Clonación en Fagos

Clonación en Fagos
Escrutinio de la biblioteca
con sonda
Bibliotecas genómicas
DNA genomico
Digestion con enzima de restriccion
Bibliotecas de cDNA
RNA mensajero
Reverso transcripcion
Sintesis de DNA
doble cadena
Cebador de oligo dT
Bibliotecas genómicas vs. Bibliotecas de cDNA
Clonación en Cósmidos
Cromosomas artificiales
Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos
La tecnología de DNA recombinante genera
herramientas para estudiar los genes y sus productos
Insertar en
vector de
expresión
Deducir
secuencia de
aminoácidos
Secuencia de
aminoácidos
Transformar
E. coli u otro
hospedero
Preparar
péptidos
sintéticos
Sintetizar
sonda
específica
Anticuerpo específico
Preparar anticuerpos
específicos para una
proteína
Escrutinio de una
biblioteca de DNA
por Southern blot
Escrutinio de una
biblioteca de
expresión por
Western blot
Análisis global de los
genomas
SNPs
Polimorfismos de un solo nucleótido: Este tipo de
análisis permite detectar mutaciones, variaciones genéticas
entre individuos, y base hereditaria en un organismo
TRANSCRIPTOMA
Análisis global de la expresión
genética: Permite obtener información
RNAs pequeños
PROTEOMA
Análisis global de la función de
proteínas: Información de redes metabólicas
y de interacción sistemática entre proteínas en
un organismo
rápida, detallada y comparativa del estado en
la expresión de genes en diferentes tipos
celulares, tejidos u órganos, estados de
desarrollo, condiciones o mutantes específicas
INTERACTOMA
METABOLOMA
Arreglos (Arrays, Chips) de DNA
Colección ordenada de secuencias de ácido nucleico que proporciona un medio para
aparearlas con una muestra problema facilitando la determinación de los niveles de
dichas secuencias en la muestra y la identificacón de genes desconocidos.
Macroarreglos: el tamaño del
spot es de ~ 300 micras
Microarreglos: el tamaño del
spot es de ~ 2-5 micras
Análisis de microarreglos con dos marcas
problema
control
Transformacion en celulas eucariontes
Biobalística
Transformación directa
Microinyección
Virus
Clonación en células animales
Métodos de transfección
Permeabilización química de las membranas
Electroporación
Liposomas
Vectores
Vectores derivados de virus animales
SV40
Retrovirus
Vacuna
Vectores mixtos
Métodos de selección
Detección de actividades enzimáticas
Resistencia a inhibidores
Resistencia a antibióticos
Integración dirigida
Vectores de expresión para células animales
Promotor
inducible para
animales
Creando ratones Knockout
Construcción de Reporteros
5’UTR X
Promotor del gen X
3’UTR X
Gen reportero
El resto de características de los vectores de expresión son similares
Proteínas reporteras
Proteína verde
fluorescente
(GFP)
Betaglucoronidasa
(GUS)
Luciferasa de
luciérnaga
(LUC)
Las regiones reguladoras del promotor se
pueden clonar individualmente ó en combinación
Transformación de células vegetales
Agrobacterium tumefaciens
Transformación mediada por Agrobacterium
tumefaciens
Transformación por biobalística
El Fin
¿ O solo el principio ?
¡ Muchas gracias por ser un grupo tan bueno y con ganas de saber !