CICLO CELULAR

CICLO CELULAR
Burke & Ellenberger, Nature Rev. MCB 2002
El ciclo celular consiste en la repetición de una secuencia de eventos
ordenados en cuatro fases: G1, S, G2 y M
El período comprendido por las fases G1, S y G2 se conoce como interfase.
El ciclo celular puede detenerse
temporalmente (quiescencia), o
permanentemente (p. ej. neuronas y
células del cristalino) en un estado
dentro de la fase G1 denominado G0.
quiescencia
(reversible)
Cada tipo celular repite el ciclo un número finito de veces; esto se conoce como el potencial de
replicación o proliferativo (número de veces que la célula se replica). La salida permanente del
ciclo celular producida por el acortamiento telomérico se conoce como senecencia replicativa.
El ciclo celular es regulado por nutrientes y factores de crecimiento
El crecimiento celular está acoplado al ciclo celular. Si la longitud del ciclo fuera invariable y no
estuviera coordinado con el crecimiento de la célula, en ausencia o restricción de nutrientes el tamaño
de las células disminuiría en cada división (A). Sin embargo, las células mantienen su tamaño a lo largo
de las generaciones debido a su capacidad de modular la duración del ciclo celular (B).
La restricción de nutrientes o factores de crecimiento provocan el bloqueo del ciclo celular en G1.
Alberts et al., BMC 2002
En los organismos pluricelulares la proliferación celular
es un proceso estrictamente regulado
En epitelios las células madre (stem cells) permanecen en un estado de G0 (a, en rojo). Daños
producidos al epitelio reactivan la proliferación de las células madre (b, en verde) las cuales se
diferencian en diversos tipos celulares y reparan el daño (c). La persistencia desregulada del estado
activado de las células madre una vez reparado el epitelio, por ejemplo por mutaciones oncogénicas,
puede promover la formación de tumores y cáncer (d y e).
Beachy et al., Nature 2004
La proliferación y apoptosis es regulada por señales extracelulares
Hormonas y factores de acción paracrina controlan la proliferación y
diferenciación de la glándula mamaria durante la pubertad, embarazo y la
lactancia. Cuando la lactancia finaliza o se suspende, el epitelio alveolar
involuciona por apoptosis de las células secretoras. El TGFβ es un factor
disparador de la apoptosis en la involución de la glándula mamaria.
Secciones de glándula mamaria de ratones
en el período de lactancia. En marrón se
visualiza la expresión de TGFβ. A: normal;
B y C: animal donde se previene la succión.
Las flechas en C indican células apoptóticas
La prolactina estimula receptores que activan la vía de JAK-STATs.
Las STATs inducen la transcripción del gen de la β-caseína.
Alberts et al., BMC 2002
Las células madre poseen un potencial replicativo ilimitado y
son una fuente de renovación celular en los tejidos adultos
Esquema que muestra la distribución de las células
madre en el epitelio que forma la epidermis
Las células madre (stem cells) de la epidermis localizadas en el ápice de las papilas de la dermis se dividen y originan células
de tránsito que mientras se desplazan lateralmente se dividen activamente y amplifican la población. Cuando llegan a la base
de las papilas, estas células se disocian del estrato basal, y migran hacia estratos superficiales a la vez que se diferencian en
keratinocitos. El potencial replicativo de las células epidérmicas correlaciona con la expresión de β1-integrinas.
El nivel de proliferación celular de un tejido puede estudiarse
determinando la incorporación de BrdU
El potencial replicativo de las células epiteliales epidérmicas
correlaciona directamente con la expresión de β1 integrinas.
control
knock out
La bromodeoxiuridina (BrdU) es un análogo de timina que se incorpora en el DNA cuando las células entran en fase S.
En la figura se muestran secciones de folículos pilosos de ratones control (A) y knock out (B) para β1-integrinas teñidos con
anti-BrdU. Note que los folículos normales presentan mayor cantidad de núcleos marcados (puntos en marrón) que los
del ratón deficiente en beta 1 integrinas (asteriscos y flechas en B)
La incorporación de 3H-timidina y la citometría de flujo son otras
técnicas experimentales para estimar la proliferación celular
La incorporación de 3H-timidina ocurre en las células que están en
fase S (flecha). (A) Autoradiografía. La determinación de la radioactividad
incorporada permite cuantificar las células en estado proliferativo (B).
A
Microscopía de una sección de epitelio
B
Células estimuladas a dividirse con insulina en presencia
o ausencia de un inhibidor de la señalización (inhibidor
del adaptador Grb10). Observe que 10 μg/ml del
inhibidor produce el máximo efecto.
insulin  IR  Grb10  Erk  Ciclinas D
La citometría de flujo revela el
contenido de DNA de una población
celular y permite calcular el porcentaje
de células en fase G1, S y G2/M.
PRINCIPIOS GENERALES
DEL CICLO CELULAR
 unidireccionalidad (secuencia temporal de eventos)
 adaptabilidad (ajustable a las condiciones ambientales)
robustez (sistemas redundantes que operan eficientemente en condiciones variables )
El progreso unidireccional del ciclo es asegurado por
mecanismos de control o “checkpoints”
Alberts et al., BMC 2002
El progreso a través de las distintas fases requiere de la actividad
de complejos heterodiméricos formados por kinasas y ciclinas
La actividad de las kinasas del ciclo celular
(Cdk, Cyclin-dependent kinases) requiere
de su asociación con ciclinas.
*
*Cdh1 es un factor que determina
la degradación de las ciclinas
mitóticas por el complejo APC.
Lodish et al., MBC 2004
La activación de las Cdk requiere de su unión a una ciclina
(a) La Cdk no unida a ciclina está autoinhibida por un bucle flexible (T-loop) que bloquea el
acceso del substrato al sitio activo unido al ATP. (b) La unión de la ciclina a la Cdk induce un
cambio conformacional que expone el sitio activo al solvente y permite la unión del substrato.
ATP
Las ciclinas cumplen dos funciones básicas:
1) activan las Cdks
2) determinan la especificidad por los substratos
Lodish et al., MBC 2004
El nivel de expresión de las ciclinas es el determinante
principal de la activación de las Cdk
Los niveles de expresion de las ciclinas oscilan durante el ciclo celular.
Dichos niveles están controlados a nivel transcripcional y post-traducción.
Al final de la mitosis todas las ciclinas son degradadas en proteosomas.
La fosforilación de la Cdk constituye otro nivel de regulación
de la actividad
La kinasa CAK fosforila la treonina 160 en la Cdk2 lo cual incrementa ~ 150 veces su actividad
(CAK)
Cdk-activating kinasa
Los complejos Cdk-ciclinas fosforilan proteínas que controlan eventos específicos del ciclo celular (ej.
condensación de la cromatina, ruptura de la membrana nuclear, ensamble del huso mitótico, etc).
Lodish et al., MBC 2004
La fosforilación de sitios inhibidores bloquea la actividad de
los complejos Cdk/ciclinas
Antes de comenzar la mitosis, las Cdk1 y 2 son fosforiladas en un sitio activador (Thr160) por la kinasa CAK,
y en uno o dos sitios inhibidores (Thr14, Tyr15) por la kinasa Wee1. En este estado la Cdk es inactiva. Al final
de la fase G2, Cdk1 es activada por la fosfatasa dual Cdc25 que remueve el fosfato del sitio inhibidor.
dual
(Thr 14, Tyr 15)
cicl B
Cdk1
cicl B
Cdk1
Thr160
(CAK)
MPF (Mitosis Promoting Factor) = Cdk1-cicl B
CAK: Cdk-activating kinase
Alberts et al., BMC 2002
Otro mecanismo que regula negativamentge la actividad de Cdks es la
expresión de inhibidores
CKI: Cdk Kinase Inhibitors
Cdk
Cdk
Los inhibidores (CKI) se unen al complejo CDK-ciclina y bloquean el acceso del dominio catalítico de la
Cdk al substrato. Hay inhibidores generales (p21, p27) y específicos (INK4a inhibe Cdk4 y 6 en G1).
Alberts et al., BMC 2002
Dos complejos de ubiquitinación, SCF y APC, promueven la degradación
de ciclinas y otros reguladores del ciclo celular
El complejo APC es activado por fosforilación y su especificidad es regulada por la unión a cofactores
específicos (ej. Cdc20 y Cdh1). El complejo SCF esta siempre activo y reconoce substratos fosforilados.
inhibidores de G1  S (ej. p21, p27, Sic1 son degradados via SCF)
inhibidores de metafase  anafase (ej. Wee es degradada via SCF)
inhibidores de anafase  telofase/citokinesis (ej. ciclinas B, securina son degradadas via APC)
APC: Anaphase Promoting Complex
SCF: Skp1/Cullin/F-box protein)
Reed, NRMCB 2003
Los substratos de APC poseen secuencias conservadas que son
reconocidas específicamente por los cofactores Cdc20 y Cdh1
Las ciclinas de fase S y M poseen una secuencia de destrucción (destruction box o degron).
(en rojo se resaltan los
residuos idénticos en
diferentes ciclinas)
E1: enzima activada por ubiquitina
E2: enzima conjugadora de ubiquitina
E3: ubiquitina ligasa )APC
EXPERIMENTOS QUE
PERMITIERON IDENTIFICAR
REGULADORES CLAVES
DEL CICLO CELULAR
Experimentos de fusión de células revelaron la existencia de
factores difusibles que controlan el ciclo celular
Experimentos que revela la actividad
de las Cdks de fase S
Experimento que revela la actividad de las Cdks de fase M
El citoplasma de células en fase S induce a núcleos en
G1 (A) y no de G2 (B) a iniciar la replicación del DNA.
(C) El núcleo en G2 no se modifica y el núcleo de G1
entra en fase S de acuerdo a su propio ritmo.
La fusión de una célula en fase M con otra en fase G1 induce eventos
en el núcleo de G1 característicos de las primeras fases de la mitosis.
Experimentos con oocitos de Xenopus permitieron aislar un factor
promotor de la mitosis denominado MPF (Mitosis Promoting Factor)
El MPF identificado originalmente es equivalente al complejo de CDK-ciclinas M
La microinyección del citoplasma de huevos detenidos en metafase de meiosis II a oocitos de G2 induce la mitosis y la
maduración a huevo sin necesidad de progesterona (b). El factor que induce la maduración fue aislado y se denominó ¨Maturation
Promoting Factor¨ o MPF. Cuando el MPF purificado es inyectado en células somáticas en interfase promueve la mitosis (c).
release from the ovary
(ovulation)
G2-arrested
oocyte
(prophase)
bajos niveles de
actividad MPF
mitosis
altos niveles de
actividad MPF
(b) microinjection
of cytoplasm
(c) microinjection
of purified MPF
mitosis
mitosis
G2-arrested
oocyte
célula en
interfase
Lodish et al, MBC2004
La actividad del MPF es máxima durante profase y metafase
Perfil de actividad del MPF durante la maduración de oocitos de Xenopus,
fertilización y etapas iniciales del desarrollo embrionario.
huevo
oocito
Lodish et al, MBC2004
Experimentos con embriones de erizos de mar demostraron que la
expresión de ciclinas mitóticas coincide con la actividad cíclica del MPF
En las primeras etapas del desarrollo del erizo de mar todas las células del embrión se dividen
sincrónicamente, entrando en mitosis simultaneamente. El análisis en geles de poliacrilamida de extractos
proteicos de los embriones revela variaciones cíclicas de la expresión de ciclinas B, con un pico máximo al
comenzar cada mitosis.
ciclina de fase M (B)
ribonucleótido
reductasa
Las ciclinas mitóticas son degradadas por el complejo promotor de
la anafase APC al final de la anafase
El complejo APC unido al cofactor Cdh1 reconoce y
ubiquitina las ciclinas mitóticas, que se degradan en
proteasomas. Durante el siguiente ciclo, Cdh1 es
fosforilado por las Cdk-ciclinas G1, lo cual impide su
unión a APC y permite la acumulación de las ciclinas M.
Al final de la anafase la fosfatasa Cdc14 defosforila
Cdh1, el cual se une y activa al complejo APC.
Secuencia reconocida por APC en las ciclinas mitóticas
Lodish et al, MBC2004
Estudios genéticos en S. pombe permitieron identificar Cdc2,
la Cdk que forma el complejo equivalente al MPF de Xenopus
Cdc2 de S. pombe es homóloga a Cdc28 de S. cerevisiae y equivalente a Cdk1 de vertebrados.
Células mutantes recesivas para el gen cdc2 (cdc2-) no se dividen. En contraste, mutantes de
ganancia de función (cdcD, dominantes) entran prematuramente a la mitosis, sin crecer lo suficiente.
cepa salvaje,
tamaño normal
microscopía electrónica de barrido
que muestra la cepa salvaje en
distintas etapas del ciclo.
mutante
recesiva
mutante dominante
Cdc: Cell division cycle
Lodish et al, MBC2004
Estudios genéticos en S. pombe también permitieron identificar genes
reguladores de la actividad del MPF: Wee1 y Cdc25
Fenotipos mutantes en S. pombe
modelo de
interpretación de
los resultados
inhibidor
activador
Lodish et al, MBC2004
Modelo de acción de los principales reguladores de
la actividad del MPF en S. pombe
S. pombe posee una sola Cdk, Cdc2. Estudios genéticos permitieron identificar cuatro proteínas reguladoras
de Cdc2: Cdc13, una ciclina mitótica equivalente a la ciclina B de vertebrados; Wee1, una kinasa que fosforila
un sitio inhibidor (Y15) en Cdc2; y CAK, una kinasa que fosforila el sitio activador T161. La activación del
complejo Cdc2-Cdc13 requiere de un cuarto regulador, la fosfatasa Cdc25, que defosforila Y15.
(Cdc13)
defosforilación del
sitio inhibidor
(Cdc2)
sitio
inhibidor
sitio
activador
* la Thr161 de Cdc2 es homóloga a la Thr160 de la Cdk1 de vertebrados.
Lodish et al, MBC2004
TRANSICIÓN DE LA
FASE G1  S
Esta transición requiere de la inactivación de inhibidores
de la actividad/expresión de Cdk-ciclinas de fase S
Cdk-ciclinas de fase S
Sic1
Cdc28-Ciclinas B5/6 en S. cerevisiae
Cdk2-ciclinas E/A en vertebrados
Cdc28-Clb5/6 (S. cerevisiae)
p21/p27
Cdk2-E/A (vertebrados)
rb
ciclinas E (vertebrados)
La destrucción abrupta de Sic1 produce la activación simultánea
de múltiples complejos Cdk1-Clb5
Sic1, que bloquea a los complejos Cdk-clinas S, es fosforilado gradualmente en G1 por Cdk1-Cln 1/2. Al
final de G1, Sic1 supera un umbral de fosforilación que dispara su ubiquitanción y degradación abrupta
en el proteosoma. De esta manera, los complejos de Cdk-ciclinas S se desbloquean y simultaneamente
disparan la duplicación del DNA.
Reed, Nature Rev. MCB 2003
Fase S: La replicación del DNA ocurre una sola vez por ciclo.
Durante G2 y M los orígenes de replicación del DNA se encuentran asociados a un complejo multiproteico
denominado ORC (Origin Recognition Complex). Durante la fase G1 del ciclo siguiente los factores de
iniciación Cdc6 y Ctd1 facilitan la unión de la helicasa Mcm al ORC y forman el complejo de pre-replicación
o pre-RC. En las fases posteriores de G2 y M, Cdk-M fosforila a estos factores impidiendo su unión al ORC.
(MPF)
Lodish et al, MBC2004
La fase S se dispara cuando las Cdk-ciclinas S y la
kinasa (DDK) fosforilan componentes del pre-RC. Esto
permite el reclutamienbto del factor iniciador Cdc45
que activa la helicasa Mcm y abre la doble hélice del
DNA (burbuja de replicación). La fosforilación de Ctd1
y Cdc6 inducen su disociación del complejo.
Cdc45 también recluta las proteínas Rpa que protegen
las hebras simples del DNA de la degradación por
nucleasas. El reclutamiento de la primasa y la DNA
polimerasa permiten el inicio de la duplicación del
DNA.
Cdk-S y Cdk-M mantienen fosforilados a los factores
de iniciación impidiendo su re-asociación al ORC. Esto
asegura que cada origen de replicación dispare la
síntesis del DNA una sola vez por ciclo. Cdc6
fosforilado además es ubiquitinado por SCF y
degradado. Otros factores son exportados al núcleo.
La degradación de las ciclinas S y M por APC en la
anafase, y la actividad de fosfatasas durante G1,
permite que los factores de iniciación de la replicación
ensamblen un nuevo pre-RC en el siguiente ciclo.
Lodish et al, MBC2004
Visualizacion de burbujas de replicación del AND en
un cromosoma eucariota
microscopía electrónica
E. coli tiene un solo origen de replicación. Los cromosomas eucariotas tienen varios, estimaciones indican que
la levadura S. cerevisiae tiene alrededor de 300 distribuidos uniformemente en sus 16 cromosomas. Los ORC
eucariotas no están muy bien caracterizados, en levaduras comprenden una región de DNA de ~ 100 pb.
TRANSICIÓN DE LA
FASE G2  M
Esta transición es regulada por fosforilación/defosforilación de Cdks de fase M
Cdc28-Ciclinas B1-4 (S. cerevisiae)
Cdk1-ciclina B = MPF (vertebrados)
La fosfatasa Cdc25 activa el MPF al final de G2 y dispara la mitosis
Cdc25 es activada por la kinasa Polo y también por MPF generando un circuito de retroalimentación
positivo que activa más MPF y además fosforila e inhibe a la kinasa inhibidora Wee1. La consecuencia de
este mecanismo regulatorio provoca un aumento brusco y robusto de la actividad de MPF al final de G2.
ciclina
mitótica (B)
CAK
daño del DNA
reparado
Tyr
Thr
Cdk1
~ Cdc28
~ Cdc2
Polo kinase
p38
P
inhibición,
ubiquitinación
y degradación
en proteosoma
chk1 & 2
MPF activo
DNA no replicado
y/o dañado
EVENTOS CONTROLADOS
POR MPF/CDK-M
EN MITOSIS
Fosforilación de las laminas y
ruptura de la envoltura nuclear
El MPF (Cdc28/Clb5; Cdk1/CiclB) fosforila las laminas A,
B y C evento que conduce a la depolimerización de los
filamentos intermedios y al desensamble de la lámina
nuclear. La lamina B fosforilada permanece anclada a la
membrana nuclear interna por un ácido graso. El MPF
también fosforila nucleoporinas provocando el
desensamble parcial de los poros nucleares.
microscopía de barrido de la lámina nuclear
MPF
El MPF fosforila condensinas y promueve el empaquetamiento de la cromatina
cromátides
Las condensinas son complejos multiproteicos que se asocian al DNA e
inducen su empaquetamiento.
Las cohesinas son complejos multiproteicos
que se asocian al DNA y mantienen unidas a
las cromátides duplicadas.
Ambos complejos de cohesinas y condensinas
contienen ATPasas denominadas Smc
(Structural Maintenance of Chromosomes)
y otras proteínas accesorias.
Los complejos de condensinas/cohesinas
se unen a regiones específicas del DNA
denominadas SARs/MARs
(scaffold/matrix-attachment regions).
metafase
Anafase
SARs o
MARs
Visualización de condensinas en cromosomas en metafase
En estas imágenes de fluorescencia los cromosomas estan teñidos con
anticuerpos contra condensinas (rojo) y el DNA esta teñido con Hoescht (azul)
Modelo de condensación de la cromatina
fibra de 11 nm
(hilera de
nucleosomas)
fibra de
cromatina
de 30 nm
en un cromosoma de metafase (~2 μm de largo)
la doble hebra del DNA (~1,5 cm de largo) se
empaqueta por un factor de ~10.000!
El MPF fosforila MAPs y promueve el incremento de la inestabilidad
dinámica de los microtúbulos de metafase
MPF (Cdc28/Clb5; Cdk1/CiclB) fosforila catastrofinas y otras MAPs que
incrementan el dinamismo de los microtúbulos.
Las catastrofinas se unen a los extremos (+) de los microtúbulos provocando la disociación de
monómeros e incrementando la frecuencia de catástrofes (transición de elongación  acortamiento).
El MPF también fosforila proteínas que conducen a
la desintegración del RE y Golgi
Se muestra la fragmentación del Golgi durante la mitosis y su
re-ensamble al final de la misma.
Magnus et al MBC2004
fosforilación de laminas  desensamble de la lámina nuclear
eventos
nucleares
fosforilación de nucleoporinas  desensamble de poros nucleares
fosforilación de proteínas de anclaje de la cromatina a la membrana
 desestabilización de la envoltura nuclear y de la cromatina
fosforilación de condensinas  empaquetamiento de la cromatina
MPF
eventos
citoplasmáticos
fosforilación de MAPs  incremento del dinamismo de los MTs
fosforilación de proteínas del RE y Golgi  inhibición del tráfico
TRANSICIÓN DE
METAFASE  ANAFASE
Esta transición es regulada por proteólisis mediada por APC
 activación de APC (fosforilación mediada por MPF)
 Unión de Cdc20 a APC y degradación de securinas
 Unión de Cdh1 a APC y degradación de ciclinas mitóticas
El comienzo de la anafase requiere de
la destrucción de las cohesinas
La proteína Scc1 actúa como un puente entre proteínas Smc unidas a las cromátides duplicadas. Scc1 es
substrato de la proteasa separasa. Separasa es mantenida inhibida en fases previas a la anafase por el
inhibidor denominado securina. La activación de APC al comienzo de la anafase promueve la degradación
de securina en proteosoma y la separasa degrada Scc1, permitiendo la separación de las cromátidas.
anafase
cromátidas
duplicadas
Lodish et al 4th Ed.
La unión de APC activo a Cdc20 y promueve la destrucción de securina
El MPF fosforila y activa el complejo APC. APC activo se une al factor Cdc20 el cual le confiere
especificidad para ubiquitinar a securina. Securina es un inhibidor de la proteasa separasa la cual
degrada específicamente a las cohesinas permitiendo la separación de las cromátides.
fosforilación
por MPF
degradación
de cohesinas
Al final de la anafase, la asociación de APC con el factor Cdh1 promueve la
degradación de las ciclinas mitóticas, y por lo tanto la inactivación del MPF
inactivo
fosforilación
La especificidad del complejo APC por las ciclinas
mitóticas es deteminada por la unión al factor Cdh1.
Cdh1
activo
Cdc20
(securinas)
La inactivación del MPF revierte
los procesos previos y promueve
la decondensación de los
cromosomas y la reformación
del núcleo
La fosfatasa Cdc14 es requerida para la inactivación del MPF
y para la ocurrencia de la citoquinesis
Durante interfase y mitosis temprana Cdc14 es retenida inactiva en
el nucleólo. Al final de la anafase Cdc15 y otras kinasas fosforilan
y activan a Cdc14 la cual defosforila el factor Cdh1/Hct1 y permite
su unión a APC. APC-Cdh1 degrada las ciclinas S y M.
nucleolo
kinasas
(Cdc15)
normal
Cdc14
Cdc14
Cdh/APC
Cdc15 es requerida para la citoquinesis.
Levaduras mutantes permancen unidas
después de la mitosis.
la fosfatasa Cdc14 es necesaria para la
formación del huso mitótico intermedio
(en verde), estructura que marca el
sitio donde ocurre la citocinesis.
mutante de cdc15
MPF
Zen-4
citocinesis
Cdc14  Zen-4  MTs del huso intermedio
(ver imagen 25)
La inactivación del MPF permite la activación de
miosina y el desarrollo de la citoquinesis
REGULADORES POSITIVOS Y
NEGATIVOS DEL CICLO CELULAR
EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
La estimulación de integrinas y receptores de factores de crecimiento
genera señales que estimulan el progreso de G1 y la entrada en S
matriz extracelular
integrinas
caveolina
factores de
crecimiento
Wnt
RTKs
Fyn/Shc
FAK/Src/
p130Cas
Freezled
Grb2
Grb2
Ras
Rac
Rho
JNK
Dishevelled
Raf/MEK
Erk
β-catenina
Tcf/Lef
p53
cki
ciclina D
early genes  S phase
La transcripción de genes de expresión temprana requiere de
la activación de vías de señalización, ej. de ras-MAPK
ej. c-fos gene
ERK  TCF  c-Fos↑
ECM  integrins
JNK  c-Jun↑
cdk inhibitors
c-Jun/c-Fos (AP1)  ciclina D  Cdk 4/6 ↑
Factores de crecimiento y la matriz extracelular
estimulan la síntesis de ciclinas y Cdks en la fase G1
La estimulación con suero de células en G0 induce un pico de transcripción de genes denominados de
“expresión temprana” (c-fos, c-jun). Estos factores de transcripción inducen la expresión de genes de
“expresión tardía” (ej. ciclinas D, E), que son necesarios para el progreso de la fase G1.
(factores de crecimiento)
La transcripción de los genes de expresión temprana ocurre por la activación de factores de transcripción
pre-existentes y por lo tanto no requiere de síntesis de proteínas. En contraste, la síntesis de las proteínas
es requerida para la transcripción de los genes de respuesta tardía y para la degradación del mRNA.
La síntesis de ciclinas D es esencial para el pasaje de G1 a S
En presencia de factores de crecimiento las células se tornan independientes de dicha estimulación al final de G1 y entran
de manera irreversible a la fase S. Este punto crítico, conocido como punto de restricción, "start“, o de no retorno,
depende de la síntesis de ciclinas D.
(A) Las células superan el punto de no retorno después de 14 -16 h de incubación con factores de crecimiento y entran
en la fase S 6-8 h mas tarde (1). La microinyección de anti-ciclina D (2) inhibe la incorporación de bromodeoxiuridina
(BrdU) (3). El porcentaje de células marcadas con BrdU (en fase S) se determina 16 h mas tarde (4, B).
A
B
(no sintetizan DNA)
La actividad de los complejos Cdk4/6-D y Cdk2-E fosforilan e
inactivan a la proteína supresora de tumores retinoblastoma Rb
La proteína Rb bloquea el ciclo celular en G1. Rb interacciona y bloquea la expresión y función de los factores de
transcripción E2Fs por un mecanismo que recluta la histona deacetilasas, HDAC y provoca el silenciamiento de E2F y otros
genes del ciclo celular. El punto de no retorno implica la generación de un bucle de retroalimentación positiva que implica la
hiperfosforilación de Rb por Cdk4/6-D y Cdk2-E al final de G1. Esto conduce a la disociación de HDAC y activación de los
factores E2Fs los cuales estimulan su propia transcripción y la de Cdk2, y de las ciclinas de fase S A y E.
hipo
fosforilación
HDAC
hiper
fosforilación
retroalimentación
positiva
gen inactivo
activo
HDAC
Mid G1
Late G1
Punto de
restricción
superado
(independiente
de ciclinas D)
En vertebrados, inhibidores de Cdks (CIP/KIP) bloquean Cdk2-E/A
Cdk2-E
integrinas
p53
TGF-β
•cumplen una función similar a Sic1
en S. Saccharomyces
SCF-ubiquitina
- p21CIP
- CIP/KIP - p27KIP1
- p57KIP2
*
Cdk2-E/A
caderinas
otro grupo de inhibidores de Cdks:
- INK4 (p16)
Cdk4/6-ciclinas D
Resumen de eventos
temprana
G1
S
tardía
APC
inactivo
Cdh1
G2
anafase
telofase
activación
fosforilado e inactivo
APC
activo
fosforilación
Wee
fosforilación
↑transcripción
SPF
Cdc28-Cln3
↑transcripción
M
CAK
Cdc28-Cln1
Cdc28-Cln2
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
activas
proteólisis
Cdc20
Cdh1
Cdc25
fosforilación
proteólisis
Cdc34-SCF
Sic1
inactivación Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
inhibidor de
inactivas
la fase S
Sic1
ensamblaje de complejos
de pre-replicación
Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
activas
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
activas
inhibidor de
la anafase
Cdc7-DbF4
kinasa
síntesis
del DNA
complejos activos
inhibición del ensamblaje de nuevos
complejos de pre-replicación
Cdc28-Clb1
Cdc28-Clb2
Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4
Cdc28-Clb5
Cdc28-Clb6
Nomenclatura comparada de levaduras y vertebrados
S. cerevisiae
vertebrados
ciclina
Cdk
ciclina
Cdk
mid G1
Cln 3
Cdc28
D (1-4)
Cdk4/6
↑E2F, SBF y MBF
G1/S
Cln 1, 2
Cdc28
E
Cdk2
↓APC, ↓Sic1, ↓Cdh1
S
B 3-6
Cdc28
A
M
B 1-4
Cdc28
A/B
Cdk2
Cdk1
función
↑replicación del DNA
↑huso mitótico, ↑división nuclear
MPF ~ Cdc28-Clb ~ Cdc2-Cdc13 ~ Cdk1- cicl B
Xenopus
S. cerevisiae
S. pombe
vertebrados
Síntesis de proteínas
reguladoras del ciclo celular
Protein kinases and protein
phosphatases that modify Cdks
Cdk-activating phosphorylates an activating site in Cdks
kinase (CAK)
Wee1 kinase
phosphorylates inhibitory sites in Cdks; primarily involved in
controlling entry into mitosis
Cdc25
removes inhibitory phosphates from Cdks; three family members
phosphatase
(Cdc25A, B, C) in mammals; Cdc25C is the activator of Cdk1 at the
onset of mitosis
Cdk inhibitory proteins (CKIs)
Sic1 (budding suppresses Cdk activity in G1 ; phosphorylation by Cdk1 triggers its
destruction
yeast)
p27 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities in G1; helps cells to withdraw
from cell cycle when they terminally differentiate; phosphorylation by
Cdk2 triggers its ubiquitylation by SCF
p21 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities following DNA damage in
G1; transcriptionally activated by p53
p16 (mammals) suppresses G1 -Cdk activity in G1; frequently inactivated in cancer
Ubiquitin ligases and their activators
SCF
catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved in G1 control,
including CKIs (Sic1 in budding yeast, p27 in mammals);
phosphorylation of target protein usually required for this activity
APC
catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved primarily in exit
from mitosis, including Securin and M-cyclins; regulated by association
with activating subunits
Cdc20
APC-activating subunit in all cells; triggers initial activation of APC at
metaphase-to- anaphase transition; stimulated by M-Cdk activity
Hct1/Cdh1
maintains APC activity after anaphase and throughout G1 ; inhibited by
Cdk activity
Gene regulatory proteins
E2F promotes transcription of genes required for G1/S progression, including genes
encoding G1/S cyclins, S-cyclins, and proteins required for DNA synthesis;
stimulated when G1 -Cdk phosphorylates Rb in response to extracellular mitogens
p53 promotes transcription of genes that induce cell cycle arrest (especially p21) or
apoptosis in response to DNA damage or other cell stress; regulated by association
with Mdm2, which promotes p53 degradation
APOPTOSIS
La apoptosis se reconoce por cambios morfológicos y moleculares
característicos
célula normal
co
ntr
ol
ap
op
tos
is
Las células que entran en apoptosis se contraen y
fragmentan en vesículas o cuerpos apoptóticos. Los
núcleos se condensan y el DNA se fragmenta
generando un patrón en escalera o ladder. Cambios
en la distribución de fosfolípidos (ej. fosfatidil serina)
pueden detectarse con anexina fluorescente.
célula en apoptosis
apoptosis
célula deprivada de factores
de crecimiento.
célula en presencia de
insulina.
La apoptosis involucra la activación en cascada de
proteasas intracelulares denominadas caspasas
Las caspasas son sintetizadas como precursores inactivos (procaspasas) que deben ser clivadas para su activación.
Estímulos que disparan apoptosis usualmente producen la agregación y autoprocesamiento de caspasas inciadoras.
Las caspasas iniciadoras activas posteriormente clivan y activan una o varias caspasas efectoras.
activación de procaspasa iniciadora
Substratos de caspasas son las laminas de la malla nuclear, proteínas del citoesqueleto, etc.
La deficiencia de señalización inducida por factores de crecimiento
provoca la apoptosis en varios tipos celulares
En ratones knockout para el gen del NGF o su receptor TrkA, se observa la ausencia
de las neuronas sensoriales que transmiten sensaciones de dolor.
Señal de
supervivencia
Los factores de crecimiento y la matriz extracelular inhiben la apoptosis
mediada por citocromo C de mitocondrias
La salida de citocromo C de mitocondrias ensambla un complejo molecular que activa caspasas.
receptor
integrinas
Factor trófico
ECM
membrana
PI-3K
14-3-3
Akt
P
Bad
Bcl-2
Bax
PI-3K
Bcl-2
mitocondria
P
Bax
Cito c APAF-1
Cito c
Akt
P Bad
14-3-3
caspasas
caspasas
La activación de procaspasas también puede ocurrir por estimulación
de receptores de superficie proapoptóticos
Receptores proapoptóticos (TNFR1, FAS-CD95, TRAIL, etc) pertenecen a la familia del
factor necrótico de tumores o ¨tumor necrosis factor (TNF).
La apoptosis controlada por factores extracelulares permite
remodelar tejidos y órganos durante el desarrollo
Pato. apoptosis inhibida
en el tejido interdigital.
el miembro derecho fue infectado con un
virus que expresa un receptor dominante
negativo de BMP, que inhibe la señalización
de BMP y la apoptosis entre los dígitos
apoptotic
zone
Pollo. apoptosis inducida
en el tejido interdigital
anterior
apoptotic
zone
expresión del mRNA
para BMP4 (en azul)
interdigital
apoptotic
zone
posterior
apoptotic
zone
apoptotic
zone
embriones de pollo
Las proteínas BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) inducen apoptosis en el tejido interdigital de los
miembros de vertebrados. En patos, la apoptosis del tejido interdigital de los miembros es inhibida por
noggin, una proteína secretada por células del mesénquima y que inhibe a BMP.
Gilbert, Dev. Biol. 6ta Ed.
CONTROL O "CHECKPOINTS"
EN EL CICLO CELULAR
sensor  mediador  efector
Mecanismos de control o "checkpoints" aseguran la correcta duplicación
del DNA, su integridad y distribución a las células hijas
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR: ATM-Rad3-Related
AT
Chk1/2: Chekpoint 1/2
(fosfatasa)
ATM y ATR son kinasas relacionadas a
PI3K; ATM sensa rupturas de la doble
hélice, ATR sensa alteraciones que
generan cadenas simples (ej. horquillas
de replicación detenidas). Chk1 y 2 son
kinasas de Ser/Trh substratos de
ATM/ATR.
La proteína p53 es un efector clave de la respuesta al
daño del DNA (“damage checkpoint”)
ubiquitinación
degradación de
p53 en proteosoma
En condiciones normales, p53 es ubiquitinado
por la ubiquitina ligasa Mdm2 y degradado en el
proteosoma. El daño del DNA activa kinasas
que fosforilan a p53 y provocan su disociación
de Mdm2. De esta manera, p53 se acumula y
ejerce su rol activando la transcripción de CKIs.
El daño del DNA y otras alteraciones activan mecanismos que arrestan
el ciclo celular o promueven la apoptosis
radiación
ionizante
daño
del DNA
sensors:
ATM y ATR
kinasas
activación P
de kinasas
Chk1 y Chk2
p53
P
estabilización
de p53
inhibición de la actividad;
degradación en
proteosoma
P
Cdc25
Cdk1
Cdk2
p21CIP
Cdk4/6
Rb E2F
↑ proteínas proapoptóticas:
Bax, receptores de Fas, etc
G2/M
G1/S
El DNA no replicado activa un mecanismo de control
(“DNA replication checkpoint“) que inactiva Cdc25
ATR actúa como sensor del DNA no replicado, y se activa al asociarse al DNA simple cadena de horquillas de replicación
arrestadas. ATR fosforila y activa la kinasa Chk1, la cual a su vez fosforila e inactiva la fosfatasa de Cdks Cdc25. La cafeína
inhibe ATR y éste mecanismo de control. La incubación de células con hidroxiurea, un inhibidor de la síntesis de
deoxinucleótidos, activa el mecanismo de control y provoca la detención del ciclo en la fase S. Células incubadas con
hidroxiurea + cafeína no se detienen en la fase S y experimentan errores fatales en la distribución de los cromosomas.
cafeína
ATR Chk1
Cdc25  CDK1-ciclA/B
Un complejo de proteínas controla el correcto
anclaje de los microtúbulos del cinetocoro
“checkpoint de metafase”
sensors
Bub, Mad
polo
mediador
Cdc20
efector APC
securina
En los cinetocoros libres se localizan y activan
proteínas de control como Mad y Bub, que retienen
y bloquean al cofactor Cdc20. De este modo, Cdc20
no esta disponible para activar APC. La ocupación
del último cinetocoro libera Cdc20 que se une y
activa APC. APC-Cdc20 ubiquitina el inhibidor de la
anafase securina y se dispara la anafase. La kinasa
Aurora-B se localiza en los cinetocoros y contribuye
a la corrección de defectos de anclaje de los
microtúbulos de los cinetocoros.
MAD: Mitotic Arrest Defficient
BUB: Budding Uninhibited by Benzimidazole
Mussachio & Salmon NRNCB 2007
La disponibilidad de Cdc20 permite la activación de APC
y la degradación de las cohesinas
cinetocoro
libre
Mad2
todos los
cinetocoros
unidos a Mts
libre
degradacion
de cohesinas
cinetocoros bi-orientados