Transcripción y Traducción en Procariontes vs. Eucariontes Etapas de la traducción Iniciación Elongación Terminación Primer Paso requerido para la Traducción: Tener tRNAs aminoacilados correctamente 1. Formación de aminoacil-adenilato 2. Síntesis de aminoacil-tRNA 1 ATP! Activación del aminoácido antes de su unión al tRNA. Esta activación se realiza por la aminoacil tRNA sintetasa y ATP para dar lugar a un Aminoacil Adenilato (aminoacil AMP) Especificidad de las aminoacil-tRNA sintetasas Fidelidad del código genético! Visualización del tRNA unido a una aminoacil tRNA sintetasa Existe un mecanismo de corrección tanto para el tRNA como para el aminoácido Aminoácidos similares pasan por un doble filtro en las aa-tRNA sintetasas Isoleucil – tRNA sintetasa Leu es demasiado grande para el sitio activo de síntesis Ile cabe en el sitio de síntesis pero no en el de edición Val cabe en el sitio de síntesis y en el de edición por lo que es eliminado Hay dos clases de aa-tRNA sintetasas dependiendo del grupo que inicialmente se aminoacila I II Se considera que ancestralmente las aa-tRNA sintetasas funcionaban en forma de dímero, de ahí la orientación de sus sitios activos hacia 2’OH y 3’OH de la ribosa Existen dos tRNAs para Metionina, uno iniciador y otro elongador El fMet-tRNA iniciador tiene características especiales En la mitad de los casos, la metionina es removida de la proteína Reconoce los codones AUG ó GUG Algunas características del código genético -61 codones para aminoácidos, 3 codones de paro -Hay aproximadamente 40 tRNAs diferentes para los 61 codones (hipótesis del bamboleo) -Hay 20 aminoácidos y 20 aminoacil-tRNA sintetasas -El código genético es degenerado -Enlace tangible entre biosíntesis de aminoácidos y metabolismo primario Si la secuencia del mRNA se lee por tripletes existen tres posibles marcos de lectura. ¿Cómo saber cuál de los tres es el correcto? ¡ Se define por el codón de inicio AUG ! Estructura del RNA mensajero: Procariontes vs. Eucariontes Alberts et al., 3rd ed., p.237 En bacterias la selección del codón de inicio AUG se realiza por interacción entre el mRNA y rRNA 16S (subunidad 30S del ribosoma) Shine-Dalgarno 5´AGGAGGU3´ Interacción de Shine-Dalgarno con el rRNA 16S En eucariontes el mRNA para traducirse es reconocido por el CAP (7mGpppG) Funciones: Protección (5’exo) Procesamiento Exportación Traducción Entorno del codón de inicio AUG En eucariontes: el primer AUG que permita pausar el ribosoma debe tener un entorno adecuado 5’CAP 40S .....C C A G C consenso C A U G G El ribosoma: máquina molecular Ribosoma: 2 subunidades desiguales unidas débilmente, formadas por polímeros de alto peso molecular, de estructura compacta Traducción: lectura consecutiva de tripletes en el mRNA que permiten síntesis concomitante de una cadena polipeptídica El ribosoma realiza 3 funciones: a) Función genética (decodificar la secuencia de nucleótidos en aminoácidos b) Función enzimática (catalizar la formación del enlace peptídico) c) Función de translocación (maquina que se mueve a lo largo del mRNA, por la que van pasando los tRNAs y se elonga la cadena peptídica) Función genética --------------- subunidad pequeña Función enzimática ------------ subunidad grande Función de translocación --- ambas subunidades Para el inicio de la traducción: Las subunidades ribosomales deben estar separadas La subunidad pequeña debe reconocer al mRNA El tRNA aminoacilado (fmet-tRNAmet o met-tRNA) debe colocarse en la posición P de la subunidad ribosomal pequeña Debe ocurrir el reconocimiento codón-anticodón de inicio Ocurre hidrólisis de al menos una molécula de GTP Factores de iniciación de la traducción IFs (bacteria) o eIFs (eucariontes) INICIO DE LA TRADUCCIÓN PROCARIONTE IF1 IF2 IF3 50S 30S [Mg2+] AUG 3 3 1 GDP 2 fMet + Shine-Dalgarno 3 1 fMet GTP 2 3 1 AUG complejo de inicio de la traducción fMet GTP + 2 fMet GTP 2 3 1 FACTORES DE INICIO DE LA TRADUCCIÓN (PROCARIONTES) Factor Función IF1 Previene la unión de tRNAs en el sitio A de la subunidad 30S IF2 GTPasa que interacciona con 3 componentes claves durante iniciación: la subunidad 30S, IF1, y fMet-tRNAif-Met) IF3 Se une a 30S y evita re-asociación con 50S. Participa en el reconocimiento codon-anticodon f-met 5’ aa-tRNA IF3 IF1 E P A 3’ INICIO DE LA TRADUCCIÓN EUCARIONTE 60S eIF1A eIF2 eIF3 eIF4 eIF5 40S [Mg2+] + Met 3 4 Met GTP 1A + 2 AUG 4 5 1A 2 3 4 Escaneo para buscar el AUG GDP Met GTP 5 2 3 1A AUG 3 Met GTP 5 2 4 3 1A AUG complejo de inicio de la traducción Met GTP 2 3 1A Se forma un complejo circularizado con los extremos 5’ y 3’ del mRNA Los factores eIF4 NO existen en bacteria Ocurre un escaneo de la región 5’ no traducible hasta encontrar el primer AUG en contexto apropiado eIF4A: helicasa; utiliza ATP para deshacer estructura secundaria en el mRNA y permitir paso de 40S Para regenerar eIF2•GTP que se une a tRNA-met para iniciar traducción, se requiere el factor eIF2B eIF2B intercambia GDP x GTP en eIF2 eIF2•GDP Resumen inicio de la traducción en eucariontes Complejo 43S eIF3-eIF4G Complejo 48S Elongación ribosoma mRNA tRNAs-aa factores de elongación GTP GTP x aa Factores de elongación Bacteria EF-Tu EF-Ts EF-G Eucariontes eEF-1 eEF-1 eEF-2 1. Posicionamiento del aa-tRNAaa elongador correcto (EF-Tu/eEF-1 ) 2. Hidrólisis de GTP y cambio conformacional. Para regenerar EF-Tu•GTP se requiere EF-Ts Formación del enlace peptídico Bacteria Eucariontes Actividad peptidil transferasa del RNAr 23S (Bases conservadas en todos los organismos) 3. Ataque nucleofílico amino del aa2 al carboxilo del aa1 4. Posicionamiento del péptido sobre el tRNA del sitio A 1. El N3 del anillo de la adenina (2486, bacteria) sustrae un protón del grupo amino del aa entrante proporcionando el ataque nucleofílico al carbonilo del aa unido al tRNA en el sito P. 2. El N3 protonado estabiliza el intermediario del carbono tetrahédrico formado en el sitio P/A por puente de H con el oxianión 3. El protón es transferido del N3 al 3’OH del tRNA en el sitio P para transferir el polipéptido al sitio A Translocación Bacteria Eucariontes EF-Tu EF-Ts EF-G eEF-1 eEF-1 eEF-2 5. Entrada de EF-G/eEF-2 6. Hidrólisis de GTP 7. Cambio conformacional y desplazamiento ciclos de elongación Terminación ribosoma mRNA factores de terminación GTP proteína subunidades ribosoma mRNA tRNA libre Factores de terminación Bacteria Eucariontes RF1 RF2 RF3 RRF IF3 EF-G eRF1 eRF3 eRF1 utiliza agua para hidrolizar el péptido Modelo de terminación propuesto para bacteria Moleculas que unen el mismo sitio en el ribosoma El gasto energético del proceso de traducción Se hidrolizan 2 GTP´s por cada aminoácido incorporado La hidrólisis promueve cambios conformacionales Cargado de tRNA con su aminoácido 1 ATP /aa TRADUCCION Iniciación Elongación Terminación 1 GTP (1er aminoácido) 2 GTPs /aa 1 GTP Resumen RIBOSOMA Centro peptidil transferasa (PTC) A: aceptor P: peptidil E: salida (exit) Centro activador de GTPasa Centro decodificador