ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA BIOSINTÉTICA DE
CAROTENOS, Y CUANTIFICACIÓN DE CAROTENOS EN HOJAS Y RAÍCES DE
PLANTAS DE YUCA A DIFERENTES EDADES
JACOBO ARANGO MEJIA
MANABU ISHITANI
DIRECTOR
PAUL CHAVARRIAGA
CODIRECTOR
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Biólogo
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
Bogotá, D.C.
Enero 2006
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,
antes bien sea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Cali, Enero 2006
Señores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Bogota D.C
Estimados Señores:
Yo Jacobo Arango Mejía, identificado con C.C. No. 75096489, autor del trabajo de grado
titulado “Análisis de expresión de los genes de la ruta biosintética de carotenos, y
cuantificación de carotenos en hojas y raíces de plantas de yuca a diferentes edades”
presentado como requisito para optar al título de Biólogo en el año de 2006; autorizo a la
Universidad Javeriana a:
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo para la consulta en
la Biblioteca General. Si
b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web de la Facultad, de
la Biblioteca General y en redes de información con las cuales tenga convenio la Universidad
Javeriana. Si
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado para participar
en concursos de trabajos de grado. Si
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con las que la
facultad tenga convenio de intercambio de información, para que este sea consultado en las
bibliotecas y centros de documentación de las respectivas entidades. No
e) Todos los usos, que tengan finalidad académica.
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido en el
artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, los cuales
son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior,
siempre que se consulte la obra, mediante cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su(s)
autor(es). Este
documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor(es) pacte con la Unidad Académica
referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir de la
actividad académica.
Jacobo Arango M.
C.C. 75096489
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA BIOSINTÉTICA DE
CAROTENOS, Y CUANTIFICACIÓN DE CAROTENOS EN HOJAS Y RAÍCES DE
PLANTAS DE YUCA A DIFERENTES EDADES
JACOBO ARANGO MEJIA
APROBADO
Manabu Ishitani
Director
Paul Chavarriaga
Codirector
Camilo Lopez
Universidad Nacional
Ivonne Balzer
Universidad Javeriana
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA BIOSINTÉTICA DE
CAROTENOS, Y CUANTIFICACIÓN DE CAROTENOS EN HOJAS Y RAÍCES DE
PLANTAS DE YUCA A DIFERENTES EDADES
JACOBO ARANGO MEJIA
APROBADO
Dr. Angela Umaña
Decano Académico
Dr. Cecilia Espíndola
Director de Carrera
FORMATO DESCRIPCIÓN TRABAJO DE GRADO
AUTOR O AUTORES
Apellidos
Nombres
Arango Mejía
Jacobo
DIRECTOR (ES)
Apellidos
Nombres
Ishitani
Manabu
ASESOR (ES) O ASESOR
Apellidos
Nombres
Chavarriaga
TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE:
Paul
Biólogo
TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO:
“Análisis de expresión de los genes de la ruta biosintética de carotenos, y cuantificación de
carotenos en hojas y raíces de plantas de yuca a diferentes edades”.
FACULTAD: Ciencias Básicas
PROGRAMA: Carrera pregrado
NOMBRE DEL PROGRAMA: Biología
CIUDAD: BOGOTA AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: 2006
NÚMERO DE PÁGINAS: 96
TIPO DE ILUSTRACIONES:
Ilustraciones; Tablas; Gráficos y diagramas; Fotografías.
MATERIAL ANEXO (Vídeo, audio, multimedia o producción electrónica):
Duración del audiovisual: ___________ Minutos.
Número de casetes de vídeo: ______ Formato: VHS ___ Beta Max ___ ¾ ___ Beta Cam ____
Mini DV ____ DV Cam ____ DVC Pro ____ Vídeo 8 ____ Hi 8 ____
Otro. Cual? _____
Sistema: Americano NTSC ______ Europeo PAL _____ SECAM ______
Número de casetes de audio: ________________
Número de archivos dentro del CD (En caso de incluirse un CD-ROM diferente al trabajo de
grado:
__________________________
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES.
Carotenos, expresión génica, HPLC, PCR en tiempo real, Yuca.
RESUMEN DEL CONTENIDO
Tres variedades de Manihot esculenta con diferencias evidentes en coloración de la raíz
fueron sometidas a análisis de expresión de genes involucrados en la ruta de biosíntesis
de carotenos (MeGGPS, MePSY, MePDS, MeZDS y MeLCYB) por PCR en tiempo real,
y a cuantificación de carotenos totales y β-caroteno por HPLC. Plantas de tres y seis
meses de edad fueron analizadas tomando muestras de hojas y raíces para establecer una
relación entre fenotipo (coloración raíz), acumulación carotenos y expresión génica entre
las variedades. El análisis estadístico de los resultados sugiere una relación entre
coloración de la raíz (fenotipo) y contenido de carotenos totales y β-caroteno en la raíz;
sin embargo los datos de expresión génica no mostraron diferencias de expresión en los
genes
evaluados
que
sostengan
esta
relación
a
nivel
molecular.
TABLA DE CONTENIDO
1
INTRODUCCIÓN
2
2
MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
4
2.1
Cultivo de la yuca
4
2.2
Calidad nutricional y contenido de carotenos
4
2.3
Carotenoides y su importancia
5
2.4
Ruta biosintética de carotenos en plantas
2.4.1
Regulación de la ruta biosintética
7
10
2.5
Biotecnología aplicada a carotenoides
12
2.6
Transformación genética en yuca
13
2.7
PCR en Tiempo Real
13
2.8
Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)
16
3
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
18
3.1
Formulación del problema
18
3.2
Justificación
18
4
OBJETIVOS
21
4.1
Objetivo General
21
4.2
Objetivos Específicos
21
5
MATERIALES Y MÉTODOS
22
5.1
Diseño de la investigación (diagrama de flujo)
5.1.1
Población de estudio y muestra
5.1.2
Variables de estudio
22
23
23
5.2
24
Métodos
5.3
Análisis de Información
5.3.1
Expresión génica
5.3.2 Cuantificación de Carotenos
30
30
31
i
6
RESULTADOS
32
6.1
Escogencia de las variedades
32
6.2
Diseño de iniciadores:
33
6.3
Extracción de ARN
34
6.4
Síntesis de ADN copia
36
6.5
Amplificación de las muestras en PCR en tiempo real
6.5.1
Cuantificación con la marca Fluorescente SYBR® Green:
6.5.2
Confirmación de la expresión génica detectada por SYBR® Green con la
metodología TaqMan®:
42
6.6
45
7
7.1
Cuantificación de carotenos totales y β-caroteno:
DISCUSIÓN
36
38
49
Selección de las variedades
49
7.2
Cuantificación de carotenos totales y β-caroteno:
7.2.1
Análisis de varianza:
49
50
7.3
Cuantificación de la expresión de los genes de la ruta biosintética:
52
7.4
Comentarios sobre metodología
55
8
CONCLUSIONES:
58
9
RECOMENDACIONES
59
10
LITERATURA CITADA
60
11
ANEXOS
66
11.1
Anexo 1. Protocolo de extracción de Carotenos totales y β-caroteno.
66
11.2
Anexo 2. Protocolo para cuantificación de β-caroteno por método HPLC
68
11.3
Anexo 3. Protocolo de extracción de ARN de raíz de yuca.
71
11.4
Anexo 4.Análisis de los datos de PCR en tiempo real.
74
11.5
Anexo. 5 Análisis estadístico medición carotenos totales y β-carotenos
75
ii
RESUMEN
Tres variedades de Manihot esculenta con diferencias evidentes en coloración de la raíz
fueron sometidas a análisis de expresión de genes involucrados en la ruta de biosíntesis de
carotenos (MeGGPS, MePSY, MePDS, MeZDS y MeLCYB) por PCR en tiempo real, y a
cuantificación de carotenos totales y β-caroteno por HPLC. Plantas de tres y seis meses de
edad fueron analizadas tomando muestras de hojas y raíces para establecer una relación
entre fenotipo (coloración raíz), acumulación carotenos y expresión génica entre las
variedades. El análisis estadístico de los resultados sugiere una relación entre coloración de
la raíz (fenotipo) y contenido de carotenos totales y β-caroteno en la raíz; sin embargo los
datos de expresión génica no mostraron diferencias de expresión en los genes evaluados
que sostengan esta relación a nivel molecular.
ABSTRACT
Three varieties of Manihot esculenta with evident differences in root color were subjected
to expression analysis of genes involved in the carotene biosynthesis pathway (MeGGPS,
MePSY, MePDS, MeZDS y MeLCYB) using Real Time PCR, and to total carotene and βcarotene quantification using HPLC. Three and six month old plants were analyzed taking
leaf and root samples to establish a relationship between phenotype, biochemical profile
and genotype among varieties. Statistical analysis of results suggests a relationship between
root color (phenotype) and total and β-carotene content; however, gene expression data did
not show expression differences in the evaluated genes that may support this relationship at
a molecular level.
1
INTRODUCCIÓN
La yuca, (Manihot esculenta Cranzt), perteneciente a la familia Euphorbiaceae, es un
cultivo de amplia distribución mundial principalmente en países en vía de desarrollo
ubicados en América Latina, Asia y África. Forma parte fundamental de la alimentación de
más de 500 millones de personas y alrededor de 70 millones de personas obtienen de la
yuca más de 500 calorías al día por individuo. La yuca es productiva en suelos marginales,
capaz de resistir enfermedades, sequía y plagas, y es flexible en su tiempo de cosecha; por
eso es un cultivo muy adaptable y vigoroso que se consume en regiones donde prevalecen,
muchas veces, la sequía, la pobreza y la desnutrición.
La raíz de la yuca es un órgano muy rico en hidratos de carbono en forma de almidón, por
lo que el aporte calórico es considerable. Entre su aporte en nutrientes se destaca la
presencia de vitamina C, B2, B6, magnesio y potasio, notándose la ausencia, o en el mejor
de los casos muy bajos niveles de vitamina A. Pese a la importancia que tiene como cultivo
alimentario en numerosos países en desarrollo, los planes de mejora en el aporte vitamínico
se iniciaron hace poco tiempo.
La deficiencia de la vitamina A ha sido considerada como uno de los problemas
nutricionales más comunes a nivel mundial. Los análisis de la UNICEF indican que un
suministro adecuado en la dieta de vitamina A podría prevenir aproximadamente de uno a
dos millones de muertes anuales entre niños de uno a cuatro años. Adicionalmente, la
Organización Mundial de la Salud calcula que cada año pierden la vista más de 250,000
niños porque su consumo de vitamina A es insuficiente.
La vitamina A se presenta principalmente en dos formas: como vitamina A propiamente
dicha, encontrada en productos lácteos y otras fuentes de origen animal, o en forma de
provitamina A (β-caroteno), que se convierte en vitamina A en el cuerpo y se encuentra en
alimentos de origen vegetal. Un incremento de provitamina A (β-caroteno) en la yuca,
2
aseguraría una mejor salud visual (menos casos de ceguera), y en general una vida más
saludable para la gente de las regiones más pobres del planeta.
Varios grupos de investigación de distintos países, han encaminado esfuerzos para
incrementar el aporte de vitamina A de los alimentos de la dieta básica humana mediante
biotecnología; entre estas especies se encuentran el arroz, la canola y el tomate, en las
cuales se ha logrado insertar genes que codifican enzimas de la ruta de biosíntesis de
carotenoides, obteniendo variedades con niveles aumentados de carotenoides, incluyendo
por supuesto el β-caroteno.
Para poder generar variedades de yuca con mayores niveles de β-caroteno en la raíz, se
debe conocer en detalle el funcionamiento de la ruta de biosíntesis de carotenos en este
órgano. Con este objetivo presente, se pretende generar el conocimiento que permita un
mejor entendimiento de la ruta biosintética de carotenos en yuca, cuantificando los niveles
de expresión de los genes que codifican las enzimas de la ruta de biosíntesis de β-caroteno
en la raíz y en la hoja. La cuantificación se llevó a cabo en dos edades de la planta (tres y
seis meses) y a su vez en tres variedades con distintos contenidos de carotenos totales y βcaroteno, utilizando la tecnología de PCR en tiempo real. Paralelamente se establecieron
los niveles de acumulación de los carotenos totales y del pigmento β-caroteno en las hojas
y en la raíz de yuca con la tecnología de HPLC. El conocimiento generado en este trabajo
sirvió de base para identificar puntos claves regulatorios de la ruta de biosíntesis de
carotenos.
El presente trabajo se enmarca dentro de un gran programa internacional llamado
Harvestplus, el cual consiste en una investigación interdisciplinaria, que intenta reducir la
desnutrición humana por micronutrientes, centrado en la investigación agrícola y
nutricional para lograr cultivos alimentarios (fríjol, yuca, maíz, arroz, batata, trigo entre
otras) con niveles más altos de micronutrientes (hierro, zinc y vitamina A). El programa
Harvestplus recibe el apoyo generoso de la Fundación Bill y Melinda Gates, de la Ayuda
Danesa para el Desarrollo Internacional (DANIDA), de la Agencia Sueca para el
Desarrollo Internacional (SIDA), de la Agencia Estadounidense para el Desarrollo
Internacional (USAID) y del Banco Mundial.
3
2
MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
2.1
Cultivo de la yuca
La yuca es cultivada hace más de 5000 años en América tropical y hace 400 años en
África. Es el alimento básico para cerca de 500 millones de personas, incluidos aquellos
países en donde las enfermedades causadas por la deficiencia de vitamina A (VAD) son un
serio problema (Ospina & Ceballos, 2002).
Manihot esculenta es considerada como un cultivo de subsistencia, debido a su alta
capacidad de adaptación a suelos ácidos e infértiles, a su relativa resistencia a malezas y
plagas y a su habilidad para resistir largos períodos de sequía. Crece en áreas en donde la
precipitación anual es mayor de 500 mm y la temperatura es superior a 20 °C, sin embargo
algunas variedades crecen en los 2000 m de altura o áreas subtropicales, con temperatura
promedio de 16 °C (Ekanayake et al, 1997). El área de cultivo de la yuca bajo condiciones
marginales ha estado continuamente incrementándose, particularmente en zonas con suelos
pobres y largas estaciones de sequía (Jos et al, 1990). Actualmente la yuca es cultivada en
92 países, considerándose el cuarto producto básico más importante del mundo, después
del arroz, trigo y maíz; se cosechan más de 170 millones de toneladas de raíces frescas,
estimándose que para el presente año su producción global podría incrementarse en un
30%. (Anónimo a, 1997)
2.2
Calidad nutricional y contenido de carotenos
La yuca ha sido tradicionalmente considerada como un alimento básico, con calidad
nutricional moderada, en especial la raíz tuberosa se resalta solamente como fuente de
almidón, pues cerca del 90% de su peso seco lo constituyen carbohidratos (Ospina &
Ceballos 2002; El-Sharkawy, 2003, Boiteux et al,2001).
4
A pesar de que se ha establecido una relación entre el color amarillo y la concentración de
componentes de provitamina A en raíces de yuca (Iglesias et al, 1997), las raíces de la
mayoría de los cultivares son blancas (Ospina & Ceballos 2002), cuya porción comestible
tiene niveles bajos de carotenos (Jos et al, 1990). La yuca de color amarillo es un cultivo
poco común en Colombia, Filipinas, Jamaica, y algunos países africanos (El-Sharkawy,
2003). Los tipos amarillo y naranja también son conocidos en Brasil, pero la mayoría de las
variedades de yuca consumidas en ese país tienen bajo contenido de carotenos (Chávez et
al, 2000).
Los trabajos realizados por Bradbury & Holloway (1988), citado por Adewusi & Bradbury,
(1993), mostraron que las raíces blancas de yuca pueden contener pequeñas cantidades de
β-caroteno, en contraste con las raíces amarillas que pueden tener un contenido mucho
mayor. No obstante, en muchas de las variedades amarillas, una gran cantidad de
carotenoides podría existir en formas que no aportan provitamina A, como la luteína
(Fregene & Puonti-Kaerlas, 2002).
2.3
Carotenoides y su importancia
En general, los carotenoides juegan roles importantes en la planta, como son el de servir
como protectores contra la foto oxidación en células y tejidos, como pigmentos accesorios
y como determinantes estructurales de los complejos pigmento-proteína en los plastidios de
plantas (Bartley & Scolnik, 1994). Los carotenoides en particular, recogen la luz radiante
en la región azul del espectro (400-600 nm), una región que no es cubierta por las
clorofilas. La energía absorbida por los carotenoides en estas longitudes de onda puede ser
transferida al centro de reacción fotosintética vía clorofilas (Bartley & Scolnik, 1995).
Adicionalmente los carotenoides actúan como atenuadores de los en estados excitados en
las clorofilas que son generados durante la fotosíntesis. Los carotenos sirven también como
señales en los plastos. Se cree que el gen que codifica para Fitoeno desaturasa, gen
importante en la ruta biosintética de carotenos, está regulada por retroalimentación a nivel
de trascripción, mediante la acumulación de productos finales de la vía de carotenogénesis
(Rommel, 2001).
5
Los carotenoides son sustancias hidrofóbicas y lipofílicas virtualmente insolubles en agua.
Aquellos que están basados en hidrocarbonos son colectivamente llamados carotenos,
mientras que aquellos que contienen átomos de oxígeno con grupos funcionales como
hidroxi, metoxi-, oxo-, epoxi-, carboxi-, aldehido, etc son comúnmente llamados xantofilas
(Armstrong, 1997) La síntesis de carotenoides se lleva a cabo invariablemente en los
plástidios, por ejemplo el cloroplasto, cromoplasto etc.
Los carotenoides son componentes químicos de lo que colectivamente se conoce como la
vía de biosíntesis de los terpenoides (Cunningham & Grantte, 1998). Los terpenoides son
compuestos químicamente diversos y estructuralmente complejos construidos de unidades
de isopreno de 5 carbonos, por lo que también suelen ser llamados isoprenoides. Se estima
que las plantas sintetizan más de 30.000 diferentes terpenoides (Brown & Somerville,
2001), convirtiéndolo en la clase más grande de productos naturales (Bramley, 2002). Los
terpenoides tienen diferentes funciones, como son las de estabilizadores de membranas
(fitoesteroles), hormonas (giberelinas y ácido abcisico), pigmentos fotosintéticos (cadenas
de fitol de la clorofila y carotenoides), transportadores de electrones (plastoquinona,
prenilquinonas y ubiquinona), vitaminas como tocoferol (vitamina E), filoquinona
(vitamina K1), (Römer et al, 2000). En adición a esas funciones fisiológicas, metabólicas y
estructurales, muchos terpenoides específicos (comúnmente las familias C10, C15, y C20)
sirven para comunicación y defensa (McGarvey & Croteau, 1995).
En humanos, los carotenoides como el β-caroteno, son convertidos en vitamina A (retinal)
por la acción de la enzima intestinal mono-oxigenasa; esta es la función de los carotenoides
mejor establecida y está restringida a los carotenoides con el anillo β. La conversión de βcaroteno en la matriz intestinal depende del ambiente del carotenoide, y la tasa de
conversión es 6:1 (6 µg de β-caroteno es equivalente a 1 µg de retinal), (Taylor & Ramsay,
2005). La presencia de provitamina A en la dieta puede prevenir afecciones oculares como
la xeroftalmia y enfermedades oculares relacionadas con la edad como las cataratas y la
degeneración macular (Fraser & Bramley, 2004). Se ha demostrado que la administración
de vitamina A a los niños pequeños en las poblaciones con alimentación insuficiente
6
permite reducir en un 23% la mortalidad general. Se calcula que una medidas de este tipo
permitirían evitar anualmente hasta 2,5 millones de muertes entre los niños menores de 5
años (Anónimo b, 2004) .
El β- caroteno, junto con otros carotenos como el licopeno, también han sido relacionados
con la disminución del riesgo de adquirir cáncer de pulmón (Wurtzel, 2001; Fraser &
Bramley, 2004 ), cáncer de seno, cáncer de próstata (Agarwal, 2000) entre otros. De igual
manera, estos carotenos se han relacionado con la protección contra enfermedades
coronarias (Bartley & Scolnik, 1994; Palace et al, 1999).
2.4
Ruta biosintética de carotenos en plantas
La biosíntesis de carotenos tiene un origen evolutivo muy antiguo, evidencia de ello es su
síntesis en bacterias con fotosíntesis anaerobia y aerobia al igual que en eubacterias que no
realizan fotosíntesis (Harker & Bramley, 1999). Los pasos iniciales de su síntesis han sido
conservados a través del proceso evolutivo (Cerrullo, 2002). En plantas los carotenos son
sintetizados y almacenados en los plastidios, existiendo evidencia substancial de la
participación de las membranas plastídicas en su biosíntesis (Fraser & Bramley, 2004).
Adicionalmente se han encontrado ejemplos de una diversidad bioquímica en la ruta de
biosíntesis para carotenos y en la compartimentalización de sus constituyentes en tejidos
específicos, como es el caso de las raíces tuberosas de yuca en donde se ha identificado en
algunos cultivares la presencia de carotenos como licopeno y luteína (Boiteux et al, 2001).
La ruta biosintética que envuelve la formación de los carotenoides fue elucidada entre 1950
y 1960 usando aproximaciones bioquímicas clásicas, con inhibidores específicos y
mutantes bloqueando ciertos pasos en la ruta (Figura 1) (Cunningham, 2002).
Isoprenil difosfato (IPP), cosiderado como el precursor de todos los isoprenoides, se
isomeriza a su isomero alélico Dimetilalil difosfato (DMAPP), para luego por intermedio
de la enzima Geranilgeranil difosfato sintasa (GPPS) generar un compuesto de 20 carbonos
derivado de cuatro unidades de isopreno (5 carbonos) denominado Geranilgeranil
7
pirofosfato (GGPP) (Taylor & Ramsay, 2005). El GGPP es el precursor intermediario de
los carotenoides y se ubica en el estroma. De este punto en adelante, toda la ruta metabólica
pasa del estroma a la membrana plastidica. La primera reacción específica de la ruta de
biosíntesis de carotenos es la condensación cabeza-cabeza de dos moléculas de trans de
GGPP para formar fitoeno. Todas las reacciones subsecuentes involucran la conversión de
esta estructura básica (Cunningham & Grantte, 1998).
Figura 1. Ruta de biosíntesis de los carotenos en plantas. Abreviaciones de los genes de
importancia en el estudio GGPS Geranil fitoeno sintasa PSY fitoeno sintasa, PDS fitoeno
desaturasa, ZDS z-caroteno desaturasa, CRTISO caroteno isomerasa, LCYb licopeno β-ciclasa,
CRTISO caroteno isomerasa (Cunningham, 2002).
La reacción de síntesis de fitoeno está catalizada por la enzima Fitoeno sintasa, que se cree
es un polipéptido monomérico aislado o fuertemente asociado a la membrana del
cloroplasto (Cunningham, 2002).
El fitoeno posteriormente sufre cuatro reacciones de desaturación, hasta formar licopeno.
La introducción de dobles enlaces procede en sucesión alternante a la derecha e izquierda
de la parte central de fitoeno (Cunningham, 2002). Esas desaturaciones sirven para alargar
8
las series conjugadas de enlaces carbono-carbono que constituyen el cromóforo en los
pigmentos carotenoides (Fraser & Bramley, 2004).
En contraste con las bacterias y hongos, en donde se realizan las reacciones de desaturación
con una única enzima (crtI), en plantas son necesarias cuatro reacciones secuenciales para
transformar fitoeno en licopeno, catalizadas por dos enzimas, Fitoeno desaturasa (PDS) y
Z-Caroteno desaturasa (ZDS) (Shaub et al, 2005). La primera desaturasa (PDS) utiliza
cada lado del simétrico fitoeno para producir z-caroteno. La segunda desatura (ZDS) lleva
a cabo la reacción con z- caroteno para formar licopeno (Cunningham, 2002).
Las desaturasas están asociadas a las membranas de cloroplastos y cromoplastos (Bartley &
Scolnik, 1995). En las plantas producen una forma cis de licopeno, produciendo prolicopeno el cual debe ser isomerizado a la forma trans licopeno por la isomerasa
recientemente identificada CRTISO (Isaacson et al, 2002).
Los carotenoides en el aparato fotosintético de las plantas son componentes bicíclicos
(Cunningham & Grantte, 1998). En esta reacción de ciclización sobre licopeno, son
formados dos tipos de anillos, los anillos beta como un grupo final a ambos lados del βcaroteno y los anillos con α-caroteno. Estos anillos difieren únicamente en la posición del
doble enlace en el anillo (Cunningham, 2002).
Un único producto génico, la Licopeno β-ciclasa (LCY-β) cataliza la formación del βcaroteno (Fraser & Bramley, 2004) y de un anillo de α-caroteno a partir de licopeno.
(Cunningham, 2002). La enzima que forma los anillos ε es conocida como licopeno εciclasa y provee de un anillo al α-caroteno del cual se deriva la luteína, el carotenoide
predominante en los tejidos fotosintéticos de plantas y algas (Cunningham & Grantte,
1998). A partir de α-caroteno ó β-caroteno se forman los carotenoides oxigenados
(xantofilas), los cuales comprenden la mayoría de los pigmentos en la membrana del
tilacoide en plantas (Cunningham, 2002).
9
Regulación de la ruta biosintética
La biosíntesis y la acumulación de los carotenoides en los plastos se realiza al tiempo con
el ensamblaje de complejo antena para la captación lumínica y los centros de reacción,
donde estos pigmentos están íntimamente asociados. (Cunningham, 2002). El papel central
de los carotenoides en el desarrollo y adaptación de la planta sugiere que su síntesis es
coordinada con otros procesos de desarrollo como la formación de plastos, floración y
desarrollo del fruto (Fraser & Bramley, 2004).
Es mucho lo que hay por conocer para responder la pregunta de ¿cuáles son los
mecanismos empleados por las plantas para determinar qué carotenoides y en qué cantidad
son acumulados en los plastos?. Hasta el momento existe evidencia fuerte de que la
reacción catalizada por Fitoeno sintasa (PSY) es un importante punto de control para
regular el flujo a través de la ruta biosintética (Welsch et al, 2001). Además de este
reconocido punto regulatorio, Cunnningham en el 2002 reconoce dos puntos más:
Disponibilidad de sustrato y ramificaciones de la ruta metabólica.
Los carotenoides son isoprenoides formados por unidades de cinco carbonos, Isopentenil
difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP) los cuales son los precursores de la vía de
todos los isoprenoides. Ambos, IPP y DMAPP son producidos en diferentes
compartimientos por dos rutas diferentes en las células vegetales(Cunningham, 2002). La
ruta del mevalonato (MVA), conocida hace bastante tiempo, que se lleva a cabo en el
citosol; esta vía empieza con Acetil CoA hasta formar IPP, el cual realiza una reacción
reversible con DMAPP por medio de la enzima Isopentenil Isomeraza (IPI). Por otro lado,
la ruta del Metileritrol, descubierta recientemente en bacterias como cianobacterias se lleva
a cabo en los plastos, sitio de síntesis de los carotenoides en las plantas. Esta ruta emplea
piruvato y gliceraldehido 3 fosfato (GAP) como sustratos iniciales para finalmente producir
IPP y DMAPP separadamente en una ramificación de la vía (Cunningham, 2002).
La ramificación de la vía como mecanismo de regulación se hace evidente en las
reacciones de ciclización en el paso de licopeno a alfa caroteno y luteína. En esta
ramificación el Licopeno puede ser ciclado o por la enzima licopeno beta ciclasa (LCYβ) o
10
por la Licopeno epsilon ciclasa (LCYε); la primera le confiere dos anillos del tipo beta y la
segunda uno beta y otro epsilon. Mutantes de LCYε en Arabidopsis thaliana acumulan dos
veces más luteína que el tipo silvestre (Fraser & Bramley, 2004).
Una ruta ramificada como la de la formación de los carotenoides, es poco probable que sea
controlada por un solo proceso regulatorio; por el contrario es más probable que existan
puntos de control en cada ramificación, y que además involucre eventos transcripcionales y
postranscripcionales (Welsch et al, 2001).
Regulación transcripcional positiva y negativa de los genes carotenogénicos ha sido
encontrada en procesos tales como la maduración del tomate, desarrollo de la flor en
tomate y marigold o flor de muerto (Tagetes erecta), narciso de los prados (Narcissus
pseudonarcissus) y melón, y la maduración de la fruta en cítricos. De estos estudios se ha
concluido que el gen PSY ejerce el mayor control en el flujo de la ruta (Welsch et al,
2002). Adicionalmente a estos procesos, la intensidad de la luz aparentemente aumenta la
formación de carotenoides aumentando la expresión de ciertos genes; por ejemplo en la
mostaza (Brassica sp.) el nivel de ARN mensajero del gen PSY aumenta con la luz,
mientras los niveles de PDS y GGPS (Geranilgeranil pirofosfato) continúan constantes
(Von Lintig et al, 1997)
La retención de carotenoides en las células es una forma de regulación. Aparentemente los
cloroplastos y cromoplastos difieren considerablemente en la forma de retener los
productos finales de los carotenoides. En los cloroplastos los productos finales de los
carotenoides están asociados con los complejos de absorción lumínica (Vishnevetsky et al,
1999). Los carotenoides que no se asocian a estos complejos se asocian con proteínas
especificas como pequeños plastoglobulos. En Cromoplastos de la pimienta los productos
finales de los carotenoides son esterificados y asociados con proteínas como fibrinas. La
esterificación de los carotenoides aparece como un mecanismo efectivo utilizado por
muchas flores (girasol, daffodil y marigold) para producir niveles altos de carotenoides. De
otro lado los cromoplastos del tomate secuestran el licopeno como cristales.
11
2.5
Biotecnología aplicada a carotenoides
El enorme progreso en el clonaje de genes carotenogénicos abrió la posibilidad de
modificar la ruta de biosíntesis en plantas (Sandmann, 2001). Por ejemplo, la
disponibilidad de clones de genes para biosíntesis de carotenos hizo posible la
modificación genética del arroz para producir más β-caroteno o provitamina A en su
endospermo produciendo una nueva variedad conocida como arroz dorado o “Golden rice”
(Ye et al, 2000). Este progreso biotecnológico fue un éxito para la genética y para la salud
pública (Wurtzel, 2001, Zimmerman & Hurrel, 2002). En canola, Brassica napus, la sobre
expresión del gen crtB bacterial con un promotor específico fue suficiente para incrementar
el contenido de β-caroteno 50 veces (Shewmaker et al, 1999). En marzo del presente año
Paine y colaboradores (2005) publicaron una segunda versión del “Golden Rice” donde
reemplazaron el gen PSY usado en el trabajo inicial de Ye et al (2000) por uno de Maíz, en
combinación con la desaturasa bacterial (crtI) y observaron una producción de carotenoides
23 veces mayor en la nueva variedad de arroz.
La caracterización de los niveles de expresión de genes de carotenos en yuca, podría
contribuir al conocimiento de la vía metabólica y comprender mejor la forma de regulación
de la ruta biosintética de β-caroteno. Por ingeniería genética se podría mejorar los puntos
débiles de la ruta y así obtener nuevos cultivares con calidad nutricional mejorada. Varios
estudios han demostrado que los niveles de ARN mensajero (ARNm) de los genes que se
expresan en la ruta de biosíntesis son fuertemente regulados en tejidos tales como flores y
frutos, indicando que los pasos transcripcionales y postranscripcionales son blancos
potenciales para la regulación de la biosíntesis de carotenoides (DellaPena, 1999).
Las raíces de yuca tienen la capacidad básica para sintetizar β-caroteno como muestra la
identificación de cultivares con raíces amarillas con carotenos. La amplia variación en
contenido de β-caroteno en las raíces de yuca, muestra que es posible que la modificación
genética mejore el contenido de carotenoides aumentando el valor nutricional de la raíz
(Fregene & Puonti-Kaerlas, 2002).
12
2.6
Transformación genética en yuca
En Noviembre de 2004, en la revista Plant Molecular Biology, se publicó un articulo donde
los principales grupos de investigación en transformación genética de yuca en el mundo,
reseñaron el estado del arte de sus investigaciones y de la transformación en yuca en
general. En la publicación se remarcó que la capacidad de integrar transgenes en yuca está
establecida, y además esta siendo utilizada para generar plantas
que expresan
características de interés agronómico. Los sistemas de cultivo de tejidos de transferencia de
genes que se emplean actualmente para producir estas variedades transgénicas de yuca han
mejorado significativamente durante los últimos cinco años (Taylor et al, 2004).
Actualmente hay programas en curso para el desarrollo de yuca con resistencia a
enfermedades virales e insectos, para mejorar el contenido nutricional, para modificar la
calidad y cantidad de almidón como también
los contenidos cianogénicos de raíces
procesadas (Taylor et al, 2004).
2.7
PCR en Tiempo Real
El PCR en tiempo real (a veces llamado PCR cuantitativo) es usado para cuantificar la
expresión de genes y confirmar su expresión diferencial en células tejidos y órganos. El
PCR en tiempo real es usado para medir la abundancia de secuencias especificas de ADN o
ARN.
Los primeros instrumentos de PCR en tiempo real usaron un fluorómetro unido a un
termociclador para medir la fluorescencia aumentada por marcas que como en el caso de
SYBR® Green, se intercalan o se unen al surco menor del ADN de doble cadena. Durante
la fase exponencial del PCR la cantidad de producto amplificado sintetizado en cada ciclo
aumenta de manera casi geométrica. Por lo tanto, la producción de ADN amplificado puede
13
ser estimada en cualquier punto por la cantidad de fluorescencia emitida por marcas
comerciales como SYBR Green I (Muller et al, 2002).
La tecnología de PCR en Tiempo Real utiliza termocicladores que detectan fluorescencia
para amplificar secuencias de nucleótidos específicas al tiempo que miden su
concentración. Para lograr la cuantificación el instrumento diagrama tasas de acumulación
de la secuencia de nucleótidos amplificada durante todo el curso de la reacción de PCR
(Figura 2). Entre más grande sea la concentración inicial de la secuencia a evaluar
(secuencia blanco) en la reacción, menor será el número de ciclos necesarios para alcanzar
una producción particular de producto amplificado. (Becker et al, 1996; Gibson et al,1996;
Heid et al, 1996; Freeman, 1999. Citado por Sambrook et al, 2001)
Figura 2. Diagrama logarítmico de amplificación de secuencias de nucleótidos con diferentes
concentraciones iniciales, detectada por florescencia emitida por la marca Brilliant® SYBR®
Green (Stratagene) durante el curso de la reacción de PCR en un termiciclador DNA Engine
Opticon® 2 System (MJ Research); cada línea representa una muestra amplificada, siendo la roja la
de mayor concentración y la amarilla la de menor. Unidad de Biotecnología, CIAT 2005.
La concentración inicial de la secuencia blanco puede por lo tanto ser expresada como el
número fraccional de ciclos (CT) requerido para alcanzar dicha producción particular de
producto amplificado. Un diagrama del valor de CT contra el valor log10 del numero inicial
de copias de un set de estándares de concentraciones conocidas del templado, produce una
línea recta (curva estándar, Figura 3) (Higuchi, et al 1993). La secuencia blanco es una
muestra de concentración desconocida, la cual puede ser fácilmente cuantificable por
interpolación en esta curva estándar (Bustin, 2002).
14
Figura 3. Diagrama una curva estándar construida con del valor de CT contra el valor log10 de un
set de estándares de concentraciones conocidas (puntos en la gráfica) de un templado el cual
produce una línea recta, Unidad de Biotecnología, CIAT 2005.
La capacidad para cuantificar el DNA o RNA amplificado durante la fase exponencial del
PCR, cuando ninguno de los componentes de la reacción son limitantes, resulta en una
mejor precisión en la cuantificación de las secuencias blanco (Muller et al, 2002).
Amplificaciones inespecíficas o la formación de dímeros de iniciadores pueden significar
errores significativos al cuantificar las moléculas blanco. Varios métodos se han
desarrollado para confirmar la especificidad del producto amplificado, entre ellos se
encuentra la curva de denaturación térmica o curva de “Melting”. En la metodología de la
curva de Melting el equipo puede ser programado para generar una curva de denaturación
térmica del ADN amplificado y medir las temperaturas de denaturación o “melting” (Tm)
de los productos de PCR. La forma de las curvas de “melting” indica cuáles de los
productos amplificados son homogéneos y asegura que el producto correcto ha sido
específicamente amplificado (Figura 4) (Ririe, 1997).
Figura 4. Diagrama de curvas de denaturación térmica “melting curve” para la amplificación del
gen PSY en tres muestras de hojas de yuca (líneas azul, verde y amarilla). Se aprecia especificidad
en los productos amplificados al generarse una sola curva de “melting” que aparece como un pico
mayor indicado por la flecha. Unidad de Biotecnología, CIAT 2005.
15
El SYBR® Green es una marca que al igual que el Bromuro de etidio, se adhiere al ADN de
doble cadena emitiendo fluorescencia a medida que se va produciendo la síntesis de ADN
de doble cadena en la reacción de PCR. SYBR® Green tiene un punto de excitación y
emisión máximo de 494 nm y 521 nm respectivamente.
La metodología de TaqMan PCR en tiempo real se basa en la utilización de pruebas que se
unen al producto que se desea cuantificar. Contrario a SYBR® Green, que se une a
cualquier ADN de doble cadena, el método TaqMan® utiliza una marca de fluorescencia
especifica unida a la sonda que se une por complementariedad de bases a la secuencia que
se pretende amplificar, dando como resultado un aumento en la especificidad y
sensibilidad. Adicionalmente diferentes maracas fluorescentes están disponibles, por lo
tanto varios iniciadores se pueden emplear para amplificar diferentes secuencias en un
mismo tubo.
2.8
Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)
La cromatografía es una técnica utilizada para la separación de los componentes de una
mezcla, basada en los diferentes grados de interacción de estos componentes con dos fases
materiales separadas. La naturaleza de las dos fases y el tipo de interacción puede variar y
esto da origen a los diferentes tipos de cromatografía. Una de las dos fases es una fase en
movimiento (fase móvil) mientras que la otra no se mueve (fase estacionaria). La mezcla
que va a ser separada usualmente se diluye en la fase móvil, la cual entonces se hace mover
o filtrar a través de la fase estacionaria generalmente por alta presión. Los componentes de
la mezcla son retenidos por la fase estacionaria en grados variables y como resultado, se
mueven junto con la fase móvil a velocidades diferentes y por lo tanto son separados
(Kenkel, 1992).
El sistema básico del HPLC consiste de un reservorio para el solvente, bomba, inyector,
columna y detector y software para análisis. La bomba permite que la fase móvil fluya a
través de todo el sistema. En la cabeza de la columna está el dispositivo de inyección el
16
cual introduce la muestra al sistema. Al final del efluente, un detector detecta los
componentes de la muestra y la señal resultante es exhibida como picos en un registro
grafico (cromatograma figura 5). Este registro puede detectar, a través de un software, la
presencia de picos, corregir líneas base, calcular áreas y tiempos de retención y determinar
la concentración de los componentes usando factores de calibración almacenados. (Kenkel,
Absorbancia 450 nm (mAU)
1992).
Tiémpo de retención (min)
Figura 5. Cromatograma donde se detectan los compuestos carotenoides (1,2 y 3) de una
muestra de raíz de yuca. La señal resultante es exhibida como un conjunto de picos.
Muestra de raíz de yuca procesada en un HPLC 10cinco0 (Hewllet Packard), con una
columna YMC-C30, detector ultravioleta-visible. Unidad de Biotecnología, CIAT 2005.
17
3
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1
Formulación del problema
Se desea conocer los niveles de expreisión de los genes carotenogenicos y la acumulación
de carotenos en hojas y raíces en tres variedades de yuca.
3.2
Justificación
Más de dos billones de personas, Un tercio de la población mundial, sufre por deficiencias
por vitamina A, Zinc o Hierro; esto, debido a que la principal fuente de vitamina A para el
hombre es de origen animal (hígado, pescado y yema de huevo), la cual esta fuera del
alcance de la mayoría de personas en el tercer mundo (Adewusi & Braddury, 1993). En
países pobres la población tiene dietas simples, compuestas principalmente de unos pocos
alimentos básicos (yuca, trigo, arroz y maíz), los cuales son pobres en algunos
macronutrientes y muchos micronutrientes esenciales (DellaPenna, 1999). Debido al
elevado costo de los alimentos derivados de animales, la mayor fuente de vitamina A (cerca
del 82%) son los carotenos presentes en los vegetales, particularmente β-caroteno o provitamina A (Zimmermann & Hurrell, 2002).
Las dos grandes consecuencias de la deficiencia de vitamina A (VAD) son el daño al tejido
epitelial y nervioso. En humanos las anormalidades en el ojo son los principales signos de
deficiencia de vitamina A y son las que causan el mayor daño, llevando entre otras
enfermedades, a la ceguera nocturna (pérdida de función en los bastones de la retina),
xerosis (un secado general o localizado de la conjuntiva), xeroftalmia (enfermedad causada
por infecciones secundarias de la superficie del ojo) y queratolmancia (un ablandamiento
de la córnea que lleva a una lesión permanente de está y ceguera). Se calcula que, en los
países en vías de desarrollo, el riesgo de deficiencia de vitamina A afecta a unos 200 ó 300
millones de niños en edad preescolar. Cada año, medio millón de niños se quedan ciegos
deficiencia de vitamina A, y la mayoría de ellos (alrededor del 70%) fallecen en el plazo de
18
un año. También han sido asociadas a la deficiencia de vitamina A un número de
enfermedades comunes a niños y adultos, incluidas diarrea, sarampión, varicela, tosferina,
tuberculosis, etc (Zimmermann & Hurrell, 2002).
Los análisis de la UNICEF indican que un suministro adecuado en la dieta de vitamina A
podría prevenir aproximadamente de uno a dos millones de muertes anuales entre niños de
uno a cuatro años (Römer et al, 2000).
Los programas de intervención con vitamina A han probado ser efectivos a corto plazo
(Wurtzel, 2001). Estos programas han consistido en la diversificación y suplementación de
alimentos, pero se han enfrentado a limitaciones como aspectos culturales, hábitos
alimenticios y condiciones económicas, además de requerir organización y seguimiento
para resultar efectivos. Por ejemplo en África, desde 1990, se han distribuido dosis masivas
de vitamina A en cápsulas, pero las madres, que no identifican los síntomas en sus niños,
frecuentemente se niegan a retomar las dosis. Lo anterior ha dificultado que los niños en
alto riesgo mantengan los niveles requeridos de vitamina A para eliminar la VAD a largo
plazo (Wurtzel, 2001). Otro problema para la mayoría de los países africanos lo constituye
el alto costo de los alimentos con vitamina A preformada (Hagenimana et al, 1997).
Además,
la vitamina A en dosis masivas puede llegar a ser tóxica al ocasionar
hipervitaminosis (Zimmermann & Hurrell, 2002) En contraste, un exceso en la dieta de βcaroteno no tiene efectos perjudiciales reportados (Guerinot, 2000).
Según datos de la organización “Sight and Life” del 2004, el problema en Colombia se
encuentra en el nivel catalogado como Grave subclínico, solamente siendo superado por el
nivel Clínico encontrado en pises del continente Africano y en la India. En el continente
Suramericano los países que presentan mayor incidencia del problema de la vitamina A son
Colombia, Perú y Brasil, poniendo en evidencia la gravedad del problema en nuestro país
con respecto al mundo y al continente.
19
Debido a todo lo anterior, el aumento en la dieta del contenido de carotenos ha sido vista
como la estrategia más efectiva para disminuir la VAD, comparada con el uso de
suplementos (Römer et al, 2000; Zimmermann & Hurrell, 2002).
Teniendo en cuenta la importancia de la yuca como alimento básico de amplio consumo,
especialmente con presencia en las regiones donde se presenta el VAD sobre todo entre
personas sin recursos, y el gran problema de salud que se presenta actualmente por
deficiencia de vitamina A, se ha propuesto desarrollar variedades de yuca más nutritivas
con niveles más altos de β-caroteno. Para lograrlo es determinante conocer la ruta de
biosíntesis, su de regulación, e identificar los pasos limitantes para implementar estrategias
biotecnológicas y/o de mejoramiento convencional para mejorar el valor nutritivo de la raíz
de yuca. Para ambas estrategias resulta importante la evaluación de los niveles de expresión
de los genes implicados en la biosíntesis de β-caroteno.
El PCR en tiempo real proporciona la exactitud necesaria y produce resultados confiables y
rápidos. El uso del PCR para amplificar productos de DNA copia que vienen de una
retotranscripción de RNA total se ha convertido en una herramienta molecular de rutina
para estudiar la expresión génica. (Pfaffl et al, 2002, Bustin, 2002).
De otro lado se cuenta con el HPLC,
que se ha usado por décadas con resultados
indiscutibles en detección de compuestos químicos; por esta razón se escogió esta
herramienta complementaria al PCR en tiempo real, para tener información precisa del
contenido y la acumulación de β-carotenos en las hojas y raíces de las variedades a las
cuales se van a evaluar sus niveles de expresión de los genes mencionados anteriormente.
20
4
OBJETIVOS
4.1
Objetivo General
Contribuir al entendimiento de la síntesis y regulación de carotenos en Yuca.
4.2
•
Objetivos Específicos
Evaluar los niveles de expresión de los genes de la ruta biosintética de β-caroteno
(GGPS, PSY, PDS, ZDS, CRTISO, LCY-β) de hojas y raíces en tres variedades
contrastantes a los tres y seis meses de edad en plantas de yuca.
•
Determinar el contenido de carotenos totales y de β-caroteno de hojas y raíces en tres
variedades de yuca contrastantes a los tres y seis meses de edad en plantas.
•
Establecer si existe correlación, en el tiempo, entre la acumulación de carotenos en la
raíz y el nivel de expresión de los genes de la ruta dentro de cada variedad.
21
5
MATERIALES Y MÉTODOS
5.1
Diseño de la investigación (diagrama de flujo)
Colecta material vegetal
Hojas y Raíces
Plantas de yuca de 3 y 6 meses de
edad en tres variedades.
Extracción ARN Total
Extracción carotenoides
Raíces y Hojas (AcetonaÉter de Petróleo)
Hojas(Kit promega)
Raíces (Trizol)
Síntesis de ADNc
Retrotranscriptasa (SuperScript
III)
Análisis de carotenos por
HPLC
Generación de
cromatogramas
Cuantificación relativa de la
expresión de genes (PCR
tiempo real SYBR® Green)
GGPS, PSY, PDS, ZDS,
CRTISO, y LCY-β
Integración de picos
Determinación contenido
carotenos totales, β-caroteno
Confirmación de la cuantificación
de expresión de genes (PCR
tiempo real PruebasTaqMan®)
U. Freiburg, Alemania
PSY, PDS y ZDS
22
Población de estudio y muestra
Tres variedades de Manihot esculenta Crantz, seleccionadas con base en contenido de
carotenos en la raíz, del germoplasma de yuca del CIAT, Palmira:
•
MBRA 253 (variedad amarilla).
•
CM 2772-3 (variedad crema).
•
CM 3306-4 (variedad blanca).
Muestra
Hojas jóvenes y raíces de cinco individuos por variedad, de plantas de tres y seis meses de
edad.
Variables de estudio
Variables independientes (son constantes para ambos objetivos específicos)
•
Edad de la planta: tres y seis meses.
•
Variedad: MBRA 253, CM 2772-3 y CM 3306-4.
Variables dependientes
Para el primer objetivo especifico:
Niveles de expresión de los genes blanco (GGPS, PSY, PDS, ZDS, CRTISO, LCY-β) en
hojas y raíces, expresados en una escala relativa generada por la normalización con
respecto al gen referencia 18S.
Para el segundo objetivo:
Contenido de carotenos totales y β-caroteno expresado en microgramos (µg) por gramo (g)
de tejido fresco.
23
5.2
Métodos
Previo al desarrollo de la metodología, y con la intención de cubrir la amplia variación en
contenido de β-caroteno en las raíces de yuca, se llevó a cabo la escogencia de las
variedades para el estudio. Se realizó un sondeo en el que se evaluaron el contenido de
carotenos totales y de β-caroteno de nueve variedades sembradas en CIAT, con la finalidad
de escoger las tres variedades de acuerdo a los siguientes criterios:
•
Variedad de mayor contenido de carotenos totales y β-caroteno en la raíz.
•
Variedad de menor contenido de carotenos totales y β-caroteno en la raíz.
•
Variedad que mostrara valores intermedios entre las dos primeras.
Luego de la escogencia de las tres variedades idóneas para las mediciones propuestas
(cuantificación de los niveles de expresión de genes y contenido de carotenos), se hizo una
propagación clonal por medio de estacas de cada una de las variedades en el mismo lote
con la finalidad de homogenizar en lo posible las condiciones. El lote se ubica en las
instalaciones del Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT situado en la ciudad
de Palmira (Valle del Cauca), con 3°31’ norte y 76°19’ oeste a 965 metros sobre el nivel
del mar, con una precipitación media anual de 965 mm, humedad relativa promedio de
76% y temperatura promedio de 24 °C. (figura 6).
Figura 6. Plantas de las variedades escogidas sembradas en un lote ubicado en CIAT Palmira.
24
Para el primer objetivo especifico:
Cuantificar los niveles de expresión de los genes de la ruta biosintética de β-caroteno
(GGPS, PSY, PDS, ZDS, CRTISO, LCY-β) de hojas y raíces en tres variedades a los tres y
seis meses de edad de las plantas de yuca.
•
Colecta del material vegetal
Se colectaron hojas y raíces de cinco plantas por cada variedad a los tres, seis de edad
meses de edad (figura 7). Adicionalmente muestras de plantas de ocho meses de edad se
colectaron para analizar solamente la expresión de los genes usando las sondas TaqMan
(ver confirmación de la amplificación con TaqMan). Se transportaron en nitrógeno líquido
al laboratorio donde se almacenaron en un congelador a -80AC hasta el momento de la
extracción de ARN.
A
B
Figura 7. Plantas de la variedad CM 3306-4 (Raíz blanca) a los tres (A) y seis meses de edad (B).
•
Extracción de ARN total
Las muestras de raíces y hojas jóvenes para cada variedad y tiempo de colecta se
maceraron individualmente en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Para cada
muestra individual se realizó una extracción. El ARN de las hojas se extrajo utilizando el
especificaciones del fabricante. El ARN de raíz se extrajo con el protocolo descrito por
Reilly y colaboradores en 2001, con modificaciones realizadas en la unidad de
25
biotecnología de CIAT, Palmira; donde se combina la acción de un Buffer de extracción
compuesto por Tris HCL, NaCl, EDTA, SDS y PVP, con el reactivo Trizol® de Invitrogen
para la extracción del ARN. Para más información ver anexo 3. El mismo proceso se llevó
a cabo con muestras de hojas y raíces de plantas de 8 meses de edad, pero estas muestras
sólo fueron incluidas en la cuantificación de expresión génica con la metodología TaqMan
como se explicará más adelante.
Una vez extraído el ARN se cuantificó por absorbancia estimando la densidad óptica de
cada muestra a dos longitudes de onda diferentes absorbancia a 260 y 280 nanómetros (nm)
con el espectrofotómetro GENios de TECAN®. Con esta información se calcularon las
respectivas concentraciones de las muestras. Adicionalmente se realizó una estimación de
la pureza del ARN con la relación A260/A280, asumiendo un rango optimo de este índice entre
1.8 y 2.2, reportado en el manual del kit de extracción de ARN “SV RNA Isolation system”
de Promega®. De otro lado se revisó la integridad del ARN con corridas electroforesis
donde se visualizó 1.5 µg de cada muestra de ARN en géles de agarosa a una concentración
de 1% con un buffer de corrida TBE (Tris base, Ácido bórico y EDTA ).
•
Digestión de ADN en las muestras de ARN
Previo a la síntesis de ADN copia se tomaron alícuotas iguales de ARN de cada extracción
y se conformaron dos pooles de ARN, uno por tejido (hoja o raíz), de cada variedad
(MBRA 253, CM 2772-3 y CM 3306-4) en el tiempo al cuál se colectó (tres y seis meses);
por ejemplo: pool número uno de raíz, de la variedad MBRA 253 de 3 meses de edad.
El ARN fue sometido a una digestión con la enzima “DNase I Amp Grade” de Invitrogen®
siguiendo las indicaciones del fabricante. Con esa digestión se buscó que la muestra de
ARN quedara libre de cualquier contaminación de ADN geonómico. Posterior a la
digestión de ADN se llevó a cabo una amplificación vía PCR tomando el ARN como
templado para la amplificación del gen constitutivo 18S. Si persiste la contaminación de
ADN se espera la amplificación del gen 18S; de lo contrario no puede efectuarse la
amplificación y se comprueba que el ARN está libre de contaminación por ADN genómico.
Una vez se tuvo plena confirmación de la ausencia de ADN se procedió a la síntesis de
ADN complementario.
26
•
Síntesis de ADN copia
A partir de aproximadamente 400 ng de ARN de cada pool se sintetizó ADN
complementario (ADNc) de cadena sencilla de cada uno de los pooles conformados,
usando la transcriptasa reversa SuperScript™ III “First-Strand Synthesis System” para RTPCR de Invitrogen®, de acuerdo a las especificaciones del fabricante, y hexámeros
aleatorios como iniciadores. Una vez terminado el evento de retrotranscripción, las
muestras se cuantificaron por absorbancia A260 / A280 realizaron diluciones a una misma
concentración.
•
Diseño de iniciadores
El diseño de los iniciadores para la cuantificación con SYBR® Green se realizó utilizando
la plataforma bioinformática Vector NTI® de Invitrogen®. Se elaboraron alineamientos
globales con ayuda del programa AlignX para cada uno de los genes blanco, comparando la
secuencia del gen en varias especies, de esta forma se identificaron regiones conservadas
entre las especies, sobre las cuales se diseñaron los iniciadores.
Para aquellos genes en los que se contaba con secuencias especificas de yuca (PSY, PDS y
ZDS), además de diseñar el iniciador en regiones conservadas entre especies, se tomaron
las secuencias de yuca como base para el diseño de los iniciadores; de otro lado para los
genes en los que no se conoce la secuencia en yuca se utilizó la secuencia consenso surgida
del alineamiento de las secuencias.
Los iniciadores y las sondas internas del cada gen (PSY, PDS y ZDS) cuantificado con
TaqMan®, fueron diseñados por el Doctor Ralf Welsch de la Universidad de Freiburg en
Alemania, tomando como base las secuencias parciales de cada gen disponibles de yuca.
•
Amplificación de las muestras en PCR en tiempo real con SYBR® Green
Las amplificaciones de los genes de yuca
MeGGPS, MePSY, MePDS, MeZDS,
MeCRTISO, MeLCY-β y Me18S (el prefijo “Me” significa Manihot esculenta), se llevaron
a cabo en el termociclador “DNA Engine Opticon® 2 System” de MJ Research®,
27
utilizando 2 µl de ADNc (misma concentración en las muestras) de cada pool como
templado. Se utilizaron los reactivos de PCR y la marca fluorescente del “Brilliant®
SYBR® Green Q. PCR Master Mix” de Stratagene, siguiendo las especificaciones del
fabricante. El perfil de PCR utilizado fue el siguiente:
1. 95 °C por 1 minuto
2. 94 °C por 30 segundos
3. 58 °C por 30 s.
4. 72 °C por 30 s.
5. Lectura del plato
6. Incubar a 67 °C por 1 s.
7. Lectura del plato
8. repetir desde el paso 2, 44 veces
9. 72 °C por 5 m.
Al final del PCR se elaboró una curva de denaturación térmica o curva de “melting”, en un
gradiente de temperatura entre 65 y 95 °C, con lecturas del plato cada 0,2 °C.
Dos réplicas técnicas se llevaron a cabo para cada muestra en cada uno de los genes.
•
Confirmación de la amplificación (expresión génica) de las muestras en PCR en tiempo
real usando la metodología de sondas TaqMan®:
Las mismas muestras de ARN utilizadas para la cuantificación de expresión genética con
SYBR® Green hechas en CIAT, más el ARN de hojas y raíces de plantas de 8 meses,
fueron llevadas a la universidad de Freiburg en Alemania donde se realizó un nuevo
proceso de cuantificación de los genes PSY, PDS y ZDS empleando la metodología de
pruebas TaqMan®. El ARN se sometió a digestión de ADN usando la enzima “DNaseI” de
Quiagen®. La síntesis de ADNc se realizó con los reactivos de trascripción reversa de
TaqMan®, siguiendo las indicaciones del fabricante. La amplificación se llevó a cabo en un
termociclador ABI® 7000 Prism System, usando los reactivos de PCR de ABI® “Master
Mix”. El gen 18S se utilizo como gen referencia, al igual que en los ensayos con SYBR®
Green. El perfil de PCR utilizado fue el siguiente:
28
1. 95°C por 10 minutos.
2. 95°C por 1 minuto.
3. 68°C por 30 segundos
4. Repetir desde el paso 2, 44 veces.
Para el segundo objetivo especifico
•
Colecta de las muestras
Se colectaron muestras de hojas y raíces de cinco plantas por cada variedad (las mismas
plantas utilizadas para la extracción de ARN); se transportaron al laboratorio cubriéndolas
de la luz para evitar degradación de carotenos.
•
Extracción de carotenos
Inmediatamente llegaron las muestras al laboratorio se picaron y luego se homogenizaron
en el Ultraturrax (homogenizador). La extracción de los carotenoides se llevó a cabo con
lavados sucesivos con solventes orgánicos (Éter de Petróleo y Acetona). Para más
información ver anexo 1, donde se detalla el protocolo de extracción utilizado para la
extracción y posterior cuantificación de carotenos totales y β-caroteno.
•
Cuantificación de carotenos totales por Espectrofotometría visible
El contenido de carotenos totales se determinó utilizando la siguiente formula:
Concentración en µg carotenos totales/g muestra = A450 x volumen final (ml) x 104
2592 x peso muestra (g)
Donde:
A450 = Absorbancia a 450 nanómetros.
104 = Constante de conversión de unidades µg/g.
2592 = Coeficiente de extinción molar de β-caroteno en éter de petróleo.
•
Análisis de β-caroteno por HPLC
29
La separación y cuantificación de los carotenos se hizo por HPLC, utilizando un equipo
Hewllet Packard series 1050, con una columna YMC-C30, especial para separación de
carotenoides, y detector ultravioleta-visible de arreglo de diodos. La detección se realizó
por espectrofotometría visible leyendo la absorbancia a 450 nm. La identificación de βcaroteno se hizo teniendo en cuenta el tiempo de retención y el espectro visible comparados
con un estándar comercial (Anexo 2).
5.3
Análisis de Información
Expresión génica
Los valores de expresión son medidas de fluorescencia emitidas en cada amplificación, y
se toman del reporte del “DNA Engine Opticon® 2 System”.
Con la finalidad de cuantificar los niveles de expresión de los genes de la ruta biosintética
de β-caroteno se hizo una cuantificación relativa de la expresión de los genes blanco
(GGPS, PDS, ZDS, CRTISO y LCY-β), empleando el método de curva estándar descrito
por Livak en 1997 y posteriormente actualizado en 2001. En esta metodología, muestras de
concentración conocida son usadas para construir una curva estándar que se emplea como
referencia en la cuantificación de la expresión de los genes blanco.
Se utilizó el gen de la subunidad ribosomal 18S como gen referencia para normalizar los
valores. El gen referencia (18S) se define como una señal activa de amplificación para
normalizar las diferencias en la cantidad de ADN copia adicionado a cada reacción. Los
genes utilizados como referencia son genes de expresión basal, que en teoría son
constantemente expresados en todas las células de todos los tejidos en una misma cantidad.
La escala relativa de cuantificación se construyó dividiendo (normalizando) los valores de
la fluorescencia de los genes blanco por el valor de la fluorescencia del gen referencia
30
5.3.2 Cuantificación de Carotenos
A los datos de contenidos de carotenos totales y β-carotenos bajo un diseño completo al
azar se les sometió a un análisis de varianza o “ANOVA” por sus siglas en inglés (analysis
of variances); para determinar si las diferencias entre las comparaciones efectuadas fueron
significativas desde el punto de vista estadístico con un nivel de significancia del 5%
(<0.05). Aquellos análisis efectuados que arrojaron diferencias al nivel de significancia
mencionado, se les aplicó la prueba de separación de medias o de rango múltiple
denominada REGWQ, por las iniciales de Ryan, Einot, Gabriel, Welsch; buscando
evidenciar agrupaciones de los datos para su posterior interpretación. Los análisis
estadísticos se llevaron a cabo con el programa SAS, versión 9.1 (SAS Institute Inc., 2005).
31
6
RESULTADOS
6.1
Escogencia de las variedades
Como se mencionó en la metodología, lo primero que se hizo fue seleccionar las variedades
de acuerdo con los criterios mencionados en los materiales y métodos. Los resultados
obtenidos en el sondeo ejecutado a las nueve variedades donde se les determinó el
contenido de carotenos totales y β-carotenos en la raíz y el color de la misma se mostraron
en la tabla 1. Destacando las variedades escogidas con negrilla ubicadas en la parte superior
de la tabla. El color de las raíces de las variedades escogidas se muestra en la figura 8,
donde se aprecia claramente las diferencias en la pigmentación de las raíces a los 6 meses
de edad.
Tabla 1 Sondeo de 9 variedades de yuca en plantas de 11 meses para la escogencia de las tres
variedades para el estudio. Las variedades escogidas se ubican en las tres primeras filas y se
resaltan en negrilla.
Variedad
MBRA 253
CM 2772-3
CM 3306-4
MBRA 337
MBRA 1251
MBRA 1087
MCOL 2279
MBRA1107
CM 523-7
Carotenos totales
µg/g materia fresca
8.42
4.08
04
5.2
2.54
0.42
8.18
3.94
0.86
32
β-caroteno Color de la raíz
5.82
Amarilla
3.21
Crema
0.24
Blanca
4.3
Amarilla
1.94
Crema
0.25
Blanca
5.42
Amarilla
2.8
Crema
0.57
Blanca
MBRA 253 CM 2772-3
CM 3306-4
Figura 8. Raíces de plantas de seis meses de edad de las variedades de yuca seleccionadas para el
estudio. El color de la raíz está directamente relacionado con el contenido de β-caroteno, siendo la
raíz amarilla (MBRA 253) la de más alto contenido de β-caroteno y la raíz blanca (CM 3306-4) la
de menor contenido de β-caroteno y la crema (CM 2772-3) de contenido intermedio entre las dos.
Cuantificación de la expresión génica por PCR en tiempo real:
6.2
Diseño de iniciadores:
Se generaron iniciadores con base en los alineamientos descritos en los materiales y
métodos (figura 9), los cuales fueron utilizados para la amplificación de los genes blanco
por PCR en tiempo real. A continuación se listan un par de iniciadores para cada gen,
directo identificado como “fw” por su nombre en inglés “forward” y reverso identificado
como “rv” por su nombre en inglés “reverse”:
•
GGPS fw 5’-TGCGCTGTGGAAATGATTCATAC-3’
rv 5’-AGTGCGTCACCGGCGAGAA-3’
•
PSY fw 5’-AGTTTGTGCTGAGTATGCCAAGAC-3’
rv 5’-CTACACCACACATAAATTGCCCA-3’
•
PDS fw 5’-GCCATGTCAAAGGCACTTAACTT-3’
rv 5’-CTTTGAACCATGTTTCTCCTGCTGAAG-3’
•
ZDS fw 5’-CAAAGAATGTGGGATCTTGTTGC-3’
rv 5’-AACATCTGGAGAACCCTTGAGCAT-3’
33
•
CRTISO fw 5’-TTCTATTCACATGGGTGTTAAAGC-3’
rv 5’-CTGGAGCCAAAGATGAATCAAG-3’
•
LCY-b fw 5’-TTTGAGCTTCCTATGTATGACCC-3’
rv 5’- CTCATCAACCCAAACACCATAATT-3’
Figura 9. Alineamiento de secuencias del gen PDS de varias especies ubicadas a la izquierda en el
programa AlignX, utilizado para el diseño de los iniciadores de los genes blanco. En color amarillo
se resaltan las regiones más conservadas entre las especies, sitio donde se diseñaron los iniciadores.
Las flechas verdes mostraron la ubicación de los iniciadores.
El gen utilizado en el trabajo como gen referencia fue el gen de la unidad ribosomal 18S,
de expresión basal en todas las células y tejidos. Las secuencias de los iniciadores
empleados para la amplificación se diseñaron sobre la secuencia del gen de frijol y se
listan a continuación:
•
18S fw 5’-ATGATAACTCGACGGATCGC-3’
rv 5’-CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3’
6.3
Extracción de ARN
Se obtuvo ARN de muy buena calidad de ambos tejidos, hoja y raíz, con las metodologías
propuestas para cada uno de los tejidos. En la figura 10 se exhibe una electroforesis en un
gel de agarosa de ocho muestras de ARN extraído de hojas jóvenes, colectadas de plantas
de 6 meses de edad; adicionalmente se presenta la información correspondiente a los
valores de densidad óptica registradas por las lecturas de absorbancia a las longitudes de
onda de 260 y 280 nanómetros (nm). En el gel se observa claramente que la integridad del
34
ARN está intacta y el índice de pureza A260/A280 se mantuvo dentro del rango referenciado en
el manual del kit de Promega® utilizado para la extracción del ARN de hojas.
Para determinar la cantidad de ARN total extraída en cada muestra se realizaron
mediciones espectrofotométricas a 260 nanómetros (nm), donde una unidad de absorbancia
(A260) es igual a 40 microgramos (µg) de ARN de cadena sencilla por mililitro. Con este
calculo se establecieron las concentraciones en las que se encontraba cada uno de los ARN.
1
2
3
4
5
6
7
8
Densidad Optica
A280
Muestra A260
1
0.51
0.22
2
0.45
0.20
3
0.18
0.08
4
0.23
0.11
5
0.59
0.26
6
0.27
0.13
7
0.54
0.25
8
0.29
0.14
A260
/A280 Concentración
2.27
2.25
2.11
2.19
2.29
2.06
2.16
1.99
ng
2044
1810.82
707.66
932
2340.84
1078.43
2152
1140.81
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa a una concentración de 1%, de muestras de ARN de
hojas jóvenes de plantas de yuca de 6 meses de edad, extraídas con el kit de extracción de ARN
“SV Total RNA Isolation system” de Promega®. En cada carril se cargó aproximadamente 1,5 µg
de ARN. A la derecha se adjunta la información de la medición por absorbancia de la densidad
óptica en cada muestra a las longitudes de onda de 260 y 280 nm; adicionalmente se incluyen el
índice de pureza A260/A280 y el cálculo de la concentración de ARN en nanográmos (ng) por cada
microlitro (µl).
Luego de estar completamente seguro de la calidad del ARN habiéndolo revisado con los
métodos anteriormente descritos, se procedió a conformar dos pooles por cada variedad,
tejido y tiempo de colecta. Seguidamente se realizaron las digestiones de ADN con la
enzima “DNase I Amp Grade” de Invitrogen®. Los resultados de la digestión del ADN
contaminante en los pooles de ARN se corroboraron con la amplificación vía PCR del gen
ribosomal 18S (figura 11); asumiendo que la no amplificación significa que no había
presencia de ADN en el ARN, y por lo tanto los pooles estaban sin ADN listos para la
síntesis de ADN copia por retrotranscripción.
35
/µl
A1
A2
B1 B2
C1 C2
- ADN MP
100 pb
Figura 11. Amplificación del gen constitutivo 18S vía PCR tomando como templado el ARN
extraído de los tejidos de yuca; el tamaño de la secuencia amplificada del gen 18S es 165 pares de
bases. Marcador de peso molecular (MP) “1KB plus DNA ladder de invitrogen®”. Si persiste la
contaminación de ADN se espera una amplificación del gen como se observa en el control positivo
de ADN de yuca identificado como ADN en el gel; de lo contrario no puede efectuarse la
amplificación y se comprueba que el ARN está libre de ADN.
6.4
Síntesis de ADN copia
En todos los eventos de retrotranscripción usando la transcriptasa reversa SuperScript™ III
“First-Strand Synthesis System” para RT-PCR de Invitrogen®, se obtuvo ADN copia que a
la postre permitió la amplificación vía PCR y posterior cuantificación de la expresión de
los genes.
Se realizaron diluciones de las muestras a una misma concentración (1:20) con el objetivo
de amplificar una cantidad similar de templado inicial.
6.5
Amplificación de las muestras en PCR en tiempo real
Se obtuvo amplificación cuantificable vía PCR en tiempo real en todos los genes blanco
GGPS, PSY, PDS, ZDS, LCY-B (Figuras 12 y 13) con excepción del gen CRTISO,
caroteno isomerasa, en el cual no se detectó señal de amplificación. El gen 18S utilizado
36
como referencia también mostró amplificación cuantificable, por lo que se pudo utilizar
como normalizador en la cuantificación relativa de la expresión de los genes blanco.
Cada uno de los genes los genes presentaron una única curva de denaturación o “melting”,
indicando especificidad en el producto amplificado, lo que asegura un buen nivel de
confiabilidad en los datos de cuantificación. En las Figuras 12 y 13 se ilustran ejemplos de
las curvas de amplificación y “melting” para los genes evaluados.
A
B
Figura 12. A. Diagrama de amplificación de los genes 18S en rojo (gen referencia o control), PSY
®
®
en verde y ZDS en azul, detectada por florescencia emitida por la marca Brilliant SYBR Green
(Stratagene) durante el curso de la reacción de PCR en un termiciclador DNA Engine Opticon®
2 System (MJ Research). B. Con los mismos colores se muestra la respectiva curva de
denaturación térmica o curva de Melting de cada uno de los genes; se aprecia un solo pico
por lo que se infiere que hubo amplificación de un solo producto especifico.
A
B
Figura 13. A. Diagrama de amplificación de los genes blanco PDS en rojo, LCY-β en verde y
GGPS en azul, detectada por florescencia emitida por la marca Brilliant®SYBR® Green (Stratagene)
durante el curso de la reacción de PCR en un termiciclador DNA Engine Opticon® 2 System (MJ
Research). Con los mismos colores se muestra la respectiva curva de denaturación térmica o curva
de Melting de cada uno de los genes. B. Se aprecia un solo pico por lo que se infiere que hubo
amplificación de un solo producto específico.
37
A pesar de intentar varias veces la amplificación del gen CRTISO, no pudo ser cuantificado
debido a que no hubo amplificación en las muestras de ADN copia. Se intentó amplificar el
gen disminuyendo la temperatura de anillaje de los iniciadores, buscando disminuir la
astringencia del la reacción de PCR. Sin embargo no se obtuvo ninguna señal amplificable.
Para facilitar la identificación de las tres variedades se utilizó una nomenclatura donde la
variedad MBRA 253 de raíz color amarilla se le nombró “A”; la variedad CM2772-3 de
raíz color crema se le llamó “C” y la variedad CM3306-4 de raíz color blanca se le llamó
“B”.
Cuantificación con la marca Fluorescente SYBR® Green:
Se elaboraron promedios de los dos pools, cada uno (con una replica técnica) de ADN
copia que representan cinco individuos de cada variedad por tiempo de colecta, y se
representaron en histogramas situando juntas las barras representativas de la expresión de
cada gen en hojas y raíces por cada variedad. Por lo tanto para cada gen se elaboró una
gráfica que resume su expresión en cada variedad, tiempo de colecta y tejido (hoja o raíz)
con su respectiva desviación estándar.
La escala en la que se valoraron los resultados de expresión de genes es una escala relativa,
la cual es perfectamente útil para establecer comparaciones entre las muestras sometidas a
las cuantificaciones efectuadas, por lo tanto no constituye de ninguna manera una escala
con valores reales. Como se mencionó anteriormente la cuantificación se llevó a cabo
siguiendo los lineamientos descritos por Livak en el 2001 para la cuantificación relativa de
expresión génica por el método de curva estándar.
En las figuras 14 a 18 se resume el análisis de expresión efectuado a genes que codifican
enzimas que participan en la síntesis de los carotenos en yuca, con la marca fluorescente
SYBR® Green.
38
Abundancia relativa [ADNc/18S]
Expresion realtiva del gen MeGGPS en plantas de
yuca de 3 y 6 m eses
1.200
1.000
0.800
HOJAS
0.600
RAICES
0.400
0.200
0.000
3A
3C
3B
6A
6C
6B
Figura 14. Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MeGGPS en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres y seis meses de edad de la
planta, usando la marca fluorescente SYBR® Green. Cada barra representa el promedio de dos
pooles generados a partir de cinco individuos de cada variedad (A, B o C) y tiempo de colecta (3 y
6 meses) .
En la expresión del gen MeGGPS la muestra de la variedad A, a los 6 meses presentó una
baja expresión en relación con las muestras de las otras dos variedades en el mismo tiempo
(figura 14). La expresión de este mismo gen en hojas fue homogénea exceptuando la
muestra de la variedad blanca a los 3 meses de edad de la planta.
Las expresiones observadas del gen MePSY fueron muy homogéneas entre los tejidos. En
raíz las muestras de la variedad C mostraron una ligera diferencia con respecto a las otras
dos variedades (figura 15)
En el gen MePDS se invierte el patrón de expresión observado en los demás gráficos de
expresión de los genes; el nivel de expresión de hojas y raíces se invierte observándose una
expresión mayor en las raíces que en las hojas. (figura 16).
39
Abundancia relativa [ADNc/18S]
Expresion relativa del gen MePSY en plantas de Yuca
3 y 6 m eses
2.000
1.800
1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
HOJAS
RAICES
3A
3C
3B
6A
6C
6B
Figura 15 Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MePSY en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres y seis meses de edad de la
planta, usando la marca fluorescente SYBR® Green. Cada barra representa el promedio de dos
pools generados a partir de cinco individuos de cada variedad (A, B o C) y tiempo de colecta (3 y 6
meses) .
En los valores de expresión del gen MeZDS y MeLCYB (Figuras 17 y 18) se observa que
la escala de valores sube con respecto a los otros genes. Los mayores valores de expresión
se alcanzan en las hojas de MeZDS de plantas de 3 meses de edad (figura 17).
Abundancia relativa [ADNc/18S]
Expresion relativa del gen MePDS en plantas de Yuca
de 3 y 6 m eses
1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
HOJAS
RAICES
3A
3C
3B
6A
6C
6B
Figura 16. Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MePDS en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres y seis meses de edad de la
planta, usando la marca fluorescente SYBR® Green. Cada barra representa el promedio de dos
pools generados a partir de cinco individuos de cada variedad (A, B o C) y tiempo de colecta (3 y 6
meses) .
40
Abundancia relativa [ADN/18S]
Expresion del gen MeZDS en plantas de Yuca a 3 y 6
m eses
8.000
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0.000
HOJAS
RAICES
3A
3C
3B
6A
6C
6B
Figura 17. Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MeZDS en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres y seis meses de edad de la
planta, usando la marca fluorescente SYBR® Green. Cada barra representa el promedio de dos
pooles generados a partir de cinco individuos de cada variedad (A, B o C) y tiempo de colecta (3 y
6 meses).
A excepción del gen PDS (figura 16), las expresiones de los genes siempre alcanzaron
niveles superiores en las hojas con respecto a los encontrados en las raíces.
Los datos se movieron en el rango de 0.032 encontrado en la muestra de ARN extraído de
hojas de la variedad blanca a 6 meses de edad, hasta 6,28, encontrado en la muestra de
hojas de la variedad blanca a tres meses de edad de la planta. Como se mencionó
anteriormente las unidades son relativas y no corresponden una medida real, sin embargo
son útiles para establecer relaciones comparativas entre las muestras analizadas. La escala
relativa de cuantificación es generada a partir de la normalización del gen blanco
(MeGGPS, MePSY, MePDS, MeZDS y MeLCYb) con el gen constitutivo ribosomal 18S
utilizado como referencia.
La tabla total de datos obtenidos en la cuantificación con SYBR® Green, así como los
valores que se obtuvieron luego de la normalización con el gen 18S se citan en el anexo 4.
41
Abundancia relativa [ADNc/18S]
Expresion relativa del gen MeLCYB plantas de Yuca
de 3 y 6 m eses
6.000
5.000
4.000
3.000
HOJAS
2.000
RAICES
1.000
0.000
3A
3C
3B
6A
6C
6B
Figura 18. Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MePDS en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres y seis meses de edad de la
planta, usando la marca fluorescente SYBR® Green. Cada barra representa el promedio de dos
pooles generados a partir de cinco individuos de cada variedad (A, B o C) y tiempo de colecta (3 y
6 meses).
Confirmación de la expresión génica detectada por SYBR® Green con la metodología
TaqMan®:
Tres genes (MePSY, MePDS y MeZDS) fueron cuantificados en el laboratorio del doctor
Peter Beyer en la Universidad de Freiburg, Alemania, usando la tecnología TaqMan®, la
cual combina la acción de los iniciadores convencionales utilizados en una amplificación
por PCR convencional, con una sonda que se une a la región flanqueada por los iniciadores
por complementariedad de bases, que porta la marca fluorescente que permite la
cuantificación de la amplificación de la secuencia blanco.
Se elaboraron promedios de las amplificaciones de ADN copia que representan 5
individuos de cada variedad por tiempo de colecta, y se representaron en histogramas
situando juntas las barras representativas de la expresión de cada gen en hojas y raíces por
cada variedad. Por lo tanto para cada gen se elaboró una gráfica que resume su expresión
en cada variedad, tiempo de colecta y tejido (hoja o raíz) con su respectiva desviación
estándar. Adicionalmente a las muestras procesadas por SYBR® Green, se incluyeron las
muestras de una colecta más, de plantas de 8 meses de edad.
42
Al igual que en la cuantificación efectuada con la marca SYBR® Green se manejo una
escala relativa, elaborada de la misma manera. La cuantificación se llevó a cabo siguiendo
los lineamientos descritos por Livak en el 2001 para la cuantificación relativa de expresión
génica por el método de curva estándar.
En las figuras 19 a 22 se resume el análisis de expresión efectuado a los genes MePSY,
MePDS y MeZDS de síntesis de carotenos con la marca fluorescente TaqMan®.
Abundancia relativa [ADNc/18A]
Expresion relativa del gen MePSY en plantas de yuca de 3, 6
y 8 meses (TaqMan)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
HOJAS
RAICES
3A
3C
3B
6A
6C
6B
8A
8C
8B
Figura 19. Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MePSY en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres, seis y ocho meses de edad
de la planta, con la marca fluorescente TaqMan®. Cada barra representa el promedio cinco
individuos procesados de cada variedad a cada tiempo de colecta.
La diferencia más notoria entre las expresiones de hojas y raíces de un mismo gen se
encuentra en el gen MePSY (figura 19 y figura 22). En los otros dos genes cuantificados
(MePDS y MeZDS ,figuras 20 y 21) la diferencia no es tan fuerte como la observada en el
gen MePSY.
43
Abundancia relativa [ADNc/18S]
Expresion relativa del gen MePDS en plantas de yuca de 3,
6 y 8 meses (TaqMan)
3.5
3
2.5
2
HOJAS
1.5
RAICES
1
0.5
0
3A
3C
3B
6A
6C
6B
8A
8C
8B
Figura 20. Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MePDS en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres, seis y ocho meses de edad
de la planta, con la marca fluorescente TaqMan®. Cada barra representa el promedio cinco
individuos procesados de cada variedad a cada tiempo de colecta.
En el gen MePDS se invierte el patrón de expresión observado en los genes MePSY y
MeZDS; el nivel de expresión de hojas y raíces se invierte observándose una expresión
mayor en las raíces que en las hojas (figura 20).
Abundancia relativa [ADN/18S]
Expresion relativa del gen MeZDS en plantas de yuca de 3, 6
y 8 meses (TaqMan)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
HOJAS
RAICES
3A
3C
3B
6A
6C
6B
8A
8C
8B
Figura 21. Análisis de expresión por PCR en tiempo real del gen MeZDS en hojas y raíces de 3
variedades de yuca (A = Amarilla, C = Crema y B = Blanca) a los tres, seis y ocho meses de edad
de la planta, con la marca fluorescente TaqMan®. Cada barra representa el promedio cinco
individuos procesados de cada variedad a cada tiempo de colecta.
La escala de valores subió con respecto a los otros dos genes en la expresión de MeZDS.
Los mayores valores de expresión se alcanzan en las hojas de MeZDS de plantas de 3
44
meses de edad (figura 21). Resultados similares se encontraron en la cuantificación con
SYBR® Green del mismo gen (figura 17).
En la figura 22, se aprecia la expresión de cada gen comparando raíz contra hoja. No se
discrimina por tiempo de colecta ni por variedad. La expresión más elevada se notó en las
hojas del gen MePSY.
La cuantificación de la expresión génica con TaqMan® fue similar a los resultados que se
encontraron con SYBR® Green. Con excepción de la diferencia presentada entre hojas y
raíces del gen MePSY.
Abundancia relativa [ADNc/18S]
Expresión relativa de genes de la ruta de carotenos
Hoja Vs. Raíz en yuca
27
24
21
18
15
12
9
6
3
0
Hojas
Raices
PSY
PDS
ZDS
Figura 22. Expresión de los genes PSY, PDS y ZDS en hoja y raíz en plantas de yuca. Cada barra
representa el promedio de 15 muestras colectadas a lo largo de 3, 6 y 8 meses de edad de la planta.
6.6
Cuantificación de carotenos totales y β-caroteno:
Al igual que en la cuantificación de expresión de los genes, las variedades fueron
denominadas A, B y C, por las iniciales del color de su raíz A amarilla, B blanca y C
crema. En las gráficas las barras representan el promedio de datos de tres individuos
procesados individualmente para cada variedad (A, B o C) y punto de colecta (3 o 6
meses), con su respectivo valor de error estándar. Todos los cálculos estadísticos
efectuados se encuentran citados en el anexo 5.
45
El resultado de la cuantificación del contenido de carotenos totales y β-carotenos en las
hojas jóvenes de 3 y 6 meses de edad se mostraron en la figura 23, donde se combinan los
valores tanto de carotenos totales, en verde, como el contenido de β-caroteno, en naranja en
una sola barra para cada muestra. Los valores más altos se detectaron en la variedad crema
(C), pero en general, los datos fueron homogéneos tanto en el contenido de carotenos
totales como en β-caroteno.
Carotenos totales y B-caroteno en hojas de 3 y 6
m eses de edad en tres variedades de Yuca
[ug/g] Materia Fresca
1200
1000
800
carotenos
totales
600
b-caroteno
400
200
0
3M A 3M C 3M B 6M A 6M C 6M B
Figura 23. Contenido de carotenos totales y β-caroteno en hojas jóvenes de 3 variedades de yuca
con distintos contenidos de carotenos en la raíz a tres y seis meses de edad (3M y 6 M) de la planta.
Variedades: MBRA 253 (A), CM2772-3 (C) y CM3306-4 (B).
Los resultados de las cuantificaciones de carotenos totales y β-caroteno de las muestras de
las raíces se mostran en la figura 24; donde al igual que en los resultados de las hojas se
integran en una sola barra los valores de cada variedad en un tiempo de colecta específico,
siendo el color amarillo el valor para carotenos totales y el color rojo para β-caroteno.
La variedad amarilla (A) siempre mostró los mayores contenidos de carotenos totales y βcaroteno, seguido por la variedad crema (C) y por último la variedad blanca (B) (figura 24).
También se observa, un aumento en el contenido de carotenos totales y β-carotenos en las
comparando las muestras de 3 meses y 6 meses para las variedades A y C; con la variedad
B no sucedió lo mismo.
46
[ug/g] Materia Fresca
Carotenos totales y B-caroteno en raices de 3 y 6
m eses de edad en tres variedades de Yuca
10
8
6
carotenos
totales
4
B-caroteno
2
0
3M A
3M C
3M B
6M A
6M C
6M B
Figura. 24 Contenido de carotenos totales y β-caroteno en raíces de 3 variedades de yuca a tres y
seis meses de edad (3M y 6 M) de la planta. Variedades: MBRA 253 (A), CM2772-3 (C) y
CM3306-4 (B).
Adicionalmente se presenta una gráfica en términos porcentuales, en la que se muestra la
proporción del β-caroteno con relación al contenido de carotenos totales detectados, el cual
representan el 100% en la barra (figura 25).
Porcentaje de B-caroteno en raíces con respecto a
Carotenos totales
100%
80%
60%
Carotenos
totales
40%
B-caroteno
20%
0%
3M A 3M C 3M B 6M A 6M C 6M B
Figura 25. Contenido de β-caroteno en porcentaje siendo el contenido de carotenos totales el
100% en raíces de 3 variedades de yuca a tres y seis meses de edad (3M y 6 M) de la planta.
Variedades: MBRA 253 (A), CM2772-3 (C) y CM3306-4 (B).
La gráfica de porcentaje de β-caroteno con respecto a carotenos totales sugiere que la
variedad amarilla aportaría la menor cantidad al total de carotenos, con respecto a las otras
dos variedades, representando sólo el 12, 7 % del total en raíces de plantas de 3 meses y el
47
47% por ciento en plantas de 6 meses. Sin embargo esta observación tendrá que ser
confirmada estadísticamente luego El mayor porcentaje de β-caroteno con respecto al total
se presentó aparentemente en la muestra de raíz de la variedad crema a los 6 meses.
Mientras que la mínima proporción de β-caroteno la mostró la muestra A a los 3 meses de
edad de la planta.
48
7
DISCUSIÓN
7.1
Selección de las variedades
Lo que más sobresale de los datos obtenidos en este sondeo es la alta variabilidad que
presentan las variedades de yuca en cuanto al contenido de carotenos totales y β-carotenos
en la raíz, lo que se traduce, en términos nutricionales, en aporte concreto de pro vitamina
A de cada variedad al consumidor. Sin embargo, en el caso de las yucas con raíces
amarillas, que son las que presentas contenidos más altos de β-caroteno se trata variedades
no comerciales que no han sido sometidas a procesos de selección para mejorar sus
condiciones de producción y su comportamiento en campo. La anterior situación se vio
reflejado en el experimento en campo, puesto que las variedades CM2772-3 y CM3306-4, a
las que se identificará como variedad Crema (C) y Blanca (B) respectivamente, presentaron
un mejor comportamiento en campo comparativamente que la variedad MBRA 253, la cual
se identificará como Amarilla (A), en términos de resistencia a plagas, vigorosidad y
llenado de la raíz. Siempre las raíces de las variedades Crema y Blanca fueron más grandes
que las de la variedad amarilla.
7.2
Cuantificación de carotenos totales y β-caroteno:
Los datos obtenidos concernientes al contenido de β-caroteno y carotenos totales en las tres
variedades resultaron satisfactorios en términos de consistencia en repeticiones biológicas
efectuadas, que se tradujo en un error estándar moderado para los promedios, el cual
permitió evidenciar diferencias entre las variedades.
Las diferencias en la escala de valores de las mediciones de contenido de carotenos en
hojas y raíces, no permitieron hacer comparaciones directas, dado que estas diferencias
podrían ser del orden de 102. Por ejemplo, mientras que en la hoja se detectaron en
49
promedio 88,85 µg/g de β-caroteno, en la raíz de se detectó 0,862 µg/g. Por consiguiente
los datos se analizaron independientemente para hojas y raíces.
Análisis de varianza:
El análisis de varianza, con un nivel de significancia del 5%, permitió establecer cinco
grandes diferencias en el contenido de carotenos totales o de β-carotenos:
1. Entre variedades en el contenido de β-caroteno en las hojas.
2. Entre variedades en el contenido de β-caroteno en las raíces.
3. En la acumulación de β-caroteno en la raíz a través del tiempo
4. Entre variedades en el contenido total de carotenos en las hojas.
5. Entre variedades en el contenido de carotenos totales en las raíces.
Para los casos 1 y 4, al realizar el análisis de separación de medias REGWQ, se agruparon
de la misma manera ambos conjuntos de datos, encontrando un grupo representado por la
variedad C, con los valores más altos, y otro grupo con las variedades A y B (anexo 5 casos
1 y 4). Al parecer las hojas mantienen niveles constantes de carotenos, independientemente
del tiempo, con algunas diferencias varietales. Esto es explicable si se piensa en el papel
fundamental de los carotenoides en el proceso de fotosíntesis en la hoja; donde
principalmente cumplen dos funciones: una participando como pigmentos accesorios en el
complejo antena, capturando radiación solar y transfiriéndola a los centros de reacción, y
también actúan como atenuadores de los estados de excitación de las clorofilas que se
generan durante la fotosíntesis. En este proceso el exceso de energía se disipa en forma de
calor (Taylor & Ramsay, 2005).
Si se agrupan los casos 2 y 3, concernientes a los valores de β-caroteno de raíz, se encontró
que las tres variedades son diferentes, y que también existen diferencias en la acumulación
de β-caroteno en el tiempo. Se presentó más acumulación de β-caroteno a los 6 meses que a
los 3 meses, independientemente de la variedad (anexo 5, casos 2 y 3; figura 24 ). Sin
embargo, el tiempo afecta diferentemente el contenido de β-caroteno en cada variedad,
50
aumentando las diferencias entre ellas. Sí existen diferencias a los tres meses, éstas se
pronuncian más a los seis meses.
El análisis de separación de medias encontró tres grupos estadísticamente diferentes con
respecto a los casos 2 y 3, siendo la variedad A la de mayor contenido de β-caroteno
(promedio de 1,489 µg/g materia fresca), seguida por la C (0,79 µg/g) y por último la B
(0,307 µg/g) (figura 24). Estos resultados mostraron concordancia con los patrones vistos
en el sondeo de selección de las variedades (tabla 1), confirmando que el color de la raíz es
un indicador confiable del contenido de carotenos. Esta conclusión se encuentra en
concordancia con estudios previos (Iglesias et al, 1997; Chavez et al, 2000; Boiteux &
Carvallo, 2001).
En términos de porcentaje de β-caroteno con respecto al total de carotenos, la variedad
amarilla es la de menor proporción de β-caroteno de las tres variedades (figura 25). No
obstante la variedad amarilla es la que mayor contenido de carotenos totales y β-caroteno
acumula, por lo tanto en términos nutricionales la variedad amarilla es la que proporciona
mayor cantidad neta de pro vitamina A al consumidor. No obstante, hay que precisar que
aunque la variedad amarilla presenta el nivel más alto de carotenos, los niveles de aporte de
provitamina A al consumidor continúan siendo muy bajos. Así, si seis microgramos de βcaroteno son convertidos en un microgramo de equivalentes de retinol (ER), y si la ingesta
diaria recomendada para un niño es 400 ER (Mclaren & Frigg, 2002), el consumo de
aproximadamente 1000 g diarios de yuca amarilla de seis meses de edad le proveería el
requerimiento mínimo diario. Consumir un kilo de yuca diario no es plausible para un niño,
por lo que sería necesario incrementar el contenido de β-caroteno al menos cuatro veces.
En el caso 5 se observaron diferencias significativas en el contenido de carotenos totales en
las raíces de las variedades analizadas. Como en el caso 2, referente a los contenidos de βcaroteno, la separación de medias indicó que la variedad A contiene más carotenos totales
que la C, la cual a su vez tiene más que la B. No sucedió lo mismo cuando se compararon
los contenidos de caroteno total en los dos tiempos de colecta. Estos hallazgos indicarían
que la única fuente de variación para el contenido de carotenos totales son las variedades, y
51
que entre los 3 y 6 meses la diferencia radica en el contenido de β-caroteno. Una
redistribución del contenido de β-caroteno en el tiempo indica una redistribución en el
aporte de cada caroteno a los carotenos totales (figura 25 ).
Según datos vistos en sondeo de plantas de 11 meses (tabla 1), la variedad A a los 6 meses
de edad ya ha acumulado el 60 % de los carotenos totales que posee a los 11 meses. La
Crema ha acumulado el 37% y la blanca parece haber llegado a su limite de acumulación
(figura 24).
7.3
Cuantificación de la expresión de los genes de la ruta biosintética:
Una de las principales observaciones de éste trabajo es que no se encontraron diferencias
significativas en los niveles de expresión de los genes entre las tres variedades. Varios
investigadores han logrado asociar el contenido de carotenos con la abundancia del ARN
mensajero de los principales genes de la ruta biosintética. Por ejemplo, en la maduración de
diferentes variedades de cítricos se pudo establecer que la acumulación de carotenos estaba
fuertemente regulada por la coordinación en la expresión de los genes (Kato et al, 2004).
En otro estudio de características similares, cuando se investigó el motivo de la diferencia
en la acumulación de carotenos en variedades de papa con contenidos de carotenos
contrastantes, se establecieron diferencias significativas en los perfiles de abundancia de
ARN mensajero de los genes de la ruta biosintética, sugiriendo que el control
transcripcional da lugar a grandes diferencias en contenido de carotenos. De hecho, se pudo
establecer una relación inversa entre el nivel de trascrito del gen Zeaxantina epoxidasa y el
contenido de carotenos en el tubérculo de la papa (Morris et al, 2004) .
En contraposición con los dos trabajos anteriores en papa y cítricos, los resultados
obtenidos en análisis de variedades de yuca no mostraron concordancia entre el contenido
de carotenos en la raíz y los niveles de ARN mensajero de los genes de la ruta biosintética
analizados. Para futuros estudios, y teniendo en cuenta los hallazgos de Morris et al en
52
2004, se sugiere incluir en el análisis genes como Zeaxantina espoxidasa, que convierten el
-caroteno en otras moléculas como Xantófilas.
La mayoría de los estudios que reportan una relación directa entre los niveles de ARN
mensajero y la acumulación de carotenos en un órgano especifico, están relacionados con
eventos de modificación genética. En éstos se ha manipulado la ruta biosintética original,
insertando secuencias nuevas como promotores específicos o genes de otras especies
(plantas o bacterias), que a la postre incrementan ostensible y lógicamente la producción y
acumulación de carotenos (Fraser et al, 2002; Shewmaker et al, 1999; Decreux et al, 2004).
Por consiguiente, al comparar los niveles de expresión de los genes manipulados de una de
estas plantas modificadas genéticamente con la variedad silvestre, las diferencias saltan a la
vista. Por el contrario el estudio en yuca se basó en un sistema sin manipulación genética,
tomando plantas de tres variedades de yuca que conservan los patrones de expresión génica
y la ruta metabólica originales.
La comparación global de la expresión de los genes MePSY, MePDS, MeZDS con ambas
metodologías (SYBR® Green y TaqMan®; figura 22), sin discriminar por variedades ni
tiempos de colecta, evidenció el bajo nivel de trascrito del gen MePSY en la raíz con
respecto a la hoja. Para los otros dos genes los niveles fueron homogéneos.
El gen PSY ha sido reportado repetidamente como punto regulatorio y clave de la ruta
biosintética (Cunningham, 2002; Fraser & Bramley, 2004; Taylor & Ramsay, 2005;
Sandmann, 2001). Por este motivo ha sido blanco frecuente en trabajos de manipulación
genética en plantas de interés alimentario, a las cuales se les ha querido aumentar la
producción de carotenos en órganos específicos (Ye, et al 2000; Fraser et al, 2002;
Lindgren et al, 2003).
Si las hojas de yuca son tejidos productores de carotenos por excelencia, y si se relaciona
esta producción con el nivel de trascrito del gen MePSY, se asumiría que una ruta de
biosíntesis de carotenos muy activa poseería altos niveles de trascripción del gen PSY. Esta
observación, unida a los resultados de manipulación genética de cultivos ya mencionados,
53
sugeriría que uno de los genes llamados a manipulación para incrementar el contenido de
carotenos en la raíz de yuca debería ser el PSY. Obviamente, no se pueden excluir con este
estudio otros genes cuya influencia en la producción y acumulación de carotenos sea
igualmente importante y desconocida en yuca.
El gen GGPS codifica la síntesis de la enzima GGPP responsable de la conversión de lPP y
DAMPP en Geranilgeranil pirofosfato. El IPP y DAMPP son los precursores de la vía de
los carotenoides y otros compuestos isoprenoides. Esta enzima juega un papel importante al
determinar la cantidad de GGPP disponible para empezar la ruta de síntesis de carotenos.
En la figura 14 se resume la expresión de este gen encontrada en hojas y raíces de las tres
variedades estudiadas. No se encontraron expresiones diferenciales de este gen en
concordancia con el contenido de β-caroteno, ni de carotenos totales. Incluso se presentó
una disminución en la muestra de raíz amarilla de 6 meses con respecto a la de 3 meses, y a
su vez menor expresión con respecto a las otras dos variedades (C y B) de 6 meses. Estas
observaciones apuntan a que posiblemente la deferencia en contenido de carotenos no se
deba a la expresión, baja o alta, del GGPS. Especulativamente, es posible que el bajo nivel
de trascrito en la variedad amarilla a los seis meses tenga que ver con regulación negativa
por alto contenido de carotenos.
La expresión del gen MePDS en las raíces fue más alta que en las hojas para todas la
variedades (figuras 16 y 20 ). Esta tendencia fue detectada con ambas metodologías
(SYBR® Green y TaqMan®). Los genes PDS y ZDS codifican para las enzimas Fitoeno
desaturasa y ζ caroteno desaturasa, encargadas de la desaturación del fitoeno sintetizado
por PSY, generando el intermediario prolicopeno (Taylor & Ramsay, 2005). La enzima
ZDS es vital en la síntesis de licopeno y su función en la ruta está muy ligada a la de PDS,
cumpliendo ambas el papel de la desaturación de fitoeno para el paso a licopeno, ambas
reacciones ejecutadas por la enzima crtI en bacterias (Shaub et al, 2005), la cual es
frecuentemente utilizada en transformación genética de plantas. El mal funcionamiento de
la enzima Fitoeno desaturasa resulta en la acumulación de fitoeno, bloqueando el flujo de
la ruta biosintética de carotenos (Fraser y Bramley 2004). Por lo tanto, el hecho de que se
detecten niveles altos de trascrito de MePDS (figura 23) en las raíces en comparación con
54
las hojas puede ser una indicativo que este paso no es limitante para la síntesis de carotenos
en las raíces.
La enzima Lycopeno beta cyclasa, codificada por el gen LCYB, es considerada un paso
regulador de la vía al ser punto de ramificación. Aquí el flujo de la vía puede tomar hacia la
síntesis de α- o β-caroteno (Fraser & Bramley, 2004). En el caso yuca, los niveles de
expresión de LCYB en la raíz, determinados solamente con SYBR® Green, y comparados
con el contenido de β-caroteno en el mismo órgano, no indicaron una relación directa. De
otro lado, si la comparación se hubiera hecho con el porcentaje de β-caroteno acumulado,
habría relación directa (figura 18, figura 25); de esta manera, y de forma especulativa, se
podría inferir que la cantidad proporcional de producción de β-caroteno en cada variedad
estría asociada a la expresión de MeLCYB.
A pesar que se observaron cambios visibles en la expresión de algunos genes, las relaciones
que se hicieron siempre tendieron a buscar la concordancia entre la expresión génica con el
patrón de acumulación de carotenos, y con el color de las raíces. Es poco probable que en
una ruta ramificada como la de la formación de los carotenoides, el control esté en manos
de un solo mecanismo regulatorio, por ejemplo, regulación transcripcional; es más probable
que existan varios puntos de control en cada ramificación, que involucren eventos
transcripcionales y postranscripcionales (Welsch et al, 2001).
7.4
Comentarios sobre metodología
La discrepancia más notoria de los resultados obtenidos con SYBR® Green y TaqMan® se
encontró en el gen MePSY (Figuras 15 y 19), la cual se evidenció en la diferencia entre los
niveles de expresión de hoja con respecto a los de raíz. Mientras que en la cuantificación
realizada con TaqMan® en promedio se detectó una diferencia de 18 veces más en la hoja
que en la raíz, con SYBR® Green se detectó solamente una diferencia 3 veces más en la
hoja que en la raíz.
55
Para implicaciones netamente metodológicas, es importante que las dos técnicas utilizadas
(para analizar expresión génica) apunten en una misma dirección, pues sugiere que ambas
metodologías son efectivas, con diferente precisión, lo cual reduce el error.
Aunque es complicado encontrar la razón exacta de la diferencia en la expresión del gen de
MePSY con las dos metodologías utilizadas, es evidente que las sondas TaqMan® son más
precisas en la cuantificación de la expresión génica. También es pertinente mencionar que
aunque los iniciadores utilizados en ambos procesos fueron diseñados sobre la misma
secuencia, no se trata del mismo par de iniciadores. La sensibilidad de los iniciadores
puede ser un factor que influyó en la diferencia observada, y en la eficiencia de
amplificación. Además, la diferencia no pudo estar en el ARN por que se utilizó el mismo
para ambas pruebas, ni tampoco en la síntesis de ADN complementario por que las
diferencias se hubieran notado en los otros dos genes evaluados (MePDS y MeZDS).
La cuantificación con las pruebas TaqMan® es mucho más precisa al emitir fluorescencia
estrictamente cuando se amplifica la secuencia blanco. El SYBR® Green se adhiere al ADN
de doble cadena emitiendo fluorescencia cuando hay amplificación indistintamente si se
amplifica el producto blanco o si se amplifica un producto inespecífico.
SYBR® Green no es tan efectivo para identificar diferencias en la cuantificación de genes
de baja expresión, como se puede ver en las figuras 17 y 21 de expresión del gen MeZDS
cuantificado con SYBR® Green y TaqMan® respectivamente. En la variedad blanca de
plantas de 6 meses de edad, donde se encontró un bajo nivel de expresión del gen, se notó
que SYBR® Green (figura 17) no pudo diferenciar la expresión de hoja con respecto a la de
raíz. Por el contrario, en la detección con TaqMan®, se evidenció un incremento de al
menos el doble en hoja. También para detectar expresión diferencial de un gen especifico el
SYBR® Green puede presentar problemas, debido a que esta marca fluorescente también
cuantifica el ruido ocasionado por cualquier ADN de doble cadena presente en la
amplificación, por ejemplo, el generado por dímeros de iniciadores.
56
Se debe tener en cuenta que el PCR en tiempo real solamente cuantifica los niveles de
ARN mensajero (ARNm). Una cuantificación precisa de los niveles de ARNm no le dice al
investigador nada acerca de los niveles de traducción o la estabilidad del ARNm. Los
niveles de ARN pueden no reflejar los niveles de proteína producidos por la célula y gran
cantidad de la regulación ocurre en el estado postranscripcional e incluso postraduccional.
PCR en tiempo real no brinda información acerca de la actividad de la proteína, o acerca de
cualquier posible mutación que puede haber ocurrido en el gen de interés. En conclusión un
análisis de expresión genética completo requiere información adicional, especialmente la
que deriva de ensayos inmuno-histoquímicos y bioquímicos (Bustin, 2002).
57
8
CONCLUSIONES:
•
Existe una relación directa entre la coloración de la raíz y los patrones bioquímicos
de carotenos en la misma; sin embargo esta relación no se mantuvo a nivel
molecular con la expresión de los genes estudiados.
•
El bajo nivel de trascrito de MePSY en la raíz, comparado con la hoja, más los
diversos reportes que postulan este gen como el punto regulador en la síntesis de
carotenos, apuntan a este gen como el gen blanco en estudios de manipulación
genética.
•
Los genes MeGGPS, MePSY, MePZDS y MeLCYB presentaron una expresión
mayor en hoja que en raíces. En el gen MePDS se observó lo contrario.
•
Existen diferencias estadísticamente significativas en el contenido de carotenos y βcaroteno en la raíz de las variedades MBRA 253 (A), CM2772-3 (C) y CM3306-4
(B); en las hojas no se conserva el mismo patrón. La yuca presenta alta variabilidad
fenotípica y bioquímica en el contenido de carotenos en la raíz.
•
La hoja acumula mucho más carotenos que la raíz. La relación es aproximadamente
100 a 1 en la variedad amarilla que es la que acumula mayor cantidad de carotenos
en la raíz.
•
La variedad de raíz amarilla (MBRA 253) presentó la mayor cantidad de
acumulación de β-caroteno en la raíz entre las variedades estudiadas. No obstante el
aporte porcentual de este compuesto a los carotenos totales fue el más bajo de las
variedades estudiadas.
•
Se encontró una tendencia en la relación entre la expresión del gen LCYB y el
porcentaje de β-caroteno con respecto a carotenos totales.
58
9
RECOMENDACIONES
A pesar que se han hecho reportes sobre la regulación de la ruta biosintética de carotenos
en plantas, los mecanismos empleados por éstas para determinar qué carotenoides, y en qué
cantidad, son acumulados en cada tejido específico, son todavía fuente de estudio.
Al parecer los mecanismos de regulación de la producción y de la acumulación de
carotenos son específicos para cada tejido, y en algunos casos para cada planta; esto explica
por qué frecuentemente los eventos regulatorios encontrados en un órgano específico de
una planta determinada no se pueden confirmar en otra.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en este estudio concernientes a los patrones de
expresión génica de los genes estudiados en las raíces de yuca, se proponen otros niveles de
estudio que potencialmente estén influyendo, bien sea en la producción o en la
acumulación de carotenos en las raíces de la yuca. Las perspectivas apuntan a regulaciones
postranscripcionales como la regulación del nivel proteico, degradación de carotenos o el
almacenaje de los carotenos sintetizados.
El siguiente paso en el estudio está relacionado con la degradación de carotenos; donde se
pretende cuantificar los productos volátiles de degradación de las raíces, buscando
establecer si la tasa de degradación es la misma en las tres variedades estudiadas.
59
10
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65
11
ANEXOS
11.1
Anexo 1. Protocolo de extracción de Carotenos totales y β-caroteno.
ANALISIS DE CAROTENOS. LABORATORIO DE BIOQUÍMICA, UNIDAD DE
BITECNOLOGÍA
Extracción de carotenos totales
Protocolo:CAR-LCH-001
Aplicación: Caracterización de germoplasma
Fecha: Julio del 2003
Persona a contactar: Alba Lucia Chavez (CIAT),
Tejido: cinco gramos de raíz u hoja de yuca (5 g. de material)
Equipo / materiales
•
Centrifuga refrigerada Sorvall
•
Ultraturrax
•
Tubos falcon, 50ml
•
Vortex
•
Espátula plástica
•
Balanza
•
Cilindro graduado
•
Cuchillo
•
Toallas de papel
•
Reactivos
•
Éter de petróleo, 35–65 C (J. T. Baker)
•
Acetona (J.T. Baker)
•
Agua
Procedimiento
Mezcle muy bien la muestra hasta completa homogenización.
Tomar 5 g. de material del material.
66
Transferir a un tubo Falcon con ayuda de la espátula plástica.
4.
Adicionar 5 ml de Éter de petróleo y 5 ml de Acetona.5.
Homogenizar
completamente por Turrax.
Centrifugar a 3000 rpm a 10 ºC, por 10min.
Separar la fase orgánica y transferirla a otro tuba falcon.
Mezclar el Pellet con 5 ml de Éter de Petróleo y 5 ml de Acetona.
Vortex corto
Centrifugar a 3000 rpm a 10 ºC, por 10min.
Se parar la fase acuosa y mezclarla con la del paso 7.
Agregar 10 ml de agua y llevar al votex.
Transferir la fase acuosa a un tubo falcon y repetir pasos 12 y 13.
Transferir la fase acuosa a un tubo falcon y completar a un volumen final de 15 ml
con Éter de petróleo.
Cuantificar el contenido de carotenos totales usando el protocolo para carotenos
totales por Colorimetría o el de β- caroteno por HPLC.
Nota: Los compuestos carotenicos son degradados por la luz y el aire.
67
11.2
Anexo 2. Protocolo para cuantificación de β-caroteno por método HPLC
Protocolo ID number: CAR-LCH-003
Aplicación:
Fecha:
Julio 2003
Contacto:
Alba Lucia Chavez (CIAT).
Equipo / materiales
•
HPLC Hewlett Packard Serie 1050
•
Water, Columna YMC-C30 HPLC (250 mm, ID:4.6mm)
•
Centrifuga refrigerada (Sorvall)
•
15 ml de tubo de centrifuga
•
vials para centrifuga 2 ml
•
filtros de 0.22 µ
•
jeringas platicas 3.0 ml
•
Balanza analítica
•
Pipetas 1000, 200, 20ul
•
Kinwipes
•
Reactivos
•
Metanol grado HPLC (J. T. Baker)
•
Metyl-t-butyl éter grado HPLC (J. T. Baker)
•
Agua grado HPLC (J. T. Baker)
•
Acetona grado HPLC (J. T. Baker)
•
β-caroteno (Sigma C0126)
•
mix de isomeros A-B caroteno (Sigma C4646)
•
Luteína (Sigma X 6250)
Procedimiento
68
1. Preparación de la curva estándar de β-caroteno
1.
Prepare un solución stock de 100 ppm de β-caroteno usando éter de petróleo como
solvente
2.
Diluya 100 ppm del stock como se describe a continuación:
Concentración
final
de
caroteno
Volumen del éter Volumen del
β- de petróleo (ml)
del
β-caroteno
standard (ml)
estándar
0
10
0
10
9
1
20
8
2
50
5
5
75
2.5
7.5
100
0
10
2. Análisis de la muestra
1.
Cuadre la lectura de absorbancia a 450 nm.
2.
Use muestras standard de β-carotene para construir la curva de calibración.
3.
Diluya las muestras usando acetona.
5.
Inyecte las muestras en el sistema HPLC
Fases móviles HPLC:
Reactivo
1 litro fase móvil A HPLC (ml)
1 litro fase móvil B HPLC (ml)
Metanol
810
200
Metil-t-butirill éter
150
760
Agua
40
40
Parámetros del sistema de HPLC:
69
•
Tasa da flujo: 1ml/min
•
Temperatura de la columna: 23 ºC
•
Volumen de inyección: 20 ul
•
Detección: UV(450 nm )
Gradiente Linear desde100%, fase móvil A hasta 100% fase móvil B durante 90 min.
70
11.3
Anexo 3. Protocolo de extracción de ARN de raíz de yuca.
Extracción de RNA de raíz de Yuca
Aplicación:
Extracción de ARN.
Fecha:
Octubre, 2004
Reilly K, Han Y, Tohme J, Beeching J R. (2001) Isolation and characterization of a
cassava catalase expressed during post-harvest physiological deterioration. Biochimica et
Biophysica Acta. 1518: 317-323. –Modificaciones realizadas en el CIATContacto :
Leonardo M. Galindo (CIAT).
Revisado por: Leonardo M. Galindo
Muestra:
Fecha: Octubre 8/04
Raíces de Yuca.
Equipo / materiales
• Cuchillo (limpiado con Rnasa away).
•
Rallador (limpiado con Rnasa away).
•
Espatula (autoclavada 3 veces).
•
Mortero (autoclavado 3 veces).
•
Tubos falcon 50 ml (nuevos).
•
Tubos de centrifuga Beckman (autoclavados 3 veces).
•
Cabina de Flujo laminar.
•
Nitrógeno liquido.
Reactivos1
• Buffer de extracción2.
•
Trizol.
•
Beta mercaptoetanol
•
Cloroformo.
•
Isopropanol.
•
75% etanol.
•
Agua DEPC3.
71
1. Cosechar raíces de yuca con guantes plásticos lavados con Rnasa Away. NO
almacenar en nitrógeno líquido.
2.
Lavar las raíces muy bien con agua normal( de la llave). Pele y descarte la corteza
café y corte la raíz en pedazos. Manténgalos en agua DEPC libre de Rnasas. Utilice
un rallador convencional para partir trozos pequeños. Lleve los trozos al mortero
(con nitrógeno líquido) a un polvo fino y almacene de 3-5 gramos en un tubo falcon
estéril..
3. Agregue 150 ul de B-Mercaptoetanol a 15 ml de Buffer de extracción por cada
muestra y caliente a 60°C.
4. Adicione el Buffer precalentado a las muestras y homogenice fuertemente. Espere 5
minutos.
5. Adicione 0,5 Volúmenes del reactivo Trizol® (aprox. 8 mL) y agite fuerte con la
mano por 30 segundos (invierta el tubo varias veces).
6. Encube a temperatura ambiente por 4:30 minutos (Agite cada minuto).
7. Adicione 0.2 volúmenes de cloroformo por cada ml de Trizol® (Aprox. 1.6 mL).
Tape los tubos y agite suavemente por 15 segundos.
8. Centrifuge a 11000 rpm por 15 minutos a 4°C la centrifuga Beckman.
9. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo (Cuidado de no tocar la fase solida) y
precipite con 0,5 volúmenes de Isopopanol. Incube las muestras a temperatura
ambiente por 8 minutos. Luego centrifuge a 11000 rpm por 15 minutos a 4°C.
10. Remueva el sobrenadante por inversión del tubo hacia el lado opuesto del Pellet y
lávelo con10 ml de Etanol al 75%. Centrifuge a 11000 rpm por 15 minutos a
Centrifuge 4°C la centrifuga Beckman.
11. Decante el sobrenadante por inversión.
12. Seque el Pellet de RNA volteando el tubo sobre una toalla de papel hasta que el
etanol no se vea. Disuelva en 100-500 ul (dependiendo del tamaño del pellet) de
DEPC.
1
Todos los reactivos deben ser exclusivos para RNA.
2
Buffer de extracción.
72
Concentración
1L
500 ml
250 ml
100 ml
50ml
25ml
10ml
final
100mM
Tris 100ml
HCl pH 7.5
3
100mM NaCl
20ml
10ml
5ml
2ml
25mM EDTA
50ml
25ml
12.5ml
5ml
1% SDS
10g
5g
2.5g
1g
2% PVP K30
20g
10g
5g
2g
Agua DEPC
•
Mezcle 50 ml de etanol al 96% (para RNA) con 1 ml de DEPC complete hasta 1L
con DDH2O (en una botella autoclavada).
•
Agitar toda la noche.
•
Autoclavar.
73
11.4
Anexo 4.Análisis de los datos de PCR en tiempo real.
tratamiento
ggpp_3_hoja
ggpp_3_hoja
ggpp_3_hoja
ggpp_3_raíz
ggpp_3_raíz
ggpp_3_raíz
ggpp_6_hoja
ggpp_6_hoja
ggpp_6_hoja
ggpp_6_raíz
ggpp_6_raíz
ggpp_6_raíz
lcyb_3_hoja
lcyb_3_hoja
lcyb_3_hoja
lcyb_3_raíz
lcyb_3_raíz
lcyb_3_raíz
lcyb_6_hoja
lcyb_6_hoja
lcyb_6_hoja
lcyb_6_raíz
lcyb_6_raíz
lcyb_6_raíz
pds_3_hoja
pds_3_hoja
pds_3_hoja
pds_3_raíz
pds_3_raíz
pds_3_raíz
pds_6_hoja
pds_6_hoja
pds_6_hoja
pds_6_raíz
pds_6_raíz
pds_6_raíz
psy_3_hoja
psy_3_hoja
psy_3_hoja
variedad
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
gen
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
ggpp
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
lcyb
pds
pds
pds
pds
pds
pds
pds
pds
pds
pds
pds
pds
psy
psy
psy
edad
3
3
3
3
3
3
6
6
6
6
6
6
3
3
3
3
3
3
6
6
6
6
6
6
3
3
3
3
3
3
6
6
6
6
6
6
3
3
3
Blanco
ngm
sng
78.748
3.306
96.499
8.248
115.259
1.489
49.974
6.871
49.664
2.160
28.632
3.122
51.146
8.405
30.416
1.053
53.356
5.056
2.528
0.739
10.044
0.926
9.326
0.823
26.897
3.690
117.360
9.068
61.147
4.992
11.927
2.083
13.939
1.124
3.053
0.380
542.282
8.933
153.024
7.367
206.227
8.294
10.618
2.867
22.587
3.086
30.462
5.261
46.440
3.588
17.029
2.995
27.558
2.412
75.566
2.380
26.086
3.823
53.985
4.633
20.689
1.510
1.706
0.805
7.718
1.090
15.472
3.818
6.682
1.486
26.688
3.311
69.711
3.475
114.430
6.599
85.826
7.277
74
control 18S
ngcm
sngc
152.002
8.769
468.890
8.748
454.192
22.579
251.772
4.525
255.783
14.361
35.626
7.051
60.065
4.733
41.427
5.702
62.041
4.379
32.110
4.833
32.125
9.229
17.424
2.591
23.364
4.360
80.754
12.673
59.685
7.465
49.304
1.846
46.101
2.204
16.284
1.998
59.133
4.418
54.065
4.341
102.895
5.981
16.364
0.905
52.284
0.910
21.077
0.614
107.346
4.136
339.001
18.637
218.040
3.463
103.692
5.963
114.724
9.415
72.522
4.165
59.133
7.246
54.065
4.341
107.895
5.981
15.380
2.341
48.284
5.152
21.077
0.614
56.453
0.214
129.310
6.855
109.954
3.615
normalizado
cm
ccv
0.518
0.037
0.206
0.018
0.254
0.013
0.198
0.028
0.194
0.014
0.804
0.182
0.852
0.155
0.734
0.104
0.860
0.102
0.079
0.026
0.313
0.094
0.535
0.093
1.151
0.267
1.453
0.254
1.024
0.153
0.242
0.043
0.302
0.028
0.187
0.033
4.585
0.702
2.830
0.265
2.004
0.142
0.649
0.179
0.432
0.059
1.445
0.253
0.433
0.037
0.050
0.009
0.126
0.011
0.729
0.048
0.227
0.038
0.744
0.077
0.350
0.050
0.032
0.015
0.072
0.011
1.006
0.292
0.138
0.034
1.266
0.161
1.235
0.062
0.885
0.069
0.781
0.071
psy_3_raíz
psy_3_raíz
psy_3_raíz
psy_6_hoja
psy_6_hoja
psy_6_hoja
psy_6_raíz
psy_6_raíz
psy_6_raíz
zds_3_hoja
zds_3_hoja
zds_3_hoja
zds_3_raíz
zds_3_raíz
zds_3_raíz
zds_6_hoja
zds_6_hoja
zds_6_hoja
zds_6_raíz
zds_6_raíz
zds_6_raíz
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
Amarilla
Blanca
Crema
psy
psy
psy
psy
psy
psy
psy
psy
psy
zds
zds
zds
zds
zds
zds
zds
zds
zds
zds
zds
zds
3
3
3
6
6
6
6
6
6
3
3
3
3
3
3
6
6
6
6
6
6
17.780
16.612
11.730
85.105
59.027
52.284
8.458
10.277
11.458
85.043
432.789
187.803
83.521
47.747
12.909
158.040
154.584
156.831
28.553
43.374
32.938
75
2.665
2.174
1.613
6.659
2.280
7.399
2.707
1.319
0.680
5.575
33.494
9.465
3.130
6.446
1.523
5.403
6.657
3.889
0.000
0.390
4.200
91.682
76.732
26.373
60.065
46.427
62.041
33.110
32.125
17.424
33.211
68.869
56.198
55.467
79.156
26.571
106.846
339.001
223.540
103.192
113.724
12.022
5.194
6.896
2.313
13.218
21.258
4.379
7.662
9.229
2.591
3.143
6.649
4.409
4.435
0.778
3.890
4.843
46.922
18.313
10.913
6.587
0.629
0.194
0.217
0.445
1.417
1.271
0.843
0.255
0.320
0.658
2.561
6.284
3.342
1.506
0.603
0.486
1.479
0.456
0.702
0.277
0.381
2.740
0.031
0.034
0.073
0.331
0.584
0.133
0.101
0.101
0.105
0.295
0.778
0.312
0.133
0.082
0.091
0.084
0.066
0.060
0.029
0.022
0.378
11.5
Anexo. 5
Análisis estadístico medición carotenos totales y β-carotenos
hplc
Obs
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
14:11 Tuesday, October 18, 2005
tejido
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
hoja
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
raíz
edad
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
6
6
6
6
6
6
6
6
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
6
6
6
6
6
6
6
6
rep
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
vari
CM2772
CM2772
CM2772
CM3306
CM3306
CM3306
MBRA253
MBRA253
MBRA253
CM2772
CM2772
CM2772
CM3306
CM3306
CM3306
MBRA253
MBRA253
MBRA253
CM2772
CM2772
CM2772
CM3306
CM3306
CM3306
MBRA253
MBRA253
MBRA253
CM2772
CM2772
CM2772
CM3306
CM3306
CM3306
MBRA253
MBRA253
MBRA253
color
cream
cream
cream
white
white
white
yellow
yellow
yellow
cream
cream
cream
white
white
white
yellow
yellow
yellow
cream
cream
cream
white
white
white
yellow
yellow
yellow
cream
cream
cream
white
white
white
yellow
yellow
yellow
75
total
713.960
684.495
965.623
471.747
548.913
560.141
448.876
441.377
651.731
925.019
788.198
651.426
415.537
670.503
621.650
644.261
399.289
561.171
1.623
1.345
2.181
0.608
0.988
0.958
5.517
5.349
3.995
1.701
1.423
1.497
0.544
0.559
0.721
5.551
5.097
4.330
beta
122.230
132.792
147.161
68.309
85.850
79.484
65.491
65.368
86.224
121.825
105.855
81.819
51.818
81.265
78.390
90.712
51.309
83.390
0.360
0.200
0.380
0.370
0.230
0.170
0.730
0.600
0.560
1.320
1.045
1.437
0.258
0.375
0.438
2.256
2.558
2.233
1
inter
cream_3
cream_3
cream_3
white_3
white_3
white_3
yellow_3
yellow_3
yellow_3
cream_6
cream_6
cream_6
white_6
white_6
white_6
yellow_6
yellow_6
yellow_6
cream_3
cream_3
cream_3
white_3
white_3
white_3
yellow_3
yellow_3
yellow_3
cream_6
cream_6
cream_6
white_6
white_6
white_6
yellow_6
yellow_6
yellow_6
hplc
14:11 Tuesday, October 18, 2005
2
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=0 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
1
108.014
.
yellow
36
311.331
44.8558
110844.45
2347.46
55.4888
8.07510
106.939
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=1 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
2
106.182
3
105.985
4
104.030
.
CM2772
cream
12
394.874
59.7019
176443.77
4018.60
121.259
18.2998
106.376
.
CM3306
white
12
274.406
37.2463
85702.18
1558.30
84.509
11.3955
106.685
.
MBRA253
yellow
12
264.712
37.6192
79068.63
1531.56
81.173
11.2973
106.225
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=2 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
5
111.468
6
106.261
3
yellow
18
306.079
47.5838
110772.44
2813.33
78.4476
12.5019
108.738
6
yellow
18
316.582
42.1277
117378.31
2003.92
80.7528
10.5512
108.220
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=3 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
7
109.668
8
109.770
9
109.646
3
CM2772
cream
6
394.871
67.1872
195034.12
5429.17
180.293
30.0809
111.841
3
CM3306
white
6
263.892
39.0688
83955.13
1839.20
118.290
17.5081
109.799
3
MBRA253
yellow
6
259.474
36.4955
83434.14
1601.26
117.922
16.3364
111.321
76
10
109.635
11
112.249
12
108.442
6
CM2772
cream
6
394.877
52.2167
193142.17
3277.28
179.417
23.3712
111.295
6
CM3306
white
6
284.919
35.4237
104324.40
1581.08
131.861
16.2331
113.363
6
MBRA253
yellow
6
269.950
38.7429
90451.00
1765.14
122.781
17.1520
111.410
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=4 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
13
30.4886
14
90.1838
hoja
.
yellow
18
620.218
88.8495
26158.27
733.814
38.1213
6.38494
26.0772
raíz
.
yellow
18
2.444
0.8621
3.69
0.604
0.4531
0.18325
78.6609
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=5 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
15
19.0616
16
16.6929
17
20.8157
18
68.4982
19
33.4900
20
63.7909
hoja
.
CM2772
cream
6
788.120
118.614
17034.41
511.199
53.2829
9.23038
16.5604
hoja
.
CM3306
white
6
548.082
74.186
8788.07
153.358
38.2711
5.05567
17.1041
hoja
.
MBRA253
yellow
6
524.451
73.749
12036.31
235.665
44.7890
6.26718
20.9190
raíz
.
CM2772
cream
6
1.628
0.790
0.09
0.293
0.1226
0.22096
18.4448
raíz
.
CM3306
white
6
0.730
0.307
0.04
0.011
0.0811
0.04192
27.2348
raíz
.
MBRA253
yellow
6
4.973
1.489
0.43
0.903
0.2681
0.38789
13.2060
hplc
18, 2005
14:11 Tuesday, October
3
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=6 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
21
32.8490
22
27.2701
hoja
3
yellow
9
609.652
94.7677
28036.44
969.091
55.8136
10.3767
27.4650
hoja
6
yellow
9
630.784
82.9313
27298.69
511.458
55.0744
7.5385
26.1933
77
23
48.3477
24
66.1232
raíz
3
yellow
9
2.507
0.4000
3.74
0.037
0.6445
0.0645
77.1183
raíz
6
yellow
9
2.380
1.3241
4.10
0.767
0.6753
0.2919
85.1151
-------------------------------------------------------------------- _TYPE_=7 ---------------------------------------------------------------------promedios------varianzas------error estandar--coef. de
variacionObs
tejido
edad
vari
color
_FREQ_
total
beta
vt
vb
st
sb
cvt
cvb
25
9.3344
26
11.4016
27
16.5916
28
19.5200
29
23.0319
30
27.8933
31
31.4865
32
39.9865
33
14.1082
34
15.8944
35
25.6217
36
7.7365
hoja
3
CM2772
cream
3
788.026
134.061
23872.64
156.596
89.2051
7.2249
19.6069
hoja
3
CM3306
white
3
526.934
77.881
2315.68
78.849
27.7830
5.1267
9.1324
hoja
3
MBRA253
yellow
3
513.995
72.361
14242.50
144.141
68.9021
6.9316
23.2185
hoja
6
CM2772
cream
3
788.214
103.166
18713.35
405.542
78.9796
11.6267
17.3553
hoja
6
CM3306
white
3
569.230
70.491
18312.77
263.586
78.1297
9.3735
23.7733
hoja
6
MBRA253
yellow
3
534.907
75.137
15520.28
439.243
71.9265
12.1002
23.2901
raíz
3
CM2772
cream
3
1.716
0.313
0.18
0.010
0.2459
0.0570
24.8126
raíz
3
CM3306
white
3
0.851
0.257
0.04
0.011
0.1221
0.0593
24.8444
raíz
3
MBRA253
yellow
3
4.954
0.630
0.70
0.008
0.4818
0.0513
16.8447
raíz
6
CM2772
cream
3
1.540
1.267
0.02
0.041
0.0834
0.1163
9.3809
raíz
6
CM3306
white
3
0.608
0.357
0.01
0.008
0.0567
0.0527
16.1513
raíz
6
MBRA253
yellow
3
4.993
2.349
0.38
0.033
0.3563
0.1049
12.3616
78
tejido=hoja
CASO 1
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
color
3
cream white yellow
edad
2
3 6
Number of Observations Read
Number of Observations Used
hplc
18, 2005
18
18
14:11 Tuesday, October
10
------------------------------------------------------------------ tejido=hoja -----------------------------------------------------------------The ANOVA Procedure
Dependent Variable: beta
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
5
9498.92108
1899.78422
7.66
0.0019
Error
12
2975.91396
247.99283
Corrected Total
17
12474.83505
Pr > F
Source
Source
color
edad
color*edad
18, 2005
CONTENIDO B-CAROTENO EN HOJAS
R-Square
Coeff Var
Root MSE
beta Mean
0.761447
17.72411
15.74779
88.84951
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
2
1
2
7973.720443
630.443357
894.757284
hplc
3986.860222
630.443357
447.378642
16.08
2.54
1.80
11
79
0.0004
0.1368
0.2065
14:11 Tuesday, October
------------------------------------------------------------------ tejido=hoja ------------------------------------------------------------------
The ANOVA Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for beta
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
12
Error Mean Square
247.9928
Number of Means
Critical Range
2
19.809813
3
24.255218
Means with the same letter are not significantly different.
REGWQ Grouping
Mean
N
color
A
118.614
6
cream
VARIEDAD C
B
B
74.186
6
white
VARIEDAD B
B
73.749
hplc
6
yellow VARIEDAD A
14:11 Tuesday, October
18, 2005 13
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz ------------------------------------------------------------------
CASO 2
The ANOVA Procedure
CONTENIDO B-CAROTENO EN RAICES
Class Level Information
Class
Levels
Values
color
3
cream white yellow
edad
2
3 6
Number of Observations Read
Number of Observations Used
hplc
18
18
14:11 Tuesday, October
18, 2005 14
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz ------------------------------------------------------------------
80
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: beta
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
5
10.05496107
2.01099221
109.60
<.0001
Error
12
0.22017431
0.01834786
Corrected Total
17
10.27513538
Pr > F
Source
R-Square
Coeff Var
Root MSE
beta Mean
0.978572
15.71274
0.135454
0.862067
Source
color
edad
color*edad
18, 2005
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
2
1
2
4.24395043
3.84310088
1.96790976
hplc
2.12197522
3.84310088
0.98395488
115.65
209.46
53.63
<.0001
<.0001
<.0001
14:11 Tuesday, October
15
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz -----------------------------------------------------------------The ANOVA Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for beta
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
12
Error Mean Square
0.018348
Number of Means
Critical Range
2
0.1703937
3
0.2086307
Means with the same letter are not significantly different.
REGWQ Grouping
Mean
N
color
A
1.48945
6
yellow
VARIEDAD A
B
0.79015
6
cream
VARIEDAD C
C
0.30660
6
white
VARIEDAD B
81
hplc
18, 2005
14:11 Tuesday, October
16
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz ------------------------------------------------------------------
CASO 3
CONTENIDO
B CAROTENO EN RAIZ POR TIEMPO
The ANOVA Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for beta
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
12
Error Mean Square
0.018348
Number of Means
Critical Range
2
0.1391259
Means with the same letter are not significantly different.
REGWQ Grouping
Mean
N
edad
A
1.32413
9
6
B
0.40000
9
3
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz -----------------------------------------------------------------contenido carotenos TOTALES en raíz a 3 y 6 meses
The GLM Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for beta
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
12
Error Mean Square
0.018348
Number of Means
Critical Range
2
0.3063754
3
0.33739
4
0.3536317
5
0.3536317
Means with the same letter are not significantly different.
82
6
0.3714835
REGWQ Grouping
Mean
N
inter
A
2.3489
3
yellow_6
A6
B
1.2670
3
cream_6
C6
C
C
C
C
C
0.6300
3
yellow_3
A3
D
0.3565
3
white_6
B6
D
D
0.3133
3
cream_3
C3
D
D
0.2567
3
white_3
B3
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------hplc
14:11 Tuesday, October
18, 2005 23
The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
tejido
2
hoja raíz
color
3
cream white yellow
edad
2
3 6
Number of Observations Read
Number of Observations Used
hplc
18, 2005
36
36
14:11 Tuesday, October
24
caso 4
hojas carotenos totales
The ANOVA Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for total
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
24
Error Mean Square
7748.212
Number of Means
Critical Range
2
74.167599
3
89.741558
Means with the same letter are not significantly different.
REGWQ Grouping
Mean
83
N
color
A
394.87
12
cream
B
B
B
274.41
12
white
264.71
12
yellow
------------------------------------------------------------------ tejido=hoja -----------------------------------------------------------------The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
color
3
cream white yellow
edad
2
3 6
Number of Observations Read
Number of Observations Used
hplc
18, 2005
18
18
14:11 Tuesday, October
29
------------------------------------------------------------------ tejido=hoja -----------------------------------------------------------------The ANOVA Procedure
Dependent Variable: total
CONTENIDO TOTAL CAROTENOS EN HOJA
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
5
258736.1936
51747.2387
3.34
0.0404
Error
12
185954.4106
15496.2009
Corrected Total
17
444690.6042
Pr > F
Source
Source
color
edad
color*edad
18, 2005
R-Square
Coeff Var
Root MSE
total Mean
0.581834
20.07098
124.4837
620.2176
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
2
1
2
255396.6907
2009.5623
1329.9406
hplc
127698.3453
2009.5623
664.9703
8.24
0.13
0.04
0.0056
0.7250
0.9581
14:11 Tuesday, October
30
------------------------------------------------------------------ tejido=hoja ------------------------------------------------------------------
84
The ANOVA Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for total
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
Error Degrees of Freedom
Error Mean Square
Number of Means
Critical Range
0.05
12
15496.2
2
156.59339
3
191.7336
Means with the same letter are not significantly different.
REGWQ Grouping
Mean
N
color
A
788.12
6
cream C
B
B
B
548.08
6
white B
524.45
6
yellow A
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz -----------------------------------------------------------------The ANOVA Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
color
3
cream white yellow
edad
2
3 6
Number of Observations Read
Number of Observations Used
hplc
18, 2005
18
18
14:11 Tuesday, October
33
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz ------------------------------------------------------------------
CASO 5
The ANOVA Procedure
Dependent Variable: total
CAROTENOS TOTALES EN RAÍZ
Source
Model
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
5
60.14459368
12.02891874
54.11
<.0001
85
Error
12
2.66749041
Corrected Total
17
62.81208408
R-Square
Coeff Var
Root MSE
total Mean
0.957532
19.29402
0.471477
2.443644
Source
color
edad
color*edad
18, 2005
0.22229087
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
2
1
2
60.00709251
0.07227602
0.06522514
hplc
30.00354626
0.07227602
0.03261257
134.97
0.33
0.15
Pr > F
<.0001
0.5791
0.8651
14:11 Tuesday, October
34
------------------------------------------------------------------ tejido=raiz -----------------------------------------------------------------The ANOVA Procedure
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test for total
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate.
Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom
12
Error Mean Square
0.222291
Number of Means
Critical Range
2
0.5930914
3
0.7261836
Means with the same letter are not significantly different.
REGWQ Grouping
Mean
N
color
A
4.9731
6
yellow
A
B
1.6282
6
cream
C
C
86
0.7296
6
white
0