PROTEASAS
Dr. Sinisterra
Biotransformations Group
Faculty of Pharmacy
Universidad Complutense
www.biotransformaciones.com
HYDROLYSIS OF THE AMIDE BOND
The enzymatic hydrolysis of the carboxamide bond is naturally
linked to the chemistry of amino acids and peptides.
The world production of enantiomerically pure amino acids
accounted for more than 0.8 million tons of materials and a
market of 4.1 billion US $ per annum in 2008.
The three amino acids dominating this area with respect to
output and value (L-glutamic acid, L-Lysine and D,L-methionine)
are produced by fermentation or by synthesis.
However, a considerable number of other optically pure D- and
L-amino acids are prepared using one of the available enzymatic
methods discussed.
HYDROLYSIS OF THE AMIDE BOND
COOR1
NHR2
RESOLUTIOM BY
HYDROLYSIS
(HYDROLASE)
COOH
H2N
R
R
DL
L
ESTERASE METHOD
AMIDASE METHOD
ACYLASE METHOD
HYDANTOINASE METHOD
LACTAMASE METHOD
1
ESTERASE METHOD
the resolution is performed by hydrolysis of the ester bond
COOR1
NHR2
ESTERASE or
PROTEASE
COOH
R
R
DL
COOMe
NHAc
-chymotrypsin
DL
Structure of α-chymotrypsin
NHR2
R
L
COOH
D
COOH
+
AcHN
R
R
COOH
+
R2HN
L
NHAc
R
D
Catalytic machinery: Ser-195; His-57;
Hidrólisis catalizada por proteasas
Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 1
2
Mecanismo de acción de
las proteasas dependientes
de serina PASO 2
Mecanismo de acción de las proteaasas
dependientes de serina
PASO 3
Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina
PASO 4
3
Mecanismo de acción
de las hidrolasas
dependientes de serina
PASO 5
Mecanismo de acción
de las proteasas
dependientes de serina
PASO 6
Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina
PASO 7
4
Other examples of the ESTERASE METHOD
COOR2
ALCALASE
(Bacillus licheniformis)
H2N
R1
t-BuOH/H2O (19:1)
DL
COOH
+ R2-OH
H2N
R1
L
in situ racemization
pyridoxal 5-phosphate
H
COOR2
HC
N
H2
C N
H
COOR2
O
H
R1
R1
O
C
HO
PO32-
N
H+
Pyridoxal-5-phosphate
AMIDASE METHOD
The resolution is performed by hydrolysis of the C- terminal amide bond
AMIDASE
CONH2
COOH
CONH2
NH2
NH2
+
H2N
R
R
DL
R
L
D
ACYLASE METHOD
The resolution is performed by hydrolysis of the endo-amide group
COOH
NHAcyl
COOH
ACYLASE
R
R
DL
COOH
+
H2N
NHAcyl
R
L
D
HYDANTOINASE METHOD
O
D-HYDANTOINASE
O
R
COOH
H
N
NH2
R
L-HYDANTOINASE
N
H
DL
COOH
HN
H2N
R
O
O
D-N-carbamoyl
D
N carbamoyl
amino acid
CARBAMOYLASE
COOH
NH2
R
D
H
N
L-N-carbamoyl
L
N carbamoyl
amino acid
CARBAMOYLASE
COOH
NH2
R
L
5
LACTAMASE METHOD
O
O
NH
NH
E
E
O
(S)
O
(R)
O
NH
(R)
+
(S)
+
NH2
(R)
O
NH
OH
(S)
OH
(S)
NH2
(R)
Blue: converted enantiomer; Red: non-converted enantiomer
The enzyme is selected according to the
DESIRED ENANTIOMER
Peptide synthesis
Dr. Sinisterra
Biotransformations Group
Faculty of Pharmacy
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PEPTIDE SYNTHESIS
6
AMIDE SYNTHESIS.Can be performed using proteasas or lipases
R3
O
NH2
R1
+
HN
O
OH
R2
OH
HIDROLASE
ORGANIC SOLVENT
R1
O
R2
R3
R2
O
R3
NH
NH2
+
R1
O
LIPASE
R1
NH 2 Acyl Donor NH
or
R
R
HN
NH
R3
O
NH
R1
R
R1 -COO-R 2
SÍNTESIS DE PEPTIDOS
1.- Síntesis secuencial.- se usa para sintetizar fragmentos
2.- Síntesis convergente.- es la mas utilizada en procesos industriales
Ventajas de la síntesis enzimática de péptidos
1.- ocurre en condiciones sostenibles.- P y T ambiente. Ausencia de disolventes contaminantes
2.- no hay epimerización de centros estereogénicos
3.- no hay que usar pasos de protección-desprotección
4.- se obtiene un péptido homogéneo
5.- permite hacer síntesis convergente con fragmentos péptidos
Desventajas
j de la síntesis enzimática de péptidos
p p
1.- las concentraciones a las que se trabajan son pequeñas
2.- la selectividad de las enzimas hacia cierto tipo de sustratos limita su uso.
peptido
P2
S2
P1
S1
union
active
site
P1’ P2’
S1’ S2’
proteasa
PEPTIDE SYNTHESIS
Enzyme-catalyzed peptide synthesis may be conduced via three basic ways:
REVERSAL HYDROLYSIS,
TRANSPEPTIDATION (which is used to a lesser extent)
AMINOLYSIS OF ESTERS.
7
PEPTIDE SYNTHESIS
THERMODYNAMIC APPROACH: under physiological conditions the
equilibrium position in proteases catalyzed reactions is far over on the
side of proteolysis. In order to create a driving force in the reverse
direction towards peptides synthesis the following constraints may be
applied:
One of the reactants is used in excess
Removal of product via formation of an insoluble derivative by
specific complex formation or by extraction of the product into an
organic phase by using a water-immiscible organic cosolvent.
Lowering the water-activity (concentration) of the system by
addition of water-miscible organic cosolvent.
PEPTIDE SYNTHESIS
KINETIC APPROACH: the aminolysis of esters, involves a kinetically controlled
irreversible type of reaction, in which two nucleophiles (water and an amine) are
competing for the acyl-enzyme intermediate.
As mentioned above this reaction can be regarded as irreversible.
PEPTIDE SYNTHESIS
8
CHEMO-ENZYMATIC SYNTHESIS OF AN ENKEPHALIN DERIVATIVE
CHEMO-ENZYMATIC SYNTHESIS OF AN ENKEPHALIN DERIVATIVE
ALCÁNTARA et al.: Peptide synthesis in organic-aqueous media catalysed by α-chymotrypsin immobilized on different supports.
Fundamental of biocatalysis in non conventional media, Elsevier Pub., 1992, pp.443-50.
ENZYMATIC SYNTHESIS OF ASPARTAME
Z
Asp + 2 Phe
OMe
Phe
Thermolysin
OMe
+
Z
Asp
Phe
OMe
Purificatión
Asp
Phe
OMe
Desprotection
Z
Asp
Phe
OMe
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OBTENCIÓN DE INSULINA CATALIZADA POR
PROTEASAS
Insulina.-Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas de
perro.
Secuencia identificada por Sanger en 1955.
Regula los niveles de azúcar en sangre, usada para el tratamiento de
la diabetes mellitus (aprox. 5% población occidental).
Es una proteína, no puede suministrarse oralmente (proteolisis)
Hoy día existen 4 rutas de obtención de insulina:
1. Extracción de páncreas humano
2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales
3. Conversión de insulina porcina en humana
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
Conversión de insulina porcina en humana
Cadena A
Cadena B
Proteasa I de Achromobacter lyticus
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.1. Producción de pro-insulina, transformada en insulina por transpeptidación (Novo
Nordisk)
Pro-insulina
Obtenida a través de fermentación
de células de S. cerevisiae
Genéticamente modificadas
Ester de la insulina humana
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4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.2. Producción de mono/di-arg-insulina usando células de E. coli modificadas
genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (ELI LILY)
Pro-Arg -insulina
Conversión: sobre 70 %.
Reactor tipo batch
Mono/di-Arg -insulina
Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana
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4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.3. Producción de pre-pro-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente y
posteriores pasos de síntesis y purificación (Hoechst, Marion Roussel)
Pre-pro-Arginsulina
Mono/di-Arg -insulina
Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana
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PROTEASAS EN SÍNTESIS DE FÁRMACOS
Poteasa usada como esterasa para resolver un racémico
13
0
