cuantificación de aminoácidos totales en harinas residuales

CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS TOTALES EN HARINAS
RESIDUALES DE LA EXTRACCIÓN DE ACEITE DE COPERNICIA
ALBA MORONG.
Gorostegui, Horacio A.a,b,*, Mufari, Jesica R.b, Orrabalis, Camilo J.a,b, Guzmán, Carlos A.b y
Calandri, Edgardo L.b
a
Universidad Nacional de Formosa. Av. Gob. Gutnisky 3200. Formosa 3600, Argentina
b
ICTA-Fac. Cs. Ex. Fís. y Nat.-UNC, Córdoba, 5016 - Argentina
*Autor a quien dirigir la correspondencia: [email protected]
Resumen
La palma blanca o caranday (Copernicia alba Morong) es una especie abundante en la zona este de la provincia
de Formosa. La semilla posee cerca de un 20% p/p de aceite que, al separarse mecánicamente, deja una cantidad
considerable de residuos de prensado y de pericarpio (cáscara), los cuales poseen 7% p/p y 8% p/p de proteínas,
respectivamente. Estos residuos se molieron y a las harinas obtenidas se las sometieron a hidrólisis ácida (HCl 6
M) y alcalina (Ba(OH)2 saturada), de manera sucesiva y en reflujo. Los residuos obtenidos se trataron con
etoximetilenmalonato de dietilo en buffer borato (pH=9) por 50 minutos y con calor, a fin de obtener los
aminoácidos derivatizados. Finalmente, 20 µL de cada muestra se inyectó en un equipo HPLC (Perkin Elmer
200) con columna de fase reversa (Sorbax C18) y detector UV-visible (280 nm). Tanto el pericarpio como el
residuo de prensado presentaron todos los aminoácidos, destacándose histidina (5,94% p/p y 7,26% p/p,
respectivamente) y valina (4,28% p/p y 5,25% p/p, respectivamente), con valores que superaron a los
recomendados por la OMS para estos aminoácidos esenciales. El puntaje químico indicó que, tanto para el
pericarpio como para el residuo de prensado, metionina y cisteína resultaron ser los aminoácidos limitantes.
Estos resultados posibilitarían el empleo de cáscaras y residuos de extracción como materia prima para elaborar
aislados proteicos o bien, en preparaciones alimenticias.
Palabras clave: Copernicia alba; aminoácidos; pericarpio; residuo de prensado.
Introducción
La palma caranday, Copernicia alba Morong, es una especie que pertenece a la familia de las
palmáceas. En la provincia de Formosa habita fundamentalmente en las zonas húmedas y también en
áreas de depresiones o bañados de las zonas semiáridas. Se lo conoce en la región de acuerdo a su
grado de madurez como palma blanca, colorada o negra, según el color que presenta su leño. (Sánchez
et al, 2008).
Su fruto es una drupa, negra y ovoide, cuando madura puede alcanzar de 1,5 a 2 cm de longitud,
usualmente de una sola semilla, muchas veces fibrosa. Las semillas también son ovoides y germinan
fácilmente (Dimitri, 1977).
Tradicionalmente su estípite ha sido utilizado en construcciones rurales, aunque en la actualidad
se han comenzado a producir con él muebles y pisos, aprovechando su calidad, coloreado y veteado
particular (Monzón et al, 2008), mientras que sus hojas se destinan a la fabricación de productos
artesanales. Actualmente no existe uso alguno para sus frutos, aunque hay vagas referencias de un
empleo comestible de estos (Ministerio del Ambiente y Desarrollo Sustentable). El contenido de
aceite de su semilla se encuentra entre el 15 al 20% y en nuestro grupo hemos logrado extraerlo
mediante prensado en frío (Gorostegui et al, 2012), generándose residuos en dicho proceso, con
potenciales usos industriales.
Por lo antes expuesto, en el presente trabajo nos propusimos determinar el perfil aminoacídico
de dichos residuos de extracción, del aceite de semillas de Copernicia alba Morong a los fines de
establecer el valor de las proteínas que estos poseen y que permitirían sugerir posibles usos para las
tortas residuales.
Materiales y Métodos
Acondicionamiento del material vegetal
Se secaron los frutos en un horno de circulación forzada, dispuestos sobre bandejas metálicas,
en cantidad de 3 kg por bandeja y a temperaturas entre 80 y 100°C, durante alrededor de 4 horas. Cada
30 minutos se realizó un pesaje por bandeja hasta alcanzar peso constante. Para la separación de las
semillas se empleó un molino de discos marca Braun, modelo U.A. 53, Motor 2 HP, Fuerza Centrífuga
Relativa 302 G. Esta acción permitió liberar a las semillas del pericarpio, el cual se separó mediante
un tamiz de malla 5.
De las semillas se extrajo el aceite, en condiciones de temperatura y humedad controladas,
mediante una prensa de tornillo (IBG Monforts Oekotec CA59G), a escala piloto. La obtención de las
harinas, tanto del residuo pericarpiano como del residuo de prensado, se realizó utilizando un molino
de martillo marca Fritsch, motor 1,5 HP, Fuerza Centrífuga relativa 636 G, y un tamiz de 0,25 mm.
Determinación del perfil aminoacídico: se empleó el procedimiento descripto por Mufari, 2011.
 Hidrolisis de harinas
Hidrólisis ácida: se peso 1 g de harina desengrasada en un balón y se adicionaron 50 mL de
acido clorhídrico 6 M, se calentó a reflujo por 24 hs, en un manto de calentamiento. Método oficial de
análisis de AOAC Internacional, 994.12.
Hidrolisis alcalina: se peso 1 g de harina desengrasada en un balón y se adicionaron 50 mL de
una solución saturada de hidróxido de bario, se coloco a reflujo por 8 hs, en un manto de
calentamiento (Comai et al, 2007).
Una vez concluidas ambas hidrólisis, se dejo enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente,
luego se las trasvasó a tubos cónicos de centrifuga, y se centrifugaron por 15 minutos a 3000 rpm
(1006 G). El sobrenadante se conservo en cámara fría a 5 ± 1° C, hasta el momento de realizar el
análisis por HPLC.
 Perfil de aminoácidos
Se determinaron y cuantificaron los aminoácidos presentes en la muestras mediante
cromatografía liquida de alta resolución. Para tal fin se utilizo un equipo HPLC Perkin Elmer 200,
equipado con un detector UV-visible y una columna Zorbax Eclipse Plus C18 (Agilent Technologies).
Derivatización: un volumen conocido de los hidrolizados proteicos se coloco en un tubo
eppendorf y se llevó a sequedad en una estufa con circulación de aire forzada (Dalvo) a 40-50 °C,
aproximadamente por 12 horas. Se resuspendió la muestra con 1 mL de buffer borato 1 M (pH=9) que
contiene 0,02% de azida de sodio. Se adicionaron 0,8 μL de etoximetilenmalonato de dietilo, se
colocaron los tubos eppendorf cerrados en un baño a 50 °C por 50 minutos, agitando cada 5 minutos
los tubos con un vortex. Los derivados obtenidos N-[2,2- bis (etoxicarbonil) vinil] de los aminoácidos,
fueron conservados a temperatura ambiente hasta su inyección (Alaiz et al,1992).
 Cromatografía
Fueron inyectados 20 μL de cada muestra, la resolución de los derivados de aminoácidos se
logro usando un sistema de gradiente binario, empleando como fase móvil: (A) buffer acetato de sodio
25 mM (pH=6) y (B) acetonitrilo, con un flujo de 0,9 mL/min a temperatura ambiente. Los derivados
fueron detectados a 280 nm. Se empleo el siguiente programa de elución: 0,5 min equilibrio con A:B
(91:9), 1,5 min gradiente lineal a A:B (86:14), 7,5 min elución con A:B (86:14) (solo en este tiempo se
utilizo un flujo de 0,7 mL/min), 8,5 min gradiente lineal a A:B (69:31), 2,5 min elución con A:B
(69:31). Para la siguiente inyección la columna se reacondiciono por 4,5 min con un gradiente lineal a
A:B (91:9) (Alaiz et al, 1992).
Resultados y discusión
En la tabla N°1 se muestran los resultados obtenidos. Se pudo establecer la existencia de 17 diecisiete
aminoácidos, tanto en el pericarpio como en el residuo de prensado de la Palma Caranday,
destacándose histidina, valina, glicina y fenilalanina (resaltados en la tabla).
Tabla N° 1: Aminoácidos en harinas de pericarpio y residuo de prensado (gAA/ 100 g π)
Aminoácidos
Ác. Aspártico + Asparragina
Ác. Glutámico + Glutamina
Serina
Histidina
Glicina
Treonina
Arginina
Alanina
Prolina
Tirosina
Valina
Metionina
Cisteína
Isoleucina
Leucina
Fenilalanina
Lisina
Pericarpio
6,58 ± 0,55
5,22 ± 0,93
2,94 ± 2,33
5,94 ± 0,77
4,02 ± 0,80
2,39 ± 0,47
3,07 ± 0,73
3,12 ± 0,56
0,54 ± 0,58
1,31 ± 0,30
4,28 ± 0,03
0,48 ± 0,14
0,95 ± 0,17
0,18 ± 0,04
2,16 ± 0,46
3,74 ± 0,78
2,30 ± 0,51
Res. de Prensado
7,99 ± 0,44
13,97 ± 2,12
6,41 ± 1,84
7,26 ± 0,61
4,01 ± 0,35
2,42 ± 0,26
9,28 ± 0,85
3,87 ± 0,36
2,76 ± 0,59
1,51 ± 0,14
5,25 ± 0,29
0,70 ± 0,17
1,18 ± 0,20
0,42 ± 0,04
2,48 ± 0,22
5,12 ± 0,45
3,35 ± 0,30
Valores expresados como (Media ± SD) n=6, en base seca.
La hidrólisis ácida provoca la descomposición de asparragina y glutamina en los ácidos
aspártico y glutámico, respectivamente, mientras que en medio alcalino esa hidrólisis no tiene lugar,
permitiendo la determinación de ambos aminoácidos y sus respectivas amidas, por diferencia. En la
tabla 2 se presenta el contenido de los ácidos aspártico y glutámico, asparragina y glutamina.
Tabla N° 2: Contenido de ácidos aspártico y glutámico, asparragina y glutamina en
harinas de pericarpio y residuo de prensado (gAA/ 100 g)
Hidrólisis ácida
Hidrólisis alcalina
Ác.
Ác.
Aspártico + Glutámico +
Asparragina Glutamina
Pericarpio
6,58 ± 0,55
5,22 ± 0,93
Ác.
Aspártico
Diferencia entre hidrólisis
Ác.
Asparragina
Glutámico
2,52 ± 0,15 2,63 ± 0,06
4,06 ± 0,7
Glutamina
2,59 ± 0,99
Residuo de
7,99 ± 0,44 13,97 ± 2,12 1,85 ± 0,03 3,82 ± 0,19 6,14 ± 0,47
Prensado
Valores expresados como (Media ± SD) n=4, en base seca.
10,15 ± 2,31
En la tabla N° 3 se comparan los requerimientos de aminoácidos esenciales de las muestras con la
proteína patrón indicado por la FAO/OMS, para niños de entre 2 y 5 años, grupo etario más exigente,
se observa que tanto Histidina como Valina superan al patrón, además podemos decir que Isoleucina y
Treonina presentan valores próximos al recomendado por estas organizaciones. Asimismo, los
aminoácidos limitantes corresponden a los denominados azufrados (Metionina y Cisteína), aunque
debemos decir que estos superan el 55% del valor recomendado.
Tabla N° 3: Comparación entre los requerimientos de aminoácidos esenciales y los
presentes en las muestras.
mg de AA en π mg de AA en
patrón*
pericarpio
Histidina
Treonina
Triptofano
Valina
Metionina + Cisteína
Isoleucina
Leucina
Fenilalanina + Tirosina
Lisina
mg de AA
en residuo
19
65
71
34
25
25
11
n/d
n/d
35
46
50
25
14
16
28
22
25
66
43
49
63
41
47
58
36
40
*Patrón FAO/OMS para niños de 2-5 años
Puntaje químico
en pericarpio
342,11
73,53
131,43
56,00
78,57
65,15
65,08
62,07
en residuo
373,68
73,53
142,86
64,00
89,29
74,24
74,60
68,97
Conclusión
Teniendo en cuenta que actualmente las semillas de la palma Caranday, no son aprovechados y que
existe la posibilidad de extraer aceites de las mismas, es importante poder utilizar los residuos que se
generan, y de acuerdo a estos resultados podríamos afirmar que los mismos posibilitarían el empleo de
cáscaras y residuos de extracción como materia prima para elaborar aislados proteicos o bien, en
preparaciones alimenticias.
Referencias
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derivatization with dietil ethoxymethylenemalonate. J. of Chromatogr., 591, 181-186.
AOAC International. (1999) Official Methods of Analysis of the Association of Official Analysis Chemist. 16th Edition, 5th
Revision, Gaithersburg, USA.
Comai, S., Bertazzo, A., Bailoni, L., Zancato, M., Costa, C. V. L., Allegri, G. (2007) The content of proteic and nonproteic
(free and protein-bound) tryptophan in quinoa and cereal flours, Food Chem.,100, 1350-1355.
Dimitri, M. J. (1977). Enciclopedia argentina de agricultura y jardinería. Tomo I. Volumen I. Editorial ACME S.A.C.I. 3ra
Edición. Bs As Argentina. 185 – 194.
Gorostegui, H. A.; Orrabalis, C. J.; Guzmán, C. A. y Calandri, E. L. (2012) .Parámetros fisicoquímicos de frutos, pericarpios
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Monzón, L.; Camera, R.; Gómez, M. (2008). Dinoderus minutus, taladrillo en Copernicia alba (palma blanca) apeada en la
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Mufari , Jesica Romina. 2011. Determinación y cuantificación de proteínas solubles y de aminoácidos totales en harinas de
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