CICLO CELULAR

CICLO CELULAR
Burke & Ellenberger, Nature Rev. MCB 2002
El ciclo celular consiste de cuatro fases principales: G1, S, G2 y M
El período comprendido por las fases G1, S y G2 se conoce como interfase.
Ciertas células post-mitóticas (ej. neuronas)
detienen el ciclo celular en G1 y entran en
una fase denominada G0.
quiescencia
(reversible)
Los distintos tipos celulares difieren en el potencial de replicación
o proliferativo (número de veces que la célula se replica).
Células de levaduras revelan un control nutricional del ciclo celular
En levaduras, la limitación de nutrientes influye sobre la duración del ciclo celular, de modo tal que las
células mantienen el mismo tamaño en cada ciclo (B). Si la longitud del ciclo fuera invariable y no estuviera
coordinado con el crecimiento de la célula, el tamaño de las células disminuiría en cada división (A).
Alberts et al., BMC 2002
En los tejidos de los organismos pluricelulares la proliferación celular
es un proceso estrictamente regulado
En epitelios monoestratificados maduros las células madre (stem cells) permanecen en un estado de G0 (a, en
rojo). Daños producidos al epitelio reactivan la proliferación de las células madre (b, en verde) y promueven su
diferenciación en diversos tipos celulares que reparan el daño (c). La persistencia desregulada del estado
activado de las células madre una vez alcanzada la confluencia de la monocapa, por ejemplo por mutaciones
oncogénicas, conducen a un crecimiento aberrante, la formación de tumores y eventualmente al cáncer (d y e).
Beachy et al., Nature 2004
Las células madre poseen un potencial replicativo ilimitado y
son una fuente de renovación celular en los tejidos adultos
Esquema que muestra la distribución de las células
madre en el epitelio que forma la epidermis
Las células madre (stem cells) de la epidermis localizadas en el ápice de las papilas de la dermis se dividen infrecuentemente
y originan células de tránsito que se desplazan lateralmente mientras se dividen activamente y amplifican la población. Cuando
llegan a la base de las papilas, estas células se disocian del estrato basal, y migran hacia estratos superficiales a la vez que se
diferencian en keratinocitos. El potencial replicativo de las células epidérmicas correlaciona con la expresión de β1-integrinas.
La proliferación y apoptosis es regulada por señales extracelulares
Hormonas y factores de acción paracrina controlan la proliferación y
diferenciación durante la pubertad, embarazo y la lactancia. Cuando la lactancia
finaliza o se suspende, el epitelio alveolar involuciona por apoptosis de las
células secretoras. El TGFβ es un factor que induce la apoptosis.
Secciones de glándula mamaria de ratones
en el período de lactancia. En marrón se
visualiza la expresión de TGFβ. A: normal;
B y C: animal donde se previene la succión.
Las flechas en C indican células apoptóticas
La prolactina estimula receptores que activan la vía de JAK-STATs.
Las STATs inducen la transcripción del gen de la β-caseína.
Alberts et al., BMC 2002
La incorporación de BrdU se emplea para determinar
la proliferación celular de un tejido
El potencial replicativo de las células epiteliales epidérmicas
correlaciona directamente con la expresión de β1 integrinas.
control
knock out
La bromodeoxiuridina (BrdU) es un análogo de timina que se incorpora en el DNA cuando las células entran en fase S.
En la figura se muestran secciones de folículos pilosos de ratones control y knock out para β1-integrinas teñidos con
anti-BrdU. Note que los folículos normales presentan mayor cantidad de núcleos marcados (puntos en marrón) que los
del ratón deficiente en beta 1 integrinas (asteriscos y flechas)
La incorporación de 3H-timidina y la citometría de flujo son otras
técnicas experimentales para estudiar el ciclo celular
La incorporación de 3H-timidina revela las células que estan en
fase S (flecha). Autoradiografía. La determinación de la radioactividad
incorporada permite cuantificar las células en estado proliferativo (B).
A
insulin Æ IR Æ Grb10 Æ Erk
B
células estimuladas a dividirse
con insulina en presencia o
ausencia de un inhibidor de la
señalización por Grb10. Observe
que 10 μg/ml del inhibidor produce
el máximo efecto.
La citometría de flujo revela el
contenido de DNA de una población
celular y permite calcular el porcentaje
de células en fase G1, S y G2/M.
PRINCIPIOS GENERALES
DEL CICLO CELULAR
¾ unidireccionalidad
¾ robustez (sistemas de reaseguro y redundancia en respuesta a perturbaciones y errores)
errores)
¾ adaptabilidad (modificable por variaciones en las condiciones externas)
externas)
Las células progresan unidireccionalmente a través del ciclo celular y
la transición entre fases es estrictamente controlada ("checkpoints")
(ciclina D es un sensor
de estimulos mitogenicos)
Alberts et al., BMC 2002
El progreso a través de las distintas fases requiere de la actividad
de kinasas dependientes de ciclinas (Cdks)
*
*Cdh1 es un factor que determina
la degradación de las ciclinas
mitóticas cuando se une a APC.
Lodish et al., MBC 2004
La activación de Cdk requiere de la unión a una ciclina
La Cdk no unida a ciclina está autoinhibida por un bucle flexible (T-loop) que bloquea el
acceso del substrato al sitio activo (a). La unión de la ciclina a la Cdk induce un cambio
conformacional que expone el sitio activo (b) al solvente y exhibe una baja actividad.
Las ciclinas cumplen dos funciones básicas:
1) activan las Cdks
2) determinan la especificidad por los substratos
Lodish et al., MBC 2004
La fosforilación de una treonina conservada induce
la actividad máxima de la Cdk
La kinasa CAK fosforila la treonina 160 en la Cdk2 lo cual incrementa ~ 150 veces su actividad
(CAK)
Cdk-activating kinasa
Los complejos Cdk-ciclinas fosforilan proteínas que controlan eventos específicos del ciclo celular (ej.
condensación de la cromatina, ruptura de la membrana nuclear, ensamble del huso mitótico, etc).
Lodish et al., MBC 2004
La fosforilación de sitios inhibidores también regula
la actividad de algunas Cdks
Antes de comenzar la mitosis, las Cdk1 y 2 son fosforiladas en un sitio activador (Thr160) por la
kinasa CAK, y en uno o dos sitios inhibidores (Thr14, Tyr15) por la kinasa Wee1. En este estado la
Cdk es inactiva. Al final de la fase G2, Cdk1 es activada por la fosfatasa dual Cdc25.
dual
(Thr 14, Tyr 15)
cicl B
Cdk1
cicl B
Cdk1
Thr160
(CAK)
MPF (Mitosis Promoting Factor) = Cdk1-cicl B
CAK: Cdk-activating kinase
Alberts et al., BMC 2002
Otro mecanismo que regula la actividad de Cdks es la
expresión de inhibidores
CKI:
CKI: Cdk Kinase Inhibitors
Cdk
Cdk
Los inhibidores (CKI) se unen al complejo CDK-ciclina y bloquean el acceso del dominio
catalítico de la Cdk al substrato.
Alberts et al., BMC 2002
Dos complejos de ubiquitinación, SCF y APC, promueven la degradación
de ciclinas y otros reguladores del ciclo celular
El complejo APC se activa por fosforilación y su especificidad es regulada por cofactores específicos (ej.
Cdc20 y Cdh1). El complejo SCF esta siempre activo y reconoce substratos después de ser fosforilados.
inhibidores de G1 Æ S (ej. p21, p27, Sic1 son degradados via SCF)
inhibidores de metafase Æ anafase (ej. Wee es degradada via SCF)
inhibidores de anafase Æ telofase/citokinesis (ej. ciclinas B, securina son degradadas via APC)
Reed, NRMCB 2003
Los substratos de APC poseen secuencias conservadas
que son reconocidas específicamente por cofactores
Las ciclinas de fase S y M poseen una secuencia de destrucción (destruction box o degron).
(en rojo se resaltan los
residuos idénticos en
diferentes ciclinas)
E1: enzima activada por ubiquitina
E2: enzima conjugadora de ubiquitina
E3: ubiquitina ligasa )APC
EXPERIMENTOS QUE
PERMITIERON IDENTIFICAR
REGULADORES CLAVES
DEL CICLO CELULAR
Experimentos de fusión de células revelaron la existencia de
factores difusibles que controlan el ciclo celular
Experimentos que revela la actividad
de las Cdks de fase S
Experimento que revela la actividad de las Cdks de fase M
El citoplasma de células en fase S induce a núcleos en
G1 (A) y no de G2 (B) a iniciar la replicación del DNA.
(C) El núcleo en G2 no se modifica y el núcleo de G1
entra en fase S de acuerdo a su propio ritmo.
La fusión de una célula en fase M con otra en fase G1 induce eventos
en el núcleo de G1 característicos de las primeras fases de la mitosis.
Experimentos con oocitos de Xenopus permitieron aislar un factor
promotor de la mitosis: MPF (Mitosis Promoting Factor)
La identidad molecular del MPF corresponde al complejo de CDK-ciclinas M
La microinyección del citoplasma de huevos detenidos en metafase de meiosis II a oocitos de G2 induce la mitosis y la
maduración a huevo sin necesidad de progesterona (b). El factor que induce la maduración fue aislado y se denominó ¨Maturation
Promoting Factor¨ o MPF. Cuando el MPF purificado es inyectado en células somáticas en interfase promueve la mitosis (c).
release from the ovary
(ovulation)
G2-arrested
oocyte
(prophase)
bajos niveles de
actividad MPF
mitosis
altos niveles de
actividad MPF
(b) microinjection
of cytoplasm
(c) microinjection
of purified MPF
mitosis
mitosis
G2-arrested
oocyte
célula en
interfase
Lodish et al, MBC2004
La actividad del MPF es máxima durante profase y metafase
Perfil de actividad del MPF durante la maduración de oocitos de Xenopus,
fertilización y etapas iniciales del desarrollo embrionario.
huevo
oocito
Lodish et al, MBC2004
Experimentos con embriones de erizos de mar demostraron que la
expresión de ciclinas B coincide con la actividad cíclica del MPF
En las primeras etapas del desarrollo del erizo de mar todas las células del embrión se dividen
sincrónicamente, entrando en mitosis simultaneamente. El análisis en geles de poliacrilamida de extractos
proteicos de los embriones revela variaciones cíclicas de la expresión de ciclinas B, con un pico máximo al
comenzar cada mitosis.
ciclina de fase M (B)
ribonucleótido
reductasa
El complejo promotor de la anafase APC promueve la degradación
de las ciclinas mitóticas al final de la anafase
El complejo APC unido al cofactor Cdh1 reconoce y
ubiquitina las ciclinas mitóticas. Durante el siguiente ciclo,
Cdh1 es fosforilado por las Cdk-ciclinas G1, evento que
impide su unión a APC y permite la acumulación de las
ciclinas M. Al final de la anafase la fosfatasa Cdc14
defosforila Cdh1, el cual se une y activa al complejo APC.
Secuencia reconocida por APC en las ciclinas mitóticas
Lodish et al, MBC2004
Estudios genéticos en S. pombe permitieron identificar Cdc2,
la Cdk que forma el complejo equivalente al MPF de Xenopus
Cdc2 de S. pombe es homóloga a Cdc28 de S. cerevisiae y equivalente a Cdk1 de vertebrados.
Células mutantes recesivas para el gen cdc2 (cdc2-) no se dividen. En contraste, mutantes de
ganancia de función (cdcD, dominantes) entran prematuramente a la mitosis, sin crecer lo suficiente.
cepa salvaje,
tamaño normal
microscopía electrónica de barrido
que muestra la cepa salvaje en
distintas etapas del ciclo.
mutante
recesiva
mutante dominante
Lodish et al, MBC2004
Estudios genéticos en S. pombe también permitieron identificar genes
reguladores de la actividad del MPF: Wee1 y Cdc25
Fenotipos mutantes en S. pombe
modelo de
interpretación de
los resultados
inhibidor
activador
Lodish et al, MBC2004
Modelo de acción de los principales reguladores de
la actividad del MPF en S. pombe
S. pombe posee una sola Cdk, Cdc2. Estudios genéticos permitieron identificar cuatro proteínas reguladoras
de Cdc2: Cdc13, una ciclina mitótica equivalente a la ciclina B de vertebrados; Wee1, una kinasa que fosforila
un sitio inhibidor (Y15) en Cdc2; y CAK, una kinasa que fosforila el sitio activador T161. La activación del
complejo Cdc2-Cdc13 requiere de un cuarto regulador, la fosfatasa Cdc25, que defosforila Y15.
(Cdc13)
(Cdc2)
* la Thr161 de Cdc2 es homóloga a la Thr160 de la Cdk1 de vertebrados.
Lodish et al, MBC2004
TRANSICIÓN DE LA
FASE G1 Æ S
Esta transición requiere de la inactivación de inhibidores
de la actividad/expresión de Cdk-ciclinas de fase S
Cdk-ciclinas de fase S
Sic1
Cdc28-Ciclinas B5/6 en S. cerevisiae
Cdk2-ciclinas E/A en vertebrados
Cdc28-Clb5/6 (S. cerevisiae)
p21/p27
Cdk2-E/A (vertebrados)
rb
ciclinas E (vertebrados)
En levaduras, Sic1 inhibe los complejos Cdc28-Ciclinas S durante G1
En la transición G1/S, Sic1 (S) alcanza un estado hiperfosforilado, condición necesaria para su
reconocimiento por el complejo SCF y su degradación en el proteosoma. Esto libera de manera
concertada una gran cantidad de complejos Cdk-S que inducen el comienzo de la fase S.
* Cdk1 aquí es usado como sinónimo de Cdc28 en S. cerevisiae
Reed, Nature Rev. MCB 2003
La destrucción abrupta de Sic1 produce la activación simultánea
de múltiples complejos Cdk1-Clb5
Sic1 es fosforilado gradualmente en G1 por Cdk1-Cln 1/2. Al final de G1, Sic1 supera un umbral de
fosforilación que el clave para su degradación abrupta en el proteosoma. Numerosos complejos de
Cdk-ciclinas S activos disparan la duplicación del DNA.
Reed, Nature Rev. MCB 2003
La replicación del DNA ocurre una sola vez por ciclo: fase S
Durante G2 y M los orígenes de replicación del DNA se encuentran asociados a un complejo multiproteico
denominado ORC (Origin Recognition Complex). Durante la fase G1 del ciclo siguiente varios factores de
iniciación (Cdc6, Ctd1 y Mcm) se unen al ORC y forman el complejo de pre-replicación o pre-RC. Su
unión durante G2 y M es inhibida por fosforilación mediada por Cdk-M.
(MPF)
Lodish et al, MBC2004
Al comienzo de la fase S las Cdk-ciclinas S y la
kinasa (DDK) fosforilan componentes del pre-RC,
evento que recluta al factor iniciador Cdc45. Cdc45
activa la helicasa Mcm que abre la doble hélice del
DNA (burbuja de replicación).
Cdc45 recluta las proteínas Rpa que protegen las
hebras simples del DNA. También se reclutan al
complejo la primasa y la DNA polimerasa.
El ORC y los factores Cdc6, Ctd1 fosforilados se
disocian.
Cdk-S y Cdk-M mantienen fosforilados a los factores
de iniciación impidiendo su reasociación al ORC.
Esto asegura que cada origen de replicación dispare
la síntesis del DNA una sola vez por ciclo. Cdc6
fosforilado además es ubiquitinado por SCF y
degradado. Otros factores son exportados al núcleo.
La degradación de las ciclinas S y M por APC en la
anafase, y la actividad de fosfatasas durante G1,
permite que los factores de iniciación de la
replicación ensamblen un nuevo pre-RC.
Lodish et al, MBC2004
Visualizacion de burbujas de replicación del ADN
microscopía electrónica
TRANSICIÓN DE LA
FASE G2 Æ M
Esta transición es regulada por fosforilación/defosforilación de Cdks de fase M
Cdc28-Ciclinas B1-4 (S. cerevisiae)
Cdk1-ciclina B = MPF (vertebrados)
La activación de MPF al final de G2 requiere de la fosfatasa Cdc25
Cdc25 es activada por la kinasa Polo y también por MPF generando un circuito de retroalimentación
positivo que activa el MPF y además inhibe a la kinasa inhibidora Wee1. La consecuencia de este
mecanismo regulatorio provoca un aumento brusco y robusto de la actividad de MPF al final de G2.
ciclina B
CAK
dañ
daño del DNA
reparado
Tyr
Thr
Polo kinase
Cdk1
~ Cdc28
~ Cdc2
P
inhibición,
ubiquitinación
y degradación
en proteosoma
chk1 & 2
MPF activo
DNA no replicado
y/o dañ
dañado
EVENTOS CONTROLADOS
POR MPF/CDK-M
Fosforilación de las laminas y
ruptura de la envoltura nuclear
El MPF (Cdc28/Clb5; Cdk1/CiclB) fosforila las laminas A,
B y C evento que conduce a la depolimerización de los
filamentos intermedios y al desensamble de la lámina
nuclear. La lamina B fosforilada permanece anclada a la
membrana nuclear interna por un ácido graso. El MPF
también fosforila nucleoporinas provocando el
desensamble parcial de los poros nucleares.
microscopía de barrido de la lámina nuclear
MPF
El MPF fosforila condensinas y promueve el empaquetamiento de la cromatina
cromátides
Las condensinas son complejos multiproteicos que se asocian al DNA e
inducen su empaquetamiento.
Las cohesinas son complejos multiproteicos
que se asocian al DNA y mantienen unidas a
las cromátides duplicads.
Los complejos de cohesinas y condensinas
contienen ATPasas denominadas Smc
(Structural Maintenance of Chromosomes)
y otras proteínas accesorias.
Los complejos de condensinas/cohesinas.
se unen a regiones específicas del DNA
denominadas SARs/MARs
(scaffold/matrix-attachment regions).
metafase
Anafase
SARs o
MARs
Visualización de condensinas en cromosomas en metafase
En estas imágenes de fluorescencia los cromosomas estan teñidos con
anticuerpos contra condensinas (rojo) y el DNA esta teñido con Hoescht (azul)
Modelo de condensación de la cromatina
fibra de 11 nm
(hilera de
nucleosomas)
fibra de
cromatina
de 30 nm
en un cromosoma de metafase (~2 μm de largo)
la doble hebra del DNA (~1,5 cm de largo) se
empaqueta por un factor de ~10.000!
El MPF fosforila MAPs y promueve el incremento de la inestabilidad
dinámica de los microtúbulos de metafase
MPF (Cdc28/Clb5; Cdk1/CiclB) fosforila catastrofinas y otras MAPs que
incrementan el dinamismo de los microtúbulos.
Las catastrofinas desestabilizan los microtúbulos incrementando la frecuencia
de catástrofes (transición de elongación Æ acortamiento).
El MPF también fosforila proteínas que conducen a
la desintegración del RE y Golgi
Se muestra la fragmentación del Golgi durante la mitosis y su
re-ensamble al final de la misma.
Magnus et al MBC2004
fosforilación de laminas Æ desensamble de la lámina nuclear
eventos
nucleares
fosforilación de nucleoporinas Æ desensamble de poros nucleares
fosforilación de proteínas de anclaje de la cromatina a la membrana
Æ desestabilización de la envoltura nuclear y de la cromatina
fosforilación de condensinas Æ empaquetamiento de la cromatina
MPF
eventos
citoplasmáticos
fosforilación de MAPs Æ incremento del dinamismo de los MTs
fosforilación de proteínas del RE y Golgi Æ inhibición del tráfico
TRANSICIÓN DE
METAFASE Æ ANAFASE
Esta transición es regulada por proteólisis mediada por APC
¾ activación de APC (fosforilación mediada por MPF)
¾ Unión de Cdc20 a APC y degradación de securinas
¾ Unión de Cdh1 a APC y degradación de ciclinas mitóticas
El comienzo de la anafase requiere de
la destrucción de las cohesinas
La proteína Scc1 actúa como un puente entre las proteínas Smc unidas a las cromátides duplicadas.
La securina inhibe la degradación de Scc1 en fases anteriores a la anafase. La activación de APC
promueve su degradación en proteosoma.
anafase
cromátidas
duplicadas
Lodish et al 4th Ed.
APC es activado por Cdc20 y promueve la destrucción de securina
APC es activado por fosforilación mediada por el MPF. APC activo se une al factor Cdc20 el cual le confiere
especificidad para ubiquitinar a securina. Securina es un inhibidor de la proteasa separasa la cual degrada
específicamente a las cohesinas permitiendo la separación de las cromátides.
fosforilación
por MPF
degradación
de cohesinas
Al final de la anafase APC promueve la degradación de las
ciclinas mitóticas, y por lo tanto la inactivación del MPF
inactivo
La especificidad del complejo APC por las ciclinas
mitóticas es deteminada por la unión al factor Cdh1.
fosforilación
Cdh1
activo
Cdc20
(securinas)
La inactivación del MPF revierte
los procesos previos y promueve
la decondensación de los
cromosomas y la reformación
del núcleo
La fosfatasa Cdc14 es requerida para la inactivación del MPF
y para la ocurrencia de la citoquinesis
Durante interfase y mitosis temprana Cdc14 es retenida inactiva en
el nucleólo. Al final de la anafase Cdc15 y otras kinasas fosforilan
y activan a Cdc14 la cual defosforila el factor Cdh1/Hct1 y permite
su unión a APC. APC-Cdh1 degrada las ciclinas S y M.
nucleolo
kinasas
(Cdc15)
normal
Cdc14
Cdc14
Cdh/APC
Cdc15 es requerida para la citoquinesis.
Levaduras mutantes permancen unidas
después de la mitosis.
la fosfatasa Cdc14 es necesaria para la
formación del huso mitótico intermedio
(en verde), estructura que marca el
sitio donde ocurre la citocinesis.
mutante de cdc15
MPF
Zen-4
citocinesis
Cdc14 Æ Zen-4 Æ MTs del huso intermedio
(ver imagen 25)
La inactivación del MPF permite la activación de
miosina y el desarrollo de la citoquinesis
REGULADORES POSITIVOS Y
NEGATIVOS DEL CICLO CELULAR
EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Factores de crecimiento y la matriz extracelular
estimulan la síntesis de ciclinas y Cdks en la fase G1
La estimulación con suero de células en G0 induce un pico de transcripción de genes denominados de
“expresión temprana” (c-fos, c-jun). Estos factores de transcripción inducen la expresión de genes de
“expresión tardía” (ej. ciclinas D, E), que son necesarios para el progreso de la fase G1.
(factores de crecimiento)
La transcripción de los genes de expresión temprana ocurre por la activación de factores de transcripción
pre-existentes y por lo tanto no requiere de síntesis de proteínas. En contraste, la síntesis de las proteínas
es requerida para la transcripción de los genes de respuesta tardía y para la degradación del mRNA.
La transcripción de genes de expresión temprana requiere de
la activación de vías de señalización, ej. de ras-MAPK
ej. c-fos gene
ERK Æ TCF Æ c-Fos↑
ECM Æ integrins
JNK Æ c-Jun↑
cdk inhibitors
c-Jun/c-Fos (AP1) Æ ciclina D Æ Cdk 4/6 ↑
Factores de crecimiento
y la matriz extracelular
estimulan la proliferación
e inhiben la apoptosis
factores
de
crecimiento
factores
de
crecimiento
matriz
extracelular
integrinas
caveolina
RTKs
FAK/Src/
RTKs
Fyn/Shc
Grb2
PI-3k
Ras
Rac
Akt
Bad
Erk
JNK
c-Jun/c-Fos
caspasa 9
Los genes de expresión temprana
estimulan la transcripción de
ciclinas D, Cdks 4/6 y de los
factores de transcripción E2F.
Estos a su vez estimulan la
síntesis de ciclinas E y A, y
de la Cdk 2.
activación
sostenida
p53
apoptosis
ciclinas D, Cdk4
y Cdk6, E2Fs
p21cip
Cdk 2, cicl E, A
división celular
La síntesis de ciclinas D es esencial para el pasaje de G1 a S
En presencia de factores de crecimiento las células se tornan independientes de dicha estimulación al final de G1 y entran
de manera irreversible a la fase S. Este punto crítico, conocido como punto de restricción, "start“, o de no retorno, depende
de la síntesis de ciclinas D.
(A) Las células superan el punto de no retorno después de 14 -16 h de incubación con factores de crecimiento y entran
en la fase S 6-8 h mas tarde (1). La microinyección de anti-ciclina D (2) inhibe la incorporación de bromodeoxiuridina
(BrdU) (3). El porcentaje de células marcadas con BrdU (en fase S) se determina 16 h mas tarde (4, B).
A
B
(no sintetizan DNA)
Los complejos Cdk4/6-ciclinas D fosforilan e
inactivan a la proteína de retinoblastoma Rb
El punto de no retorno se pasa cuando se activan los factores de transcripción E2Fs. Estos son inhibidos en G1 por la
proteína Rb en un complejo con la histona deacetilasa HDAC. La hiperfosforilación de Rb por Cdk4/6-D al final de G1 provoca
la disociación y activación de los factores E2Fs los cuales estimulan su propia transcripción y la de Cdk2, ciclinas A y E.
retroalimentación
positiva
fosforilación
HDAC
activo
gen inactivo
HDAC
Mid G1
Late G1
Punto de
restricción
superado
(independiente
de ciclinas D)
En vertebrados, inhibidores de Cdks (CIP/KIP) cumplen
una función similar a la de Sic1 de S. cerevisiae
Cdk2-E
•cumplen una función similar a Sic1
en S. Saccharomyces
integrinas
SCF-ubiquitina
p53
- p21CIP *
- CIP/KIP - p27KIP1
- p57KIP2
Cdk2-E/A
TGF-β
caderinas
otro grupo de inhibidores de Cdks:
- INK4 (p16)
Cdk4/6-ciclinas D
Resumen de eventos
temprana
G1
S
tardía
APC
inactivo
G2
anafase
telofase
activación
fosforilado e inactivo
APC
activo
fosforilación
Cdh1
Wee
fosforilación
↑transcripción
SPF
Cdc28-Cln3
↑transcripción
M
CAK
Cdc28-Cln1
Cdc28-Cln2
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
activas
proteólisis
Cdc20
Cdh1
Cdc25
fosforilación
proteólisis
Cdc34-SCF
Sic1
inactivación Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
inhibidor de
inactivas
la fase S
Sic1
ensamblaje de complejos
de pre-replicación
Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
activas
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
activas
inhibidor de
la anafase
Cdc7-DbF4
kinasa
síntesis
del DNA
complejos activos
inhibición del ensamblaje de nuevos
complejos de pre-replicación
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
Nomenclatura comparada de levaduras y vertebrados
S. cerevisiae
vertebrados
ciclina
Cdk
ciclina
Cdk
mid G1
Cln 3
Cdc28
D (1-4)
Cdk4/6
↑E2F, SBF y MBF
G1/S
Cln 1, 2
Cdc28
E
Cdk2
↓APC, ↓Sic1, ↓Cdh1
S
B 3-6
Cdc28
A
M
B 1-4
Cdc28
A/B
Cdk2
Cdk1
función
↑replicación del DNA
↑huso mitótico, ↑división nuclear
MPF ~ Cdc28-Clb ~ Cdc2-Cdc13 ~ Cdk1- cicl B
Xenopus
S. cerevisiae
S. pombe
vertebrados
Síntesis de proteínas
reguladoras del ciclo celular
Protein kinases and protein
phosphatases that modify Cdks
Cdk-activating phosphorylates an activating site in Cdks
kinase (CAK)
Wee1 kinase
phosphorylates inhibitory sites in Cdks; primarily involved in
controlling entry into mitosis
Cdc25
removes inhibitory phosphates from Cdks; three family members
phosphatase
(Cdc25A, B, C) in mammals; Cdc25C is the activator of Cdk1 at the
onset of mitosis
Cdk inhibitory proteins (CKIs)
Sic1 (budding suppresses Cdk activity in G1 ; phosphorylation by Cdk1 triggers its
destruction
yeast)
p27 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities in G1; helps cells to withdraw
from cell cycle when they terminally differentiate; phosphorylation by
Cdk2 triggers its ubiquitylation by SCF
p21 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities following DNA damage in
G1; transcriptionally activated by p53
p16 (mammals) suppresses G1-Cdk activity in G1; frequently inactivated in cancer
Ubiquitin ligases and their activators
SCF
catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved in G1 control,
including CKIs (Sic1 in budding yeast, p27 in mammals);
phosphorylation of target protein usually required for this activity
APC
catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved primarily in exit
from mitosis, including Securin and M-cyclins; regulated by association
with activating subunits
Cdc20
APC-activating subunit in all cells; triggers initial activation of APC at
metaphase-to- anaphase transition; stimulated by M-Cdk activity
Hct1/Cdh1
maintains APC activity after anaphase and throughout G1 ; inhibited by
Cdk activity
Gene regulatory proteins
E2F promotes transcription of genes required for G1/S progression, including genes
encoding G1/S cyclins, S-cyclins, and proteins required for DNA synthesis;
stimulated when G1 -Cdk phosphorylates Rb in response to extracellular mitogens
p53 promotes transcription of genes that induce cell cycle arrest (especially p21) or
apoptosis in response to DNA damage or other cell stress; regulated by association
with Mdm2, which promotes p53 degradation
APOPTOSIS
La apoptosis se reconoce por cambios morfológicos y moleculares
característicos
célula normal
co
ntr
ol
ap
op
tos
is
Las células que entran en apoptosis se contraen y
fragmentan en vesículas o cuerpos apoptóticos. Los
núcleos se condensan y el DNA se fragmenta
generando un patrón en escalera o ladder. Cambios
en la distribución de fosfolípidos (ej. fosfatidil serina)
pueden detectarse con anexina fluorescente.
célula en apoptosis
apoptosis
célula deprivada de factores
de crecimiento.
célula en presencia de
insulina.
La apoptosis involucra la activación en cascada de
proteasas intracelulares denominadas caspasas
Las caspasas son sintetizadas como precursores inactivos (procaspasas) que deben ser clivadas para su activación.
Estímulos que disparan apoptosis usualmente producen la agregación y autoprocesamiento de caspasas inciadoras.
Las caspasas iniciadoras activas posteriormente clivan y activan una o varias caspasas efectoras.
activación de procaspasa iniciadora
Substratos de caspasas son las laminas de la malla nuclear, proteínas del citoesqueleto, etc.
La deficiencia de señalización inducida por factores de crecimiento
provoca la apoptosis en varios tipos celulares
En ratones knockout para el gen del NGF o su receptor TrkA, se observa la ausencia
de las neuronas sensoriales que transmiten sensaciones de dolor.
Señal de
supervivencia
Los factores de crecimiento y la matriz extracelular inhiben la apoptosis
mediada por citocromo C de mitocondrias
La salida de citocromo C de mitocondrias ensambla un complejo molecular que activa caspasas.
integrinas
receptor
Factor trófico
ECM
membrana
PI-3K
14-3-3
Akt
P
Bad
Bcl-2
Bcl-2
mitocondria
P
Bax
Cito c APAF-1
Bax
PI-3K
Cito c
Akt
P Bad
14-3-3
caspasas
caspasas
La activación de procaspasas también puede ocurrir por estimulación
de receptores de superficie proapoptóticos
Receptores proapoptóticos (TNFR1, FAS-CD95, TRAIL, etc) pertenecen a la familia del
factor necrótico de tumores o ¨tumor necrosis factor (TNF).
La apoptosis controlada por factores extracelulares permite
remodelar tejidos y órganos durante el desarrollo
Pato. apoptosis inhibida
en el tejido interdigital.
el miembro derecho fue infectado con un
virus que expresa un receptor dominante
negativo de BMP, que inhibe la señalización
de BMP y la apoptosis entre los dígitos
apoptotic
zone
Pollo. apoptosis inducida
en el tejido interdigital
anterior
apoptotic
zone
expresión del mRNA
para BMP4 (en azul)
interdigital
apoptotic
zone
posterior
apoptotic
zone
apoptotic
zone
embriones de pollo
Las proteínas BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) inducen apoptosis en el tejido interdigital de los
miembros de vertebrados. En patos, la apoptosis del tejido interdigital de los miembros es inhibida por
noggin, una proteína secretada por células del mesénquima y que inhibe a BMP.
Gilbert, Dev. Biol. 6ta Ed.
CONTROL O "CHECKPOINTS"
EN EL CICLO CELULAR
sensor Æ mediador Æ efector
Mecanismos de control o "checkpoints" aseguran la correcta duplicación
del DNA, su integridad y distribución a las células hijas
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR: ATM-Rad3-Related
AT
Chk1/2: Chekpoint 1/2
(fosfatasa)
ATM y ATR son kinasas relacionadas a
PI3K; ATM sensa rupturas de la doble
hélice, ATR sensa alteraciones que
generan cadenas simples (ej. horquillas
de replicación detenidas). Chk1 y 2 son
kinasas de Ser/Trh substratos de
ATM/ATR.
La proteína p53 es un efector clave de la respuesta al
daño del DNA (“damage checkpoint”)
ubiquitinación
degradación de
p53 en proteosoma
En condiciones normales, p53 es ubiquitinado
por la ubiquitina ligasa Mdm2 y degradado en el
proteosoma. El daño del DNA activa kinasas
que fosforilan a p53 y provocan su disociación
de Mdm2. De esta manera, p53 se acumula y
ejerce su rol activando la transcripción de CKIs.
El daño del DNA y otras alteraciones activan mecanismos que arrestan
el ciclo celular o promueven la apoptosis
radiación
ionizante
daño
del DNA
sensors:
ATM y ATR
kinasas
activación P
de kinasas
Chk1 y Chk2
p53
P
inhibición de la actividad;
degradación en
proteosoma
P
Cdc25
Cdk1
Cdk2
p21CIP
estabilización
de p53
Cdk4/6
Rb E2F
↑ proteínas proapoptóticas:
Bax, receptores de Fas, etc
G2/M
G1/S
El DNA no replicado activa un mecanismo de control
(“DNA replication checkpoint“) que inactiva Cdc25
ATR actúa como sensor del DNA no replicado, y se activa al asociarse al DNA simple cadena de horquillas de replicación
arrestadas. ATR fosforila y activa la kinasa Chk1, la cual a su vez fosforila e inactiva la fosfatasa de Cdks Cdc25. La cafeína
inhibe ATR y éste mecanismo de control. La incubación de células con hidroxiurea, un inhibidor de la síntesis de
deoxinucleótidos, activa el mecanismo de control y provoca la detención del ciclo en la fase S. Células incubadas con
hidroxiurea + cafeína no se detienen en la fase S y experimentan errores fatales en la distribución de los cromosomas.
ATR ÆChk1
Cdc25 Æ CDK1-ciclA/B
Un complejo de proteínas controla el correcto
anclaje de los microtúbulos del cinetocoro
“checkpoint de metafase”
sensors
Bub, Mad
polo
mediador
Cdc20
efector APC
securina
En los cinetocoros libres se localizan y activan
proteínas de control como Mad y Bub, que retienen
y bloquean al cofactor Cdc20. De este modo, Cdc20
no esta disponible para activar APC. La ocupación
del último cinetocoro libera Cdc20 que se une y
activa APC. APC-Cdc20 ubiquitina el inhibidor de la
anafase securina y se dispara la anafase. La kinasa
Aurora-B se localiza en los cinetocoros y contribuye
a la corrección de defectos de anclaje de los
microtúbulos de los cinetocoros.
MAD: Mitotic Arrest Defficient
BUB: Budding Uninhibited by Benzimidazole
Mussachio & Salmon NRNCB 2007
La disponibilidad de Cdc20 permite la activación de APC
y la degradación de las cohesinas
cinetocoro
libre
todos los
cinetocoros
unidos a Mts
Mad2
libre
degradacion
de cohesinas
cinetocoros bi-orientados