad celular
Una vez aisladas las células, se realizo el recuento celular y la determinación del
porcentaje de viabilidad celular, mediante la técnica de tincibn de exclusión con azul de
tripano (Boyum, 1968). Se utilizó azul de tripano al 4% como colorante supravital. Se
transfirieron 0.5 ml de una solución al 4% (p/v) de azul de trípano en un vial de 1.5 ml (Costar
Cambridge MA.). Se afíadíeron 0.3 ml al PBS pH de 7.2 y 0.2 ml de la suspensión celular
(factor de dilución = 5), mezclando por 15 seg. Se dejó reposar de 5 a 10 mín. Con la solución
formada, se llenaron por capilaridad las cámaras del hematocítómetro (cámara de Neubauer,
Spencer Bright-líne Buffalo N.Y.), cubiertas por un cubreobjeto.
Se contaron todas las células utilizando un microscopio óptico (Carl Zeiss objetivo 4X)
en el cuadrado mílímétrico central y en los cuadrados de cada esquina, llevando cuenta
separada de las células tefíidas y células totales. Cada cuadro del hematocímetro representa un
volumen total de lo4 por rnn?.
Para determinar la concentración de células/ml de la suspensión celular, se realizaron los
cálculos considerando un factor de dilución del 50%, ya que la tincíón se realizó a partes
iguales con la suspensión. El procedimiento fue el siguiente (Sigma. 1999):
Conteo celular: Cada cuadro del hematocímetro con la cubierta en su lugar, representa
un volumen de 0.1 mm3 ó 104/cm3. Ya que 1 cm3 equivale aproximadamente 1 ml, la
subsecuente concentración celular por ml (y el numero total de células) fue determinado
siguiendo los siguientes cálculos:
Células por ml = a la cuenta promedio por cuadrante por el factor de dilución por 1 04.
Células totales = células por ml X el volumen original del cual se tomó la muestra.
Viabilidad celular = Total de células (no teñidas) entre las células totales (teñidas y
tetidas) por 100.
no
3.5 Lisis celular
Después de haber sido obtenidas las células tiroideas, el precipitado de células se lavó
con 1 ml de PBS, pH de 7.2 a 4OC, posteriormente se resuspendió dicho precipitado en 150 pl
de la solución de lisis que contenía: 1% de Tritón X-l OO (Merck West Germany) 140 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.6 (Gibco BRL Grand Aisland NY ), mas 1 mM de
PMSF. El lisado celular se homogenizó y centrifugó por 10 min a 16,000 g recuperandose
exclusivamente el sobrenadante, que fue transferido a viales etiquetados para congelarse hasta
su procesamiento.
3.6 Determinación de proteínas en extractos totales
Para determinar la cantidad total de proteína de los explantes celulares, se utilizó la
técnica de Bradford (1976), para su posterior caracterización por medio de electroforesis en
geles de poliacrilamida.
3.7 ElectroforCsis (PAGE-SDS)
Se realizó el corrimiento de las proteínas del lisado celular, en geles de poliacrilamida,
de acuerdo a la técnica propuesta por Laemmli (1970). Se ensamblaron los cristales de vidrio
de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se agregó la solución de poliacrilamida al 10%
entre los cristales. El menisco de solución de poliacrilamida llegó aproximadamente a 8 cm
del borde superior, se mantuvo el gel en posición vertical a temperatura ambiente. El gel se
formó (entre 20-30 min), se inclinaron los cristales por su vértice, se lavó el gel de separación
tres ocasiones con agua destilada, y se evitó la presencia de algún residuo.
Se preparo la solución de poliacrilamida para el gel concentrador. Esta solución se
agregó directamente sobre el gel separador polimerizado. Se colocó el peine, apropiado dentro
de la solución cuidando de no producir burbujas. El gel se mantuvo en posición vertical a
temperatura ambiente. El gel concentrador polimerizó en aproximadamente 10 min. Los pozos
se lavaron 3 veces con agua destilada o solución de corrida para eliminar la poliacrilamida no
polimerizada. Los pozos se cargaron con 30 ug de las muestras problema, previamente
tratadas con buffer de muestra, y calentadas a 95OC por 5 min. La corrida electroforética se
llevó a cabo a 1 OO V, a temperatura ambiente y por 80 min de acuerdo a la técnica de 0 ‘Farrel
(1975).
3.8 Transferencia de proteinas a membrana de nitrocelulosa
Para detectar a los receptores a TSH, y los componentes del citoesqueleto, tubulina y
actina, las proteínas en los geles de poliacrilamida, se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa (Amersham Hybond-C # FWN303C), utilizando la técnica de Towbin et al.,
(1979).
3.9 Bloqueo de la membrana de nitrocelulosa
Para evitar la absorción inespecífíca del anticuerpo en la membrana de nitrocelulosa,
ésta se lavó tres veces con PBS. Después se le agregó solución bloqueadora (3% de leche
descremada Sbelty de Nestlé en PBS) y se dejó en la solución por 12 h (Sharon, 1979;
Olmsted, 198 1).
3.10
Inmunodetección
Las proteínas transferidas a la membrana de nitrocelulosa, se identificaron utilizando
anticuerpos específicos contra los diferentes tipos de proteínas; anti TSHr, tubulina y actina y
un segundo anticuerpo conjugado a peroxidasa (Towbin et al., 1979). Después de bloquear la
membrana de nitrocelulosa con la solución de leche descremada al 3% en PBS durante 12 h,
se lavó tres veces con PBS a 4°C. Posteriormente se incubo por 1 h en solución bloqueadora y
por separado con los anticuerpos anti receptor a TSH, anti actina y ami tubulina
respectivamente, enseguida la membrana de nitrocelulosa fue lavada en forma alternada 5
veces con PBS, y 5 veces con PBS-Twin-20. Después la membrana se incubó 1 h con un
segundo anticuerpo conjugado a peroxidasa, con agitación suave. Pasado el tiempo de
incubación se procedió a lavar de nuevo en la forma anteriormente descrita y por último se
utilizó
un
reactivo
quimioluminiscente
(ECL,
Amersham
Little,
Chalfont
Buchinghamshire
England), el cual, al reaccionar con la peroxidasa emite luz, misma que fue detectada en una
película fotográfica (Dupont de Neumors, USA).
3.11 Determinación de tiroglobulina
La presencia de tiroglobulina fue detectada por medio de RIA, que es una metodología
con una alta sensibilidad y especificidad (99.5%) para la tiroglobulina (Berson y Yallow,
1956; Larsen et al., 198 1).
28
Para medir los niveles de tiroglobulina (secretada por los tirocitos en el medio de
cultivo), fueron utilizados paquetes para radioinmunoanálisis en fase líquida de tiroglobulina
(Diagnostic
Products Corporation, DPC Los Angeles, USA). Las muestras fueron corridas por
duplicado, introduciendo estándares altos, medio y bajo para tiroglobulina. Para la validación
de los datos, se utilizó el programa RIAWHO, donado por la Organización Mundial de la
Salud, que provee ademas del cálculo de resultados, los diferentes parámetros de control de
calidad para asegurar la validez de los datos obtenidos (Lamen ef al., 198 1).
3.12 Inmunoflorescencia indirecta para detectar receptores a TM-I,
y microtúbulos
filamentos de Actina
Para evidenciar los receptores y componentes del citoesqueleto, fueron utilizados
marcadores biológicos fluorescentes. Esta técnica, ha sido utilizada para medir la dinámica de
macromoléculas en las células obtenidas, de acuerdo a la técnica propuesta por Harlow y Lane
(1988). Las células tiroides que crecieron en los cubreobjetos, se fijaron y permeabilizaron
con metano1 absoluto a -20°C, por 20 segundos, el experimento fue realizado por duplicado
con los tirocitos y con células HeLa, como control negativo para receptores a TSH, y positivo
para actina y para microtúbulos: Cada laminilla se permeabilizó con SFB y se agregó 10 pl de
primer anticuerpo anti TSH (dilución 1: 1 OO), anti actina (dilución 1: 1 OO)(A 4700, Clone AC 40, SIGMA) y anti 01 - tubulina (dilución 1: lOO)(T - 5 168, Clone B - 5 - 1 - 2, SIGMA), l3 tubulina ( T - 5293, Clone 2 - 28 - 33, SIGMA). Posteriormente fue agregado un segundo
anticuerpo anti ratón desarrollado en conejo y conjugado con fluoresceína (F - 9137,
SIGMA), una vez concluído éste proceso, los cubreobjetos fueron montados en laminillas y
utilizando aceite de inmersión, y se observaron en un microscopio invertido (Axiovert 25)
equipado con lámpara y filtros para fluorescencia y cámara fotográfica, obteniendo imágenes
por contraste de fases y por fluorescencia.
3.13 Análisis estadistico
Para evaluar el efecto de la digestión con tripsina - EDTA a tiempos de 30 y 60
minutos fue utilizada la prueba de t de Student, partiendo de las siguientes hipótesis;
Hipótesis nula: (Ho) La viabilidad celular para un tiempo de digestión de 30 min del tejido
tiroideo, es igual a la viabilidad celular para un tiempo de digestión de 60 minutos.
29
Ho: V30 - Vho = 0,
Donde V30 es la viabilidad celular a 30 min , y VIO es la viabilidad
celular a 60 min.
Hipótesis alternativa: (Ha) El tiempo de digestión de 30 min del tejido tiroideo, permite
obtener una viabilidad celular diferente al tiempo de digestión de 60 minutos.
Ha: V3o--Va#O
Para determinar sí la viabilidad de las cClulas expuestas a tripsina - EDTA varía en
función del tiempo de digestión, 30 y 60 min, se realizó la prueba estadística t de Student
(Kokoska y Nevison, 1989; Lyman, 1993). La prueba se realiz& para comparar el efecto
analizando los valores de la desviación estándar de los promedios de la viabilidad.
IV. RESULTADOS
4.1 .Viabilidad celular
En el aislamiento de células del tejido tiroideo de rata, se emplearon 4 diferentes tipos
de enzimas (tripsina-versenokolagenasa tipo III; tripsina-EDTAkolagenasa tipo 1) en dos
grupos experimentales para lograr la disociación tisular (digestión) de las células del tejido
tiroideo. En la Figura 1 se observa el porcentaje de la viabilidad celular, obtenido en cuatro
cultivos empleando las enzimas tripsina-verseno y colagenasa tipo III; con un tiempo de
digestión de 2 y 3 h. Los porcentajes de viabilidad obtenidos fueron 14.23 f 6.15 a 2 h y de
29.99 f 9.06 a las 3 h.
100
60
4
60
3
s
40
20
0
I
Figura 1
1
2
CULTIVOS
Porcentaje de viabilidad celular obtenida
3
4
con el método de Rapoport usando 2
tiempos de digestión.
En la Figura 2 se aprecia que la viabilidad celular fue sensiblemente mayor, al utilizar
las enzimas tripsina-EDTA y colagenasa tipo 1, enzimas recomendadas por Ambesi Impiombato et al., (1980) para llevar a cabo la disociación celular con tiempos de digestión
muy cortos en comparación con la técnica propuesta por Rapoport 1976), mostrada en la
Figura 1, lo que permite una menor manipulación y contacto con los agentes proteolíticos.
31
1
2
3
4
CUJlVO6A(3OMN)
Figura 2
5
6
7
CUllVCE(6OMN)
6
Valores obtenidos en la viabilidad celular de acuerdo al método de Ambesi Impiombato, a 30 min (barras l-4) y a 60 min (barras 5-8).
Para determinar sí la viabilidad de las células expuestas a tripsina - EDTA varia en
función del tiempo de exposición, 30 y 60 min, se realizó la prueba estadística de t de Student,
para comparar el efecto analizando los valores de la desviacion
estándar de los promedios de
la viabilidad. La prueba de t de Student se aplicó bajo la hipótesis de que la viabilidad a 30
min es estadísticamente igual a la viabilidad a 60 min.
Bajo este criterio se acepta Ho, por lo tanto la viabilidad celular no fue
estadísticamente distinta al tiempo de exposición a la enzima.
Como Ttab > Tcal, entonces se puede decir con un 95 % de certeza que la viabilidad 1 no es
diferente de la viabilidad 2.
La utilización de las pruebas estadísticas para comparar; sí la viabilidad celular fue
igual a los 30 y a los 60 min, permitió establecer un efecto similar entre ambos tiempos, por lo
tanto se puede utilizar cualquiera, sin tener diferencias significativas en la viabilidad celular.
4.1.1 Concentración de suero fetal de ternera
Para seleccionar de la cantidad más eficiente de suero fetal de ternera, el experimento
qué se montó con 8 diferentes concentraciones y dio como resultado que del 0.0 al 3.0 % el
rendimiento celular por el desarrollo de colonias fue escaso, en relación con el campo visual
del microscopio con un áirea menor al 20%, mientras que para el 5% las colonias y densidad
celular fue mayor del 50% del campo visual. A concentraciones mayores, 7.5, 10.0 y 15.0%,
no se observó diferencia visual respecto a la concentración del 5%, razón por la que se
continuó con una concentración al 5%.
4.2 Caracterización morfológica
Los cultivos primarios de tirocitos se caracterizaron morfológicamente comparando su
desarrollo con la línea FRTLS. Los cultivos celulares aislados a partir del tejido tiroideo, se
muestran en las Figuras 3 a 5, como se puede observar, los resultados obtenidos en cuanto a
las formas celulares, tamaiio de los folículos y por el tipo de desarrollo, se puede presumir que
son tirocitos.
Figura 3
Microfotografía de cultivos de tirocitos después de 21 días, donde se
muestran, las células tiroideas obtenidas en cultivo primario (izquierda)
y las células tiroideas de la línea celular FRTLS (derecha), tomadas con
un objetivo 40X.
En la Figura 3 una microfotografia
en donde se muestra un cumulo de células tiroideas
obtenidas en cultivo primario (izquierda), el cual guarda la morfología respecto a los tirocitos
de la línea celular FRTLS (derecha), en donde se observan los tirocitos organizados en
ll
folículos, rodeando unos espacios correspondientes al lumen folicular. En la Figura 4 también
se comparan ambos grupos celulares.
Figura 4
Microfotografia de los tirocitos obtenidos después de 15 días en cultivo
primario (izquierda), comparado contra la línea celular de tirocitos
FRTLS (derecha) utilizando un objetivo 40X.
Figura 5
Microfotografía en donde se muestra una de las morfologías adoptadas
por los tirocitos en cultivo primario obtenida con un objetivo 1 OX.
34
4.3 Determinación de Tiroglobulina
Para determinar si las células tiroideas en cultivo primario, producen tiroglobulina en
el medio de recambio procedente de los cultivos, se realizó la medición a partir de la semana 1
a la 5, utilizando como control el medio de cultivo, que contenía 1.47 ng/ml de tiroglobulina.
La cuantificación en ng/ml de ésta proteína fue realizada por medio de radioinmunoanálisis
(RIA) (Berson y Yallow, 1956; Larsen, 1981). Los datos obtenidos son mostrados en la Figura
6, en la cual no se aprecia diferencia en la primera semana respecto a la cifra control,
mostrando una elevación importante durante la segunda semana, encontrando una elevación
más importante a la 3” semana, luego el comportamiento se mantuvo a manera de meseta,
durante la cuarta y quinta semanas que fue monitoreada. Lo anterior demuestra que las células
cultivadas son células tiroideas en cultivo primario, ya que es el único tejido que es capaz de
producir tal metabolito.
Figura 6
Comportamiento de la producción de tiroglobulina desde la 1” a la 5” semana, y
en donde se muestra que la primera barra es la concentración basal del medio de
cultivo, y las 5 siguientes son las cifras determinadas cada semana (La
incertidumbre asociada es < 0.05%).
4.4 Expresión de receptores a TSH
Para demostrar que las células que se obtuvieron de la glándula tiroides fueron tirocitos
y no otras células, a las células que se sembraron sobre cubreobjetos y se procesaron para IFI,
con anticuerpos antireceptor contra TSH. Se encontró que los tirocitos en cultivo primario
expresaron los receptores a la TSH, más no en las células HeLa, como se muestra en la Figura
7. Asi mismo, las cClulas se procesaron por IFI para detectar componentes del citoesqueleto
utilizando anticuerpos contra actina y tubulina, en donde dio positivo para las células
tiroideas como para células HeLa, como se observa en las Figuras 8,9, 10 y ll.
Figura 7
Microfotografia
primario, obtenida
de los tirocitos obtenidos después de 15 días de cultivo
por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia
para la detección de los receptores a la TSH (derecha) con objetivo 100X.
Figura 8
Microfotografia
de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo,
observados por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia para
detectar la a tubulina (derecha), utilizando un objetivo 100X.
Figura 9
Microfotografía de los tirocitos obtenidos, después de 15 días de cultivo,
observados por medio de contraste de fases (izquierda)
inmunofluorescencia para detectar filamentos de actina
objetivo 100X.
Y por
(derecha) utilizando un
Figura 10
Microfotografia de los tirocitos obtenidos a los 15 días de cultivo, observados
por contraste de fases (izquierda) y por inmunofluorescencia para detectar
filamentos de actina (derecha), con el objetivo 100X.
Figura ll
Microfotografia de los tirocitos cultivados en cubreobjetos, después de 15 días,
observados por contraste de fases (izquierda) e inmunofluorescencia para p
tubulina (derecha), con el objetivo X 1 OO.
Figura 12
Microfotografía de las células HeLa, observadas por contraste de fases
(izquierda) e inmunofluorescencia para detectar los filamentos de actina
(derecha), tomada con un objetivo 100X.
Para corroborar por western blot que los tirocitos en cultivos primarios expresaran el
receptor a la TSH, las células en cultivo se lisaron y sus proteínas se caracterizaron en geles de
poliacrilamida, se transfirieron a papel de nitrocelulosa y se procesaron para inmunodetectar el
receptor a la TSH, con un anticuerpo específico. Como control se utilizó lisado de células
HeLa, de hepatocitos y de linfocitos de rata Sprague - Dawley. Se encontró que las células
tiroideas, de hígado y linfocíticas, fueron las únicas en donde se expresó el receptor a la TSH,
mientras que las HeLa no, como se observa en la Figura 13.
Figura 13
Los extractos de células hepáticas (H), tiroideas (T), células HeLa (He), y
linfocitos (L) respectivamente. Se observa que las células tiroideas, hepáticas y
linfocitos expresan al receptor de la TSH, mientras que las c4ula.s HeLa no
como se observa por IFI.
V. DISCUSIÓN
El objetivo general de ésta investigación fue estandarizar una técnica para el desarrollo
de tirocitos morfológica y fisiológicamente diferenciados, en cultivos primarios a partir de
glándula tiroides de rata Sprague - Dawley.
Los resultados obtenidos permiten concluir que: a partir de los explantes tiroideos, con
la combinación de enzimas proteolíticas y la concentración de suero fetal de ternera, es
factible la obtención de tirocitos normales en cultivos primarios sin alterar sus características
funcionales y morfológicas.
5.1 Tknicas de disociación, a partir del explante tiroideo y medición de la viabilidad
celular
El primer paso para la obtención del modelo biológico, es el explante de la glándula
tiroides, disociación y aislamiento de los tirocitos y la siembra en un medio de cultivo
específico.
Existen pasos cruciales en la optimización de los procedimientos de aislamiento
para un tipo particular de células y es dependiente de una recuperación adecuada teniendo
VUklS
características: un
manejo
enzimático
apareado
(http://www.worthington-biochem.com/tissueDissociation/cellOpt.html,
con la viabilidad.
1999).
Uno de los aspectos importantes en la obtención de los cultivos primarios, es conocer
el porcentaje de c&las vivas, que serán sembradas luego de su aislamiento, a partir del
explante
tiroideo. Esto es con el fin de contrastar su desarrollo en el cultivo específico, con
respecto al numero inicial contabilizado. Esto permitió la estandarización en cuanto a que tipo
de enzimas utilizar, y durante cuanto tiempo se debe de exponer el explante glandular, así
como determinar el rendimiento celular obtenido, que fue de 3.16 X 1 O6 células totales y una
viabilidad celular del 68% en promedio (Ambesi-Impiombato et al., 1980)
Para la disociación del explante
tiroideo fueron utilizados dos grupos con dos enzimas
cada uno, el primero comprendió a la tripsina - verseno / colagenasa III, y en el segundo a la
tripsina - EDTA / colagenasa 1. Para el primer grupo se observó un numero total de células,
similar al descrito por Rapoport (1976) 1 X lo5 células por ml, y al aplicarle la prueba de
Al
exclusión con azul de tripano, se encontró que la viabilidad celular fue de 14.225 f 6.145 a las
2 h, mientras que a las 3 h fue de 29.985 f 9.058.
Esto condujo a buscar alternativas, para mejorar dicha viabilidad, que de manera inicial
se consideró crucial, para la obtención de un rendimiento celular a confluencia, ya que se parte
de que sí se siembra una baja cantidad de células vivas, esto retrazará el tiempo de respuesta
previsto para que alcancen dicha confluencia.
En cambio para el segundo grupo de enzimas, la disociación se realizó durante
perIodos de 30 min (n=4) y 60 min (n=4), encontrándose que a los 30 min, la viabilidad fue de
67.4875 f 6.3517, y del 69.3575 f 5.8705 a los 60 min. Esto es casi similar al promedio
aceptable para la obtención de un cultivo primario reportado por Kolodny (1985) que osciló de
entre el 60 al 70 %, pero es bajo respecto al 90% registrado para el cultivo de hepatocitos por
Lykkesfeldt et al., (1998) y respecto al reportado para las células FRTLS, cuando son
reactivadas que debe ser mayor al 95% según Ambesi-Impiombato et al., (1980).
Para el segundo grupo de enzimas, y para evidenciar sí existe o no alguna ventaja en
cuanto a la obtención de células viables a 30 y 60 min, los datos fueron analizados aplicando
la prueba t de Student, y se encontró, que no existe diferencia estadísticamente significativa,
(pcO.05) y que por lo tanto, se puede disgregar los tejidos por 30 o 60 min, sin variar la
viabilidad celular, con una exactitud del 95%. Esto sugiere que es indistinto utilizar 30 o 60
min para digerir los explantes. Esto se basa en que al aplicar la prueba estadística para los 2
tiempos, tratando de encontrar diferencias, ésta no se pudo demostrar, en ese sentido se
observa que es indistinto la utilización de uno u otros, tiempos, qué servirán como un
parámetro cuando se utilice ésta metodología.
Se encontró en primer lugar que el aislamiento celular total con células vivas, fue
mejor en el segundo grupo de enzimas, ya que existe diferencia entre el método propuesto por
Rapoport (1976), (primer grupo) y el grupo propuesto por Ambesi-Impiombato et al., (1980).
Por otro lado, los autores de los métodos utilizados como base para la operativización
del trabajo (Rapoport, 1976; Ambesi - Impiombato et al., 1980),
incluyendo algunos otros que
han obtenido cultivos primarios a partir de explantes, centraron su atención en los
42
procedimientos de disociación y aislamiento del modelo biológico, en los medios enzimaticos
y mecánicos como el utilizado por Pourati et al., (1998),
o ambos métodos Rapoport (1976),
pero la viabilidad celular, no fue contemplada por ninguno de los autores quienes disefiaron
medios de cultivo, como Ham (1964) y Conn (1965),
el que disefió y estandarizó el cultivo de
la línea celular FRTLS, Ambesi-Impiombato et al., (1980), el que comenzó a utilizar las
células tiroideas bovinas utilizando la TSH y un antimicótico, para observar cambios, Knopp
et al., (1970).
En todos los casos anteriormente expuestos la viabilidad celular no fue medida, se
puede argumentar que es un fenómeno estudiado desde principios del siglo, pero según los
autores del manual Worthington, es un factor crucial, cuando se está llevando a cabo un
proceso de estandarización de un cultivo, así como para medir la variación de células viables
durante un experimento. Otros autores han considerado, la estandarización de cultivos
básicamente dirigidos hacia la disociación celular, medios de cultivo y factores de crecimiento
específicos, pero dejan de lado la viabilidad celular, a diferencia de los autores del manual de
Worthington, los parámetros a considerar en cualquier esquema para la estandarización de un
cultivo son la viabilidad celular por un lado y el rendimiento celular. Por lo tanto, no basta tan
solo con disociar un gran numero de células, sino que se debe de buscar un balance entre el
numero de
CélUhS
disociadas
y
su
biochem.com/manual/tissueDissociation/cellOpt.htlm~,
viabilidad (<http://www.worthington19992
5.1.1 Condiciones del cultivo
Se debe elegir un acondicionador nutritivo general para las células de los mamíferos, y
proporcionar las condiciones metabólicas específicas para un tipo individual de célula.
Estableciendo los requerimientos más favorables para la supervivencia y crecimiento de la
célula, las condiciones de cultivo deben de promover el mantenimiento del estado diferenciado
(Koningsberg,
1963).
La función del medio condicionado general de Eagle y Piez (1955), fue constituído por
30 aminoácidos y 8 vitaminas como elementos esenciales para las diferentes células de
mamífero, pero se deben adicionar algunas otras sustancias para lograr las condiciones
específicas de un cultivo en especial. Este es el caso de las células tiroideas, que aparte del
medio específico Ham F 12 (modificado de Conn), se requieren además 6 hormonas o factores
de crecimiento específicos para su desarrollo, los cuales son esenciales para la proliferación de
los tirocitos aislados (Ambesi-Impiombato et al., 1980).
Los factores de crecimiento específicos, en el caso de las células tiroideas son la
insulina, transferrina, somatostatina, glicil histidil lisina y TSH, y substituye la hidrocortisona
por cortisol (Smelderly et al., 1993), mientras que otros utilizan los considerados como
mínimos, la insulina, transferrina y TSH (Dere et al., 1985). Se estableció el experimento
conforme lo recomendado por Ambesi - Impiombato et al., (1980), en el cual se inició con
una serie de ensayos tendientes a estandarizar las concentraciones de los diferentes factores de
crecimiento hormonal, y se observó que no hubo el desarrollo celular esperado, por lo anterior
se considera que la fuente de error no depende de la concentración de las 6H, posiblemente
influyeron factores como la disociación enzimática y la resiembra semanal, o la actividad
específica de las hormonas utilizadas.
Asi mismo en la preparación del medio de cultivo, se realizó una modificación en la
concentración de suero fetal de ternera, para lo cual se instaló un experimento utilizando
diferentes concentraciones que fueron desde 0, 0.1, 0.5, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0 y 15.0 %, y la
concentración en donde se observó un mejor crecimiento fue al 5%, misma que es utilizada
por Ambesi - Impiombato et aZ.,( 1980) para la línea celular FRTLS, mas no para la siembra de
tejidos nativos, cuya propuesta es a una concentración de 0.1 a 0.5 %, para evitar la
proliferación de los fibroblastos sobre los tirocitos.
En este experimento con la modificación de suero fetal de ternera a diferentes
concentraciones, no se observó el desarrollo de los fibroblastos, probablemente a que los
factores de crecimiento específico para los tirocitos, interfieren con el desarrollo de los
fibroblastos, privilegiando exclusivamente la proliferación de los tirocitos.
En cambio hay autores quienes no utilizan ni suero, ni hormonas, como en el cultivo de
células epiteliales de pulmón (Nielsen et al., 1997),
(Lemoine, 1989),
o células transfectadas de tiroides humana
ya que no logran ventaja adicional con su uso.
44
Algunos explantes obtenidos quirúrgicamente en humanos con enfermedad de Graves,
fueron digeridos con colagenasa IV y dispasa, a 32’C por 30 min, el medio utilizado fue el
Ham F12 y el RPM1 1640 (1: l), el suero fetal varió de 0 al lo%, en donde se observó gran
reactividad a la bTSH a bajas concentraciones entre 1 al 2 %, perdiéndose ésta respuesta entre
3 aI 10% (MacNeil el al., 1994; Sato el al., 1995).
5.2 Caracterización morfolhgica
Los cultivos celulares tiroideos en cultivo primario, obtenidos in vitro, pueden permitir
su utilización como un modelo biológico que facilite, evidenciar algunos mecanismos
celulares y moleculares, en el desarrollo de las diferentes enfermedades tiroideas, desde las
simples disfunciones endocrinas, como en el hipotiroidismo e hipertiroidismo, hasta la
investigación de los factores precipitantes de neoplascias
y algunas enfermedades
autoinmunes, que ya no solo afectan el proceso de secreción hormonal, sino que pueden tener
efectos devastadores en otros ámbitos no tiroideos. Para la caracterización morfológica de los
tirocitos obtenidos, se realizó la comparación entre éstas células de cultivo primario,
contrastándolas contra los tirocitos de la línea celular FRTLS (Figuras 4 y 5) respectivamente.
Se puede evidenciar cuan importante es la morfología asumida por las células tiroideas,
de tal manera que Yap y Manley (1984), consideran como la base anatómica y funcional a la
histoarquitectura folicular de la tiroides. La organización de las células epiteliales tiroideas en
formas quisticas, conteniendo coloide en el lumen permite la síntesis, procesamiento y
secreción de hormonas tiroideas. Esos eventos morfogenéticos son coordinados por procesos
como la adhesión celular, el tráfico intracelular, ensamble de uniones especializadas y la
regulación de los movimientos celulares morfogenéticos (Yap et al., 1992). La morfogénesis
folicular tiroidea es alterada en enfermedades endócrinas
como la tiroiditis de Hashimoto y
neoplasia de la tiroides, cuya característica es la alteración de la histoarquitectura folicular
(Yap et al., 1987).
Por otro lado cuando se siembran células a alta densidad en presencia de TSH, las
células tiroideas se adhieren unas a otras. La influencia morfogenética de la TSH es mediada
por la proteína cinasa A, vía cAMP, y lo identifican como el principal determinante de la
morfología folicular tiroidea in vitro. La TSH regula la adhesión de células tiroideas, la
organización del citoesqueleto e inhiben la locomotilidad celular. Los patrones de las celulas
tiroideas en cultivo, no son fijos, ya que pueden disociarse y migrar convirtiendo los folículos
en monocapas (Yap y Manley, 1994; Yap et al., 1997).
Para asumir una funcionalidad y morfología adecuadas, es importante que la célula esté
polarizada. La polaridad celular (asimetría) es extensamente distribuida y altamente
conservada en los diferentes tipos celulares, desde procariotes hasta los grandes eucariotes. En
organismos multicelulares es mas conspicuo, pero no esta restringido a neuronas y células
epiteliales. La membrana plasmática esta organizada en dos dominios, el apical y el
basolateral. Esta función inherente a las células epiteliales es acomptiada de funciones mas
especializadas incluyendo la absorción y la secreción (Salas et al., 1997).
La morfología de los folículos tiroideos tiene un comportamiento similar en las
diferentes especies de vertebrados, como en células de rata (Ambesi-Impiombato et al., 1980),
en células humanas transfectadas (Lemoine, 1989),
células de cerdo (Yap et al., 1997),
células
bovinas y caninas (Depoortere et al., 1998), entre otros modelos biológicos de células tiroideas
utilizados.
La organogénesis y el remodelado de tejido requieren no solo la proliferación y
diferenciación extensiva de los tejidos, sino también de la eliminación selectiva de células
indeseables. Las hormonas tiroideas son esenciales durante el desarrollo de los humanos, ya
que regulan directamente la transcripción genética a través de los receptores a hormonas
tiroideas, como son los factores de transcripción nuclear. Muchos de los genes son regulados
por la T3, han sido aislados y caracterizados, confiriéndoles a las células tiroideas una función
importante dentro de los mecanismos de apoptosis (muerte celular programada) en especial en
ésta especie, pero que a futuro se pueden extender las investigaciones a otras especies (Su et
al., 1997).
Uno de los fenómenos observados durante el desarrollo de los folículos tiroideos fue la
generación de estructuras extracelulares, con morfología aproximadamente hexagonal,
nominada matriz extracelular (ECM). La interacción de células con las proteínas de ECM,
afecta muchos aspectos del comportamiento y regulación de los procesos biológicos,
46
incluyendo
(Vitale ef
la
al.,
morfología
celular,
migración,
diferenciación,
transformación
y
crecimiento
1997).
La comparación gráfica-gráfica permite cotejar las similitudes morfológicas entre las
células obtenidas de glarrdula tiroides de rata y las de línea celular FRTLS. No se observó
diferencia en cuanto a distribución y tarnaiio de los tirocitos, en la formación de folículos y de
los espacios interfoliculares. Cabe mencionar que las células de línea FRTLS, no se
desarrollaron adecuadamente bajo las condiciones proporcionadas por la patente, por lo que no
se pudieron obtener patrones de cúmulos mayores a las aproximadamente circulares,
mostradas en las Figuras 4 y 5.
5.3 Caracterización funcional
La tiroglobulina es uno de los marcadores específicos que se expresa en las células
tiroideas, y es una glicoproteína yodada en la cual se sintetizan las hormonas tiroideas
(Fontana, 1982). Este proceso de yodación de hormonas tiroideas se lleva a cabo en la
membrana apical de las células epiteliales de la tiroides (Lemansky, 1998).
La tiroglobulina, es el precursor de las hormonas tiroideas T4 y T3, deriva de las
células epiteliales tiroideas. La tiroglobulina es almacenada en el lumen del folículo tiroideo y
su transporte a la circulación, es a través de transporte vesicular transepitelial (trancitosis). La
depuración de la tiroglobulina de la circulación ocurre en el hígado, por endocitosis en las
células de Kupffer. La intemalización de la tiroglobulina es acompañada por la liberación
proteolítica
de las hormonas tiroideas, de sus moléculas precursoras. El significado biológico
de esta liberación extratiroidea de hormonas por los macrófagos, quizás consista en
interacciones parácrinas con los hepatocitos (Brix, 1998).
La tiroglobulina se detectó, por medio de RIA, desde la 1” a la 5” semana, y se utilizó
como control estandar o cifra basal, la determinada en el medio de cultivo (1.47 ng/ml) a
utilizar para el recambio, encontrando que la tiroglobulina mostró una elevación incipiente
durante la primera semana (1.88 ng/ml), se observó una mayor elevación en la segunda
semana (4.96 ng/ml), alcanzando el umbral a la tercera semana (7.04 ngml). Durante la cuarta
(6.71 ng/ml) y la quinta semanas (6.80 ng/ml), el comportamiento observado fue a manera de
meseta. La medición por medio de RIA mostró una sensibilidad para tiroglobulina del 99.5%,
A-l
aunque las cifras obtenidas, son bajas en relación a las reportadas por Fontana et al., (1982)
que fue desde una producción de 60 a 80 pg/ml hasta 20 ng/ml, encontrando que en el cultivo
de tirocitos, la liberación de tiroglobulina, al medio de cultivo es de 30 pg/ml, y ésta respuesta
es directamente proporcional al numero de células (Fontana et al., 1982). En el experimento
no fue posible medir la densidad celular in sifu, debido a no contar con la infraestructura para
tal fin.
Existe evidencia de que algunas hormonas polipeptídicas son degradadas en los
órganos blanco, y sugiere que la inactivación local, quizás funcione como un importante
mecanismo de regulación celular, así como de inactivación de la señal hormonal (DeRubetis
et
al., 1975).
Se han reportado secreción y formas anormales de tiroglobulina, como lo mencionó
Medeiros-Neto et al., (1996), donde identificaron una alteración en el retículo endoplásmico,
con inducción de una proteína chaperona y deficiencia de tiroglobulina. Abramowicz et al.,
(1997) describieron la presencia de una tiroglobulina mutante estructuralmente y la
propusieron como un factor potencial para la presencia de hipotiroidismo congénito, cuyos
efectos intra y extraútero, son muy importantes, dentro. del esquema de evolución, que
relaciona al hipotiroidismo con el retraso mental.
5.4 Expresión de los receptores a TSH y componentes del citoesqueleto
La presencia de receptores y componentes del citoesqueleto fue determinada de dos
formas, la primera fue el procesamiento por medio de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la
segunda por Western Blot.
La importancia de la inmunofluorescencia indirecta, se encuentra dentro de las técnicas
para evidenciar estructuras utilizando marcadores biológicos fluorescentes. Los biosensores
protéicos
fluorescentes, están involucrados en la citoquímica y espectroscopia fluorescente, y
han sido utilizadas para medir la dinámica de macromoléculas, metabolitos, iones, y para
explorar las bases moleculares de las funciones vitales, en los campos de la química orgánica,
bioquímica y biología celular y molecular, incorporándolas en diversas células, tejidos y
órganos. Se han desarrollado ademas dispositivos como son los paquetes de cómputo, e
instrumentación para el procesamiento digital de las imágenes obtenidas, como la
AQ
cristalografia
por rayos “X” y la resonancia magnética nuclear, que acoplado a un modelo
molecular que permite definir la relación entre la estructura y función de proteínas “in vitre”
(Giuliano et al., 1995).
La tendencia acerca de los receptores a TSH y de los receptores nucleares para
hormonas tiroideas, es estudiar las vías de acción y expresión de los componentes de ambos
receptores en la termogénesis, lipogénesis y maduración cerebral (Wilkstrom et al., 1998),
específicamente en el desarrollo del sistema auditivo, funciones cocleares y en el órgano de
Corti (Rusch et al., 1998) y en la alteración de la expresión del receptor a hormonas tiroideas y
de otros receptores nucleares, que provocan resistencia a hormonas tiroideas (Weiss el al.,
1999). Igualmente la atención se enfoca hacia los factores de crecimiento que actúan en la
organogénesis y que pueden causar agenesia de glándulas endócrinas y exocrinas, rifion,
pulmón, estructuras cutáneas, anormalidades craneofaciales y del esqueleto humano,
provocado por una mutación en el factor de crecimiento de los fibroblastos
(Celli et al., 1999).
Los tirocitos obtenidos en cultivo primario, y procesados para IFI, así como los
resultados obtenidos, por medio de las estructuras y receptor expresados, pueden permitir que
sea factible su utilización para evidenciar las estructuras celulares antes mencionadas, lo
expuesto en los resultados es tan solo una parte de la verificación funcional, y su potencial
para facilitar su utilización combinando variables que serán exploradas a futuro.
En algunas disciplinas, los sistemas in vitre, no son bien vistos como una alternativa de
reemplazo, pero son una norma para los estudios en el ámbito celular y molecular. En muchos
casos el reemplazo es relativo, porque requiere de células y tejidos frescos. Aun así, los
animales utilizados son económicamente mejores, puesto que de un sólo animal se obtienen
tejidos y sirven para realizar numerosos cultivos. El material humano puede en algunas
ocasiones ser utilizado, pero es muy difícil de obtener, guardar y distribuir. Algún tejido
humano puede estar disponible después del explante
quirúrgico. La placenta humana ha sido
utilizada como fuente para algunos tipos de tejidos para investigación, ya que contiene algunas
estructuras con células nerviosas para estudios neurológicos.
El utilizar tejidos humanos tiene
el riesgo de contener virus peligrosos como el SIDA y la hepatitis, que requieren mayores
precauciones.
A9
En trabajos de investigación la utilización de cultivos celulares es más económica, que
con
la
utilización
de
un
<http://hayato.med.osaka.ac.ip/index/g;uide/inform/renulation/standard.html>,
animal
completo
las células
diferenciadas en cultivo proveen de una herramienta muy útil para estudiar los mecanismos de
acción de hormonas y otros factores que influyen en el crecimiento y metabolismo celular
(Tramontano eC al., 1986).
Trabajos a futuro van encaminados a cómo la TSH interacciona con su receptor. Pero
más importante para la perspectiva clínica es definir los epítopes de las células B y células T
sobre el receptor a TSH que son reconocidas por el sistema inmunológico. Esta información
facilita el desarrollo para una aproximación inmunológica para controlar la enfermedad de
Graves e hipertiroidismo, y quizás ofrezca un evidenciar los mecanismos acerca de la
destrucción de la glándula tiroides y el consecuente hipotiroidismo (Nagayama et al., 1992).
A pesar de los avances en el cultivo celular, es pequeño el número de células epiteliales
diferenciadas en cultivo. Las células obtenidas en dichos cultivos se han empleado no sólo
para el diagnóstico citológico de enfermedades de tipo metabólico y hereditario, sino también
en deficiencias bioquímicas para plantear o resolver problemas de investigación, que
actualmente demandan soluciones a los diferentes problemas que afectan a la salud humana,
soluciones que se han de encontrar utilizando los diversos métodos existentes para lograrlo
(Ambesi-Impiombato et al., 1980).
Aún se ignoran muchas de las vías que son utilizadas en polimerización dinámica de
los microtúbulos, y se pueden remarcar en algunos aspectos. A muchos niveles fundamentales
la polimerización dinámica permite la rápida reorganización del citoesqueleto. La hidrólisis de
NTP es el potencial para poder realizar el trabajo mecánico, (estos mecanismos son
pobremente entendidos). Existe evidencia que la polimerización de actina produce trabajo
mecánico y fuerza en las células (Inoue y Salmon, 1995) y que la atención en su distribución
es crucial para la función celular tiroidea, ya que este se encuentra asociado con el receptor de
la TSH.
Los resultados, muestran que la estandarización del modelo biológico propuesto
inicialmente como alternativa a la línea celular FRTLS, sirve como punto de partida para
proseguir la investigación en el ámbito celular y transpolarlo a las diferentes anormalidades
que sufren las células tiroideas in vivo como son el estudio de la alteración de los productos
característicos que endocita o exocita la célula tiroidea normal, como es la produccibn de
tiroglobulina, el estudio de los segundos mensajeros, las vías de activación, y alteraciones en
la bomba de yodo, entre otros (Martínez-Galán et al., 1997).
Es un hecho que los avances logrados en éste trabajo pueden proporcionar un buen
modelo biológico que permita la relativamente fácil obtención y reproducción de células
tiroideas en cultivo primario, y que sus características tanto fisiológicas como metabólicas
sean de utilidad para investigar algunas funciones normales complementarias y las
alteraciones que afectan dicho funcionamiento de la glándula tiroides. Los resultados
conseguidos a la fecha impulsan la continuación para lograr superar los objetivos que a futuro
se tienen contemplados tomando como punto de partida el presente trabajo. Tanto el objetivo
principal como cada uno de los particulares propuestos, fueron realizados en su totalidad, pero
queda la inquietud para continuar en ésta línea de investigación, dado que cada día la
incidencia de enfermedades tiroideas es mayor y las alternativas de solución muy escasas.
Cl
VI. CONCLUSIONES
l.- La técnica propuesta para la obtención de los tirocitos de rata Sprague-Dawley, ha sido
estandarizada.
2.- Se obtuvieron cultivos de tirocitos cuya morfología fué similar a la línea celular FRTLS.
3.- Los cultivos tiroideos son morfológica y funcionalmente similares a las células in vivo, ya
que éstas células expresan el receptor a la TSH y producen tiroglobulina. Asimismo, al utilizar
anticuerpos contra citoesqueleto se observa una distribución de manera normal.
4.- Lo anterior, provee una herramienta importante para poder estudiar in vitro, la distribución
y función del receptor de la TSH y el citoesqueleto, como alteraciones como son el hipo e
hipertiroidismo.
VII. LITERATURA CITADA
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