GUIA DE PRÁCTICAS LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

GUIA DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
ESCUELA DE ENFERMERIA
PERIODO 2014-2015
SEGUNDO SEMESTRE 201520
ANA GABRIELA CARDENAS
PRACTICA No. 1
PRINCIPOS BASICOS DE MICROBIOLOGIA MÉDICA
OBJETIVOS:
Conocer que es un laboratorio de microbiología médica, como actuar, trabajar y utilizar los implementos
suministrados.
1. INTRODUCCION:
La microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos, seres vivos muy pequeños que
están por debajo del poder resolutivo del ojo humano.
Las bacterias representan más del 90% de todo el material vivo de la Tierra.
Para conseguir su multiplicación en el laboratorio es preciso aportar determinados nutrientes y
condiciones ambientales para cada tipo particular.
2. NORMAS DE BIOSEGURIDAD:
 Leer manual anexo.
 Establecer normas internas y consensos generales.
3. MATERIALES DE LABORATORIO:
Identificar los materiales y equipos útiles en el laboratorio de microbiología.
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

De acuerdo a la práctica introductoria establezca 8 normas de bioseguridad aplicables al
laboratorio de microbiología.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Describa 5 materiales o equipos utilizados en el laboratorio de microbiología, indicar el tipo
de uso que tiene cada uno.
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5. BIBLIOGRAFIA:
 Organización mundial de la salud, Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, Ginebra, OMS,
2005.
 Universidad de Alicante, Facultad de Ciencias, Manual de Supervivencia en el Laboratorio
(monografía
en
línea),
España,
1999,
disponible
enlinea:
http://www.ua.es/centros/ciencias/seguridad/hab_seg_lab_biol.htm

Gamazo Carlos, Microbiología basada en la experimentación, Primera edición, España 2013
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
SESIONES
PRÁCTICA No:2
1
TEMA: MICROSCOPIA BASICA
1.- OBJETIVO
Determinar que es una tinción de Gram, como se realiza y su utilidad clínica.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Manejar correctamente el microscopio óptico y realizar tinciones bacterianas
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Cinco vasos de precipitación.
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Papel flitro
Mecheros de bunsen
Incubadoras.
Pipetas pasteur
12 pares de guantes.
Microscopios
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
PERIODO:
2015-1
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal
que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La
principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el
contraste
es
la
utilización
de
colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las
células para la microscopía, son suficientes los
procedimientos que usan un solo colorante llamado de
tinción simple. Sin embargo, a menudo se utilizan métodos
que no tiñen de igual modo todas las células, es el proceso
denominado tinción diferencial. Uno muy usado en
microbiología es la tinción Gram. Basándose en su reacción
a la tinción Gram, las bacterías pueden dividirse en dos
grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tinción tiene
gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica
diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.
Mientras que las bacterias gramnegativas son constantes en su reacción, los
microorganismos grampositivos pueden presentar respuestas variables en
ciertas condiciones (son gramlábiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas
bacterias grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en
consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como gramnegativas.
Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo,
o por ligeras modificaciones en la ejecución de la técnica. Por este motivo, es
preciso atenerse,
en la práctica,
al procedimiento establecido.
Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias
hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los
microorganismos.
Pared Gram +
capa densa y uniforme de 200 a 800 A)
ácidos teicoicos
Polisacáridos
proteínas (pocas veces)
glicopéptido (50% del peso seco)
Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta
por capas externas de densidad menor)
Lipopolisacáridos
Lipoproteínas
Proteínas
glicopéptido (10% del peso seco)
El mecanismo de la tinción Gram es el siguiente:
GRAM +
GRAM -
1) Cristal
violeta
Células color violeta
2) Lugol
solución
iodada
Se forma el complejo CV-I.
Se forma el complejo CV-I. Las
Las células continúan teñidas células continúan teñidas de
de color violeta.
color violeta.
3) Alcohol
Se deshidratan las paredes
Eliminación por extracción de
celulares. Se contraen los
grasas de las paredes
poros. Disminuye la
celulares. Aumenta la
permeabilidad. El complejo
porosidad. El complejo CV-I se
CV-I no sale de las células quesepara de la célula.
continúan teñidas de color
violeta.
4) Safranina Células no decoloradas;
quedan teñidas de color
violeta.
Células color violeta
Células decoloradas; se tiñen
de color rosado.
DESCRIPCION DE LA ACTIVIDAD:
1. COLORACION:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña
de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
2. OBSERVACION:
Debe utilizarse el objetivo de inmersión.
Se coloca una gota de aceite de sobre la preparación. Se enfoca, preferentemente, con
el micrométrico.
Después de utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol
3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
Anotar los hallazgos importantes y realizar el informe.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Practicas de Microbiologia General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
1. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
2. ¿Qué forma tienen las bacterias observadas?
3. ¿Las bacterias aparecen aisladas o agrupadas? En caso de que aparezcan
agrupadas indicar el tipo de asociación. Indica tipo de Gram.
4. Como son aplicables estos conocimientos en su profesión?
5. Investigue 3 tipos de tinción para bacteriología, exceptuando la de Gram, como se
realizan y para que microorganismos son aplicables.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2015-1
SESIONES
PRÁCTICA No:3
1
TEMA: CULTIVOS Y SIEMBRAS
1.- OBJETIVO
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de medios de cultivo, métodos de
siembra y técnicas anexas para identificación microbiana. Que obtenga la información
básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
1. Realizar siembras microbiológicas
2. Entender que es un medio de cultivo y su uso adecuado
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Muestras de orina, secreción faríngea y nasal.
-Cultivos de bacterias en agar.
-Agares solidos ( Mac Conkey, Sangre, Chocolate, Saboroud).
-Agares líquidos(BHI, Tioglicolato).
-Asas calibradas y no calibradas(plástico y vidrio).
-Incubadora.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el
crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de
Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han añadido las substancias que necesitan
los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se
añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras
bacterias que podrían contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos
de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para
los microorganismos.
A continuación se procede a la "incubación" del medio ya sembrado. En cada caso se
hace en condiciones particulares de presión de oxígeno, temperatura, agitación,
duración, etc. Muchas de las bacterias patógenas crecen bien a temperaturas cercanas
a los 37ºC habituales de nuestro organismo.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
SIEMBRA DE MUESTRAS DE ORINA
a) Encender el mechero, para crear un ambiente aseptico.
b) Colocarse guantes y material de bioseguidad.
c) Esterilizar el asa metalica al rojo vivo y enfriarla en una esquina del agar o sobre
la muestra.
d) Introducir el asa estéril en la orina, colectar una gota exacta.
e) Inocular en el agar.
f) Estriar por agotamiento y para contaje semicuantitativo.
g) Incubar boca abajo las cajas Petri a 37 oC.
h) Leer los cultivos a las 24 y 48 horas.
SIEMBRA DE MUESTRAS FARINGEAS
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Encender el mechero, para crear un ambiente aseptico.
Colocarse guantes y material de bioseguidad.
Extraer el hisopo esteril y realizar un inoculo en la esquina del agar.
Inocular en el agar.
Estriar por agotamiento y picar el agar sangre
Incubar boca abajo las cajas Petri a 37 oC.
Leer cultivos a las 24 y 48 horas.
SIEMBRA DE CAJA CON CULTIVO A MEDIOS SOLIDOS Y LIQUIDOS.
a) Encender el mechero, para crear un ambiente aseptico.
b) Colocarse guantes y material de bioseguidad.
c) Esterilizar el asa metalica al rojo vivo y enfriarla en una esquina del agar o sobre
la muestra.
d) Colectar una o un grupo de colonias de las mismas características.
e) Estriar por agotamiento y picar el agar sangre
f) Incubar boca abajo las cajas Petri a 37 oC.
g) Leer cultivos a las 24 y 48 horas.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
Anotar los hallazgos importantes y realizar el informe.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Practicas de Microbiologia General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
1. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
2. Describa los resultados obtenidos.
3. Como son aplicables estos conocimientos en su profesión?
4. Señale 8 medios de cultivos sólidos y 3 líquidos, sus aplicaciones y su composición.
5. Describa las formas de incubación, que son ambientes aerofilicos y anaerofilicos, según
las temperaturas en que se pueden clasificar los microorganismos.
6. Que es una siembra en profundidad, como se realiza.
7. Anotar bibliografía.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
SESIONES
PRÁCTICA No:2
1
TEMA: MICROSCOPIA BASICA
1.- OBJETIVO
Determinar que es una tinción de Gram, como se realiza y su utilidad clínica.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Manejar correctamente el microscopio óptico y realizar tinciones bacterianas
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Cinco vasos de precipitación.
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Papel flitro
Mecheros de bunsen
Incubadoras.
Pipetas pasteur
12 pares de guantes.
Microscopios
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
PERIODO:
2015-1
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal
que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La
principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el
contraste
es
la
utilización
de
colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las
células para la microscopía, son suficientes los
procedimientos que usan un solo colorante llamado de
tinción simple. Sin embargo, a menudo se utilizan métodos
que no tiñen de igual modo todas las células, es el proceso
denominado tinción diferencial. Uno muy usado en
microbiología es la tinción Gram. Basándose en su reacción
a la tinción Gram, las bacterías pueden dividirse en dos
grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tinción tiene
gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica
diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.
Mientras que las bacterias gramnegativas son constantes en su reacción, los
microorganismos grampositivos pueden presentar respuestas variables en
ciertas condiciones (son gramlábiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas
bacterias grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en
consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como gramnegativas.
Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo,
o por ligeras modificaciones en la ejecución de la técnica. Por este motivo, es
preciso atenerse,
en la práctica,
al procedimiento establecido.
Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias
hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los
microorganismos.
Pared Gram +
capa densa y uniforme de 200 a 800 A)
ácidos teicoicos
Polisacáridos
proteínas (pocas veces)
glicopéptido (50% del peso seco)
Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta
por capas externas de densidad menor)
Lipopolisacáridos
Lipoproteínas
Proteínas
glicopéptido (10% del peso seco)
El mecanismo de la tinción Gram es el siguiente:
GRAM +
GRAM -
1) Cristal
violeta
Células color violeta
2) Lugol
solución
iodada
Se forma el complejo CV-I.
Se forma el complejo CV-I. Las
Las células continúan teñidas células continúan teñidas de
de color violeta.
color violeta.
3) Alcohol
Se deshidratan las paredes
Eliminación por extracción de
celulares. Se contraen los
grasas de las paredes
poros. Disminuye la
celulares. Aumenta la
permeabilidad. El complejo
porosidad. El complejo CV-I se
CV-I no sale de las células quesepara de la célula.
continúan teñidas de color
violeta.
4) Safranina Células no decoloradas;
quedan teñidas de color
violeta.
Células color violeta
Células decoloradas; se tiñen
de color rosado.
DESCRIPCION DE LA ACTIVIDAD:
4. COLORACION:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña
de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
5. OBSERVACION:
Debe utilizarse el objetivo de inmersión.
Se coloca una gota de aceite de sobre la preparación. Se enfoca, preferentemente, con
el micrométrico.
Después de utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
Anotar los hallazgos importantes y realizar el informe.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Practicas de Microbiologia General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
6. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
7. ¿Qué forma tienen las bacterias observadas?
8. ¿Las bacterias aparecen aisladas o agrupadas? En caso de que aparezcan
agrupadas indicar el tipo de asociación. Indica tipo de Gram.
9. Como son aplicables estos conocimientos en su profesión?
10. Investigue 3 tipos de tinción para bacteriología, exceptuando la de Gram, como se
realizan y para que microorganismos son aplicables.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2015-1
SESIONES
PRÁCTICA No:3
1
TEMA: CULTIVOS Y SIEMBRAS
1.- OBJETIVO
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de medios de cultivo, métodos de
siembra y técnicas anexas para identificación microbiana. Que obtenga la información
básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
3. Realizar siembras microbiológicas
4. Entender que es un medio de cultivo y su uso adecuado
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Muestras de orina, secreción faríngea y nasal.
-Cultivos de bacterias en agar.
-Agares solidos ( Mac Conkey, Sangre, Chocolate, Saboroud).
-Agares líquidos(BHI, Tioglicolato).
-Asas calibradas y no calibradas(plástico y vidrio).
-Incubadora.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el
crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de
Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han añadido las substancias que necesitan
los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se
añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras
bacterias que podrían contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos
de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para
los microorganismos.
A continuación se procede a la "incubación" del medio ya sembrado. En cada caso se
hace en condiciones particulares de presión de oxígeno, temperatura, agitación,
duración, etc. Muchas de las bacterias patógenas crecen bien a temperaturas cercanas
a los 37ºC habituales de nuestro organismo.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
SIEMBRA DE MUESTRAS DE ORINA
i) Encender el mechero, para crear un ambiente aseptico.
j) Colocarse guantes y material de bioseguidad.
k) Esterilizar el asa metalica al rojo vivo y enfriarla en una esquina del agar o sobre
la muestra.
l) Introducir el asa estéril en la orina, colectar una gota exacta.
m) Inocular en el agar.
n) Estriar por agotamiento y para contaje semicuantitativo.
o) Incubar boca abajo las cajas Petri a 37 oC.
p) Leer los cultivos a las 24 y 48 horas.
SIEMBRA DE MUESTRAS FARINGEAS
h)
i)
j)
k)
l)
m)
n)
Encender el mechero, para crear un ambiente aseptico.
Colocarse guantes y material de bioseguidad.
Extraer el hisopo esteril y realizar un inoculo en la esquina del agar.
Inocular en el agar.
Estriar por agotamiento y picar el agar sangre
Incubar boca abajo las cajas Petri a 37 oC.
Leer cultivos a las 24 y 48 horas.
SIEMBRA DE CAJA CON CULTIVO A MEDIOS SOLIDOS Y LIQUIDOS.
h) Encender el mechero, para crear un ambiente aseptico.
i) Colocarse guantes y material de bioseguidad.
j) Esterilizar el asa metalica al rojo vivo y enfriarla en una esquina del agar o sobre
la muestra.
k) Colectar una o un grupo de colonias de las mismas características.
l) Estriar por agotamiento y picar el agar sangre
m) Incubar boca abajo las cajas Petri a 37 oC.
n) Leer cultivos a las 24 y 48 horas.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
Anotar los hallazgos importantes y realizar el informe.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Practicas de Microbiologia General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
8. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
9. Describa los resultados obtenidos.
10. Como son aplicables estos conocimientos en su profesión?
11. Señale 8 medios de cultivos sólidos y 3 líquidos, sus aplicaciones y su composición.
12. Describa las formas de incubación, que son ambientes aerofilicos y anaerofilicos, según
las temperaturas en que se pueden clasificar los microorganismos.
13. Que es una siembra en profundidad, como se realiza.
14. Anotar bibliografía.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
SESIONES
Fecha:
2014/09/29
PRÁCTICA No: 4
1
TEMA: TINCIONES SIMPLES Y DIFERENCIALES
1.- OBJETIVO
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más
utilizadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos. Que obtenga la
información básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
5. Realizar pruebas para identificar estructuras básicas de las bacterias.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Cinco vasos de precipitación.
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Papel flitro
Mecheros de bunsen
Incubadoras.
Pipetas pasteur
12 pares de guantes.
REACTIVOS:
Azul de metileno
Verde de malaquita
Safranina
Acido fosfomolíbdico
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
PERIODO:
2014-1
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
PARED CELULAR
Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas mucosas y
externas a la membrana citoplasmática está la pared celular que es una estructura muy rígida y
que da forma a la célula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo
algunas paredes celulares son considerablemente más gruesas.
Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la división. Todas
las bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a la célula de explotar en medios
de baja presión osmótica.
Composición química de las paredes celulares.- Los peptidoglicanos proporcionan a la
pared celular una estructura rígida. Estos grandes polímeros, están compuestos de tres clases
de bloques estructurales: N- Acetil-Glucosamina, Ácido N- Acetil-Murámico y un péptido que
consta de cuatro o cinco aminoácidos que son: L- alanina, D-Alanina, _D-Ácido Glutámico y
Lisina. Además contiene proteínas con polisacáridos, lipoproteínas y lipopolisacáridos
Propiedades y Funciones:
1. Brinda protección y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios
de presión osmótica del medio en el que se encuentra y a la acción de ciertos agentes
externos.
2. Presenta Poros que actúan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos
esenciales.
3. Presenta antígenos de tipo y grupo específicos.
4. Participa en la división (multiplicación) bacteriana (se invagina junto con la membrana
plasmática).
5. En las bacterias Gram. negativas tiene poder patógeno debido a que presenta
endotoxinas (Lípido A).
6. Es el sustrato donde actúan los  - Lactámicos y otros antimicrobianos.
La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos
citoplasmáticos se pueden hidrolizar diferencialmente con ácido fosfomolíbdico, dejando la
pared sin afectar. Después de teñir se puede observar la pared celular con citoplasma como
ahuecado.
ESPORAS
Son elementos de reproducción y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas
bacterias, especialmente del género bacilar. Su forma, tamaño y ubicación varía según la
especie. Estos cuerpos son producidos en el último estadío del crecimiento celular, que bajo
condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de célula en crecimiento o
vegetativa.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
Preparación de frotis.
A. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
B. Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar
enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son de
cultivos sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
C. Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la boca e
introducir el asa para tomar la muestra.
D. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en área circular de
más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire.
D. En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se realiza
el mismo procedimiento antes descrito.
E. fijar por calor
A) TINCIÓN DE LA PARED CELULAR
1.- Prepara un frotis húmedo relativamente concentrado de Bacillus Suptillus sobre un
portaobjetos limpio . NO LO FIJES A LA FLAMA.
2.-Antes de que la suspensión bacteriana se seque sobre el portaobjetos, adiciónale la solución
del ácido fosfomolíbdico cubriéndola por completo.
3.- Déjalo reaccionar 4 minutos.
4.- Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar totalmente el ácido
fosfomolíbdico
5.-Agrega el azul de metilo directamente sobre el frotis húmedo y déjalo reaccionar 5 minutos.
6.- Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se
desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lava bien,
hasta que el agua ya no arrastre colorante.
7.- Seca al aire y después examina con aceite de inmersión
8.- Si se tiñó correctamente, las paredes celulares aparecerán de verde oscuro o azul, mientras
que el citoplasma se verá de un verde claro o incoloro.
B) TINCION SIMPLE
1. Cubrir el frotis de Candida albicans y de la muestra problema con 1 gota de azul de metileno
durante 60 segundos.
2. Eliminar el exceso de colorante con la piceta de agua destilada y dejar secar al aire.
C) TINCION SELECTIVA DE ENDOESPORAS
1. Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre un frotis de Bacillus sp.
2. Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.
3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.
4. Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más, si es
necesario).
5. Eliminar el colorante con agua destilada y cubrir con safranina durante 30 segundos.
6. Lavar nuevamente, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.
Observación al microscopio.
1. Limpiar con precaución los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación (iluminación Köhler), siguiendo
las indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X,
después pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X colocar previamente una
pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Practicas de Microbiologia General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacte rias.
2.-¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos de las paredes celulares?
3. ¿Qué característica y que color tiñeron las paredes celulares de las bacterias que lograste
observar?
4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas
5.- Describe dos diferencias para distinguir a una endospora de una exospora
6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las distintas muestras
microbiológicas?
7.- Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2014-1
SESIONES
PRÁCTICA No:5
1
TEMA: METABOLISMO Y MOVIMIENTO BACTERIANO
1.- OBJETIVO
Que el alumno observe micro y macroscópicamente la movilidad de bacterias (Proteus)
así como la influencia de antibióticos en su movilidad.
Determinar el metabolismo bacteriano mediante el uso de agares específicos y
descriptivos como es el TSI.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
6. Observar motilidad y uso de sustratos de las bacterias, gracias al uso de
técnicas sencillas.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Cultivo liquido de Proteus mirabilis
Placas porta y cubre objetos
Hisopos estériles
Agar Sangre
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
15 discos de Azitromicina
15 discos de Eritromicina
Caldos BHI
Mecheros de bunsen
Incubadoras
Pipetas pasteur
Guantes
Tubos con agar TSI.
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
MOVIMIENTO BACTERIANO
Algunas bacterias son inmóviles y otras limitan su movimiento a cambios de profundidad. Por
ejemplo, cianobacterias y bacterias verdes del azufre contienen vesículas de gas con las que
pueden controlar su flotabilidad y así conseguir un óptimo de luz y alimento.94 Las bacterias
móviles pueden desplazarse por deslizamiento, mediante contracciones o más comúnmente
usando flagelos. Algunas bacterias pueden deslizarse por superficies sólidas segregando una
sustancia viscosa, pero el mecanismo que actúa como propulsor es todavía desconocido. En el
movimiento mediante contracciones, la bacteria usa su pilus de tipo IV como gancho de ataque,
primero lo extiende, anclándolo y después lo contrae con una fuerza notable.
El flagelo bacteriano es un largo apéndice filamentoso helicoidal propulsado por
un motor rotatorio (como una hélice) que puede girar en los dos sentidos. El motor utiliza como
energía un gradiente electroquímico a través de la membrana. Los flagelos están compuestos
por cerca de 20 proteínas, con aproximadamente otras 30 proteínas para su regulación
y coordinación.94 Hay que tener en cuenta que, dado el tamaño de la bacteria, el agua les
resulta muy viscosa y el mecanismo de propulsión debe ser muy potente y eficiente. Los
flagelos bacterianos se encuentran tanto en las bacterias Gran-positivas como Gran-negativas
y son completamente diferentes de los eucarióticos y, aunque son superficialmente similares a
los arquéanos, se consideran no homólogos.
1- filamento
2- espacio periplásmico
3- codo
4- juntura
5- anillo L
6- eje
7- anillo P,
8- pared celular
9- estator
10- anillo MS
11- anillo C
12- sistema de secreción de tipo III
13- membrana externa
14- membrana citoplasmática
15- punta.
Según el número y disposición de los flagelos en la superficie de la bacteria se distinguen los
siguientes tipos: un solo flagelo (monotrico), un flagelo en cada extremo (anfitrico), grupos de
flagelos en uno o en los dos extremos (lofotrico) y flagelos distribuidos sobre toda la superficie
de la célula (peritricos). En un grupo único de bacterias, las espiroquetas, se presentan unos
flagelos especializados, denominados filamentos axiales, localizados intracelularmente en el
espacio periplásmico, entre las dos membranas. Estos producen un movimiento rotatorio que
hace que la bacteria gire como un sacacorchos desplazándose hacia delante.
Muchas bacterias tienen dos tipos de movimiento: en línea recta (carrera) y aleatorio. En este
último, se realiza un movimiento tridimensional aleatorio al combinar la bacteria carreras cortas
con virajes al azar. Las bacterias móviles pueden presentar movimientos de atracción o
repulsión determinados por diferentes estímulos. Estos comportamientos son denominados
taxis, e incluyen diversos tipos como la quimiotaxis, la fototaxis o la magnetotaxis. En el
peculiar grupo de las mixobacterias, las células individuales se mueven juntas
formando ondas de células, que terminarán agregándose para formar los cuerpos fructíferos
característicos de este género.
METABOLISMO BACTERIANO:
El metabolismo microbiano es el conjunto de procesos por los cuales un microorganismo obtiene
la energía y los nutrientes (carbono, por ejemplo) que necesita para vivir y reproducirse. Los
microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies
pueden a menudo distinguirse en función de estas estrategias. Las características metabólicas
específicas de un microorganismo constituyen el principal criterio para determinar su papel
ecológico, su responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos
industriales.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
Observación macroscópica de la movilidad:


Con una pipeta Pasteur o una micropipeta se añaden unas gotas de cultivo bacteriano
en un portaobjetos y se coloca un portaobjetos.
Observar directamente al microscopio con lente de 40x.
Cultivo bacteriano:




Anadir inoculo de Proteus(2-5 ul)en el centro de una placa de agar sangre.
Dejar que la gota se absorba.
Colocar los discos con antibióticos en los extremos de la placa.
Incubar durante 24 hrs a 370C.
Realizar tinción de Gram de las zonas de ondulaciones y de la zona de interondas para
comparar la morfología bacteriana.
Control de Inhibición:


Para asegurarnos de que la inhibición del fenómeno swarming es específica y no se
debe a una inhibición del crecimiento realizaremos un antibiograma con los discos
impregnados de antibiótico.
Sembrar en césped el cultivo de Proteus.


Colocar los discos.
Incubar durante 24 hrs. a 370C.
METABOLISMO BACTERIANO:


Tomar un inoculo del cultivo liquido de Proteus y sembrarlo tanto en profundidad
como en superficie en el TSI.
Incubar durante 24 hrs a 370C.
Observaciones:
Anotar los resultados, tanto de inhibición, swarming, observación macroscópica, tinción
de Gram y metabolismo bacteriano.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS



Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
Universidad de Alicante, Facultad de Ciencias, Manual de Supervivencia en el Laboratorio
(monografía en línea), España, 1999, disponible en linea:
http://www.ua.es/centros/ciencias/seguridad/hab_seg_lab_biol.htm
Gamazo Carlos, Microbiología basada en la experimentación, Primera edición, España 2013
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
1. Grafique los resultados obtenidos en la parte experimental de movimiento bacteriano y
metabolismo bacteriano.
2. Describa 3 tipos de movimientos bacterianos naturales además del swarming, como se
realizan y en que tipo de bacterias se producen.
3. Según el metabolismo bacteriano en que se pueden dividir las bacterias.
4. Que es la fermentación, puntualice 2 ejemplos.
5. En que consiste la fijación del nitrógeno.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2014-1
SESIONES
F
PRÁCTICA No:6
1
TEMA: FLORA NORMAL HUMANA
1.- OBJETIVO
Determinar cuáles son los microorganismos presentes en flora de secreción nasal,
secreción faríngea, piel, secreción vaginal, orina y heces.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Estableceremos cuales son los microorganismos que se encuentran normalmente en el cuerpo
humano y las secreciones que el produce.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Agar base de sangre
Agar EMB
Agar nutriente
Agar Salmonella-Shigella
Agar Saboroud
Caldo tioglicolato
Solución salina
Microscopio
incubadora
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
Microbiología de la Flora Normal Humana
La flora normal o flora indígena es una colección de organismos que se encuentra
habitualmente en el individuo sano normal y que coexisten en forma bastante pacífica en una
relación equilibrada con su huésped. La mayoría de los organismos de la flora son bacterias.
Algunos virus, hongos y protozoos pueden encontrarse habitualmente en individuos sanos,
aunque sólo constituyen un componente menor en la población total de organismos residentes.
Dibujo artístico de las diferentes morfologías bacterianas.
(Fuente: Museo Natura de San Diego)
Se ha estimado que los humanos tienen aproximadamente 10^13 células en el cuerpo y
alrededor de 10^14 bacterias asociadas a ellas, la mayoría en el intestino grueso.
Bajo ciertas circunstancias (estrés, inmunocomprometidos o en recién nacidos) pueden causar
enfermedad.
Algunos de estos organismos son beneficiosos para el huésped, y su importancia para la salud
se puede desvelar en forma bastante espectacular bajo terapia antibiótica: los antibióticos
causan una reducción drástica de la flora normal y como consecuencia el huésped puede,
quizás, ser infectado por patógenos nuevos o por crecimiento excesivo de organismos
presentes normalmente en número pequeño. Por ejemplo: la proliferación del Clostridium
difficile que sobreviene al tratamiento antibiótico con clindamicina, y que ocasiona colitis
pseudomembranosa.
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de
forma continua durante el crecimiento. Refleja la edad, la nutrición y medio ambiente del
individuo. Por ejemplo, los lactantes alimentados al pecho tienen estreptococos y lactobacilos
en su tracto gastrointestinal, mientras que los alimentados con biberón muestran una variedad
mucho mayor de organismos.
Los organismos se encuentran en las partes del cuerpo expuestas al medio ambiente o que
comunican con él (piel, nariz y boca, intestino y tracto urogenital). Los órganos y tejidos
internos son normalmente estériles.
FUNCIONES DE LA FLORA NORMAL
La flora normal previene la colonización de otras bacterias potencialmente patógenas. Lo hacen
liberando factores con actividad antibacteriana (bacteriocinas, colicinas), así como productos de
desecho metabólicos que junto con la falta de oxígeno disponible impiden el establecimiento de
otras especies. Por ejemplo, los lactobacilos les mantienen un medio ambiente ácido que
suprime el crecimiento de otros organismos.
Las bacterias intestinales liberan también ciertos factores que pueden tener algún valor
metabólico para el huésped; además producen vitaminas B y K en cantidades suficientes para
complementar una dieta deficiente. Además se cree que la estimulación antigénica
proporcionada por la flora tiene importancia para asegurar el desarrollo normal del sistema
inmunitario.
PROBLEMAS OCASIONADOS POR LA FLORA NORMAL
Existe un riesgo potencial de diseminación hacia zonas normalmente estériles del cuerpo, lo
cual puede suceder bajo diversas circunstancias, por ejemplo, cuando se perfora el intestino o
se produce una herida cutánea, durante la extracción de un diente (los Streptococos viridans
pueden entrar al torrente sanguíneo) o cuando las Escherichia coli provenientes de la piel
perianal, ascienden por la uretra y causan infección del tracto urinario.
El crecimiento excesivo de la flora normal puede producirse cuando varía la composición de la
misma, varía el medio ambiente o el sistema inmune se hace ineficaz.
FLORA DE LA PIEL
Staphilococcus (estafilococos):
epidermidis (90 % del total de gérmenes aerobios de la piel).
aureus: presente en cara y manos de “portadores nasales” de dicho germen.
Streptococcus (estreptococos).
Difteroides (corinebacterias), en folículos pilosos, glándulas sebáceas y sudoríparas.
Propionibacterium ácnes.
Micrococcus.
Candida: sobre todo en personal sanitario.
Las distintas zonas de la piel soportan floras distintas, lo que gran parte está determinado por el
grado de humedad disponible. A mayor humedad, mayor flora, ya que ésta se relaciona con las
glándulas sudoríparas.
Los Staphilococcus y el Propionibacterium producen ácidos grasos que inhiben el crecimiento
de los hongos.
El olor axilar se produce como resultado de la actividad de la flora bacteriana sobre las
secreciones de las glándulas sudoríparas apocrinas La secreción de estas glándulas tomada
de forma aséptica es inodora.
ZONAS DE LA PIEL CON MAYOR FLORA
CueRo cabelludo, cara y oído.
Axilas.
Regiones urinarias y anal.
Plantas y espacios interdigitales de los pies.
FLORA DE LA NARIZ
Staphilococcus (Estafilococos).
aureus (20 % de la población).
epidermidis.
Micrococcus.
Streptococcus (Estreptococos).
Difteroides.
FLORA DE LA CONJUNTIVA
Staphilococcus:
epidermidis.
aureus.
Streptococcus.
Propionibacterium acnes.
Haemophillus sp.
Neisserias sp.
FLORA DE LA BOCA
La cavidad oral es uno de los hábitats microbianos más complejos y heterogéneos del cuerpo.
Streptococcus del grupo viridans:
mitis.
mutans (relacionados con las caries).
sanguis.
Otros.
Otros Streptococcus no viridans.
Bacteroides.
Fusobacterium.
Actinomyces.
Trichomonas tenax.
Cándida.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias
anaerobias.
La placa es una película de células bacterianas, que se anclan en una matriz de polisacáridos
secretada por los microorganismos.
Cuando los dientes no se limpian con regularidad, la placa se puede acumular rápidamente y la
actividad de ciertas bacterias, especialmente el Streptococcus mutans, puede dar lugar a la
destrucción dental (caries). La prevalencia de caries guarda relación con la dieta.
FLORA FARINGEA
Streptococcus:
grupo viridans
S. pyogenes (Beta Hemolítico del grupo A)
S. pneumoniae (neumococo)
Staphylococcus:
epidermidis.
aureus.
Especies de Neisseria.
A veces: Neisseria meningitidis.
Haemophilus influenzae.
Algunos de los componentes de la flora en individuos sanos son potencialmente patógenos (ej:
neumococo, S. pyogenes, Haemophilus).
FLORA DEL PULMÓN
Pneumocystis carinii (en muchas personas, según algunos expertos)
El tracto respiratorio es bastante estéril en condiciones normales, a pesar de la entrada
continua de organismos con la respiración.
FLORA DE LA URETRA ANTERIOR
Staphylococcus epidermidis.
Estreptococos, sobre todo alfa hemoliticos.
Enterococcus feacalis.
En ocasiones:
Corinebacterias y bacilos gramnegativos.
En los pacientes con sondas Foley permanentes puede aparecer Cándida en la orina.
FLORA DE LA VAGINA
Experimenta cambios en su flora con la edad.
Antes de la pubertad predominan Staphilococcus, Streptococcus, Difteroides y Escherichia coli.
Luego de la pubertad predomina el Lactobacillus Aerophillus, y la fermentación del glucógeno
por esa bacteria es responsable del mantenimiento de una pH ácido, lo que evita el crecimiento
excesivo de otros organismos vaginales.
Se encuentran algunos hongos, incluyendo Cándida, que puede proliferar para causar
candidiasis si el pH vaginal aumenta y disminuyen las bacterias competidoras.
El protozoo Trichomonas vaginalis se puede hallar en mujeres sanas.
Lactobacillus
Lactobacillus y células epiteliales de la vagina (CDC).
FLORA DEL ESTOMAGO
El estómago, por su acidez, puede considerarse una barrera contra la penetración de bacterias
extrañas al tracto intestinal. La cantidad de bacterias presentes en el estómago es
generalmente baja y, en sus paredes, podemos encontrar:
Lactobacilos.
Streptococcus (Estreptococos) acidotolerantes.
Estas bacterias aparecen poco después del nacimiento, estando bien establecidas a la semana
de vida.
FLORA DEL INTESTINO DELGADO
Lactobacilos.
Estreptococos.
Enterobacterias.
Especies de bacteroides.
Candida.
En primera parte del intestino delgado, adyacente al estomago, es muy acida y se parece al
estomago en su flora normal. A medida que el pH se hace alcalino aumenta el número de
bacterias.
FLORA DEL INTESTINO GRUESO (COLON)
En el intestino grueso la gran mayoría de las bacterias son anaerobias 95 – 99 %.
Especies de Bacteroides.
Especies de Fusobacterium.
Enterococos faecalis.
Enterobacterias.
Escherichia coli.
Especies de Klebsiella.
Salmonellas.
Pseudomonas.
Eubacterias.
Bifidobacterias.
Lactobacillus.
Especies de Clostridium.
Staphilococcus aureus
Estreptococos.
Candida.
GERMENES PRESENTES EN LA MATERIA FECAL
Especies de Bacteroides.
Bifidobacterias.
Eubacterias.
Coliformes.
Enterococo feacalis.
Candida.
En el intestino existen varios protozoos inócuos que pueden ser considerados parte de la flora
normal a pesar de ser animales ej: Entamoeba coli.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
MUESTRA FARINGEA:



Tomar una muestra faríngea de su compañero de laboratorio, sin olvidar hacerlo de la
parteinterna de las amígdalas.
Sembrar en agar sangre, por agotamiento.
Incubar a 37oC por 24 horas.
MUESTRA NASAL:



Tomar una muestra nasal de su compañero de laboratorio, sin olvidar hacerlo de la
parte interna de los cornetes nasales.
Sembrar en agar sangre, por agotamiento.
Incubar a 37oC por 24 horas.
MUESTRA DE PIEL:




Tomar un hisopado de piel (antebrazo), con el aplicador un poco húmedo.
Sembrar en agar sangre, por agotamiento.
Sembrar también en caldo tioglicolato.
Incubar a 37oC por 24 horas.
MUESTRA DE ORINA:



Tomar una gota de orina con el asa calibrada y sembrarla.
Sembrar en agar sangre para recuento y en agar McConkey por agotamiento.
Incubar a 37oC por 24 horas.
MUESTRA DE HECES:




Tomar con un hisopo un poco de muestra de heces.
Sembrar en agar Salmonella-Shigella/HecktoenEnteric agar.
Incubar a 37oC por 24 horas.
Realizar una tinción de Gram.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS




Manual de Practicas de Microbiología General, AquiauhualtMa de los Angeles,
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
MIMS – PLAYFAIR – ROITT – WAKELING – WILLIAMS MOSBY / DOYMA LIBROS
PRIMERA EDICIÓN EN ESPAÑOL DE LA PRIMERA EDICIÓN EN INGLES.
COPYRIGHT (c) 1995.
THOMAS D. BROCK – BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS – LA FLORA
NORMAL DE LOS ANIMALES. CAPITULO 12.
THE NORMAL FLORA. THE BACTERIAL NORMAL FLORA. 2007. KENNETH TODAR.
UNIVERSIDAD DE WISCONSIN. DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA DE
MADISON.
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
1. Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
2. Mencione los microorgamismos más comúnmente aislados en las muestras que
analizamos en el laboratorio.
3. Del mismo tipo de muestras mencione 3 microorganismos patógenos yque tipo de
enfermedades producen.
4. Que son los prebióticos? cuales son los microorganismos involucrados?
5. Que microorrganismos pueden encontrarse en una impronta de manos? Y POR
QUE?
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
SESIONES
PRÁCTICA No:7
1
TEMA: SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA.
1.- OBJETIVO
Conocer que son los antibióticos, para que sirven, cuáles son sus mecanismos de
acción y como se realiza un antibiograma.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Estableceremos cual es la manera adecuada de realizar un antibiograma.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar Mueller-Hinton
Caldo BHI
Discos de antibióticos
Incubadora
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
PERIODO:
2014-2
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
LOS ANTIBIOTICOS
Se denomina Antibiótico (del griego, anti, 'contra'; bios, 'vida'), a cualquier compuesto químico
utilizado para eliminar o inhibir el crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad común
a todos los antibióticos es la toxicidad selectiva: la toxicidad hacia los organismos invasores es
superior a la toxicidad frente a los animales o seres humanos. La penicilina es el antibiótico
más conocido, y ha sido empleado para tratar múltiples enfermedades infecciosas, como
la sífilis, la gonorrea, el tétanos o la escarlatina. En un principio, el término antibiótico sólo se
empleaba para referirse a los compuestos orgánicos producidos por bacterias u hongos que
resultaban tóxicos para otros microorganismos. En la actualidad también se emplea para
denominar también compuestos sintéticos o semisintéticos. La principal categoría de
antibióticos son los antibacterianos, pero se incluyen los fármacos antipalúdicos, antivirales y
antiprotozoos.
Los agentes antimicrobianos pueden interferir diferentes funciones que lleva a cabo la bacteria,
tales como la síntesis de sus ácidos nucleicos, de proteínas, o para el procesamiento de
aminoácidos o azúcares del medio, necesarios para la biosíntesis de sus paredes o
membranas celulares. Las drogas antibacterianas pueden actuar en una o más áreas del
funcionamiento del microorganismo y producir dos principales efectos: la muerte de la bacteria,
designándose entonces como agentes bactericidas o sólo inhibir el desarrollo y reproducción
del
germen,
llamándose
entonces agentes
bacteriostáticos.
Clasificación
de
los
antibióticos
y
mecanismo
de
acción.
De acuerdo al mecanismo de acción que presentan los antibióticos, se clasifican en siete
grandes grupos:
Mecanismo de acción
Ejemplos
Inhibición de la síntesis de la pared celular
Penicilinas, cefalosporinas, vancomicina,
bacitracina, oxacilina, nafcilina
Daño a la membrana plasmática
Polimixina, nistatina, anfotericina B
Inhibición de la síntesis de proteínas
Aminoglucósidos, cloranfenicol, eritromicina,
tetraciclina
Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos
Rifamicina, actinomicina D, ácido nalidíxico,
ciprofloxacina, norfloxacina
Antimetabolitos
Trimetoprim, sulfonamidas
Inhibidores de betalactamasas
Sulbactam, clavulanato, tazobactam
Antifímicos
Etambutol, pirazinamida, isoniazida,
estreptomicina, rifampicina
De: Mendoza Medellín A. El formidable reto de la resistencia bacteriana a los antibióticos.
Revista de la Facultad de Medicina. 2011;54( 001).
Las pruebas de sensibilidad bacteriana se llevan a cabo mediante el antibiograma que sirve
para medir la sensibilidad de una cepa bacteriana a uno o varios antibióticos. El estudio de la
sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento
antibiótico. También es importante para realizar estudios sobre la evolución de las resistencias
bacterianas que permite revisar los protocolos de la antibioticoterapia empírica.
Conceptos:
La determinación de la Concentración Mínima Inhibidora
(CMI) es la medida de la
sensibilidad de una bacteria a un antibiótico. Es la mínima cantidad de antimicrobiano que es
capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones normalizadas. Es
el método habitual utilizado en los laboratorios de Microbiología Clínica. Este método nos
ofrece información sobre la sensibilidad de las bacterias S (sensible), I (intermedia) y R
(resistente).
Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un
tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es
de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir
efecto terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o
aumento de la posología).
Existen diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de forma rutinaria, y de
manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o
semiautomatizados). Se puede realizar mediante:
1.- Difusión en agar: Disco placa y E test
2.- Dilución: Medio sólido y Medio líquido (micro/macrodilución)
3.- Mecanizados y Automatizados
La Concentración Mínima Bactericida (CMB) es la mínima cantidad de antibiótico capaz de
destruir el 99,9% de una muestra inoculada en condiciones estandarizadas.
Métodos
En un primer momento, el método estándar utilizado para las pruebas in vitro fue el de dilución
en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo. Actualmente existen varios métodos que
se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad a los antibióticos y todos ellos se
realizan bajo condiciones entandarizadas por organismos internacionales.
Dilución en caldo
Se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones
1:2, en tubos con un caldo de cultivo que mantiene el desarrollo del microorganismo. Los
antibióticos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta
obtener las concentraciones apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Después de
un periodo de incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos que indica el desarrollo
bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los que no contengan
suficiente antibiótico que sea capaz de inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que
presente ausencia de crecimiento es la Concentración Mínima Inhibitoria.
Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo
sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.
A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de
caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el número de colonias que crece en estos
subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del
cultivo original. La mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a
menos de 0,1 % del inóculo original se denomina concentración bactericida mínima (CBM).
Difusión en agar
Este método incorpora el antimicrobiano a discos de papel de filtro. Su introducción permitió
agilizar la determinación de la sensibilidad de las cepas bacterianas frente a un número
importante de antimicrobianos de forma simultánea. El empleo de los discos de papel de filtro
para las pruebas de sensibilidad está estandarizado y se correlaciona con las CMIs. Durante
muchos años, y a pesar de ser una técnica puramente cualitativa, el método de difusión por
disco (o método Kirby-Bauer), en función sobre todo de su comodidad, economía y fiabilidad,
ha sido uno de los más utilizados en los laboratorios.
El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie
se disponen los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas durante
16-24 horas y se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de inhibición
que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas publicadas
por la CLSI. De esta manera se sabe si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente
a cada uno de los antibióticos.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
INOCULO:



A partir de un cultivo puro o axénico tomar una colonia con un hisopo estéril.
Colocarlo en el caldo BHI y homogenizar por completo.
Comparar con el estándar McFarland 0.5.
ANTIBIOGRAMA EN AGAR:



Escurrir el hisopo contra las paredes del tubo.
Estriar en una caja de agar Mueller-Hinton horizontalmente, cambiar de posición hacerlo
verticalmente, cambiar de posición hacerlo inclinado, cambiar de posición hacerlo
nuevamente inclinado, terminar dando la vuelta el hisopo por el borde de la caja.
Colocar los discos en la caja Petri.
GRAM POSITIVOS: oxacilina, penicilina, gentamicina, cotrimoxasasol sulfa, ciprofloxacina,
Clindamicina, eritromicina, linezolid, vancomicina, teicoplanina.
GRAM NEGATIVOS: amoxicicilina acido clavulanico, ceftriaxona, ceftazidima, cfepime,
aztreonam, ciprofloxacina, gentamicina, ampicilina, cotrimoxasasol sulfa.
AMPLIACIONES: carbapenemicos,tetraciclinas, fosfomicinas.


Incubar a 37oC por 24 horas.
Realizar lecturas de halos de discos y comparar con las tablas CLSI.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
Que es un standard Mcfarland, como se realiza?
Cuál es la clasificación de las penicilinas?
Que antibióticos no pueden utilizarse en pacientes pediátricos y por qué?
Que significa que una bacteria sea productora de BLEE? que antibióticos se ven
involucrados en este fenómeno?
6. Investigue la utilidad de la anfotericina.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2014-2
SESIONES
PRÁCTICA No:8
1
TEMA: COCOS GRAM POSITIVOS
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los cocos Gram positivos aerobias de importancia clínica,
cuáles son sus reacciones bioquímicas y su perfil de susceptibilidad bacteriana
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Estableceremos las diferencias entre Streptococcus y Staphylococcus, su perfil bioquímico y de
susceptibilidad antimicrobiana.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar Mueller-Hinton
Caldo BHI
Agar manitol salado
Agar sangre de cordero
Discos de antibióticos
Incubadora
REACTIVOS:
Plasma normal
Taxo A
Taxo P
Antibioticos.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Los cocos Gram positivos excluyendo las enterobacterias, son los microorganismos más
frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como agentes
importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el año 1836.
Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora microbiana
normal de la piel y las mucosas del hombre y de animales. Las infecciones en el hombre se
producen por contacto directo con individuos infectados o portadores sanos, o por penetración
a través de piel y mucosas mediante objetos corto punzantes por heridas, trauma o
procedimientos quirúrgicos o por la acción detoxinas producidas por cepas de algunas
especies.
Staphylococcus
Los estafilococos son células esféricas Gram positivas dispuestas en grupos semejantes a
racimos de uvas en medios sólidos o en pares, cadenas o tétradas, en medios líquidos. Crecen
bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen diferentes pigmentos: blanco,
amarillo y dorado y algunas de ellas producen beta hemólisis. Son catalasa positiva, inmóviles,
no esporulados, con raras excepciones, no encapsulados y son aerobios o anaerobios
facultativos.
Las colonias de estafilococo son fáciles de reconocer, relativamente son grandes tienen de 2 a
3 mm o más, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias son circulares, convexas, de
superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas o amarillas o doradas. Para iniciar la
identificación además de las características de crecimiento tanto en medio líquido como sólido
y la coloración de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del
género estreptococo, el cual carece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan
diferentes pruebas dentro de las cuales están las siguientes.
Streptococcus
Los estreptococos son células esféricas u ovaladas Gram positivas dispuestas en pares o
cadenas cortas o largas. Son más exigentes que los estafilococos, no crecen en medios
simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados.
Producen diferentes tipos de hemólisis, característica que permite clasificarlos en beta
hemolíticos, alfa hemolíticos o no hemolíticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa,
inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios y anaerobios
facultativos.
Enterococcus
Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, son células
esféricas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que los estreptococos,
requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Son capaces de
desarrollarse en medios que contienen altas concentraciones de NaCl (6.5%) y de bilis (40%).
Pueden producir hemólisis de tipo alfa, beta o ser no hemolíticos. No forman pigmentos, son
catalasa negativa, inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios
y anaerobios facultativos.
Descripción de la actividad:
Pruebas Bioquímicas
CATALASA
Principio
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en
agua y oxígeno según la siguiente reacción:
2H2O2 →2H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba catalasa se usa con frecuencia, para diferenciar miembros de la familia
Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.
Materiales
- Colonia aislada (Medio de cultivo sembrado e incubado)
- Peróxido de hidrógeno al 3%
Procedimiento
1. Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de
un portaobjetos.
2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de
efervescencia o burbujas.
Resultados
- Positiva: Una prueba positiva esta dada por la aparición rápida y sostenida de
burbujas o efervescencia.
- Negativa: Unas pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30 segundos se
considera un resultado negativo.- Falsas Positivas: Los eritrocitos poseen catalasa, por
lo cual debe tenerse cuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el
material de la colonia.
COAGULASA
Principio
La coagulasa es una proteína de composición química desconocida, que tiene actividad
similar a la protombina, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da como
resultado la formación de un coágulo visible en los sistemas apropiados. Se utiliza para
identificar Staphylococcus aureus de otras especies. La coagulasa se presenta en dos
formas, ligada y libre y para determinarlas se utiliza dos procedimientos: en lámina y en
tubo; si la prueba en lámina da positiva, no hay necesidad de hacer la prueba en tubo.
Prueba en lámina (Coagulasa ligada)
Materiales
- Cepa en estudio
- Lámina
- Plasma de conejo
Procedimiento
- Colocar 1 gota de plasma sobre la lámina
- Agregar la colonia en estudio
- Mezclar
Resultados
- Positivo: La presencia de aglutinación o formación de grumos
- Negativo: No se observa aglutinación, permanece emulsionada la colonia
Prueba en tubo (Coagulasa libre)
Materiales
- Cepa en estudio
- Tubo de ensayo con 0.5 ml de plasma de conejo
Procedimiento
- Agregar la colonia en estudio al tubo de ensayo
- Incubar a 35ºC por 4 horas; si no se ha formado el coágulo, reincubar por 24
horas a temperatura ambiente
Resultados
- Positivo: La formación de un coágulo
- Negativo: No se observa formación de coagulo, permanece líquido el plasma.
MANITOL
Principio
Al utilizar el microorganismo al manitol como sustrato e incorporarlo al sistema
Embden-Meyerhoff-Parnas, que tiene como productos finales ácidos que provocan la
disminución del pH en el medio de cultivo, que se detecta mediante el viraje del
indicador rojo de fenol a amarillo.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar de Manitol
Procedimiento
- Sembrar la colonia en el caldo
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Positivo: cuando el indicador del medio vira a amarillo
- Negativo: cuando conserva su color rojo
NOVOBIOCINA
Principio
Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensiblesy
resistentes a la novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es de las especies
resistentes, la más frecuente en humanos, causante de infecciones de el tracto urinario.
Por lo tanto esta prueba proporciona una identificación presuntiva confiable de esta
especie.
Materiales
- Cepa en estudio
- Disco de novobiocina de 5ug
- Agar sangre de carnero
Procedimiento
- Preparar una suspensión (equivalente al estándar 0.5 de McFarland) del
microorganismo en agua destilada.
- Sembrar con escobillón en forma masiva sobre la placa de Mueller Hinton
- Colocar con la pinza un disco de novobiocina en el centro
- Incubar a 35ºC durante por 24 horas.
Resultados
- Sensible: Halo de inhibición mayor a 16 mm
- Resistente: Halo de inhibición menor a los 12 mm
BACITRACINA
Principio
Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones (0.04U) de Bacitracina.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar sangre
- Discos de Bacitracina
Procedimiento:
- Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar sangre
- Colocar un disco de Bacitracina y presionar suavemente
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Sensible: La aparición de cualquier halo de inhibición alrededor del disco
- Resistente: Crecimiento alrededor del disco
CAMP
Principio
Se basa en que Streptococcus agalactiae produce un factor llamado CAMP (factor de
monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por
algunas cepas de Staphylococcus aureus productoras de ß lisina.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar sangre
- Cepa de Staphylococcus aureus ß lisina positivo
Procedimiento:
- Sembrar sobre la palca de agar una estría de estafilococo ß lisina positivo
- Perpendicular al estafilococo, hacer una estría con la colonia en estudio
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Positivo: Presencia de una zona de hemólisis en forma de flecha
- Negativo: Ausencia de la hemólisis en flecha.
OPTOQUINA
Principio
El clorhidrato de etildihidrocupreína (optoquina) a muy bajas concentraciones, inhibe en
forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae. La optoquina puede
inhibir a otros estreptococos del grupo viridans, pero solo a concentraciones más altas.
Materiales
- Cepa en estudio- Agar sangre
- Discos de Optoquina 5 ug.
Procedimiento:
- Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar sangre
- Colocar un disco de Optoquina y presionar suavemente
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Sensible: La aparición de un halo de inhibición mayor a 16 mm de diámetro
- Resistente: Crecimiento alrededor del disco o halos menores a 16 mm.
Enterococcus spp.
Materiales:
-Cepa en estudio-Agar sangre
Agar Bilis esculina-BHI+6.5%NaCl
Procedimiento:
-Sembrar la colonia por profundidad en el agar inc;linado de Bilis esculina.
-Sembrar la colonia en el caldo BHI
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
Positivo: crecimiento en la bilis con pigmentación negra y turbidez del caldo BHI
Negativo: crecimiento en la bilis, ausencia de pigmento y turbidez del caldo BHI.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
http://www.medicina.unal.edu.co/Departamentos/microbiologia/Docs/W%203%20COCOS_GR
AM_POSITIVOS_2012.pdf
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
6. Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
7. Defina los diferentes tipos de hemólisis.
8. Escriba 5 enfermedades infecciosas que produzca cada uno de los agentes
9. etiológicos aislados en el grupo y otras especies de microorganismos Gram
positivos importantes en patología humana.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2014-2
SESIONES
PRÁCTICA No:9
1
TEMA: COCOS GRAM NEGATIVOS
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los cocos Gram negativos aerobios de importancia clínica,
cuáles son sus reacciones bioquímicas y su perfil de susceptibilidad bacteriana
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Estableceremos cuales son los cocos Gram positivos su perfil bioquímico y su susceptibilidad
antimicrobiana.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar Chocolate
Caldo BHI
Agar Sangre de Cordero
Discos de antibióticos
Incubadora
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Peróxido de Hidrogeno
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
COCOS GRAM NEGATIVOS:
Los unicos coco gram- de la cavidad oral son los cocos Veillonella: V..parvula, V. atypica, V.
dispar.
Hay otras especies de Gram negativos pero que están en la cavidad oral de animales.
Caracteristicas generales:
Se agrupan en cadenas cortas o en parejas.
No metabolizan los hidratos de carbono.
Mediante la fermentacion del ac lactico produce energia., ac acetico, CO2, y ac propionico
Se encuentra en la placa dental, en el dorso de la lengua, saliva y intestino.
Tiene actividad proteolitica, es decir, produce ciertas enzimas que degradan proteinas se
liberan compuestos volatiles, que dan lugar a la halitosis.
Descripción de la actividad:
COLORACION DE GRAM
Realizar la coloración de Gram como la hemos realizado hasta el momento.
PRUEBA DE SUPEROXOL
 Esta es una prueba muy útil para diferencia N. gonorrhoeae.
 Colocar en un porta objetos un poco de colonia y anadir una gota de peróxido de
hidrogeno al 30%.
 Si fuese positivo produce burbujeo inmediatamente.
THAYER MARTIN
 Seleccionar la colonia deseada y sembrarla por agotameinto en este medio de
cultivo.
METODOS ESTANDARIZADOS:
GONOCHECK
BACTICARD NEISSERIA
RIM NEISSERIA
INMUNOFLUORESCENCIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES
PRUEBA DE CLOAGLUTINACION\GONOGEN
PCR PARA NEISERRIA MENINGITIDIS
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
http://www.medicina.unal.edu.co/Departamentos/microbiologia/Docs/W%203%20COC
OS_GRAM_POSITIVOS_2012.pdf
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
1. Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
2. Investigue acerca de la gonorrea, y que antibióticos se utilizan para su tratamiento.
3. En el caso de Neisserias meningitidis, describa el tipo de infección que causa y cuál
es el tratamiento antibiótico utilizado.
4. Para Moraxella catarralis cuál es la prueba de identificación y que antibióticos son
los utilizados para tratarla.
5. Que es el Haemophyllus influenzae, como se trata.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2014-2
SESIONES
PRÁCTICA No:10
1
TEMA: BACILOS GRAM NEGATIVOS
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los bacilos Gram aerobios de importancia clínica, cuáles son
sus reacciones bioquímicas y su perfil de susceptibilidad bacteriana
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Estableceremos cuales son los bacilos Gram negativos de importancia clínica su perfil
bioquímico y su susceptibilidad antimicrobiana.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar McConkey
Discos de antibióticos
Incubadora
Pruebas bioquímicas(Citrato, TSI, Urea, MR, VP, SIM)
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Placas Petri con Agar Mc. Conkey y sembrado con enterobacterias.
Placas Petri con Agar SS sembrado con enterobacterias.
Tubos con TSI, LIA, CITRATO inoculados con especie a estudiar.
Cepas a estudiar: Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella typhi y Shiguella.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Las enterobacterias (orden Enterobacteriales) son bacterias Gram negativas que contiene
más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología de bacilos o cocos.
Los miembros de este grupo forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y
de otros órganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir
en tierra, en plantas o en animales acuáticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes
comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de enterobacterias en la
bio-industria: para comprobar la sanidad de la fermentación de quesos y productos lácteos,
alcoholes y en tratamientos médicos, como la producción de toxinas en el uso de cosméticos y
fabricación de agentes antivirales de la industria farmacéutica, etc.
CARACTERISTICAS:
En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la
aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no cumplen con
todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia:







Son bacterias Gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos.
No son exigentes, son de fácil cultivo.
Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de
la enzima citocromo oxidasa.1
Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
Son anaeróbicos facultativos.
Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción
de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en
condiciones aeróbicas.2
Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no
son móviles.
Adicional a ello, las enterobacterias no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser
encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para
su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa,
aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es
de entre 22 °C y 37 °C.
Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos,
como la fermentación de los diferentes azúcares, la producción o no de azufre, la presencia
de enzimas metabólicas (β-galactosidasa,desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de
importancia médica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia
de antígenos en su constitución celular, tales como en el lipopolisacárido (antígeno O), el
antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K).
ECOLOGIA:
La mayoría de las especies pueden aislarse del intestino del hombre y de otros animales, de
allí su nombre "enterobacteria" (del griego entéron, intestino. Pueden ser flora o ser transitorias
en la cavidad bucal, en las regiones húmedas de la piel, en especial el perineo, las fosas
nasales y las vías genitales femeninas. Son abundantes en la naturaleza, en particular en
medios húmedos y, por ser expulsadas por las heces, funcionan como medidores
epidemiológicos de salubridad e higiene poblacional.
En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en
grandes números en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a
la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de
la fermentación.
La especie Escherichia coli juega una función importante en el control de otras especies
intestinales, constituyendo cerca del 80 por ciento de la flora aeróbica intestinal en una
concentración aproximada de 108 en la materia fecal. Otras especies
de Enterobacteriaceae con una presencia numerosa intestinal son Proteus y Klebsiella,
mientras que otras especies, como Citrobacter, Hafnia, Providencia y Enterobacter están
presentes de manera irregular.
En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos
como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en
especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos,desnutrición, etc.
PATOGENIA:
La presencia de enterobacterias dentro del organismo es normal, pero puede determinar la
aparición de infecciones, cuya gravedad depende principalmente de la capacidad patológica o
de la virulencia de la especie en cuestión y de las características del hospedador. Introducidas
por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de
la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies
provocan patologías específicas:





La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea.
La especie Shigella dysenteriae es el agente responsable de la disentería bacilar.
La especie Escherichia coli enterotóxica es responsable de la gastroenteritis infantil.
La especie Yersinia pestis es responsable de la peste.
La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como
resultado de tratamiento en un hospital.
Las enterobacterias incluyen a organismos que resultan patógenos para el ser humano como
la Escherichia coli o la Salmonella, especialmente importantes en la mortalidad infantil en
países en desarrollo3 y patógenos para las plantas como Erwinia, en la mayor parte de los
casos causando infecciones oportunistas. Todos los bacilos de Enterobacteriaceae son
resistentes a antimicrobianos comunes, tales como la penicilina, la meticilina y la clindamicina,
entre otros.4
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
Observar el desarrollo bacteriano en las placas de Agar Mc. Conkey, colonias rojas que
corresponden a bacterias que han metabolizado la lactosa debido al indicador de pH ácido (rojo
neutro). Las colonias incoloras son bacterias que no han metabolizado la lactosa, se
consideran como sospechosas de ser patógenas (Salmonella-Shiguella).
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA:
El reconocimiento de las diversas especies de Enterobacterias se realiza observando las
reacciones metabólicas, por los cambios del color del medio sobre los sustratos contenidos en
dichos medios diferenciales.






Tomar la colonia de enterobacteria con el asa esteril e inocularla en cada tubo de
bioquímica.
El citrato, TSI, Urea, realizarlo hasta el fondo y sacarlo en zigzag.
Al SIM realizar un pique en profundidad y sacar el asa de forma vertical.
Las pruebas de MR y VP se deben realizar homogenizando las colonias en el caldo de
cultivo.
Incubar las pruebas bioquímicas, 24 horas a 37oC.
Leer e identificar el tipo de enterobacteria.
CUADRO
DE
DIFERENCIACIÓN
BIOQUÍMICA
DE
ENTEROBACTERIAS
-----------------------------Lactosa, sacarosa, glucosa y H2SSup. Ac. Fond. Ac. Gas H2S Lisina Citrato Indol
Escherichia coli
+
+
+
-
V
-
Shiguella
-
+
-
-
-
-
V
Salmonella typhi
-
+
-
(t)
+
-
-
Salmonella paratyphi A
-
+
+
-
-
-
-
Otras Salmonellas
-
+
+
+
+
+
-
Klebsiella
+
+
+
-
-
+
V
Proteus sp
-
+
V
V
+
V
V
Citrobacter
-
+
V
V
-
+
-







Ac.: Acidez (toma el color Amarillo)
Lisina: + (permanece color violeta)
Lisina: - (cambia a un color amarillo)
(t): Trazas
+: Positivo
-: Negativo
V: Variable
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
10. Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
11. Cuáles son los microorganismos mayormente asociados a IVUs?
12. Salmonella typhi que tipo de infección causa, describa síntomas ycual es el
tratamiento?
13. Describa las toxinas asociadas a la infección por Shigella.
14. Investigue cuales son las enterobacterias asociadas mayormente a infecciones
nosocomiales.
ASIGNATURA:
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
MICROBIOLOGIA
PERIODO:
2014-2
SESIONES
PRÁCTICA No 11
1
TEMA: BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los bacilos Gram negativos aerobios no fermentadores de
importancia clínica, cuáles son sus reacciones bioquímicas y su perfil de
susceptibilidad bacteriana.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Estableceremos cuales son los bacilos Gram negativos no fermentadores de importancia
clínica su perfil bioquímico y su susceptibilidad antimicrobiana.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar McConkey
Discos de antibióticos
Incubadora
GALERIAS API 20NE
Agua destilada
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Placas Petri con Agar Mc. Conkey y sembrado con Pseudomonas aeuruginosa.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Las infecciones por bacilos gram-negativos no fermentadores han cobrado notoria importancia
por su incidencia en las infecciones hospitalarias. Actualmente, se destaca el hallazgo de
especies como la Pseudomonas aeruginosa y el Acinetobacter spp.; de este último,
el Acinetobacter baumannii es la especie que con mayor frecuencia se asocia a infecciones
graves y a la muerte. El aislamiento de estos patógenos se asocia a un incremento de la
mortalidad y están entre los agentes que más frecuentemente causan infecciones en las
Unidades de Terapia Intensiva, de ahí que constituyan desafíos terapéuticos. En el presente
artículo, se realiza una revisión actualizada de la literatura y se hace énfasis en la problemática
de la resistencia bacteriana y la terapéutica antibiótica.
Con el término de Bacilos gram-negativos no fermentadores (BNF), se designa un heterogéneo
grupo de microorganismos incapaces de fermentar diversos hidratos de carbono. Muchos de
ellos se comportan como oportunistas y pueden causar infecciones graves. Actualmente, han
cobrado notoria importancia por su incidencia en infecciones hospitalarias; se destaca en estos
el hallazgo de especies como la Pseudomonas aeruginosa y el Acinetobacter spp.; de este
último, el Acinetobacter baumannii es la especie que con mayor frecuencia se asocia a
infecciones nosocomiales graves y a la muerte.1
El aislamiento de estos patógenos se asocia a un incremento de la mortalidad; esta situación
es más preocupante aún, ya que hoy, ningún nuevo antimicrobiano contra las variantes
multidrogorresistentes (MDR) de estos organismos, está en fases avanzadas de desarrollo
clínico. 2
Un porcentaje considerable de los pacientes que ingresan en Unidades de Cuidados Intensivos
(UCI) tienen como motivo de ingreso una infección y un porcentaje aún mayor desarrolla
infecciones durante su estancia en ellas. Los BNF están entre los agentes que más
frecuentemente causan infección nosocomial en las UCI; de hecho, forman parte de las
llamadas "bacterias problemáticas".
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
REALIZACION DEL API 20NE
Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogéneamente en
5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril.
Siembra de la galería API
Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (parte aerobia).
Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula, de todos los pocillos.
Llenar la cúpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensión de bacterias.
Tapar con parafina líquida
Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener
anaerobiosis.
Poner la galería en su propia cámara húmeda de incubación
Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación.
Previamente poner agua en los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda
durante la incubación.
Incubar a 37 °C durante 18-24 h.
La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los
de las tablas de lectura.
Y anotando el resultado como positivo o negativo.
Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios:
Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que añadir reactivos.
Cuando ésto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE, API OF, el API M o el API 10S
para ver determinados metabolismos especiales.
Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos:
Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos
están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test
número 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4.
Si la reacción es negativa se pone 0.
Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es
el tercero.
Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras.
Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pd
f
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/LabV/API/api.html\
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
15. Investigue acerca de la Stenotrophomonas maltophilia, que tipo de infecciones
producen y cuál es el tipo de tratamiento antibiótico que se administra.
16. Que es la fibrosis quística, que bacterias son las mayormente involucradas en la
infección?
17. A qué tipo de infecciones está asociado el Acinetobacter baumannii, que
tratamiento antibiótico es el adecuado?
18. Describa las colonias de Aeromonas hydrophila en agar sangre y McConkey?
ASIGNATURA:
MICROBIOLOGIA
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
SESIONES
PRÁCTICA No 12
1
TEMA: MYCOBACTERIAS
1.- OBJETIVO
Identificar Mycobacterias, cuál es su método diagnóstico, que tipo de afecciones causan y
cómo manejarlos hospitalariamente.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Establecer importancia clínica y diagnostica de mycobacterias.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Placas coloreadas con zhiel nielsen de bacilos tubercolosos
Agar Lowenstein Jensen positivos.
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Placas Petri con Agar Mc. Conkey y sembrado con Pseudomonas aeuruginosa.
PERIODO:
2014-2
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3 a 5µm de longitud o curvos
en forma de maza, inmóviles, no esporulados, con abundantes gránulos citoplasmáticos, que
poseen una resistencia mayor a la tinción por los colorantes comunes, pero una vez teñidos
son resistentes a la decoloración con una mezcla de alcohol ácido. Desde el punto de vista de
los requerimientos atmosféricos algunos son aerobios y otros microaerófilos. En cuanto a la
velocidad de crecimiento algunas especies son de crecimiento rápido y otras lento. Se destaca
en su estructura una gran riqueza en lípidos (20-60%). El contenido de bases de guanina más
citosina en la molécula de ADN es de 62 a 70 moles %.
El género comprende 50 especies, entre ellas patógenos primarios, oportunistas y saprofitas.
La especie tipo es Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), la cual vamos a utilizar como
modelo al referirnos a las principales características del género.
Importancia
Las mycobacterias son agentes de enfermedades infecciosas que han acompañado al hombre
a lo largo de su historia.
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae son los agentes etiológicos más
frecuentes de las dos enfermedades más conocidas de este género. Poco tiempo después que
Roberto Koch descubriera M. tuberculosis en 1882, fueron identificadas otras mycobacterias,
constituyendo el grupo de las mycobacterias atípicas. El hallazgo de estas últimas estuvo
vinculado por años a colonización transitoria o contaminación de la muestra clínica, pero es a
partir de 1950 que se les ha asignado un rol en determinadas patologías; por ejemplo,
actualmente M. Avium Complex y enfermedad pulmonar y diseminada en pacientes con SIDA.
Desde un punto de vista histórico evolutivo, existen evidencias de tuberculosis (TBC) espinal
desde el neolítico, pero es a partir de la revolución industrial donde la enfermedad adquiere
carácter endémico, debido a una mayor aglomeración de la población en las urbes, lo cual
facilitó su diseminación.
Desde 1945, con el descubrimiento de las drogas antituberculosas, la utilización del examen
radiológico de tórax y la implementación de programas estrictos de control de diagnóstico y
tratamiento, se logró una disminución de la incidencia de tuberculosis, lo que hizo pensar a
principios de la década de 1980, en una posible erradicación de la enfermedad para el año
2010 (Center for Disease Control, Estados Unidos). Pero, a partir de 1985, comienza a emerger
la TBC en tasas que no se veían desde hacía 20 años en los países desarrollados. Los factores
postulados para explicar esta reemergencia de la enfermedad son varios:
• el compromiso del sistema inmune en los individuos infectados por el VIH, que permite tanto
una reactivación de una antigua infección, como un aumento de la susceptibilidad a una nueva
infección.
• cambios sociales: aumento del índice de pobreza, hacinamiento;
• falla en los sistemas de control de la salud pública;
• emergencia de bacilos tuberculosos multirresistentes a las drogas;
• escasa asignación de recursos para la investigación de nuevas drogas, nuevos métodos
diagnósticos y vacunas.
Clasificación y nomenclatura
En 1950, Timpe y Runyon propusieron una clasificación útil de Mycobacterium en cuatro
grupos, que se basaba en la velocidad de crecimiento (rápido o lento, según sea superior o
inferior a una semana), producción de pigmento en presencia o ausencia de luz (fotocromógeno, escotocromógeno y no cromógeno) y características coloniales. En la tabla 1 se presenta
una clasificación modificada de la original de Runyon, que incluye los miembros del género
Mycobacterium de importancia humana actualmente
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS
Bioseguridad en la bacteriología de la tuberculosis
Existen estrictas normas de bioseguridad para el manejo de las muestras clínicas en el
laboratorio.
Como ya fue visto en los aspectos teóricos del tema, la vía de transmisión principal es la
inhalatoria, por la aspiración de partículas aerosolizadas; éstas pueden provenir del paciente o
ser diseminadas al manipular las muestras en el laboratorio (apertura de frascos, flameo del
asa, etc.). Evitar el desprendimiento de estas partículas, trabajar en ambientes amplios y
ventilados de circulación restringida, y recordar las normas de no fumar, beber, comer, o
aplicarse cosméticos en el laboratorio, son algunos de los puntos a tener en cuenta.
El estudiante que se dedicará fundamentalmente a la observación de frotis y cultivos ya
procesados y no al manejo de muestras clínicas, deberá cumplir con las habituales normas de
bioseguridad y buenas prácticas en el laboratorio.
Obtención de la muestra
Las muestras pueden provenir de zonas naturalmente estériles, zonas naturalmente
contaminadas o de zonas estériles pero en las que al efectuar la toma, se pasa por un área
contaminada.
La expectoración es la muestra de más frecuente manejo, ya que como dijimos, la pulmonar es
la presentación más habitual. La expectoración debe ser representativa de las secreciones del
tracto respiratorio inferior; para ello se debe recoger a primera hora de la mañana, previa
higiene bucal, y con el esfuerzo de la tos, en frasco estéril. La toma debe repetirse tres veces
en días consecutivos, ya que la eliminación de bacilos no es constante. Mujeres y niños pueden
tener dificultades por no poder, o no saber, expectorar, pudiendo entonces hacer
nebulizaciones con NaCl hipertónico. En pacientes hospitalizados graves puede recurrirse a
FBA o lavado gástrico.
Transporte y conservación
La rapidez es una condición fundamental en el transporte pues los bacilos se debilitan con el
tiempo y prolifera, en caso de ser una muestra contaminada, la flora acompañante, por ej.:
proliferación de la flora del tracto respiratorio superior en la expectoración. La conservación
puede hacerse a 4 ºC hasta 7 días.
Procesamiento
El trabajo con las muestras clínicas en el laboratorio se realiza en cabina de seguridad, con las
debidas protecciones para el personal.
Metodos directos
Microscopía - baciloscopía
El examen microscópico directo o baciloscopía es la técnica fundamental para la investigación
bacteriológica de la tuberculosis pulmonar, tanto para el diagnóstico como para el control
detratamiento, resultando también útil para muestras provenientes de otros orígenes.
TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN
Se trata de una coloración diferencial basada en la capacidad de las mycobacterias de
incorporar colorantes y luego retenerlos ante la acción de una mezcla de alcohol y ácido, lo que
es conocido como ácido-alcohol resistencia. Las particulares características de la pared de las
mycobacterias parece ser responsable de esta propiedad, pudiendo formar complejos ácido
estables, cuando se exponen a colorantes aniónicos, con los lípidos de la pared, especialmente
los ácidos micólicos, o también constituyendo complejos fucsina-ARN.Con un frotis seco y
fijado se recorren los siguientes pasos:
 Coloración Fucsina + calor
 (calor hasta emisión de vapor;
 no ebullición)
 Aproximadamente 5 min.
 Decoloración Alcohol-Acido Aproximadamente 3 a 5 min.
 Coloración de contraste Azul de metileno Aproximadamente 1 min.
Se debe lavar con agua corriente a baja presión entre paso y paso. Después se seca y se
observa co lente de inmersión. Las mycobacterias se ven rosadas sobre un fondo de
leucocitos,fibrina y escasa flora asociada, coloreados de azul.
La observación debe recorrer unos 200 campos microscópicos y se informa según el siguiente
criterio semicuantitativo:
Baciloscopía
negativa -
No se observan bacilos ácido-alcohol resistentes en 200
campos microscópicos observados.
Baciloscopía
positiva +
Se observan menos de un bacilo por campo en 200 campos
observados.
Baciloscopía
positiva ++
Se observan 1 a 10 bacilos por campo en 100 campos
observados.
Baciloscopía
positiva +++
Se observan más de 10 bacilos por campo en 50 campos
observados.
La baciloscopía por la técnica de Ziehl-Neelsen es una técnica sencilla de bajo costo, cuya
utilidad ya hemos destacado. Aplicado a la expectoración se estima que se necesitan 10.000
para que la probabilidad sea del 95-100
TÉCNICA DE FLUORESCENCIA AURAMINA RODAMINA
Basada igual que el Ziehl-Neelsen en la ácido-alcohol resistencia de la mycobacterias, aquí se
colorean con un fluorocromo y no se decoloran con la mezcla de alcohol-ácido. La técnica no
necesita del agregado de calor y permite una visualización más rápida ya que los bacilos se
ven luminosos sobre un fondo oscuro. La observación se hace con objetivo en seco y se
requiere un microscopio de fluorescencia, lo que hace esta técnica más cara con respecto al
Ziehl-Neelsen.
Se utiliza en laboratorios que manejan un número importante de muestras por día.
Respecto al valor de la microscopía y a las técnicas de coloración mencionadas, nos parece
oportuno señalar:
• Si se tiene una baciloscopía positiva y una clínica sugestiva, casi siempre se tratará, en
nuestro país, de una tuberculosis, pero es necesario tener presente que puede tratarse de otras
especies del género Mycobacterium.
• La microscopía no sustituye el cultivo.
• Referente a las técnicas de coloración, recordar la importancia de las mismas, y que la técnica
de Gram, muy difundida en el diagnóstico de otras bacterias, no es útil para las mycobacterias.
Cultivo
El cultivo es complemento de la microscopía; permite diagnosticar como positivos casos
negativos en el examen microscópico. Las muestras contaminadas se someten a una
descontaminación que destruye la flora asociada y mantiene viables a las mycobacterias.
Después se siembra en los medios adecuados. Las muestras no contaminadas se siembran
directamente (previa centrifugación para concentrar).
La incubación se realiza a 35-37 ºC en aerobiosis. Se observan los medios periódicamente y, al
cabo de 3-5 semanas, crecen colonias rugosas, secas, amarillentas. Deben esperarse
hastaocho semanas para informar un cultivo como negativo.
El medio empleado es el de Lowenstein-Jensen, compuesto por hierro, aminoácidos, sales,
glicerina, fécula de papa, huevo, y verde de malaquita (este último inhibe la flora asociada).
La inoculación en animales se ha dejado de usar por ser poco práctica y no definitiva en
algunas situaciones.
M. tuberculosis crece lentamente, es no cromógeno, productor de niacina, reduce nitratos,
produce una catalasa sensible al calor, es generalmente sensible a la isoniacida, etc.
Estudio de sensibilidad
La sensibilidad de las mycobacterias se estudia como para otros gérmenes, poniendo en
contacto el bacilo con el antibiótico a probar; pero existen algunas diferencias con el
antibiograma utilizado de rutina en los laboratorios, por ejemplo, no se utiliza el medio de
Mueller Hinton, ni el método de difusión en agar (Kirby-Bauer). En su lugar se emplea
Lowenstein-Jensen y distintas técnicas para el antibiograma. Mencionaremos solamente una, la
cual consiste en inocular un medio control y simultáneamente medios que contienen en
solución el antibiótico a probar en diferentes concentraciones. El inóculo bacteriano debe ser de
concentración conocida. La resistencia o sensibilidad se determina por comparación entre el
control y los otros medios.
Nuevos métodos para aislamiento, identificación y sensibilidad
Métodos radiométricos
Son útiles para el aislamiento y estudio de sensibilidad. El medio de cultivo es suplementado
con un substrato marcado con 14C. El substrato es utilizado, y durante el metabolismo se libera
CO2, el que es medido, detectándose así en forma indirecta el desarrollo bacteriano.
El sistema comercial Bactec que utiliza este método realiza el aislamiento y la determinación de
la sensibilidad en aproximadamente 18 días. El método convencional requiere cerca de 40
días.
DETECCIÓN DE COMPONENTES CELULARES
Se trata de identificar por diferentes técnicas algunos componentes de la bacteria.
Métodos genéticos
DNA fingerprinting, basado en la fragmentación del ADN por una endonucleasa de restricción
específica; el ADN después se separa electroforéticamente y se trata con una sonda que
hibridiza con una secuencia repetitiva del ADN (IS 6110). Los aislamientos que muestren esta
secuencia pueden ser identificados como M. tuberculosis. Esta técnica parte de cultivo puro.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
A diferencia de otras pruebas, PCR no necesita partir de cultivo puro pudiendo hacerlo
directamente de la muestra clínica. En esta técnica se amplía una secuencia del genoma de M.
tuberculosis para después ser reconocida. El resultado de la PCR puede estar listo en 48hs.
Una muestra conteniendo 10 bacilos puede ser positiva por PCR (para la baciloscopía se
necesitan 10.000). La técnica puede ser útil para la detección rápida de resistencia, si se
conocen los genes responsables de la misma.
Las deficiencias de la técnica están en los riesgos de contaminación cruzada y que no resulta
de utilidad en el control de tratamiento, ya que no distingue entre bacilos vivos y muertos.
Métodos indirectos
Se han estudiado métodos inmunológicos para la detección de anticuerpos por técnicas
inmunoenzimáticas, aglutinación, etc. Estos tienen dificultades para su desarrollo debido a la
falta de antígenos purificados específicos.
Prueba de la tuberculina
Siendo la respuesta inmune esencialmente de tipo celular, las pruebas cutáneas se
transforman en una ayuda importante. Se pueden realizar pruebas cutáneas frente a todas las
mycobacterias, pero nos referiremos a la prueba tuberculínica.
Esta prueba estudia la hipersensibilidad frente a antígenos proteicos de M. tuberculosis. La
tuberculina de Koch (OT: old tuberculin) era un extracto de caldo de bacilo tuberculoso. En
1934 Siebert creó un precipitado proteico que llamó derivado proteico purificado (PPD) y que se
usa hasta hoy.
La reacción se prueba con la intradermorreacción de Mantoux. Se inyectan en la dermis de la
cara anterior del antebrazo 0,1 ml de tuberculina de 5 UT. Después de 72 hs se mide el
diámetro de la induración producida (no del eritema). La interpretación de los diámetros delas
induraciones es la siguiente:
10 mm
Positiva
5-9 mm
Dudosa
0-4 mm
Negativa
El PPD positivo (más de 10 mm) permite separar una población infectada de otra que no lo
está, siendo un buen estudio de masas. De todos modos, debe considerarse el contexto del
paciente, su sintomatología y signología, así como estudios radiográficos y datos
epidemiológicos.
Concepto de viraje. Si se realizan dos pruebas tuberculínicas con un intervalo de dos meses en
un año, y la primera es negativa y la segunda positiva con una diferencia de 6 mm o más, se
habla de viraje e indica una infección actual. Puede o no acompañarse de hallazgos clínicos o
radiológicos.
CRITERIO DIAGNÓSTICO
• Paciente con sospecha clínica y epidemiológica de tuberculosis.
• Paciente con tuberculosis extratorácica en la que hay dificultades para aislar el germen.
CRITERIO EPIDEMIOLÓGICO
• Contacto con enfermos de tuberculosis.
• Tuberculosis confirmada (para registro).
Si la reacción tuberculínica es positiva:
1. El paciente está infectado.
2. El paciente recibió BCG.
Si la reacción tuberculínica es negativa:
1. El paciente no está infectado.
2. El paciente está en período prealérgico (período que va desde la infección hasta la aparición
de la hipersensibilidad retardada). Si dos meses más tarde se repite la prueba se puede ver el
viraje de la reacción.
Puede haber falsos negativos por aspectos técnicos o en tuberculosis avanzadas en las que el
50% no reacciona por tener elevadas concentraciones de antígenos en sus tejidos; se revierte
al recuperarse el paciente.
Otros falsos negativos:
• fisiológicos-embarazo;
• infecciones-sarampión;
• desnutrición;
• neoplasias-linfomas;
• medicamentos-corticoides.
El 3-5% de la población es inmunocompetente y no reacciona nunca frente a las pruebas
cutáneas.
Prueba tuberculínica en el paciente VIH positivo: en el paciente VIH positivo la reactividad
disminuye a medida que los CD4 disminuyen. Un diámetro de induración de 5 mm es aceptado
como positivo en un paciente VIH positivo para realizar inmunoprofilaxis (CDC, Center for
Desease Control, Estados Unidos).
Diagnostico de las mycobacteriosis
El diagnóstico de las mycobacteriosis en el huésped con defensas normales es similar al que
acabamos de mostrar para la tuberculosis. Las mycobacteriosis en el paciente con SIDA u
otros inmunocomprometidos, demanda una sistemática diagnóstica más exhaustiva por parte
del laboratorio, al igual que en las mycobacteriosis diseminadas. La microscopía incluye el
estudio de un mayor número de muestras: sangre, heces, ganglios, etc. En cuanto a los
cultivos, se realizan los convencionales; el hemocultivo parece ser la mejor manera de aislar
mycobacterias en casos diseminados. Los sistemas Bactec e Isolator (lisis-centrifugación) son
medios comerciales disponibles para el procesamiento de los hemocultivos. Para la
identificación,los métodos convencionales mantienen vigencia, pero los métodos genéticos
parecen ser los más adecuados.
DIAGNÓSTICO DE MYCOBACTERIUM LEPRAE
El diagnóstico bacteriológico de lepra ofrece la dificultad de que su agente etiológico no puede
ser cultivado en medios sintéticos ni en cultivos celulares. La inoculación animal (armadillo y
plantilla plantar del ratón) es muy restringida y tiene dificultades prácticas.
Métodos directos
Estos se hallan limitados a la observación microscópica de frotis provenientes de las lesiones
clínicamente sospechosas.
Microscopía
La técnica utilizada es la de Ziehl-Neelsen o la de fluorescencia. En tinciones de biopsias
puede usarse el Ziehl u otras (Fite). Con los resultados de la microscopía se confecciona el
llamado índice morfológico, que es el porcentaje de bacilos bien teñidos (vivos) en relación al
total; con este se evidencia la actividad de la enfermedad.
Métodos indirectos
Inmunidad humoral
La búsqueda de los anticuerpos está supeditada al hallazgo de antígenos específicos para así
diferenciar
M. leprae de otras mycobacterias, y determinar los títulos de una población normal, una
infectada y una enferma. Las técnicas están en fase de implementación (ELISA,
Inmunofluorescencia, etc.).
Inmunidad celular. Prueba de la lepromina
La prueba cutánea de hipersensibilidad utiliza células muertas de M. leprae en inyección
intradérmica (0,1 ml en la cara anterior del antebrazo). Produce una induración a los 3 ó 4 días
(reacción de Fernández), y una induración papular a las 3 ó 4 semanas (reacción de Mitsuda).
El test de la lepromina es positivo en pacientes con lepra tuberculoide, en individuos no
afectados en áreas endémicas y en ciertos pacientes lepromatosos tratados, pero es negativa
en los pacientes lepromatosos no tratados, por lo que no tiene valor diagnóstico.
El clínico, el radiólogo, el anatomopatólogo, pueden sospechar la enfermedad; el microbiólogo
puede aislar e identificar el agente etiológico. Pero esto no es todo, el diagnóstico
bacteriológico continúa siendo lento, las técnicas que aceleran la obtención de resultados están
en desarrollo o recién comienzan a comercializarse. La preocupante asociación tuberculosis y
SIDA continúa avanzando. El equipo de salud debe estar atento y con conocimientos firmes
para manejar la situación
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gene.
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/micobacterias.pdf
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
19. Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
20. Investigue acerca de tuberculosis, cadenas epidemiológicas y tratamiento.
21. Que es la lepra, cuál es su agente causal, cadena epidemiológica y tratamiento?
22. Investigue otros tipos de micobacterias, y a breves rasgos identifique que tipo de
infecciones causan.
ASIGNATURA:
MICROBIOLOGIA
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
PERIODO:
2014-
SESIONES
PRÁCTICA No 13
1
TEMA: BACTERIAS ANAEROBIAS
1.- OBJETIVO
Identificar bacterias anaerobias, cuál es su método diagnóstico, que tipo de afecciones causan
y cómo manejarlos hospitalariamente.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Establecer importancia clínica y diagnostica en bacterias anaerobias.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Muestras de tierra.
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Solución salina
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Anaerobios son aquellos gérmenes que sólo pueden desarrollarse en ausencia de cantidades
significativas de oxígeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox, por tanto son estrictos
en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son
expuestos al oxígeno molecular libre en la atmósfera, aunque el grado de resistencia bajo
estas condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados por
tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy escasa proporción de agua
en su composición. Si bien se considera bacteria anaerobias aquel germen que puede crecer
sólo en ausencia de oxígeno, la sensibilidad frente al oxígeno varía ampliamente de una
especie a otra. Así, distinguimos bacterias microaerófilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos
u obligados. Las bacterias microaerófilas resultan dañadas por niveles altos de oxígeno como
el atmosférico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%.
MÉTODOS DE CULTIVO
Cultivo
Los medios de cultivo primarios para la siembra de una muestra de anaerobios son varios, pero
en general incluyen un medio no selectivo como el agar sangre y algún medio selectivo.
Además otra placa de agar sangre, una de agar chocolate y una de agar MacConkey son
inoculadas e incubadas en aerobiosis, ya que la mayoría de las infecciones por anaerobios son
polimicrobianas e incluyen bacterias aerobias y facultativas. Un medio de cultivo líquido
habitualmente caldo tioglicolato se utiliza como medio de enriquecimiento cuando la muestra
proviene de un sitio estéril.
Existen varios medios líquidos comercialmente disponibles para hemocultivos. Algunos
contienen (SPS) sodium polyanetol sulfonate, el cual estimula el desarrollo de los anaerobios,
aunque al parecer sería inhibidor para Peptococcus anaerobius.
Se trata de frascos de 100 ml, al vacío, con el agregado de CO2, una base nutritiva (digerido
tríptico de soja o peptonas) y un agente reductor (tiol o tioglicolato). El porcentaje de sangre a
inocular es del 5 al 10 % v/v. Los frascos se examinan diariamente buscando turbidez,
hemólisis o gas; se consideran negativos definitivamente a los 10 días de incubación previo
subcultivo final.
Las placas inoculadas deben ser inmediatamente incubadas en condiciones anaerobias a 37
ºC durante 48 horas, al cabo de las cuales si no hay desarrollo deben ser incubadas al menos 5
días antes de ser descartadas.
Luego de sembrar la muestra en un medio de cultivo adecuado, la incubación en anaerobiosis
se consigue por medio de alguno de los siguientes sistemas: jarras anaeróbicas, bolsas de
anaerobiosis y la cámara de anaerobiosis o “cámara de guantes”. El último método es muy
caro, requiere equipamiento complejo, es lento y se usa para estudios de flora normal y en
laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista práctico las jarras y los sobres o
bolsas son equiparables en rendimiento a los sistemas más sofisticados y son aceptables para
el aislamiento de bacterias anaerobias en el laboratorio clínico. Con estos sistemas son
posibles los cultivos en medios sólidos para la obtención de aislamientos que permitan la
identificación bacteriana.
Jarras de anaerobiosis
Es el sistema más utilizado para generar una atmósfera anaeróbica. Consiste en una jarra de
plástico con una tapa que cierra herméticamente. La atmósfera anaerobia puede lograrse por
dos métodos diferentes. El más sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrógeno y
CO2 que es activado, ya sea mediante la adición de agua o por la humedad de las placas de
agar. El H2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta
reacción es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran
depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra.
El segundo método consiste en la extracción del aire contenido en la jarra a través de la
generación de vacío, sustituyendo el mismo por otro gas libre de O2 como el nitrógeno.
Para crear la atmósfera anaerobia se utiliza el sobre comercial que contiene una tableta de
borohidrato sódico, otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico y un catalizador de paladio.
Cuando se añade agua al sobre, el borohidrato sódico, bicarbonato sódico y ácido cítrico
reaccionan para formar hidrógeno y dióxido de carbono. El catalizador de paladio cataliza la
reacción entre el hidrógeno y el oxígeno presente dentro de la jarra. Esta reacción produce
agua, que se condensa en las paredes de la jarra. Para confirmar que la atmósfera es
anaerobia se coloca dentro de la jarra un papel indicador que contiene azul de metileno. Ëste
es azul en presencia de oxígeno y vira a blanco en un ambiente anaerobio.
El contenido final de la jarra consiste en una mezcla de gases conteniendo generalmente 8090% de nitrógeno, 5-10% de hidrógeno y 5-10% de CO2.
Bolsas de anaerobiosis
Consiste en una bolsa plástica transparente, gas impermeable, un indicador de anaerobiosis
(azul de metileno o resarzurina) y un sobre generador de anaerobiosis igual al utilizado para las
jarras. Una o dos placas de Petri pueden introducirse antes de sellar la bolsa. Este sistema
tiene las ventajas de su economía y practicidad, además de poder observar directamente si
existe crecimiento en las placas de Petri sin abrir el sistema; también se puede utilizar para los
sistemas de identificación tipo API-20A. Estas bolsas sirven además para el transporte de
muestras como habíamos visto anteriormente.
IDENTIFICACIÓN DE LOS ANAEROBIOS
Examen macroscópico de la muestra
Al recibir la muestra en el laboratorio debe ser examinada en busca de algunas características
que sugieren la presencia de anaerobios, como: olor fétido, gránulos de azufre (asociados a la
presencia de Actinomyces spp., Propionibacterium spp., o Eubacterium nodatum),
fluorescencia bajo luz ultravioleta (que ocurre ante la presencia de cepas pigmentadas de
Prevotella o Porphyromonas).
Tinción de Gram
Una característica general de los microorganismos anaerobios es su tendencia a tornarse
gramnegativos cuando se aplica la coloración de Gram, sea por la poca estabilidad frente a la
decoloración lo que los convierte en Gram inestables al examen directo de los materiales, sea
porque existe una variación tintorial en los cultivos bacteriológicos. Por esto es que pueden
realizarse las siguientes modificaciones a la técnica de la tinción de Gram:
• efectuar la decoloración solamente con alcohol etílico prescindiendo de la acetona
• prolongar el tiempo de contacto con lugol mas de 1 minuto.
Identificación
La morfología colonial así como la presencia de hemólisis, olor, etc. son algunas características
a tener en cuenta como primera aproximación a la identificación. Todas los morfotipos
coloniales de la placa de agar sangre incubada en anaerobiosis deben ser examinados con una
tinción de Gram y subcultivadas para determinar su aerotolerancia. Para ello cada colonia debe
ser subcultivada en una nueva placa de agar sangre en anaerobiosis y en una placa de agar
chocolate en CO2.
En la placa de agar sangre se colocan los siguientes discos de antibióticos para una
identificación preliminar de los anaerobios y no con fines de probar la susceptibilidad
antibiótica: kanamicina, colistina, vancomicina.
La identificación completa de los anaerobios es bastante costosa, frecuentemente requiere
varios tests bioquímicos, cromatografía gas-líquido de los productos metabólicos derivados de
la fermentación de la glucosa, y cromatografía de ácidos grasos de cadena larga. Es por esto
que en general la identificación completa o confirmatoria queda reservada a laboratorios de
referencia. La mayoría de los laboratorios clínicos deben conformarse con una identificación
presuntiva que además es suficiente para guiar la terapia antimicrobiana adecuada.
Una agrupación preliminar de los anaerobios se obtiene de la combinación de las siguientes
características: origen de la muestra, morfología microscópica, reacción al Gram, morfología
colonial, prueba de aerotolerancia.
.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gene.
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/micobacterias.pdf
6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
23. Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
24. Investigue acerca de las bacterias anaerobias presentes en la cavidad oral, que
complicaciones causan y como se las trata.
25. Cuales son las principales bacterias anaerobias presentes en muestras de tierra?
26. Investigue acerca del Clostridium tetani, que tipo de enfermedad produce, y cual es
su tratamiento.
27. Construya un cuadro sinóptico con las principales bacterias anaerobias que causan
infecciones en humanos.
ASIGNATURA:
MICROBIOLOGIA
SIGLA: ENF 303
PARALELO: 1
SESIONES
PRÁCTICA No 14
1
TEMA: PARASITOLOGIA
1.- OBJETIVO
Identificar parásitos de interés clínico en muestras de heces y sangre periférica, , cuál es su
método diagnóstico, que tipo de afecciones causan y cómo manejarlos hospitalariamente.
2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS
Adquirirás las siguientes habilidades:
Establecer importancia clínica y diagnostica en parasitos intestinales y periféricos.
3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Muestras de heces
Preservados de parásitos intestinales.
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Solución salina
Lugol parasitologico
PERIODO:
2014-2
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción:
¿Qué es Parasitología?
Parasitología: rama del conocimiento que estudia los organismos parásitos y los efectos que estos
organismos producen en los organismos hospedadores.
Fundamentalmente sustentada y estudiada por la biología, por sus importantes contribuciones e
implicaciones en medicina y veterinaria.
TERMINOLOGÍA
Huésped u hospedero: organismo que recibe el parásito. Varios tipos:
- Huésped definitivo: aquel que posee el parásito en su estado adulto o en el cual se reproduce
sexualmente.
- Huésped intermediario: aquel que posee las formas larvarias en desarrollo o en el cual se produce de
manera asexual.
- Huésped paraténico o transportador: es el que tiene formas larvarias que no se desarrollan en él.
- Huésped reservorio: aquel que es el responsable de la presencia de determinado parásito en la
naturaleza. Sintomáticos/Asintomáticos
Ciclos de vida: en parasitología, ciclo vital donde el hospedador esta directamente involucrado. Puede
ser:
- DIRECTO (Monoxenos): necesitan únicamente un hospedero
- INDIRECTO (Heteroxenos): se requieren por lo menos dos hospederos de especies diferentes para
completar el ciclo
Formas evolutivas: formas de desarrollo por las cuáles pasan los parásitos a lo largo del ciclo de vida.
En algunas especies pueden ser muy diversas.
Vector: artrópodos que sirven como transportadores de organismos patógenos. Dos tipos importantes:
- Mecánicos: se da la diseminación del patógeno por medio de la superficie corporal, apéndices, aparato
bucal, entre otros. (moscas)
- Biológicos: hospederos invertebrados que forman parte del ciclo del parásito que hacen ciclos de vida
indirectos.
Zoonosis parasitaria: cuando los parásitos de animales vertebrados se transmiten al hombre. Cuando
la parasitosis afectan igualmente al hombre y a los animales.
Denominaciones de los parásitos:
- Endoparásitos: aquellos que infestan a su hospedero internamente provocándole infecciones, se
localizan a la luz de una víscera o un órgano hueco (parásitos cavitarios o celozoicos); también pueden
parasitar tejidos (parásitos tisulares o histozoicos)
- Ectoparásitos: colonizan a su hospedador externamente produciéndole infestaciones, se localizan en la
superficie del cuerpo, pelos, plumas, entre otros.
Especificidad Parasitaria:
- Extenoxesnismo: relaciones parasitarias sumamente estrechas entre hospedador y parásito
- Euroxenismo: relaciones parasitarias de poca especificidad
Tipos de parasitismo:
- CLASICO: el parásito infecta a su hospedador natural en su hábitat correspondiente
- ERRÁTICO: el parásito se localiza en su hospedero natural, pero el hábitat es incorrecto
- EXTRAVIADO: parásito infecta hospedador anormal, el cual no es permisivo y no puede completar su
ciclo de desarrollo, por lo que el parásito muere
- ACCIDENTAL: parásito infecta hospedador anormal, pero este es permisivo para el desarrollo del
parásito. Ciclo no se completa
- FACULTATIVO: cuando en ciertas circunstancias organismos no acostumbrados a la vida parasitaria se
adaptan a esta
- ESPÚREO (Pseudoparasitismo): ingesta de microorganismos de vida libre, que son eliminados por las
heces luego de un tránsito por el tubo digestivo, sin infectar al hospedero.
ENFERMEDADES CAUSADAS POR PROTOZOARIOS:
AMEBAS COMENSALES: No causan una enfermedad imporantante, sin embargo como su vía de
infección es fecal-oral, sirven como medida indirecta del Indice de fecalismo (consumo de agua o
alimentos contaminados con materia fecal). Presentan un ciclo de vida directo.
Son organismos relativamente simples, que presentan un solo núcleo, que puede ser de dos tipos
dependiendo la especie:
- Vesiculosos
•Entamoeba: membrana nuclear con cromatina en placas adosadas a membrana interna, con cariosoma
central
•Limax: membrana nuclear sin cromatina adosada, esta y el cariosoma están en una sola masa dentro
del núcleo
- Compactos
Los estadíos evolutivos son:
- Trofozoitos: forma vegetativa, se alimenta y se mueve. (Membrana, citoplasma, núcleo y pseudópodos)
- Quistes: forma de resistencia, poseen: Pared quística, vacuola de glucógeno y cromatoidales (ADN,
ARN).
AMEBAS DE VIDA LIBRE: Habitan muy diversos hábitats (acuáticos, terrestres), TODAS poseen una
vacuola pulsátil que regula la presión osmótica y permite el movimiento por flotación en ambientes
acuáticos. Existen 3 especies importantes:
- Naegleria fowleri: única que produce patología en el hombre inmunocompetente(Meningoencefalitis
Amibiana Primaria: MAP)
- Balamuthia mandrillaris (produce meningoencefalitis)
- Acanthoameba sp. (produce meningoencefalitis)
Naegleria fowleri: Distribución geográfica amplia, sin embargo se ha encontrado presente en piscinas,
lagos, ¨spa´s¨, aguas termales, suelos y su reproducciónse ve aumentada durante el verano. Causan
alrededor de 100% mortalidad. Producen Meningoencefalitis Primaria Amibiana (MAP).
Se adquiere por el contacto de aguas contaminadas (bañistas), a través del sistema respiratorio. Se han
hallado en muestras de heces, garganta, vías nasales. En autopsias en el tejido cerebral se han
encontrado trofozoitos.
Síntomas: cefalea, anorexia, náuseas, vómito, fiebre, rigidez cuello, coma, muerte.
Acanthoameba/Balamuthia mandrillaris: poseen las formas evolutivas comunes: trofozoitos y quistes.
Son organismos oportunistas (cáncer, inmunodeficientes). Pueden afectac Sistema Nervioso Central
(Cerebro), ojos, piel y pulmón.
- Balamuthia mandrillaris: afecta pulmón y SNC. Produce GAE: Encefalitis amibiana granulomatosa
(Autopsia: quistes y trofozoitos en cerebro)
- Acantamoeba sp.: producen queratitis ocular (cuadro crónico)
AMIBIASIS: Ciclo patógeno de Entamoeba histolytica
Se da la presencia de síntomas intestinales principalmente: Disentería (diarrea con moso y sangre). Sin
embargo puede evolucionar a Colitis fulminante (penetración pared intestinal) y además si no se ha un
tratamiento oportuno, se pueden producir ciertas complicaciones: Apendicicitis, peritonitis, fistulaciones,
absceso hepático y compromiso de otros tejidos como pulmón, cerebro, bazo y riñón.
GIARDIASIS: Producida por Giardia intestinalis/Lamblia intestinalis. En el ser humano se ubican en:
intestino delgado, duodeno y yeyuno. En estos lugares se la la colonización por adhesión utilizando sus
discos suctorios.
La infección es fecal-oral (transmisión por agua y alimentos contaminados) y el ciclo de vida es directo:
trofozoitos y quistes.
Sintomatologia: Asintomática en personas adulatas, pero en niños es frecuente la presencia de : dolor
abdominal, malestar, pérdida peso. Las depocisiones son acuosas, pastosas, fétidas, blancuzcas,
mucosas y sin sangre. El diagnóstico se puede llevar a cabo en: heces, pero es difícil, se evidencia la
presencia de quistes.
TRICOMONIASIS: Causada por Trichomonas vaginalis (flagelado), produce vaginitis y es considerada
una enfermedad de transmisión sexual. Su ciclo de vida directo, pero no presenta formas quísticas y su
reproducción es por fisión binaria. Los síntomas asociados en mujeres son: Prurito vaginal, irritación
uretral y descarga de flujo. Los hombres suelen ser asintomáticos.
LEISHMANIASIS:
Causada por protozoarios del género Leishmania sp (existen 32 especies distintas, 20 producen la
enfermedad). Es considerada una zoonosis y se da principalmente en regiones tropicales y subtropicales
del mundo.
La enfermedad básicamente puede darse en diversas formas, principalmente:
- Forma Visceral (mortal)
- Forma Cutánea
- Forma Muco-cutánea (Deformantes)
El parásito tiene un ciclo de vida indirecto, con dos formas evolutivas evidentes:
•Amastigotos (Mamífero): formas intracelulares (macrófagos)
•Promastigotos (Vector): formas extracelulares en el sistema digestivo del vector (infectantes)
En muchos casos existen reservorios de la enfermedad (perros)
VECTOR:
- Plebothomus sp (Viejo Mundo)
- Lutzomia sp (Nuevo Mundo)
Nombres comunes: aliblanco, papalomoyo. Activo en las noches (a partir de las 5 de la tarde). Hay
diferencias con respecto a la preferencia de especie de Leishmania según vector (Alta especificidad)
Ciclos transmisión:
- Selvático
- Peridomiciliar
- Zoonosis urbana
- Antroponosis (persona-persona: ciclo artificial)
Diagnóstico:
- Frotis directo lesión
- Cultivo
- Otras técnicas: PCR, sondas ADN, serología (ELISA)
ENFERMEDAD DE CHAGAS: Lamada también: tripanosomiasis americana. Cusada por Trypanosoma
cruzi. Posee un ciclo de vida indirecto (hospedero vertebrado/hospedero invertebrado) en donde
presenta tres estadios evolutivos diferentes:
- Amastigotos
- Epimastigotos
- Tripomastigotos
Vector: Triatominos
- Triatoma dimidiata
- Triatoma infestans
- Rhodniux prolixus
- Panstrongylus megistus
La enfermedad se encuentra estrechamente ligada a la pobreza. Los ciclos de Transmisión:
- Ciclo silvestre o zoótico
- Ciclo intermedio o zooantrópico
- Ciclo domiciliario o antrópico
Reservorios: Zorro pelón, armadillos, perros, gatos, roedores comensales
Hospedero vertebrado : se encuentran las siguientes formas:
- Amastigotos
- Tripomastigotos sanguíneos
Vías de transmisión:
- Congénita
- Sangre
Fases enfermedad:
- Aguda
- Indeterminada
- Crónica
Diagnóstico:
- Examen microscópico de sangre fresca
- Concentraciones de sangre por centrifugación
- Cultivos
- Xenodiagnóstico
- Serología
Prevención: Control de vectores
TOXOPLASMOSIS: Causado por el parásito Toxoplasma gondii, parásito eurixeno de ciclo de vida
indirecto:
- Hospedero definitivo (Familia Felidae)
- Hospedero intermediario: animales de sangre caliente (roedores, monos, humanos)
Vías de transmisión:
- Por contaminación
- Fetal (Congénita)*
Infección usualmente asintomática, puede presentar una forma congénita:
- Exposición durante el embarazo (infección intrauterina)
- Manifestaciones oculares, sistema nervioso central y sistémicas (hidrocefalia, corioretinitis,
calcificaciones intracerebrales, ceguera, encefalitis, retardo, epilepsia)
- Diagnóstico prioritario en población femenina en edad reproductiva.
MALARIA O PALUDISMO: Causada por parásitos del género Plasmodium. Varias especies:
- P.vivax
- P.malariae
- P.falciparum
- P.ovale
Ciclo de vida indirecto:
- Hospedero definitivo (Hombre)
- Hospedero intermediario (Mosquito) Anopheles
Cuadro clínico:
- Fiebre ondulante
- Problemas respiratorios
- Convulsiones
- Colapso circulatorio (Hipotensión)
- Sangrados
- Ictericia
- Anemia severa
- Hemoglobinuria
- Hipoglicemia
- Acidosis metabólica
- Falla renal
Los niños son los más afectados. El diagnóstico se puede hacer por métodos directos como:
•Frotis
•Gota Gruesa
PROCEDIMIENTOS:
1. Colocar una gota de NaCl 0.85%, y una de lugol en un porta objetos limpio.
2. Con un palillo obtener una cantidad pequeña y representativa de materia fecal,
(aproximadamente 2mcg) y mezclar en la gota de solución salina.
3. Con el mismo pallillo pasar a la solución de lugol y mezclar hasta obtener una
suspensión uniforme.
4. Colocar un cubreobjetos en cada una de las mezclas (salina y lugol) .
5. Observar y realizar la búsqueda con el objetivo de 10X y diagnostico con 40X.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Manual de Practicas de Microbiología General, Aquiauhualt Ma de los Angeles,
Universidad Autonoma Metropolitana, México 2012, disponible en línea:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gene.
http://ocw.usal.es/ciencias-biosanitarias/parasitologiabiologia/contenidos/5_practicas2010_11.pdf

6.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS
CUESTIONARIO
28. Grafique los procedimientos y observaciones realizadas en esta práctica.
29. Investigue el ciclo biológico de los protozoos intestinales.
30. Investigue el ciclo biológico de los nematodos instestinales.
31. Investigue el cilco biológico de los hemoparasitos.