Vectores de clonado

Vectores
Plásmidos o Vectores Son moléculas pequeñas de
ADN doble cadena y circular.
Vectores de clonado, son pequeñas moléculas de
ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro
de la célula hospedadora y en general, producen un gran
numero de copias.
Vectores de expresión, poseen
información necesaria para expresar una
aminoacídica.
toda la
secuencia
Vectores de clonado
PLASMIDOS: moléculas de DNA doble cadena y circular que
se encuentran en bacterias y se replican en
forma independiente del cromosoma
Características:
• Son pequeños (miles de pares de bases)
• Son circulares
• Tienen un único origen de replicación
• Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción
• Gran numero de copias
• Marcadores que permitan su reconocimiento
Características generales de los vectores de clonado:
Sitios de restricción únicos
mcs
Marcadores
genéticos
(permiten selección
de transformantes)
Orígen de
replicación
pBR322
4361 bp
Tamaño pequeño
(mayor eficiencia de transformación)
Vectores de expresión eucariotas
Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector
dentro del organismo hospedador.
Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa.
Elementos
promotores
Promotor
Tata Box
Constitutivos:
SV40, RSV, CMV, hEF-1a
Inducibles:
Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina
Olac inducible por IPTG
Metalotioneína inducible por metales pesados
GAL4-E1b inducible por mifepristona
Vectores de expresión eucariotas
Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector
dentro del organismo hospedador.
Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa.
Terminador: Sitio de terminación de la transcripción.
Sitio de unión a ribosomas: se une la subunidad menor del ribosoma en
el momento de iniciarse la traducción (Secuencias Kozak y codón ATG).
Sitio de clonado múltiple (MCS): Región del vector que posee varias
secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de restricción.
Factor de selección: Codifica el/los marcador/es de selección que
permita diferenciar células transformadas.
Otras características: secuencias codificantes para fusion-tag, His-tag,
péptido señal de localización periplasmatica, etc.
Segmentos de DNA para recombinación homóloga (para transfecciones
estables).
Vectores de expresión eucariotas
Resumiendo.....
k
Obtención de grandes
cantidades del plásmido
para
su
posterior
transfección a células
eucariotas.
Clonado de PTP1B en el vector de expresión eucariota pGFP-N1
PTP1B
pGFP-N1
Transfección de
células eucariotas
• Se usa el término Transfección para
denominar la entrada de DNA foráneo a
las células eucariotas mediante métodos
químicos o físicos.
• Se denomina Infección a la introducción
de DNA foráneo dentro de las células
eucariotas mediante la utilización de
moleculas virales.
Objetivos de la transfección
- Expresión de proteínas para su purificacón.
- Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el
fenotipo celular.
- Estudio de promotores y elementos regulatorios.
- Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento
del RNA, postraduccionales, etc.
-Estudio de interacción de proteínas.
- Estudio de localizacion subcelular de proteínas.
- Terapia génica.
Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido
dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos.
Métodos químicos: DEAE-Dextrano
Coprecipitados de Fosfato de calcio
Lípidos cationicos (Liposomas)
Métodos físicos: Biobalística
Microinyección
Electroporación
Métodos químicos
Métodos Físicos
Electroporación
Microinyección
Biobalistica
Métodos Físicos
Biobalistica
Resumen
Liposomas
alta eficiencia, no-tóxico, estables
Fosfato de calcio
simple, baja eficiencia, no para estable
DEAE-dextrano
simple, alta efiencia, no para estable,toxico para
algunas líneas celulares
Electroporación
alta eficiencia, altos niveles de muerte
Microinyección
laborioso, alta eficiencia
Biobalística
baja eficiencia, muy costosa, se han logrado
buenos resultdos solo para células vegetales
Transfección estable y transiente
Transfección
estable
• Por integración
• Por recombinación homóloga
• Requiere de un marcador de selección en
el vector
• Util para estudios que impliquen inducción
de la expresión
Transfección estable y transiente
Transfección
transiente
(48 a 72 horas)
 Análisis rápido
 Múltiples propósitos
 Análisis de secuencias regulatoria
Consideraciones para transfección con lípidos
cationicos
Tansfección en presencia de
suero
Antibióticos en el medio de
cultivo
Densidad celular
Elección del promotor
Cantidad de DNA
Infección: proceso mediado por una molécula viral donde la células
target son infectadas con un virus que lleva clonado la secuencia
de interés en su genoma.
Ejemplos:
Vaccinia
Semmliky
Baculovirus