219618

V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
VI Jornadas Científicas de Biomedicina y
Biotecnología Molecular
Clave: 219618
MODIFICACIÓN EN LA TRANSFECCIÓN GENÉTICA CELULAR EN PRESENCIA
DE DISTINTOS FÁRMACOS
Carlos, Wong-Baeza; Verónica, Alcántara-Farfán; Miguel, Ibáñez-Hernández; Carlos, Wong e
Isabel, Baeza.
DIRECCIÓN DE LOS AUTORES
Laboratorio de Biomembranas y Laboratorio de Enzimología del Departamento de Bioquímica de
la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (IPN). Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n.
c.p. 11340. D.F. México.
CORREO ELECTRÓNICO
[email protected]
Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F.
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INTRODUCCIÓN
La terapia génica es una estrategia para transferir genes al interior de células específicas de
animales o del hombre, para corregir enfermedades causadas por alteraciones genéticas.
Actualmente, se encuentra en fase experimental y uno de sus principales retos, es encontrar
las condiciones óptimas para transferir eficientemente el gen terapéutico a las células
seleccionadas y obtener su expresión estable y con alto margen de seguridad1.
Debido a que la membrana es el organelo que delimita a las células, es necesario conocer su
estructura, para diseñar procedimientos que mejoren el paso de genes a través de ella. La
membrana plasmática da su individualidad a las células al separarlas del medio extracelular
y de otras células. Regula el paso de iones y moléculas hacia el interior y exterior, lo que
mantiene las diferencias en composición entre el citoplasma y el medio, regula el volumen
celular; además, transfiere señales hacia el interior y exterior de las células 2.
La terapia génica requiere de metodologías de biología molecular e ingeniería genética para
diseñar, transportar y liberar ácidos nucléicos, que contengan las secuencias necesarias para
funcionar como genes terapéuticos en células específicas de un organismo1. En la
lipotransfección, el DNA se encapsula en liposomas que se fusionan con la membrana o
penetran por endocitosis y vacían su contenido en la célula3. Los liposomas con lípidos
catiónicos, como el lípido comercial lipofectamina, han sido más eficientes que los
liposomas neutros y aniónicos, en transferir genes a células en cultivo y en animales de
experimentación.
Se han usado varias estrategias para aumentar la eficiencia y la reproducibilidad de la
lipotransfección. Como son: el uso de liposomas pH sensibles que se desestabilizan al pH
ácido de los lisosomas, liposomas con alto contenido de dioleoilfosfatidiletanolamina
(DOPE) que se disocian fácilmente al disminuir el pH (durante la activación de las enzimas
lisosomales), el polietilenglicol que protege a los liposomas de ser capturados por
macrófagos, por lo que permanecen más tiempo en la circulación (vida media de 2 días en
lugar de 2 h) y el uso de sustancias lisosomotrópicas que evitan la disminución de pH del
lisosoma y desestabilizan la membrana de este organelo4.
Sin embargo, debido a la baja eficiencia de transfección genética (25%) que se ha obtenido
en general con los complejos lipofectamina-DNA, lo cual representa una limitante para
aplicar la lipofectamina en protocolos para terapia génica en el humano, es que se ha
tratado de mejorar su actividad en la transferencia y la expresión de genes, y por ello se
analizó en este trabajo el efecto de dos promotores de fusión celular, una poliamina y un
lisosomotrópico, en la transfección de células en cultivo mediada por estos lipocomplejos.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Se llevó a cabo el cultivo de las líneas celulares de humanos HEK 293 (células
transformadas) con medio DMEM completo y C-33 A (células cancerígenas) con medio
DMEM F-12 completo, en las que se determinó la citotoxicidad de los fármacos
cloroquina, cloropromacina, procainamida, espermidina y la mezcla de los mismos, por las
técnicas de azul tripan y azul alamar. Se seleccionaron las concentraciones del fármaco que
permitieran una viabilidad celular mayor al 60%.
Se obtuvo el plásmido pRSVβgal de un cultivo de la bacteria Escherichia coli DH5α
previamente transformada por el método de Cohen et al. (1973). La pureza y concentración
del plásmido se determinaron por su espectro de absorción y su integridad estructural se
caracterizó por el electroferograma correspondiente. Una vez caracterizado el plásmido, se
formaron los lipocomplejos con el lípido comercial lipofectamina (DOSPA + DOPE 3:1).
Se estandarizó el proceso de transfección en ambos cultivos celulares de acuerdo al inserto
de Invitrogen. La transfección genética se determinó por citoquímica por la expresión del
gen reportero de la β-galactosidasa.
Para cuantificar la expresión del gen reportero, se contaron las células que presentaron la
expresión de la β-galactosidasa en 2 campos del microscopio a una amplificación de 4X, y
se obtuvo el promedio, que se tomó como el porcentaje de expresión genética celular. Por
lo que el porcentaje de expresión genética es una medida de la eficiencia de la transfección
genética obtenida.
A continuación se transfectaron las líneas celulares HEK 293 y C-33 A en presencia de los
fusionadores de membrana cloropromacina o procainamida, del inactivador lisosomal
cloroquina, de la poliamina espermidina y de la mezcla de los fármacos. La transfección
genética también se determinó por citoquímica. Es importante señalar que todos los
experimentos de transfección genética en ausencia y en presencia de fármacos se repitieron
por lo menos 5 veces.
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RESULTADOS
Al determinar la citotoxicidad de los fármacos cloroquina, cloropromacina, procainamida,
espermidina y las mezclas de los mismos por las técnicas del azul tripan y azul alamar, se
encontró que ésta fue mayor en las células HEK 293 que en las C-33 A. En la línea celular
HEK 293 el fármaco mas tóxico fue el fusionador de membranas cloropromacina y el
menos tóxico fue la procainamida. Para la línea celular C-33 A, el fármaco más tóxico fue
la poliamina espermidina y el menos tóxico fue el fusionador de membranas procainamida.
Para la transfección genética se seleccionaron las concentraciones de fármaco que
permitieran una viabilidad celular mayor al 60%.
La transfección genética con los complejos de lipofectamina-pRSVβgal, llevada a cabo en
las mismas condiciones y con la misma cantidad de DNA (1 µg) fue dos veces mayor, es
decir 100% mayor, en células HEK 293 que en C-33 A. Para evaluar los resultados de la
trasfección en presencia de los fármacos, se tomó el número de células transfectadas con
lipofectamina-pRSVβgal sin la adición de fármacos como el 100% de transfección y con
base en este valor, se evaluó un aumento o disminución en el porcentaje de transfección
por el efecto de los fármacos.
La espermidina produjo un aumento en la transfección en ambas líneas celulares. En la
Figura 1 se presenta el efecto de la mezcla de espermidina y cloroquina que llevó a un
aumento en la transfección de 175% en C-33 A y de 200% en HEK 293.
Con el lisosomotrópico cloroquina se obtuvo un aumento en el número de células
transfectadas de 1.75 veces (175%) en células HEK 293 y de 1.4 veces (140%) en células
C-33 A. Sin embargo, con los dos promotores de fusión celular cloropromacina y
procainamida se obtuvo una disminución en el número de células transfectadas. La
disminución fue desde el 40 ó 50% hasta del 90% con las concentraciones probadas de
ambos fármacos. No obstante, cuando los fusionadores de membrana procainamida y
cloropromacina se usaron junto con cloroquina se obtuvo un aumento en la transfección de
175% en células C-33 A y del 250% en las HEK 293(Figura 2).
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A
B
Figura 1. Transfección genética de células HEK 293 con lipofectamina-pRSVβgal en
presencia de diferentes concentraciones de espermidina y cloroquina. Se presenta el
histograma que muestra las concentraciones de espermidina y cloroquina usadas (con la
desviación estándar correspondiente) y microfotografías de la transfección con
lipocomplejos con 3 µg de DNA en ausencia (A) y en presencia de 0.06 mM de
espermidina y 0.06 mM de cloroquina (B).
A
B
Figura 2. Transfección genética de células C33 A con lipofectamina-pRSVβgal en
presencia de diferentes concentraciones de cloropromacina y cloroquina. Se presenta el
histograma que muestra las concentraciones de cloropromacina y cloroquina usadas (con la
desviación estándar correspondiente) y microfotografías de la transfección con
lipocomplejos con 3 µg de DNA en ausencia (A) y en presencia de 0.007 mM de
cloropromacina y 0.07 mM de cloroquina (B); el aumento es de 120 X.
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DISCUSIÓN
La mayor citotoxicidad y transfección genética observada en los cultivos de HEK 293
comparadas con las C-33 A, puede atribuirse a que HEK 293 son células transformadas con
genoma de un adenovirus, es decir, no son células cancerosas. En general se conoce que las
células de líneas cancerosas como C-33 A son más resistentes a la acción de fármacos y a
los procesos de transfección genética.
El aumento en la transfección de 175% en células HEK 293 y de 140% en C-33 A que se
obtuvo con la cloroquina, sugiere fuertemente que los complejos lipofectamina-pRSVβgal
penetraron en ambas líneas celulares por endocitosis. Posiblemente, la inactivación de las
enzimas hidrolíticas de los fagolisosomas por el aumento del pH causado por la cloroquina
evita la degradación de los lipocomplejos; además el efecto de desestabilización de la
membrana de los fagolisosomas4, permite la liberación de los lipocomplejos hacia el
citoplasma, y posteriormente se lleva a cabo la expresión genética del pRSVβgal en el
núcleo celular.
Con los fármacos que promueven fusión celular, cloropromacina y procainamida, se
esperaba también un aumento en la transfección genética, porque dichos fármacos al
favorecer la penetración de los lipocomplejos por fusión con la membrana plasmática
permitirían que éstos llegaran directamente al citoplasma, sin pasar por los fagosomas y
los fagolisosomas. Sin embargo, la disminución en la transfección genética a todas las
concentraciones que se analizaron de estos fármacos, sugiere que los complejos
lipofectamina-pRSVβgal también penetraron en ambas líneas celulares por endocitosis, y
que la cloropromacina y la procainamida favorecieron además la fusión de los lisosomas
con los fagosomas que llevan los lipocomplejos. Como no había un inactivador de los
fagolisosomas los lipocomplejos fueron degradados por las enzimas hidrolíticas que
contienen.
El aumento en la transfección genética de 175% en células C-33 A y del 250% en las HEK
293 obtenido al combinar los fármacos fusionadores de membrana con el agente
lisosomotrópico, puede atribuirse a la suma de los efectos del fusionador de membranas y
del lisosomotrópico. Como se ha indicado la cloropromacina y la procainamida inducen la
formación de partículas lipídicas2, y estos arreglos lipídicos intervienen en la fusión de
membranas2, por lo que se promueve la internalización de lipocomplejos vía vesículas
endosomales. Adicionalmente la cloroquina interfiere con la endocitosis ya que al
incrementar el pH del fagolisosoma inhibe sus enzimas4, lo desestabiliza y permite que se
libere su contenido de DNA al interior de la célula.
El aumento de la transfección genética observado en presencia de la poliamina espermidina
se puede deber a que este compuesto estimula los procesos de replicación, transcripción y
traducción, por lo que aumenta la expresión genética y se induce la división celular; se
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conoce que las células que se están dividiendo activamente son mas susceptibles de ser
transfectadas. Este efecto junto con el del fármaco cloroquina es el que seguramente
produjo un mayor aumento en la transfección genética en presencia de los dos fármacos.
Estos hallazgos indican que la combinación de compuestos que tienen propiedades de
favorecer la fusión de membranas, de inhibir las enzimas hidrolíticas de los fagolisosomas
y de desestabilizarlos, así como de aumentar la división celular y la expresión genética,
aumentan de forma muy importante la eficiencia de la transfección genética de cultivos
celulares con lipocomplejos. Por lo que los lipocomplejos en presencia de estos compuestos
pueden emplearse en protocolos de terapia génica ex vivo, en donde se extraen células del
paciente, se cultivan y procesan para transferirles el gen requerido y se reintegran a dicho
paciente.
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CONCLUSIONES
1. La transfección genética con lipocomplejos lipofectamina-pRSVβgal fue 100% mayor
en la línea célular HEK 293, integrada por células transformadas con genoma de un
adenovirus, con respecto a la línea de células de cáncer cérvicouterino C-33 A.
2. La transfección genética aumentó 175% en células HEK 293 y 140% en C-33 A con el
inactivador de lisosomas cloroquina, lo que indica que los lipocomplejos penetraron por
endocitosis.
3. La disminución en la transfección del 40 hasta el 90% en HEK 293 y C-33 A, en
presencia de los fusionadores de membrana confirma que los lipocomplejos penetraron
por endocitosis y no por fusión con la membrana plasmática, y que fueron degradados
por los fagolisosomas.
4. El aumento en la transfección del 175% en C-33 A y 250% en HEK 293 al combinar
los fusionadores de membrana con el lisosomotrópico, se atribuye a la suma de los
efectos de aumentar la internalización de lipocomplejos vía vesículas endosomales y de
inactivar y desestabilizar los fagolisosomas, que aumenta la liberación de DNA al
interior de la célula y con ello aumenta la transfección genética.
5. El aumento en la transfección genética de 175% en C-33 A y a 200% en HEK 293 al
combinar la espermidina y la cloroquina, se debe a la mayor división celular y a la
mayor expresión genética inducida por la espermidina y a la inhibición de los
fagolisosomas por la cloroquina.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Nishikawa, M. & Huang, L. 2001. Nonviral vectors in the new millennium: Delivery
barriers in gene transfer. Human Gene Therapy. 12: 861 - 870.
2. Baeza, I., Ibáñez, M. y Wong, C. 2007. Biomembranas y fenómenos de transporte. En:
Bioquímica. J. J. Hicks Ed. McGraw-Hill Interamericana. México, Sidney, Toronto. pp.
168 - 200.
3. Ibañez, M., Gariglio, P., Chávez, P., Santiago, R., Wong, C. & Baeza, I. 1996.
Spermidine-condensed DNA and cone-shaped lipids improve delivery and expression
of exogenous DNA transfer by liposomes. Biochem. Cell Biol. 74: 633 -643.
4. Medina-Kauwe, L. K., Xie, J. & Hamm-Alvarez, S. 2005. Intracelullar trafficking of
non-viral Gene Therapy. 12: 1734 - 1751.
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