Herramientas básicas de clonación molecular Estirpes de

Herramientas básicas de clonación molecular
Estirpes de Escherichia coli para propagar el DNA
Plasmidos como vectores de clonación
Métodos de transformación de bacteria
Bacteriófagos para clonación
Estirpes de Escherichia coli para propagar el DNA
E. coli K12
Bacteria Gram-negativa con flagelos
Habitat natural: intestino
Membrana interna y externa
Cromosoma circular con un unico origen de replicación
Se replica cada 20 minutos en condiciones aeróbicas
Pueden ser congeladas en glicerol
Crecen bien en condiciones de laboratorio
No son patógenas
Se conoce bien su genética y su bioquímica
No vive fuera de condiciones de laboratorio
El operon lac de E. coli consiste en un promotor, un operador (o), un
lugar de unión de la proteína activadora de catabolito CAP (c), 3 genes
estructurales en un mRNA policistronico (lacZ, lac Y, lac A) y un gen
estructural que produce la proteína represora Lac
Sistema de
inducción de la
expresión por IPTG
usando
componentes del
operon lac.
Se requiere que la
cepa de E. coli
contenga la
mutación de
sobreexpresión en el
receptor lacIq
La actividad
ß-galactosidasa
como indicador de la
función génica
Los plasmidos que
expresan el Nterminal de la enzima
pueden ser usados
en cepas de E. coli
que expresan el Cterminal del enzima
en el plasmido F’.
Varios tipos de sistemas de modificación y restricción deben ser
eliminados de las cepas de E. coli K12 para que puedan ser usadas en
clonación.
(a) DNA no metilado se
degrada por la nucleasa
hsdR y por tanto para
clonar DNA no metilado
debe emplearse
estirpes hsrR–.
(b) DNA metilado en
posiciones distintas del
de E.coli se degrada
por las proteínas
mdrA/mcrB por tanto
para clonar DNA de
mamifero y plantas
deben emplearse
estirpes con
mutaciones en
mdrA/mcrB.
PLÁSMIDOS: los modelos pBR322 y pUC18
pBluescript SK+
Bacteriofago λ
Infección por fagos es muy
eficiente en comparación
con métodos químicos de
transformación
Ciclo del fago λ
Lisogenia
vs.
Lisis
Infección por fago λ
Lisogenia vs. Lisis
El gen cI inhibe la transcripción de los genes tempranos de la ruta lítica:
genes estructurales de cabeza, cola y de lisis de pared bacteriana
Genoma del fago λ: 48502 pb (18 kpb necesarios para lisis)
Genoteca en
fago λ
Genoteca en fago λ: Sitios cos
Capacidad: empaqueta entre 38 y 52 kb (clona hasta 25 kb de DNA)
Genoteca en
fago λ :
Ensayo de
formación de
placas de lisis
Screening de genoteca en fago lambda
Fagemidos y fagos
auxiliares para
producción de cadenas
sencillas de DNA
λ ZAP: clonación de cDNA
Contiene elementos
reguladores
eucarioticos
(promotores y
poliadenilación)
que permiten
expresión en
células eucarióticas
y selección de la
integración estable
de DNA
Rescate de fagémidos
Infección secuencial
con 2 cepas
diferentes de E.coli
que permite o
restringe la
producción de fagos
y que resulta en el
rescate de colonias
resistentes a kan
(con el fagemido)
Expresión
heteróloga en
E.coli con el
vector pET
Producción de
anticuerpos
utilizando
proteína
recombinante
Screening por anticuerpos
Screening por oligonucleótidos degenerados
Hibridación substractiva
Utilización de clones
de cDNA como sonda:
Para detectar
expresión diferencial
de genes
(“nuclear run-on”):
marcaje in vivo e
hibridación
Sistema de dos
híbridos en
levaduras
3 elementos para
detectar
interacciones entre
dos proteínas:
- Proteína de fusión
GAL4-DBD con
proteina “cebo”
- Genoteca de cDNA
con insertos de
fusión en el gen
GAL4-AD.
- Gen indicador
seleccionable
activable por el
complejo
GAL4-DBD-AD
Protocolos de
transfección
transitoria
Optimización de la
eficiencia para cada tipo
celular y para
construcción.
Control de la
expresión en lineas
celulares de
mamíferos
El receptor de la
tetraciclina puede ser
utilizado para dos
sistemas: apagado y
activado.
La presencia o ausencia
de doxiciclina inhibe o
activa la expresión
VP es un dominio de
activación de la
transcripción
Mutaciones en rTetR
evitan la unión a DNA en
ausencia de Tet.
Expresión de proteínas de
fusión en E. coli (e.g.
Thiofusión)
Expresión es inducida por la
derepresión del gen λcI
mediada por triptofano.
En E.coli las proteínas de fusión
con actividad tioredoxina se
localizan en las proximidades
de la membrana: por shock
osmotico pueden liberarse al
medio (purificación).
Mediante una proteasa
(enteroquinasa) puede
eliminarse la zona de la
tioredoxina dentro de una
columna de afinidad.
Expresión de proteínas con
modificaciones posttraduccionales (Baculovirus
y células eucariotas)
Fosforilación, glicosilación y
procesamiento proteolítico no
sucede en E.coli.
Vectores de expresión de
baculovirus se producen in vivo
seleccionado eventos de
recombinación específicos
(complementación de lacZ)
Ventajas:
- Proteinas activas y solubles
- Genoma viral acomoda tamaños
grandes (hasta 15kb)
- Acoplamiento de heterodimeros
-Virus de hospedador restringido
- Altas producciones de proteína
Genes indicadores permiten mapear in vivo secuencias
reguladoras.
Fragmentos genomicos
amplios pueden delimitarse
por su funcíon reguladora
de la expresión.
Mutagénesis de deleción
secuencial permite ir
identificando zonas
necesarias para la expresión
del gen indicador
(luciferasa).
El análisis de los datos
permite la localización de
diferentes elementos
(potenciadores, promotores,
etc…)
Las secuencias reguladores de
unión a DNA pueden ser
identificadas mediante analisis
por protección (footprinting)
Proteínas que se unen con alta
afinidad a DNA se pueden incubar
con fragmentos de DNA
reguladores y la secuencia de DNA
que une la proteína es identificada.
(a) En una primera aproximación se
puede observar la presencia de
diferentes tamaños en una
digestión limitada con Dnase I
(b) En una segunda aproximación
se puede identificar con precisión la
secuencia de unión.
Genes indicadores
permiten identificar
regiones reguladoras
específicas de tipos
celulares.
CAT: gen de cloranfenicol
acetil transferasa.
3 tipos de plasmidos
permitiran saber si la zona
clonada de un gen codifica
un promotor especifico de
un tipo celular.
La actividad de CAT se mide
mediante CCF con
cloranfenicol marcado.
El fragmento clonado dirige
selectivamente la
transcripción en el tipo B
MUTACIÓN
Cambio en la
secuencia de DNA
Detección
Efecto fenotípico:
disfunción clínica en
individuos,
familias y/o poblaciones
Disfunción
MOLECULAR
TERAPIA
Detección de mutaciones en fragmentos de PCR
SSCP:
“single strand
conformation
polymorphism”
Mutaciones en DNA
genomico pueden ser
identificadas mediante
desnaturalización de
fragmentos de PCR y
analisis de su
movilidad en geles de
electroforesis.
Clonación de
fragmentos de PCR
Los productos de PCR
pueden ser clonados de
diferentes formas
dependiendo de la
secuencia terminal del
fragmento.
El sistema de elección
depende del uso posterior
del clon.
Mutagenesis por PCR
La mutagenesis dirigida es muy
frecuentemente necesaria para
crear fusion de fragmentos,
imitar mutaciones naturales, y
elaborar construcciones
recombinantes.
El solapamiento de segmentos
puede servir de puente para una
segunda amplificación por PCR.
El resultado es un nuevo
fragmento con las dianas de
restriccion necesarias para la
clonación