Bacterias ácido-lácticas _BAL__aplicaciones como cultivos
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Bacterias ácido-lácticas (BAL): aplicaciones como cultivos estárter para la industria láctea y cárnica1. Enrique Alfonso Cabeza Herrera2 Ph.D en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Universidad de León, España. Microbiólogo, Especialista en Protección de Alimentos, Universidad de Pamplona, Colombia Email: [email protected] 1. Introducción Las bacterias ácido-lácticas (BAL o LAB por sus siglas en inglés) han sido utilizadas durante siglos en fermentaciones industriales y han despertado gran atención al ser empleadas en la industria farmacéutica y de alimentos, especialmente para la obtención de ácido láctico, componentes saborizantes, espesantes y bacteriocinas, así como al considerable valor nutritivo que pueden aportar a los productos alimenticios y el bajo coste energético de su producción (Topisirovic y col, 2006; Wilches, 2005; de Vos, 2004; Guern, 1995; McKay y Baldwin, 1990). Además, durante la última década se ha incrementado el número de estudios sobre el rol de que algunas cepas de BAL pudieran ser empleadas como cultivos probióticos (Topisirovic y col, 2006). Sin embargo, las BAL también han sido asociadas como bacterias alterantes de alimentos y en mayor medida de productos cárnicos (Cabeza y col., 2005; Cayré y col., 2005; Hemme y Foucaud, 2004; Lyhs, 2002; Huis in’t veld, 1996). En este artículo se presenta una revisión general de las bacterias ácido-lácticas y el papel que cumplen como cultivos estárter tanto en la industria cárnica como láctea. 2. Generalidades Las BAL son un conjunto de bacterias Gram-positivas, no esporuladas, en forma de cocos o bastones y catalasa negativa (aunque en algunos casos pueden encontrarse una pseudo-catalasa), con un metabolismo estrictamente fermentativo produciendo ácido láctico como el mayor producto final de la fermentación de los azúcares vía Embden-Meyer –glucólisis- (homofermentación, ver fig. 1 Conferencia dada en: Simposio Regional de Microbiología “Microorganismos Eficientes en el Sector Productivo”, Universidad Libre, Barranquilla – Colombia. 15 y 16 de septiembre de 2006. 2 Correspondencia: Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad de Pamplona, Ciudadela Universitaria, Km. 1, vía Bucaramanga. Pamplona. Norte de Santander. Colombia. 1) y en otras ocasiones producen además etanol, acetato y CO2 por la vía del ácido-6fosfoglucónico (heterofermentación, ver fig. 2) (Lyhs, 2002; Larpent, 1995a). En términos generales estas bacterias tienen complejas necesidades de factores de crecimiento: vitamina B, aminoácidos, péptidos, bases púricas y pirimídicas. Esta es una de la razones del porqué abundan en un medio tan rico nutricionalmente como la leche. A nivel de laboratorio se deben emplear medios selectivos que posean estas características para su aislamiento (por ej., el caldo o agar MRS, agar Rogosa). Otra característica de este grupo de bacterias es su tolerancia al pH ácido (pH = 5, incluso a veces menores), pero conforme el medio se va acidificando, resultan inhibidas un mayor número de especies. Glucosa Fructosa-1,6-difosfato gliceraldehído 3-fosfato dihidroxi-acetona-fosfato Ácido pirúvico Ácido láctico Figura 1. Fermentación láctica homofermentativa. (Adaptada de Larpent, 1995a). Glucosa ácido-6-fosfoglucónico CO2 gliceraldehído 3-fosfato Ácido láctico ribulosa-5-fosfato acetil fosfato etanol Figura 2. Fermentación láctica heterofermentativa. (Adaptada de Larpent, 1995a). La síntesis de dextranos y ácido láctico, la tolerancia de las bacterias ácido-lácticas a este ácido orgánico, y a un pH inferior a 7 ha hecho que este grupo de microorganismos se emplee en la industria de los alimentos para la conservación y mejora tecnológica de los productos lácteos, cárnicos y vegetales fermentados (Hemme y Foucaud, 2004; Larpent, 1995a). Topisirovic y col. (2006) estudiaron el efecto antimicrobiano de algunas bacteriocinas producidas por diversas cepas de BAL contra bacterias patógenas y no-patógenas obteniendo en general buenos resultados (ver tabla 1), por lo que concluyen entre otras que la presencia de este grupo de bacterias en los alimentos además de modificar sus propiedades físico-químicas, sensoriales y de textura, puede contribuir a un efecto protector de los mismos e incrementar su vida útil. Tabla 1. Actividad antimicrobiana de diversas cepas de BAL frente a bacterias patógenas y nopatógenas. (Tomado de Topisirovic y col, 2006). Cepa de BAL Microorganismo antagonista Lactobacillus helveticus E. coli, S. aureus, St. pneumoniae, B. mycoides, B. subtilis, B. cereus. Lactococcus lactis subsp lactis Micrococcus flavus, Salmonella paratyphi A, Ps. aeruginosa, S. aureus. Lactobacillus paracasei subsp. S. aureus. paracasei Lactobacillus acidophilus Cl. sporogenes 3. Principales grupos. En 1919-1920, Orla-Jensen, clasificó las bacterias ácido-lácticas en dos grupos según sus características bioquímicas: las homofermentativas y las heterofermentativas. Lyhs (2002) divide las BAL en tres grupos de acuerdo con sus características fermentativas: las homofermentativas estrictas, heterofermentativas estrictas, y las heterofermentativas facultativas. Las BAL homofermentativas estrictas degradan las hexosas exclusivamente a ácido láctico y no fermentan las pentosas o el gluconato. Los heterofermentativos estrictos degradan las hexosas a ácido láctico, ácido acético, etanol y CO2, y las pentosas a ácido láctico y ácido acético. Los facultativos heterofermentativos fermentan las hexosas a ácido láctico y puede producir CO2 a partir del gluconato pero no de la glucosa. Ellos también fermentan las pentosas para producir ácido láctico y acético. Las BAL de importancia en la industria de alimentos pertenecen a los géneros Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Paralactobacillus, Pediococcus, Streptococcus y Weissella (Lyhs, 2002; Leisner y col., 2000; Stiles y Holzapfel, 1997; Axelsson, 1993). Dentro del grupo de las bacterias ácido-lácticas homofermentativas encontramos algunas especies de Streptococcus (St. thermophilus y St. lactis) y Pediococcus (P. acidilactici, P. pentosaceus), y de las heterofermentativas algunas especies de Lactobacillus (L. brevis y L. buchnerii) y Leuconostoc (L. mesenteroides, L. dextranicum y L. cremoris) (Larpent, 1995a). El género Lactobacillus ha sido usado históricamente de forma segura, especialmente en la industria láctea, y juega un papel principal en la producción de leches fermentadas (Maragkoudakis y col., 2006). 4. Cultivos estárter para la industria cárnica. La BAL como cultivos estárter en la industria cárnica son empleados principalmente con fines tecnológicos más que biológicos, en este orden de ideas, las BAL originan cambios deseables en los embutidos durante el proceso de maduración (de 21 a 30 días) los cuales se manifiestan en un descenso rápido del pH de la carne, una desecación y concentración de la sal, y por otra parte por la producción de sustancias antimicrobianas que contribuyen a la reducción y posterior desaparición de bacterias Gram negativas (principalmente Pseudomonas, Enterobacteriaceae) (Larpent, 1995b). Las especies de BAL más empleadas en la industria cárnica pertenecen a los géneros Lactobacillus (Lb. sakei y Lb. curvatus, Lb. pentosus, Lb. plantarum, y ocasionalmente Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. paracasei) y Pediococcus (P. cerevisiae, P. pentosaceus, P. acidilacti) (Leroy y col., 2006). Estos cultivos para ser empleados deben reunir las siguientes características: - Deben estar constituidos por organismos viables (vivos) en un soporte de lactosa o azúcar fermentable. - Contener a la fecha de uso millones de microorganismos vivos por gramo (normalmente la 6 7 tasa se sitúa en torno a 10 – 10 bac/g). - Producir una fermentación láctica homofermentativa rápida con desaminación de la arginina. Los pediocococs a diferencia de los lactobacilos poseen una menor tasa de acidificación (más lenta), menor descenso del pH y producen una aromatización menos intensa, sin embargo, estos dos grupos intervienen en la hidrólisis de los glúcidos liberando ácidos y sus derivados (aldehídos, cetonas, etc). La actividad de los cultivos estárter en la industria cárnica se puede situar sobre tres niveles: 1. Acción sobre otras bacterias contaminantes, especialmente gram-negativas (Pseudomonas, Enterobacteriaceae) y en menor grado estreptococos fecales y estafilococos, por acción de las bacteriocinas y descenso del pH provocado por la liberación de ácido láctico y otros ácidos. 2. Acción sobre el pH, como se ha dicho, las BAL originan ácido láctico a partir de los glúcidos (glucosa, lactosa, sacarosa, etc.) acelerando la acidificación del producto. 3. Aroma, si los lactobacilos y los pediococos intervienen en la maduración se originan productos volátiles aromáticos provenientes del metabolismo y de la biosíntesis microbiana como resultado de la degradación de azúcares más que de proteínas y lípidos. Por hidrólisis de los glúcidos se originan monoácidos orgánicos (alcanoicos y alcenoicos), poliácidos orgánicos (ácido-alcohol, ácido-cetona, aminoácidos). Por oxidación de los ácidos grasos monoinsaturados se originan peróxidos y compuestos carbonilos. Los productos de degradación de los lípidos también incluyen aldehídos como el metanal, etanal, propanal, n-butanal, iso-butanal, n-hexanal, etc., y cetonas como la 2-propanona, 2butanona, 2-pentanona, 2,3-butanodiona, etc.(Leroy y col., 2006). En la siguiente tabla (Tabla 2) se muestra algunos ejemplos de productos cárnicos elaborados con intervención de cepas de BAL. Tabla 2. Productos cárnicos y BAL empleadas durante su elaboración. Carne Microorganismo Embutidos: Salami Lactobacillus homofermentativos Salchichón ahumado Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus heterofermentativos Salchichas Frankfurt Streptococcus spp, Pediococcus spp, Leuconostoc spp, Lactobacillus spp. De cerdo fresco Leuconostoc spp, Pediococcus spp, Lactobacillus spp. Bacón: En empaquetado Tipo Wiltshire lonchas, Empaquetado al vacío Jamón: Crudo Principalmente Lactobacillus spp; también Enterococos. Lactobacillus spp. Streptococcus spp, Leuconostoc spp, Pediococcus spp, Lactobacillus spp. Lactobacillus spp, enterococos, Leuconostoc spp. En lonchas, empaquetado Prensado, con especias Streptococcus faecium, Enlatado Enterococos Lactobacillus heterofermentativos, Leuconostoc spp. (Fuente Autor) Los Lactobacilos, constituyen la microflora dominante en los embutidos con fermentación espontánea. Su actuación está limitada a la cantidad de azúcar que consumen, por eso se debe adicionar un agregado en cantidad adecuada a la masa para garantizar un rápido y correcto pH final en el producto. A los lactobacilos se les debe también importantes funciones en el proceso de maduración y conservabilidad del producto. Son los agentes de la fermentación láctica de los azucares y como consecuencia aumentan la acidez o bajan el pH, determinado la coagulación de las proteínas, la contribución a la formación del color y a la estabilidad del producto desde el punto de vista microbiológico. En definitiva, el principal papel de las BAL en la industria cárnica es contribuir con la rápida acidificación de estos productos y aportar componentes aromáticos y propiedades texturales. 5. Cultivos estárter para la industria láctea. La industria láctea durante siglos ha aprovechado la utilidad de distintos grupos de microorganismos (bacterias, mohos, levaduras) para la obtención de diversos subproductos fermentados, como prueba de ello encontramos entre otros a los quesos, yogures y mezclas de leches y granos fermentados. La principal aplicación de las BAL como cultivos iniciadores en la industria láctea ha sido para la obtención de yogurt y diversos quesos madurados. Yogurt: Durante la preparación de este derivado lácteo se emplea una mezcla de cepas termófilas de Streptococcus salivarius sbsp. thermophilus (denominado S. thermophilus) y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (denominado L. bulgaricus). La fermentación se lleva a cabo a 45ºC y se considera que esta etapa termina una vez que el pH de los yogures alcanza un valor por debajo de 4,6 (aproximadamente el 1% de acidez expresada como % de ácido láctico). El tiempo de fermentación es aproximadamente entre 2 y 4 horas, pero no es un valor fijo sino que varia constantemente. Esto se debe a que el metabolismo de las bacterias lácticas depende de muchos factores como las características físico-químicas de la leche, la presencia de sustancias contaminantes que interfieran en la fermentación, la calidad del cultivo usado (entre 0,5 y 5%), entre otros. A nivel industrial la fermentación de la lactosa sigue una única vía metabólica: ß-D-galactosidasa ß-D-galactosa Vía glicolítica Lactosa D-glucosa Ác. pirúvico Ác. láctico Figura 3. Ruta metabólica durante la fermentación industrial de la leche para obtención de yogurt. En la tabla 3 puede observarse mas detalles de la fermentación de la leche para obtención de yogurt. La interacción entre las dos cepas empleadas es de tipo sinergista, ya que el desarrollo de los lactobacilos favorece el crecimiento de los estreptococos y viceversa. La leche contiene aminoácidos y proteínas utilizables en cantidades limitadas, una vez agotadas estas, gracias a la acción de las proteasas de los lactobacilos se liberan a partir de las proteínas de la leche pequeños péptidos que son metabolizados hasta aminoácidos, de esta forma el estreptococo puede continuar con el crecimiento. De las dos especies empleadas en la elaboración de yogurt, los lactobacilos son los únicos que poseen estas proteasas. Por otra parte, el crecimiento de los lactobacilos se ve estimulado por diversos compuestos producidos por el estreptococo, en particular el ácido fórmico, el CO2 y el ácido pirúvico. Dependiendo del lugar donde se lleve a cabo la fermentación se puede obtener un yogurt de consistencia sólida o firme (si la fermentación se lleva a cabo en el recipiente destinado a la comercialización) o como yogurt batido (si se lleva a cabo en tanques de fermentación); de todas formas el proceso de fermentación en cuales quiera de los dos casos es idéntico. Durante la fermentación de la leche tiene lugar un marcado descenso del pH que desestabiliza las micelas de caseína suspendidas en la fase acuosa, como resultado de la liberación de las sales de calcio (fosfatos y citratos), lo que da lugar a la formación del gel. El proceso de fermentación se detiene enfriando bien los envases (yogurt sólido) o en su defecto el yogurt líquido previa agitación (yogurt batido). Tabla 3. Características de la fermentación del yogurt (Tomado de Hermier y Accolas, 1995). Agentes de la fermentación Streptococcus salivarius sbsp. Thermophilus Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus Productos de la fermentación Principal: Ácido láctico L(+) y D(-) Secundarios: Acetaldehído Acetona Acetoína Diacetilo Glucanos Objetivos de la fermentación Principal: formación de un gel por descenso del pH (Ácido láctico) Secundarios: sabor ácido, consistencia, formación de productos del aroma. Quesos: Para la obtención de quesos debe lograrse la coagulación de la caseína, para tal fin se emplea de forma normal la adición de cuajo natural (renina) o sintético (enzimas), obteniendo de esta forma una cuajada húmeda, gelatinosa, muy impermeable, que se desuera por calentamiento (queso de pasta cocida), por prensado (quesos de pasta prensada) o cortándola. Pero en algunas ocasiones suele usarse a las BAL como cultivos iniciadores o el ácido láctico producido por estas, lo que da lugar a una cuajada frágil, compacta, muy friable, permeable y de la que se separa fácilmente el suero. Dentro de las muchas formas de clasificación de los quesos (frescos, curados, semi-curados, de pasta blanda, pasta prensada no cocida o semi-cocida, pasta azul, etc.) es claro que un conjunto de BAL intervienen en su elaboración. En la tabla 4 se presenta un resumen de algunos tipos de quesos y las BAL implicadas en su elaboración. El mecanismo de la fermentación de la lactosa es prácticamente el mismo descrito para el yogurt, con excepción de los productos secundarios obtenidos debido al tipo de cultivo empleado. Lo que está claro es que durante la elaboración de estos quesos suelen intervenir más de un grupo de organismos empleados como cultivos estárter: BAL, bacterias propiónicas, mohos, levaduras. En cuanto a las BAL estas pueden ser homofermentativas (producción de ácido láctico) como los Streptococcus, o heterofermentativas (ácido láctico, ácido acético, etanol) como Leuconostoc y Betabacterium. En cuanto a los estreptococos las especies Streptococcus lactis y Streptococcus cremoris son esencialmente acidificantes, mientras que Streptococcus diacetylactis es más aromatizante; por su parte Leuconostoc también es acidificante (L. lactis) y aromatizante (L. cremoris). En síntesis, las BAL empleadas en la industria lechera pertenecen a las familias Streptococcaceae y Lactobacillaceae, aunque también se pueden emplear bacterias productoras de ácido láctico en menor cuantía como Propiobacterium (productor de ácido propiónico y ácido acético, y en menor cuantía de ácido isovalérico, fórmico, succínico y láctico). A pesar de su utilidad, las BAL también suelen causar defectos en tanto en la leche (Yogurt) como en los quesos. Los principales defectos se relacionan con el sabor (ácido, amargo, malta), textura, olor y color, en el primer caso se debe a la producción excesiva de ácido láctico, péptidos y aldehídos, respectivamente; con relación a los defectos de textura se deben principalmente por la formación de CO2 y polisacáridos; el olor puede verse afectado por la formación de aldehídos (malta), ésteres (afrutados) o productos de la proteólisis (putrefacción y olor a fenol), y en cuanto al color pueden aparecer puntos de oxidación o manchas rosadas causada por la presencia de lactobacilos pigmentados o como resultado de procesos oxidativos. Tabla 4. Algunos ejemplos de tipos de quesos y los cultivos lácticos empleados en su elaboración. (Adaptada de Larpent, 1995c; http://www.ffyb.uba.ar, 2006). Tipo de queso Cultivo BAL empleado Cottage Quesos frescos Petit-Suisse Baby-Swiss o Camembert Nata Quesos de pasta blanda Brie Limburger duro) Lactococcus spp., Str. thermophilus. (semi- Cheddar Edam Quesos de pasta dura prensada semi- o no cocida. Gouda Emmental Parmesano Roquefort Stilton Quesos de pasta azul Queso Azul Danés Gorgonzola Provolone Quesos de pasta filata Mozzarella Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris. Predominante: Str. thermophilus, Pequeña cantidad: Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus, Lb. Lactis, Opcional: Lactococcus spp. Str. cremoris, Str. lactis, Str. diacetylactis, Leuconostoc spp. Str. cremoris, Str. lactis, Str. diacetylactis, Leuconostoc spp. Str. cremoris, Str. lactis, Str. Leuconostoc spp, Str. Lactococcus spp, B. linens. Str. cremoris, Str. lactis, Str. Lactococcus spp. Str. cremoris, Str. lactis, Str. Leuconostoc spp., Lactococcus lactis biovar diacetylactis Str. cremoris, Str. lactis, Str. Leuconostoc spp., Lactococcus lactis biovar diacetylactis diacetylactis, thermophilus, diacetylactis, diacetylactis, lactis subsp. diacetylactis, lactis subsp. Lb. bulgaricus (o Lb. lactis o Lb. helveticus), Str. thermophilus. Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus o Lb. helveticus, Leuconostoc spp, Str. diacetylactis. Opcional: Lactococcus lactis. Leuconostoc spp, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Leuconostoc spp, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Leuconostoc spp, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Leuconostoc spp, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Str. cremoris, Str. lactis, Str. diacetylactis, Lb. bulgaricus, Str. thermophilus. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus o Lactobacillus helveticus, Str. thermophilus. 6. Cultivos estárter para la industria de conservas vegetales y cereales. La conservación de alimentos mediante la fermentación láctica es una tradición que se remonta a la Antigüedad. El consumo de vegetales y cereales fermentados en importante en los países asiáticos -principalmente los obtenidos de la fermentación de la soja: leche y quesos, miso, salsa de soja “shoyu, kecap, chiang-yiu, kanjang”, sufu, natto, tofu, tempeh (Gauthier y col., 1995)- y en menor medida en Europa y América, donde únicamente las coles –Sauerkräut-, pepinillos y aceitunas son fermentados en cantidades importantes (Guern, 1995). En el caso de los cereales las fermentaciones son llevadas a cabos en la mayoría de los casos por las especies de mohos Aspergillus oryzae y Rhizopus oryzae, y en menor medida por las BAL (leche, miso y salsas), otras bacterias y levaduras. La producción de cultivos estárter para la industria de conservas vegetales no se encuentra masificada, por diversos factores destacando entre otras la poca difusión y aceptabilidad de algunos de estos productos en mercados occidentales, además, si la fermentación de estos vegetales se desarrolla en forma correcta, durante el transcurso de la misma las BAL implicadas en la fermentación aparecen en la mayoría de los casos de forma natural, es decir, sin la adición de cultivos iniciadores. La fermentación láctica de los vegetales es un proceso microbiano complejo que conduce al dominio de la flora láctica, poco importante en la microflora inicial. Las BAL eliminan producto de la acidificación por una parte a los microorganismos responsables de la alteración (principalmente bacterias gram negativas y bacterias esporuladas), y por otro lado a las o sus enzimas pectinolíticos responsables de las putrefacciones blandas. La evolución de la microbiota está controlada por numerosos factores físicos y químicos y la puesta en salmuera inicial de los vegetales es un elemento muy importante. El desarrollo de la fermentación de los vegetales se da en cuatro etapas tal y como se muestra en la figura 4., pero a nivel industrial solo son deseables las dos primeras: el inicio de la fermentación y la fermentación primaria que es llevada a cabo directamente por las BAL y en menor medida por levaduras. Las bacterias lácticas que predominan en la fase de iniciación y la fermentación primaria por orden creciente de tolerancia al ácido: Streptococcus faecalis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum. Las dos primeras especies no soportan bien la sal, ni la acidificación, y tienen poca importancia en salmueras con más de un 5% de NaCl. Lactobacillus plantarum es el más ácidotolerante, y es el que finaliza la mayor parte de las fermentaciones en los vegetales. Por otro lado Pediococcus rhamnosus y Pediococcus cerevisiae también suelen estar implicados en la fermentación de los vegetales. Como se ha mencionado antes, el uso de cultivos estárter para esta actividad industrial se encuentra poco explotada a pesar de que se hayan estudiado aproximadamente desde 1930. De todas formas la puesta a punto de nuevos productos vegetales fermentados es posible y queda como un campo de investigación y desarrollo para futuras generaciones. Inicio Biota diversa Gram positiva y negativa Fermentación primaria BAL - levaduras Fermentación secundaria Levaduras Crecimiento superficial de levaduras o mohos oxidativos en anaerobiosis defectuosa Figura 4. Sucesión de etapas y especies microbianas durante la fermentación natural de los Post-fermentación vegetales. (Tomado de Guern, 1995). 7. Bibliografía Axelsson, L.T. (1993). Lactic acid bacteria: Classification and physiology. In: Salminen, S. and von Wright, A. (Eds.), Lactic acid bacteria. 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