i Extracción de caseína a partir de leche de vaca cruda, pasteurizada, semidescremada y descremada para la elaboración de pinturas ecológicas. Autor: Guaraca Bedón, Pablo Andrés Tutor: Ruiz López, Washington Polivio Facultad de Ingeniería Química, Universidad Central del Ecuador Carrera de Ingeniería Química Trabajo de titulación modalidad Proyecto de Investigación previo a la obtención del título de Ingeniero Químico Quito, 2023 ii Derechos de autor Yo, Pablo Andrés Guaraca Bedón en mi calidad de autor y titular de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: “Extracción de caseína a partir de leche de vaca cruda, pasteurizada, semidescremada y descremada para la elaboración de pinturas ecológicas ” modalidad proyecto de investigación, de conformidad con el ART.114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS , CREATIVIDAD E INNOVACÍON , concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada. Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la LEY ORGÁNICA DE EDUCACIÓN SUPERIOR. El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad. Firma: ………………… Pablo Andrés Guaraca Bedón C.C. 1716856735 p_andres1010 @hotmail.com iii Aprobación del tutor En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por Pablo Andrés Guaraca Bedón, para optar por el Grado de Ingeniero Químico; cuyo título es “Extracción de caseína a partir de leche de vaca cruda, pasteurizada, semidescremada y descremada para la elaboración de pinturas ecológicas”, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe. En la ciudad de Quito, 20 de diciembre del 2022 Firmado electrónicamente por: WASHINGTON POLIVIO RUIZ LOPEZ …………………………………… Ing. Washington Polivio Ruiz López DOCENTE – TUTOR C.C.1711337939 iv Tabla de contenidos Pag Derechos de autor ....................................................................................................................ii Aprobación del tutor.............................................................................................................. iii Tabla de contenidos ................................................................................................................ iv Lista de tablas.......................................................................................................................... ix Lista de figuras ........................................................................................................................ xi Lista de anexos .......................................................................................................................xii Resumen ................................................................................................................................ xiii Abstract .................................................................................................................................. xiv Introducción ............................................................................................................................. 1 1. Marco teórico .................................................................................................................... 3 1.1. Leche........................................................................................................................... 3 1.1.1. Generalidades .................................................................................................. 3 1.1.2. Industrias lácteas en el Ecuador .................................................................... 3 1.1.3. Propiedades organolépticas de la Leche......................................................... 4 1.1.3.1. Opacidad.. ....................................................................................................... 4 1.1.3.2. Color................................................................................................................. 4 1.1.3.4. Olor.. ................................................................................................................ 6 v 1.1.4. Composición proteínica de la leche ................................................................ 6 1.1.4.1. Caseína.. .......................................................................................................... 8 1.1.4.2. Proteínas del lactosuero. .............................................................................. 13 Lactoalbúminas ............................................................................................ 13 1.1.4.3. Carbohidratos en la leche. ........................................................................... 15 1.1.5. Composición fisicoquímica de la leche líquida ............................................ 16 1.1.5.2. Componentes minerales en la leche líquida.. ............................................. 18 1.1.6. 1.1.6.3. Fosfolípidos en la leche. ............................................................................... 20 1.1.6.4. Esteroles en la leche...................................................................................... 20 1.1.6.5. Pigmentos en la leche. .................................................................................. 20 1.1.6.6. Enzimas presentes en la leche ..................................................................... 20 1.1.6.7. Vitaminas. ..................................................................................................... 22 1.1.7. 1.2. Componentes menores en la Leche ...................................................................... 19 Tipos de Leche de vaca ......................................................................................... 23 1.1.7.1. Leche cruda. .................................................................................................. 24 1.1.7.2. Leche pasteurizada. ...................................................................................... 24 1.1.7.10. Leche esterilizada. ........................................................................................ 26 1.1.7.11. Leche Evaporada. ......................................................................................... 26 Ensayos de calidad en muestras de leche .................................................................. 26 1.2.1. Norma Inen NTE 9 ............................................................................................... 26 1.2.2. Requisitos organolépticos ..................................................................................... 27 vi 1.2.2.1. Color.. ............................................................................................................ 27 1.2.2.2. Olor. ............................................................................................................... 27 1.2.2.3. Aspecto. ......................................................................................................... 27 1.2.3. Requisitos físicos y químicos......................................................................... 27 1.2.3.2. Material Graso.............................................................................................. 28 1.2.3.3. Acidez titulable como ácido láctico. ............................................................ 29 1.2.3.4. Sólidos totales, sólidos no grasos y cenizas. ................................................ 30 1.2.3.5. Punto de congelación. ................................................................................... 31 1.2.3.6. Proteínas. ....................................................................................................... 32 1.2.4. Ensayos cualitativos en muestras de leche .......................................................... 32 1.2.4.2. Método de detección de hipocloritos y cloraminas. ................................... 34 1.2.4.3. Método para la detección de neutralizantes alcalinos............................... 34 1.2.4.4. Método para la detección de almidones y sacarosa. .................................. 35 1.2.4.5. Prueba de estabilidad de proteína.. ............................................................ 35 1.2.4.6. Prueba de detección de sacarosa.. ............................................................... 35 1.2.4.7. Prueba de adulteración de suero de leche. ................................................. 35 1.2.4.8. Residuos de medicamentos veterinarios. .................................................... 37 1.2.5. Requisitos microbiológicos en leche Cruda ......................................................... 41 1.2.5.1. E. coli. ............................................................................................................ 42 1.2.5.2. Microorganismos aerobios. ......................................................................... 42 1.2.5.3. Enterobacterias............................................................................................. 42 vii 1.2.5.4. Mohos y levaduras........................................................................................ 42 1.2.5.5. Recuento de células somáticas.. ................................................................... 43 1.3. Pintura ...................................................................................................................... 43 1.3.1. Pintura a partir de caseína............................................................................ 44 1.3.2. Método de extracción de caseína .................................................................. 45 1.3.2.1. Punto isoeléctrico de la caseína. .................................................................. 46 1.3.2.2. Bioluminometría en la determinación del punto isoeléctrico de la caseína……………………………………………………………………………..47 1.3.2.2. Requisitos de calidad en pinturas a base de agua . ......................................... 47 3. 1.3.2.4. Requisitos organolépticos de las pinturas. ................................................. 49 1.3.2.5. Requisitos físicos y químicos. ...................................................................... 49 2. Metodología experimental .......................................................................................... 51 2.1. Esquema metodológico ........................................................................................... 51 2.2.1. Sustancias y Reactivos................................................................................... 52 2.2.2. Materiales y Equipos ..................................................................................... 52 2.2.3. Procedimiento realizado para la caracterización de los tipos de leche ....... 53 Cálculos y resultados ...................................................................................................... 54 3.1. Caracterización en muestra de leche cruda .......................................................... 55 3.2. Caracterización en muestra de leche pasteurizada .............................................. 58 3.3. Caracterización en muestra de leche semidescremada ........................................ 61 3.4. Caracterización en muestra de leche Descremada ............................................... 64 3.5. Segunda Parte: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína .................. 70 viii 3.5.1. Procedimiento utilizado para determinar el punto isoeléctrico de la caseína 70 3.5.2. Resultados del punto isoeléctrico de la caseína ................................................. 72 3.6. Tercera Parte: Extracción de caseína en cada tipo de leche ............................... 72 3.7. Preparación de pintura a partir de caseína .......................................................... 73 3.8. Resultados de aplicar la pintura a distintas superficies ...................................... 75 3.8.1. Resultados de la pintura elaborada a partir de leche cruda ........................ 75 3.8.2. Resultados de caseína a partir de leche pasteurizada .................................. 76 3.8.3. Resultados de caseína a partir de leche semi descremada ........................... 77 3.8.4. Resultados de caseína a partir de leche descremada ................................... 78 3.8.5. Características generales de la caseína extraída.......................................... 79 3.8.6. Humedad en la caseína y extracto seco ........................................................ 80 4. Discusión ...................................................................................................................... 82 5. Conclusiones ................................................................................................................ 86 6. Recomendaciones ........................................................................................................ 87 REFERENCIAS ................................................................................................................. 88 ANEXOS ................................................................................................................................. 91 ix Lista de tablas Tabla 1 Aminoácidos presentes en las proteínas de leche ........................................................ 7 Tabla 2 Compuestos nitrogenados en la leche ......................................................................... 8 Tabla 3 Componentes de la caseína ......................................................................................... 9 Tabla 4 Cantidad de proteina en distintos tipos de leche ....................................................... 14 Tabla 5 Composicion de la leche de vaca por cada 100g ....................................................... 16 Tabla 6 Composición de la grasa en la leche ......................................................................... 17 Tabla 7 Principales ácidos grasos saturados que forman la grasa de leche ............................ 17 Tabla 8 Pincipales ácidos grasos no saturados que forman la grasa de leche ......................... 17 Tabla 9 Composición mineral de la leche de vaca por cada mg/100ml de leche ................... 18 Tabla 10 Vitaminas en 100 g de leche bajo diferentes tratamientos térmicos ........................ 22 Tabla 11 Perdida de vitaminas en leche bajo diferentes tratamientos térmicos...................... 23 Tabla 12 Requisitos fisicoquímicos de la leche Cruda ........................................................... 41 Tabla 13 Requisitos microbiológicos de la leche cruda .......................................................... 43 Tabla 14 Simbología utilizada para los tipos de leche ............................................................ 51 Tabla 15.Resultados cuantitativos en muestras de leche cruda .............................................. 57 Tabla 16 Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche cruda. ...................... 57 Tabla17 Resultados cualitativos de muestras de leche cruda. ................................................ 57 Tabla 18 Resultados microbiológicos de muestras de leche cruda. ........................................ 58 Tabla 19 Conteo de células somáticas en leche de vaca cruda. .............................................. 58 Tabla 20 Resultados cuantitativos en muestras de leche pasteurizada ................................... 60 Tabla 21 Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche pasteurizada............ 60 Tabla 22 Resultados cualitativos de muestras de leche pasteurizada. .................................... 60 Tabla 23 Resultados microbiológicos de muestras de leche pasteurizada. ............................. 61 Tabla 24 Conteo de células somáticas en leche de vaca pasteurizada. ................................... 61 Tabla 25 Resultados cuantitativos en muestras de leche semidescremada ............................. 63 Tabla 26 Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche semidescremada. .... 63 Tabla 27 Resultados cualitativos de muestras de leche semidescremada. .............................. 63 Tabla 28.Resultados microbiológicos de muestras de leche semidescremada ....................... 64 Tabla 29 Conteo de células somáticas en leche de vaca semidescremada.............................. 64 Tabla 30 Resultados cuantitativos en muestras de leche descremada .................................... 66 Tabla 31 Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche descremada. ............ 66 Tabla 32 Resultados cualitativos de muestras de leche descremada. ..................................... 66 Tabla 33 Resultados microbiológicos de muestras de leche descremada. .............................. 67 Tabla 34 Conteo de células somáticas en leche de vaca descremada. .................................... 67 x Tabla 35 Cuadro comparativo propiedades cuantitativas de los tipos de leche ...................... 67 Tabla 36 Cuadro comparativo resultados cuantitativos por milkoscan .................................. 68 Tabla 37 Cuadro comparativo resultados cualitativos tipos de leche ..................................... 68 Tabla 38 Cuadro comparativo resultados microbiológicos de los tipos de leche ................... 69 Tabla 39 Cuadro comparativo de células somáticas en los distintos tipos de leche ............... 69 Tabla 40 Cuadro comparativo de contenido de cenizas en los distintos tipos de leche .......... 70 Tabla 41 Soluciones preparadas a distinto pH y luminometria determinada .......................... 72 Tabla 42 Cantidad de caseína obtenida en función de las propiedades de la leche ................ 73 Tabla 43 Aspecto de la pintura en distintos tipos de leche en una solución de 1 ml .............. 74 Tabla 44 Aspecto de la pintura en distintos tipos de leche en una solución de 2 ml y 3 ml ... 74 Tabla 45 Aspecto de la pintura en distintos tipos de leche en una solución de 4ml ............... 74 Tabla 46 Propiedades de la pintura de caseína cruda en concreto .......................................... 75 Tabla 47 Propiedades de la pintura de caseína cruda en metal ............................................... 75 Tabla 48 Propiedades de la pintura de caseína cruda en plástico ........................................... 76 Tabla 49 Propiedades de la pintura de caseína pasteurizada en concreto ............................... 76 Tabla 50 Propiedades de la pintura de caseína pasteurizada en metal .................................... 76 Tabla 51 Propiedades de la pintura de caseína pasteurizada en plástico ................................ 77 Tabla 52 Propiedades de la pintura de caseína semidescremada en concreto ........................ 77 Tabla 53 Propiedades de la pintura de caseína semidescremada en metal ............................. 77 Tabla 54 Propiedades de la pintura de caseína semidescremada en plástico .......................... 78 Tabla 55 Propiedades de la pintura de caseína descremada en concreto ................................ 78 Tabla 56 Propiedades de la pintura de caseína descremada en metal ..................................... 78 Tabla 57 Propiedades de la pintura de caseína descremada en plástico ................................. 79 Tabla 58 Características organolépticas de la caseína obtenida ............................................. 79 Tabla 59 Humedad de la caseína y extracto seco.................................................................... 81 xi Lista de figuras Figura 1 Cola de caballo ........................................................................................................... 5 Figura 2 Estructura de una proteína .......................................................................................... 6 Figura 3 Estructura primaria de la alfa caseína....................................................................... 10 Figura 4 Estructura primaria de la beta caseína ...................................................................... 11 Figura 5 Estructura primaria de la gamma caseína ................................................................. 12 Figura 6 Formula estructural de la lactosa .............................................................................. 15 Figura 7 Esquema general de un crioscopio ........................................................................... 31 Figura 8 Diagrama de interpretación de prueba de adulteración de suero .............................. 36 Figura 9 Diagrama de interpretación de prueba de antibióticos ............................................. 38 Figura 10 Diagrama de interpretación de prueba de aminoglucósidos ................................... 39 Figura 11 Diagrama de interpretación de prueba de aflatoxinas ............................................ 40 xii Lista de anexos Anexo 1 Materia prima utilizada en el proceso de caracterización ...................................... 92 Anexo 2 Ensayos físicos para la caracterización de los tipos de leche ................................ 93 Anexo 3 Resultados cuantitativos a partir del método FTIR ............................................... 97 Anexo 4 Análisis cualitativos en los tipos de leche ............................................................. 98 Anexo 5 Ensayos microbiológicos en muestras de leche ................................................... 103 Anexo 6 Determinación del punto isoeléctrico de la caseína............................................. 105 Anexo 7 Extracción de caseína de los distintos tipos de leche .......................................... 108 Anexo 8 Elaboración de pinturas a partir de caseína y aplicación en superficies .............. 110 xiii TITULO: Extracción de caseína a partir de leche de vaca cruda, pasteurizada, semi descremada y descremada para la elaboración de pinturas ecológicas Autor: Pablo Andrés Guaraca Bedón Tutor: Washington Polivio Ruiz López Resumen La caseína es una proteína presente en la leche que puede ser usada para la elaboración de pegamentos y pinturas, debido a esto se busca determinar qué tipo de caseína es la más adecuada para la elaboración de pinturas ecológicas que pueden servir como un reemplazo a las pinturas a base de hidrocarburos. La caseína se obtuvo a partir de cuatro tipos de leche, previo a su extracción se realizó la caracterización determinando sus propiedades fisicoquímicas, microbiológicas y posibles adulteraciones mediante la norma NTE INEN 9. Se determinó el punto isoeléctrico de la caseína mediante la formulación de soluciones ácidas, básicas y bioluminometría, el cual fue alrededor de 4.6, una vez determinada esta propiedad se extrajo la caseína en cada tipo de leche mediante un proceso de extracción sólido - líquido y acidificación. La pintura se preparó mediante distintas disoluciones de caseína y colorante, la cual se aplicó sobre distintas superficies para determinar cuál presento mejores propiedades de adherencia, resistencia al cambio climático, tiempo de secado y resistencia a sustancias acidas y básicas. Se determinó que la caseína que presenta mejores propiedades para la elaboración de pintura ecológica es la obtenida a partir leche descremada, debido a su bajo contenido de grasa. Palabras clave: Extracción solido-liquido, Caseína, Pintura-ecológica, Caracterización xiv TITLE: Extraction of casein from raw, pasteurized, semi-skimmed and skim cow's milk to produce ecological paints. Author: Pablo Andrés Guaraca Bedón Tutor: Washington Polivio Ruiz López Abstract Casein is a protein from milk that can be used for the production of glues and paints. Therefore, the aim is to determine which type of casein is the most suitable for the production of ecological paints that can serve as a replacement for hydrocarbon-based paints. The casein was obtained from four types of milk, prior to its extraction, it was characterized by determining its physicochemical and microbiological properties and possible adulterations according to the NTE INEN 9 standard. The isoelectric point of casein was determined through the formulation of acidic and basic solutions and bioluminometry, which was around 4.6. Once this property was determined, the casein was extracted from each type of milk through a solid-liquid extraction and acidification process. The paint was prepared using different solutions of casein and dye, which was applied on different surfaces to determine which had the best adhesion properties, resistance to climate change, drying time and resistance to acidic and basic substances. It was determined that the casein with the best properties for the production of ecological paint is the one obtained from skim milk, due to its low-fat content. Keywords: Solid-liquid extraction, Casein, Paint-ecological, Characterization TRANSLATION CERTIFICATION: I hereby certify this to be an accurate translation into English of the original document in the Spanish language. Quito, 08 February 2023. Signature and seal: _________________________ Lic. Andrea Rosero, Mg.MSc. ICN: 1713850111, Authorized Translator of the English/Spanish Language at Instituto Académico de Idiomas – UCE. SENESCYT – Registry Number MDT-3104-CCL-259518 1 Introducción El Ecuador se encuentra entre los 17 países considerados megabiodiversos a nivel mundial, con una amplia producción agrícola que se considera como una de las actividades económicas más esenciales en el desarrollo del país, diariamente se producen cerca de 5 millones de litros de leche. (MAGAP 2017) La leche es un líquido opaco ligeramente amarillo con un sabor y olor característico. En la mayoría de las empresas lácteas ecuatorianas recolectan leche cruda, que es obtenida del ordeño de vacas, a esta leche no se le realiza ningún tratamiento fisicoquímico, por lo que tiene una alta carga microbiana por lo cual en ese estado no es recomendable su consumo. Para la elaboración de los distintos productos lácteos, la leche cruda se somete a distintos procesos fisicoquímicos, entre ellos el más importante el cual reduce la carga microbiana a través de procesos térmicos de calentamiento hasta los 77 °C y posterior enfriamiento es la pasteurización, posterior a esto se pueden adicionar procesos secundarios en los que se utiliza sustancias como colorantes, vitaminas, edulcorantes y saborizantes, para mejorar la apariencia y el valor nutritivo de los productos. Para el aseguramiento de la calidad de los distintos productos lácteos se realizan análisis fisicoquímicos y microbiológicos, en los cuales se toman muestras de producto terminado de cada lote que es producido y en el caso de la leche cruda se reciben contramuestras de los distintos centros de acopio en el caso de que se presente el incumplimiento de la norma NTE INEN 9. Las contramuestras son muestras específicas y rotuladas de cada 2 proveedor de leche, se mantienen siempre a una temperatura de hasta 8°C y son utilizadas para análisis microbiológicos de cada proveedor. La caseína es una proteína presente en la leche, esta sustancia es esencial en el producto lácteo de la mayoría de los mamíferos, que se separa por medio de alcohol, ácidos diversos o sales. (Lanzarini,1907, pp.24-27). La cantidad obtenida de caseína varía en diversos animales esto principalmente por su alimentación y en el caso de las vacas por su raza. Además de encontrarse como un componente principal en la leche de los mamíferos se encuentra también en líquidos animales como la sangre de mujeres embarazadas, líquido muscular, tejidos celulares elásticos, yema de huevo y en el suero de la sangre. (Lanzarini, 1907 pp.24-27) La caseína tiene varias aplicaciones y se puede obtener mediante procesos de acidificación, entre sus aplicaciones más importantes se encuentra la elaboración de pintura y pegamento (Lanzarini 1907, pp.24-27) En el presente trabajo se elaboró pintura ecológica a partir de caseína obtenida de cuatro tipos de leche, aprovechando la materia prima sobrante de una industria láctea, a estas muestras de leche se les realizó ensayos fisicoquímicos, microbiológicos y de adulteración. Se busca determinar en base a las muestras de leche, que tipo de caseína nos ofrece una pintura ecológica que tenga propiedades similares a una pintura a base de petróleo y pueda usarse como sustituto, disminuyendo el uso de recursos petroleros por cambios más amigables con el planeta. 3 1. Marco teórico 1.1. Leche 1.1.1. Generalidades La leche es un líquido secretado por las glándulas mamarias de hembras de los distintos mamíferos tras el nacimiento de una cría, es un líquido de composición compleja que se presenta de un color blanquecino opaco (Alais, 2003, pp.35-38). La función natural de la leche es proveer los componentes necesarios para el crecimiento adecuado de las crías, cada tipo de leche es distinto en cada tipo de animal esto puede variar de acuerdo con su alimentación. 1.1.2. Industrias lácteas en el Ecuador La industria láctea en el Ecuador se ha visto en desarrollo desde alrededor del año 1900 donde se obtenía únicamente leche cruda, ya que el proceso de pasteurización se empezó a aplicar desde al año 1938, desde ese entonces la actividad productiva de la leche ha ido en crecimiento. Según la asociación de Ganaderos de la sierra y Oriente (AGSO) en el Ecuador se dedican cerca de 4 millones de hectáreas en la producción de leche, presentándose en su mayoría en la sierra. Es el medio de sustento de varios campesinos que residen en zonas altas en las cuales la actividad de siembra no es rentable (Real 2013). De todos los litros que se obtienen, basados en cifras de la AGSO se determinó que un 35% de la leche cruda es destinada para la alimentación de crías de ganado, un 25% para la elaboración de quesos artesanales y un 40% se dirige a la venta de las distintas 4 industrias lácteas para elaboración de productos para el consumo humano (Ruiz, 2007, pp.34-38) 1.1.3. Propiedades organolépticas de la Leche 1.1.3.1. Opacidad. La opacidad o la opalescencia es definida como una propiedad óptica de la materia en el cual un cuerpo o sustancia evita ser atravesado por la luz. En el caso de la leche esto se debe a los glóbulos de grasa que se encuentran suspendidos y también basándose en la caseína que se encuentra insoluble en la sustancia. (Chavallier,1854, pp.60-68). 1.1.3.2. Color. El color se define como una percepción visual, una interpretación de las longitudes de onda de luz emitida o reflejada por un cuerpo. En el caso de la leche esta se encuentra en un color blanquecino o ligeramente amarillento, esto depende netamente de la dieta de cada mamífero. La variación de colores puede atribuirse a la oxidación de lactosa en presencia de sales alcalinas o componentes minerales y nutricionales del mismo animal, en algunos casos la leche se ha presentado de un color azul o rojizo esto se debe a un tipo de hierba especifica denominada cola de caballo o Equisetum arvense (Lanzarini 1907,pp.35-38). La cola de caballo era utilizada como medicina natural dada su composición, en ella se encuentra minerales como el sílice, potasio, aluminio, óxido de hierro y manganeso, que la hacen muy útil en casos de caída de cabello o fragilidad de uñas. 5 Figura 1 Cola de caballo Nota: Tomada de 40 plantas medicinales (p.66), por Alfredo Ara Roldán Vida Natural 1.1.3.3. Sabor. Se define al sabor como la cualidad de una sustancia o cuerpo de ser percibida por el sentido del gusto, en el caso de la leche esta se presenta con un sabor dulce característico debido a la lactosa, esta característica puede diferenciarse en el reino animal dependiendo de su alimentación (Bolaños 1956, pp.69-76). 6 1.1.3.4. Olor. Se define al olor como una cualidad de una sustancia o cuerpo que puede ser percibida con el sentido del olfato, en el caso de la leche se aprecia un olor característico, esta se puede percibir de mejor manera en la acción del ordeño, posterior a esto su olor va disminuyendo. Esta propiedad es importante, ya que si se percibe un olor amargo inusual se debe a la acidificación de la leche y puede encontrarse echada a perder (Bolaños 1956, 69-76). 1.1.4. Composición proteínica de la leche Las proteínas presentes en la leche son polímeros de alfa aminoácidos, de manera general su estructura básica se encuentra formada por cadenas de aminoácidos unidos mediante un enlace péptido entre un grupo amino y carboxilo. Figura 2 Estructura de una proteína Nota: Tomada de tecnología de la Leche (p. 26) por Aurelio Revilla 7 Tabla 1 Aminoácidos presentes en las proteínas de leche Aminoácido Porcentaje %m/m Acido aspártico 7.40 Acido glutámico 23.90 Alanina 3.50 Arginina 3.70 Cistina 1.80 Fenilalanina 4.90 Glicina 2.00 Histidina 2.70 Isoleucina 6.50 Leucina 10.00 Listona 7.90 Metionina 2.50 Prolina 11.30 Serina 6.00 Tirosina 5.20 Treonina 4.70 Triptófano 1.40 Valina 7.00 Nota: Tomada de tecnología de la leche (p. 28) por Aurelio Revilla 8 1.1.4.1. Caseína. La caseína se define como la proteína fundamental de la leche, en los mamíferos esta constituye el 80% del contenido proteico. El restante se divide en las proteínas provenientes del suero de leche, la caseína tiene una variedad de aplicaciones porque fácilmente puede separarse de la leche mediante un proceso de acidificación, la cantidad de caseína presente en la leche varía de mamífero en mamífero y está influenciada directamente por la alimentación de cada especie (Lanzarini 1907, pp.27-29). Tabla 2 Compuestos nitrogenados en la leche Detalle Gramos en 1 kg de proteína Gramos en 1 litro de leche Proteína total 1.000 32.00 Caseína entera 780 25.00 Alfa caseína 312 10.00 Beta caseína 234 7.50 Gamma caseína 117 3.80 Diversas caseínas 117 3.70 Proteínas del Suero 170 5.40 Beta lactoglobulina 85 2.70 Alfa lactoglobulina 38 1.20 Globulinas 21 0.65 Nota: Tomada de tecnología de la Leche (p. 26) por Aurelio Revilla Alfa y Beta caseínas: Este tipo de caseínas contienen un ácido fosfórico ligado a un hidroxiaminoácido, es decir son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio, ninguna de estas es soluble en leche, sin embargo, al añadirse la gamma caseína a cada una de ellas se forma un complejo de caseína que es estabilizado en forma de micela. La alfa caseína se encuentra compuesta de 207 aminoácidos con un 9 peso molecular de alrededor de 25390 mientras que la beta cuenta con 209 aminoácidos. Gamma Caseína: Este tipo de caseína contiene un ácido fosfórico y carbohidratos, todos sus carbohidratos se encuentran dispuestos en una sola cara de superficie por lo que esta parte exterior es soluble en agua debido a los grupos polares que posee. Se encuentra formada con alrededor de 169 aminoácidos y con un peso molecular de 19000. Tabla 3 Componentes de la caseína Fracción Alfa caseína Beta caseína Gamma caseína Sigma caseína Nota: Tomada de tecnología de la Leche (p. 30) por Aurelio Revilla Porcentaje (%m/m) 45 – 63 19 - 28 3-7 1 10 Figura 3 Estructura primaria de la alfa caseína Nota: Tomada de ciencia de la leche (p. 139) por Charles Alais 11 Figura 4 Estructura primaria de la beta caseína Nota: Tomada de ciencia de la leche (p. 142) por Charles Alais 12 Figura 5 Estructura primaria de la gamma caseína Nota: Tomada de ciencia de la leche (p. 146) por Charles Alais 13 1.1.4.2. Proteínas del lactosuero. Este tipo de proteínas representan alrededor de un 20% del total de contenido proteínico en la leche, estas provienen de la fracción de suero que se encuentra en la leche líquida, una cualidad importante es que se mantienen en solución al llegar al punto isoeléctrico de la caseína donde esta se precipita en su totalidad. Su composición proteínica basada en la porción de suero se puede diferenciar de la siguiente manera. Lactoalbúminas: Este tipo de proteína se encuentra presente en la mayoría de las especies de mamíferos, su función es sintetizar la lactosa y a su vez esta proteína se sintetiza como respuesta a cambios hormonales cuando el proceso de la lactancia está en una fase madura. Se encuentra formada por una sola cadena polipeptídica de alrededor de 123 aminoácidos, con un peso molecular de 14200 aproximadamente. Es del tipo Holo proteína debido a que se encuentra formada solo por aminoácidos. Lactoglobulinas: Este tipo de proteína es la más abundante en el lactosuero ya que representa alrededor de un 50-55%. Una consideración particular es que este tipo de proteínas no se encuentran en la leche humana, forma parte de la capa de nata en la superficie de la leche cuando esta hierve. Se encuentra formada por una cadena de 162 aminoácidos y un peso molecular de alrededor de 18400. Adicionalmente es transportadora de ácidos grasos que ejercen su 14 función en el tubo digestivo del lactante, se encuentra en una concentración de 2 a 4 mg/ml. Inmunoglobulinas: Estas proteínas actúan como sistema de defensa ante la presencia de microorganismos, presentan actividad en especies donde la placenta no permite el paso de inmunoglobulinas, dado este caso se transmite una inmunidad pasiva desde la madre a sus crías encontrándose en una concentración de 0,4 a 1 mg/ml. Albúmina: Este tipo de proteína proveniente de la sangre cumple la función de transportar ácidos grasos libres. En el caso de la leche no se le atribuye nada en concreto esta se encuentra en una composición de alrededor de 0,4 mg/ml. Lactoferrina: Es una proteína fijadora de hierro al igual que las inmunoglobulinas y albuminas, la composición de esta proteína se encuentra casi residual. El mayor punto de presencia de las lactoferrinas es en la producción del líquido precursor de la leche después del proceso de parto (Miguel Calvo, 1983) Tabla 4 Cantidad de proteína en distintos tipos de leche Tipo de leche Leche de Mujer Leche de Vaca Leche de Cabra Leche de Oveja Nota: Tomada de la caseína Lanzarini 1907 (p. 22) Proteína 1.90% 3.60% 3.70% 6.1% 15 1.1.4.3. Carbohidratos en la leche. El carbohidrato de mayor importancia en la leche es la lactosa, la cual se encuentra formada por moléculas de glucosa y de galactosa. Su fórmula química se asemeja a la de la sacarosa 𝐶12 𝐻22 𝑂11 𝐻2 𝑂, pero debido a su estructura presenta propiedades diferentes a esta. (Revilla 1982, pp.142) Figura 6 Formula estructural de la lactosa Nota: Tomada de tecnología de la leche (p. 31) por Aurelio Revilla La Lactosa representa el 50% de los sólidos no grasos presentes en la leche, a pesar de tener una estructura semejante a la sacarosa esta es seis veces menos dulce y se encuentra en solución en el suero. Cuando la leche se expone a temperaturas superiores a los 100 °C se produce la descomposición de este la cual se manifiesta por un cambio de color en la leche tornándose de un color café claro. (Revilla,1982, pp.32) La lactosa es el factor principal de control de fermentación y maduración de los lácteos contribuyendo el valor nutritivo de la leche, esta puede reaccionar de manera química en procesos de hidrólisis, oxidación y reducción. Adicionalmente la lactosa se ve afectada por condiciones infecciosas de ubre y mastitis. 16 Problemas de salud: La intolerancia a la lactosa se debe a la ausencia de encima lactasa en los intestinos, ya que esta es la encargada de digerir la lactosa. Los síntomas de la carencia de lactasa se manifiestan de manera instantánea después de consumirla. 1.1.5. Composición fisicoquímica de la leche líquida La composición de leche líquida varia de mamífero en mamífero dependiendo del ciclo de lactancia en el cual se encuentre o de su alimentación, de manera general se puede distribuir su composición de la siguiente manera. Tabla 5 Composición de la leche de vaca por cada 100g Sustancia Agua Caseína y otras proteínas Grasas Sales Minerales Nota: Tomada de la caseína Lanzarini 1907 (p. 18) Composición 87.40% 3.504% 3.748% 0.750% 1.1.5.1.Componentes grasos en la leche líquida. La grasa láctea se sintetiza en las glándulas mamarias encontrándose en manera de emulsión o en suspensiones microscópicas, se encuentra rodeada de fosfolípidos que evitan que la grasa se aglutine y pueda separarse de la parte acuosa. El contenido graso de la leche dependerá de la dieta diaria del animal, así como de la raza a la que pertenezca. (Agudelo 2005). La grasa se encuentra compuesta principalmente por triglicéridos o esteres de ácidos grasos, con glicerol en un 98%, fosfolípidos de 0.50 a 1% y otras sustancias alrededor del 1 %. (Revilla,1982, pp.34) 17 Tabla 6 Composición de la grasa en la leche Detalle En 100 gramos de grasa Triglicéridos 97-98 gramos Diglicéridos 250-480 miligramos Monoglicéridos 16-38 miligramos Otros glicéridos 872-1318 miligramos Ácidos grasos libres 100-444 miligramos fosfolípidos 200-1000 miligramos Cerebrósidos 13-66 miligramos Esteroles 220-410 miligramos Carotenoides 700-900 microgramos Vitamina A 600-900 microgramos Vitamina D 1-2 microgramos Vitamina E 2400 microgramos Vitamina K 100 microgramos Nota: Tomada de tecnología de la Leche (p. 23) por Aurelio Revilla En 100 gramos de leche 342-346 gramos 7-35 miligramos 7-14 miligramos 28-35 microgramos 71-86 microgramos vestigios 7-175 microgramos vestigios Glicéridos: Se definen como compuestos formados a partir de la unión de uno, dos o tres ácidos grasos ya sean idénticos o diferentes. La cantidad de ácidos grasos saturados que se encuentran en la grasa es de alrededor del 64%, ácidos grasos no saturados 35% y el 1% restante representa a ácidos grasos no saturados que cuentan con dobles enlaces. Tabla 7 Principales ácidos grasos saturados que forman la grasa de leche Ácidos saturados Volátiles solubles Butírico Caproico Volátiles insolubles Caprílico Cáprico Láurico Nota: Tomada de tecnología de la Leche (p. 25) por Aurelio Revilla 𝐶3 𝐻7 𝐶𝑂𝑂𝐻 𝐶5 𝐻11 𝐶𝑂𝑂𝐻 𝐶7 𝐻15 𝐶𝑂𝑂𝐻 𝐶9 𝐻19 𝐶𝑂𝑂𝐻 𝐶11 𝐻23 𝐶𝑂𝑂𝐻 Tabla 8 Principales ácidos grasos no saturados que forman la grasa de leche Ácidos no Saturados Oleico Linoleico Linolénico Araquidónico Nota: Tomada de tecnología de la Leche (p. 26) por Aurelio Revilla 𝐶17 𝐻33 𝐶𝑂𝑂𝐻 𝐶17 𝐻31 𝐶𝑂𝑂𝐻 𝐶17 𝐻29 𝐶𝑂𝑂𝐻 𝐶19 𝐻31 𝐶𝑂𝑂𝐻 18 De todos los ácidos grasos el butírico se denomina como el de mayor importancia, ya que es el responsable del sabor característico de la crema, mientras que el sabor a rancio se debe a la oxidación de ácidos insaturados. (Revilla, 1982, pp.26) 1.1.5.2. Componentes minerales en la leche líquida. En menor cantidad, pero aun presentes existen varios componentes minerales. En la leche de vaca líquida se pueden apreciar de la siguiente manera. Tabla 9 Composición mineral de la leche de vaca por cada mg/100ml de leche Sustancia Calcio Sodio Potasio Cloro Fosforo Magnesio Nota: Tomada de la caseína Lanzarini 1907 (p. 21) Composición (mg/100ml) 120-140 45-70 140-175 100-110 78-100 10-15 Cuando la leche es sometida a temperaturas de alrededor de los 550°C deja un residuo de tonalidad blanquecina que representa alrededor del 0.6 al 0.9 % de la leche, esto varía de animal en animal. Macroelementos: En este conjunto se encuentran los elementos metálicos que están en mayor cantidad, en el caso de la leche se encuentra el calcio, fósforo, magnesio, cloro, potasio, sodio. Microelementos: En este conjunto se encuentran el hierro, cobre, aluminio, zinc, manganeso, cobalto, yodo, boro, plomo, arsénico, cromo, selenio. Estos elementos se encuentran en cantidades mínimas que casi no pueden ser cuantificadas con exactitud, salvo en análisis externos especializados. 19 El contenido de cada elemento está directamente relacionado por factores genéticos y condiciones alimenticias de cada animal, si las condiciones alimenticias son desfavorables estos minerales se obtienen de reservas corporales tal como sucede con el calcio y el fósforo. 1.1.6. Componentes menores en la Leche Además de las composiciones antes mencionadas, existen elementos en la leche que se encuentran en una mínima cantidad, pero que aun así se encuentran presentes. 1.1.6.1. Gases presentes en la leche. Estos pueden representar cerca de un 10% de su propio volumen, se puede mencionar el dióxido de carbono representando de un 5 a 10%, nitrógeno de 2 a 3 % y oxígeno de 0.5 a 1%. Con el paso del tiempo el contenido de gases va disminuyendo hasta que se estabiliza en cerca de un 4% de su volumen, cabe destacar que un ordeño manual aumenta el contenido de gases. (Revilla, 1982, pp.21-23) 1.1.6.2. Ácidos orgánicos en la leche. El principal ácido orgánico de la leche es el cítrico, siendo un componente normal en la leche que le da cierta sensación de acidez. Este se encuentra entre 1.80 y 2.45 gramos por cada kilogramo de leche, la importancia de este ácido se basa en que es la materia prima para la producción de compuestos aromáticos durante la fermentación láctica. Los ácidos como el láctico, butírico y los antes mencionados son productos metabólicos que se originan durante la fermentación láctica (Revilla, 1982 pp.21-23) 20 1.1.6.3. Fosfolípidos en la leche. La composición de fosfolípidos en la leche se distribuye con un 30% de lecitinas, 45% de cefalinas y 25% de esfingomielinas. El fosfolípido de mayor importancia es la lecitina, ya que funciona como un agente emulsionante. (Revilla, 1982 pp.21-23) 1.1.6.4. Esteroles en la leche. En el apartado de esteroles el de mayor importancia y predominante en la leche es el colesterol, representa el 3% de la grasa contenida en ella. Cerca del 82% del colesterol se encuentra en la grasa y el 18% restante se encuentra asociado con la proteína, especialmente con la lecitina. (Revilla,1982 pp.21-23) 1.1.6.5. Pigmentos en la leche. Principalmente se encuentra el caroteno, que se presenta de color amarillo y es soluble en grasas siendo además el precursor de la vitamina A. Esto a su vez se encuentra relacionado con la alimentación de cada animal y de su raza. Algunas vacas lecheras son más aptas para producir niveles más altos de caroteno. (Revilla, 1982 pp.21-23) 1.1.6.6. Enzimas presentes en la leche. Las enzimas en la leche son secretadas por las células, estas estimulan las reacciones químicas sin formar parte del compuesto resultante. Son denominados además como catalizadores orgánicos debido a su actividad que se encuentra directamente relacionada con el pH y temperatura de la sustancia. Las enzimas juegan un rol importante en la leche como son la degradación del producto que se debe a la lipasa causante de la rancidez, otras como la fosfatasa controlan el calentamiento de la leche en el proceso de pasteurización y otras se encargan de la acción bactericida. (Revilla, 1982 pp.21-23) 21 Lacto peroxidasa: Esta enzima es usada para verificar la pasteurización a 80°C por 1 a 2 min, esto debido a que la enzima se destruye a esa temperatura. Lipasa: Esta enzima hidroliza las grasas de la leche en glicerol, ácidos grasos y por ende esta ocasiona la rancidez. La homogenización de la leche activa la lipasa, pero a través de un tratamiento térmico a 55°C por 30 min la inactiva. Xantinoxidasa: Esta enzima se encuentra ausente en la leche humana, por lo cual es utilizada para diferenciar los tipos de leche. Reductasa: Esta enzima no es de origen lácteo, es producida por microorganismos que decoloran el azul de metileno. De acuerdo con el tiempo que tarda la decoloración se puede determinar si una leche es de buena calidad. Fosfatasa: Esta enzima se encuentra formada por la fosfatasa alcalina y se inactiva por el proceso de pasteurización. Es usada como un control para asegurar si la pasteurización de la leche se realizó de manera efectiva. Lisozima: Esta enzima tiene propiedades bacteriostáticas, en varias especies su función es la protección del producto lácteo y actúa hidrolizando el polisacárido que forma la pared celular de ciertas bacterias. 22 1.1.6.7. Vitaminas. Las vitaminas son sustancias orgánicas necesarias para la vida, aunque en pequeñas cantidades estas regulan la utilización de carbohidratos, grasas, proteínas y minerales, su ausencia puede causar trastornos y daños en la salud. Las vitaminas presentes en la leche se encuentran agrupadas en grupos liposolubles e hidrosolubles; entre las liposolubles se encuentran las vitaminas A, D, E y K y entre las hidrosolubles las vitaminas del complejo B y la vitamina C. El calentamiento de la leche puede disminuir el valor nutritivo, así como el cambio en vitaminas y aminoácidos. La ebullición casera o el hervido disminuyen drásticamente el valor vitamínico de la leche. (Revilla 1978 pp.28-32) Tabla 10 Vitaminas en 100 g de leche bajo diferentes tratamientos térmicos Detalle Cruda Pasteurizada 72°C Esterilizada 130°C Evaporada Condensada En polvo Humana Vitamina A 150 150 150 389 278 1110 180 Vitamina D 2 2 2 5 5 15 1.5 Vitamina E 96 - - 280 - 750 900 Timina 46 42 25 56 110 310 15 Riboflavina 175 175 175 380 380 1150 40 Panoténico 360 350 350 700 870 2700 200 Nicotenico 100 100 100 200 210 760 170 Biotina 1.5 1.5 1.5 3.4 3.4 10 0.4 Vitamina B1 35 35 18 35 88 286 10 Vitamina B2 0.3 0.3 0 0.1 0.53 1.8 0.1 2000 4300 13000 4000 Vitamina C 2000 1800 1000 Nota: Tomada de Tecnología de la Leche (p. 39) por Aurelio Revilla 23 Tabla 11 Perdida de vitaminas en leche bajo diferentes tratamientos térmicos Detalle Pasteurizada Esterilizada 72°C Tiamina 7 30-50 Riboflavina 0 <10 A Panotenico 0 <10 Biotina 0 <10 Vitamina B4 0 <50 Vitamina B 12 0 90-100 Vitamina C 10 50 Nota: Tomada de Tecnología de la Leche (p. 40) por Aurelio Revilla Evaporada Condensada En polvo 20-60 0 <10 10-15 <10 70-90 60 10-20 <10 <10 10-15 10-15 30-40 15 10-50 10-15 <10 10-15 0 20-35 20 1.1.7. Tipos de Leche de vaca El presente trabajo se enfoca en caseína proveniente de leche de vaca, para lo cual se procederá a la caracterización de 4 tipos de leche en concreto, las cuales son leche cruda, pasteurizada, semi descremada y descremada. 24 1.1.7.1. Leche cruda. Se denomina a la leche cruda como aquella que no ha sido sometida a ningún tipo de calentamiento, es decir que su composición no se ha visto afectada desde la práctica del ordeño, su temperatura no ha superado los 40°C y esta únicamente puede disminuir para el enfriamiento y su conservación. (INEN 9 -2012) 1.1.7.2. Leche pasteurizada. La leche pasteurizada es aquella que ha sido sometida a un tratamiento térmico especifico y por un periodo de tiempo determinado, para lograr la destrucción total de organismos patógenos sin alterar de forma considerable su composición ni valor alimenticio. La pasteurización no corrige los defectos de la leche, solamente conserva sus propiedades naturales mediante la destrucción del 90 al 99% de microorganismos. La eficiencia de dicha destrucción depende del número y tipo de microorganismos presentes en la leche cruda. (Revilla 1982 pp.43) Pasteurización Lenta: Denominada también como discontinua, por retención o sostenimiento, esta sucede cuando se calienta la leche a 62.8°C durante un periodo de 30 minutos como mínimo con un agitamiento constante. Este proceso no modifica de manera considerable las propiedades de la leche, su efecto germicida se encuentra en el 95% y no se recomienda cuando la leche tiene un componente bacterial alto. (Revilla 1982, pp.50) Pasteurización Rápida: Conocida también como pasteurización continua, relámpago o TATC (Temperatura alta y tiempo corto) consiste en calentar la leche a los 72-77 °C durante 15 segundos como mínimo. La ventaja de 25 este proceso es su capacidad de pasteurización que puede llegar a ser de hasta 15000 litros de leche, la eficiencia germicida en este proceso es de alrededor del 99,5%. (Revilla 1982, pp.45) 1.1.7.3. Leche semi descremada. Se define como la leche a la cual se le ha extraído cerca del 50% de su material graso. (Revilla 1982 pp.10-13) 1.1.7.4. Leche descremada. Se define como aquella leche que contiene alrededor del 0.5% de grasa o menos, también es conocida como leche magra, aunque en algunos países se le conoce a la leche magra como aquella que contiene del 2 al 3 % de grasa. (Revilla,1982, p.14) 1.1.7.5. Leche estandarizada. Se define como aquella cuyo porcentaje de grasa ha sido alterado, pudiendo ser mayor o menor al que se tenía originalmente. Usualmente se entiende por estandarizada a aquella cuyo contenido graso se ha ajustado mínimo a 3%. (Revilla 1982, p.14) 1.1.7.6. Leche reconstituida. Es el resultado de mezclar leche entera en polvo con agua potable o leche descremada en polvo, en tal composición que se asemeje a la normal de la leche. (Revilla 1982 p.14) 1.1.7.7. Leche recombinada. Es el producto que se resulta de mezclar leche reconstituida con leche entera. (Revilla 1982 pp.14) 1.1.7.8. Leche compuesta. Se define como la leche a la cual se le han agregado insumos para darle un sabor determinado, generalmente saborizantes y fortificantes. (Revilla 1982, p.11) 26 1.1.7.9. Leche ultra pasteurizada. Se define como aquella que ha sido sometida a tratamientos térmicos o mecánicos, cambiando ciertas propiedades físicas para prolongar la estabilidad de la emulsión. (Revilla 1982 p.14) 1.1.7.10. Leche esterilizada. Este tipo de leche ha sido sometida a tratamientos térmicos específicos y tiempos determinados, para realizar una destrucción total de microorganismos sin afectar su valor alimenticio. (Revilla 1982 p.14) 1.1.7.11. Leche Evaporada. Es el producto que se obtiene de la leche entera o descremada, a la cual se le ha extraído gran parte del agua y se le ha agregado cerca del 40 al 45% de azúcar de caña (Revilla 1982 p.14) 1.2. Ensayos de calidad en muestras de leche 1.2.1. Norma Inen NTE 9 La presente norma establece los requisitos que debe cumplir la leche cruda de vaca previo a su procesamiento, se denomina a la leche cruda a aquella que no ha sufrido un tratamiento térmico, únicamente un enfriamiento para su conservación sin presentar una modificación en su composición (INEN 9:2012). En su mayoría los análisis realizados en el trabajo de titulación se basaron en los procedimientos presentes en la norma NTE Inen 9, sin embargo, por la facilidad de equipos algunos de los análisis se basaron en el principio de la norma, pero con un procedimiento distinto. 27 1.2.2. Requisitos organolépticos 1.2.2.1. Color. Debe presentarse de un tono blanco opalescente o ligeramente amarillento. 1.2.2.2. Olor. Debe ser suave, lácteo característico y libre de olores extraños. 1.2.2.3. Aspecto. Debe presentarse de manera homogénea, libre de materias extrañas. 1.2.3. Requisitos físicos y químicos 1.2.3.1. Densidad relativa. La densidad se define como la cantidad de materia que ocupa un determinado volumen de una sustancia (Ralph 2002). Mediante los ensayos de densidad se puede analizar en el caso de los líquidos si estos han sido adulterados de alguna manera, al ser la leche un 95% de agua su valor de densidad será cercano al de esta sustancia. Este procedimiento se basa en la norma NTE Inen 11(Ver anexo 9), determinación de densidad relativa en la leche, el método se basa en el uso de un densímetro graduado de manera adecuada y una probeta que permitirá el movimiento de este para la lectura de su densidad. El lactodensímetro es un instrumento utilizado para medir la densidad de la leche, es un arcómetro graduado mediante el cual también se puede determinar la temperatura a la cual se encuentra el producto lácteo, realizando una ligera corrección. La densidad estándar de la leche oscila entre 1.030 y 1.033 g/ml. (Don 2008) 28 Cálculo de la densidad relativa Dada la corrección que se debe realizar de acuerdo con la densidad aparente obtenida, se usa la siguiente ecuación para determinar la densidad relativa 20/20°C. 𝑑20 = 𝑑 + 0,0002 (𝑡 − 20) 𝑑20 : 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑎 (1) 20 °𝐶 20 𝑑: 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎𝑝𝑎𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎 𝑡 °𝐶 𝑡: 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 En la norma se menciona además el método de determinación de densidad por medio de picnómetro el cual se utiliza mayoritariamente para muestras de leche que ha sido reconstituida, este método no será aplicado en este trabajo de titulación. 1.2.3.2. Material Graso. El contenido de grasa se expresó como porcentaje en masa de sustancia, mediante el método gerber o el método Rose-Gottlieb. Siguiendo el procedimiento establecido en la norma NTE Inen 12 (Ver anexo 9) Método gerber Este procedimiento se basa en separar mediante acidificación y centrifugación la materia grasa contenida en el producto analizado, esto mediante la lectura directa de un butirómetro estandarizado (Norma NTE Inen 12). 29 Un butirómetro Gerber es un instrumento de vidrio graduado, utilizado específicamente para determinar el contenido graso de sustancias, existen distintos tipos de butirómetros que se diferencian de acuerdo con el producto que se desea analizar. Este proceso utiliza ácido sulfúrico concentrado que es un compuesto químico muy corrosivo y peligroso, su fórmula química es 𝐻2 𝑆𝑂4 (Nothomb 2007, p.58). La función del ácido es disolver completamente la proteína en la muestra de leche mientras que el alcohol amílico disuelve los lípidos presentes en la misma, en conjunto con el proceso de centrifugación separa la muestra en dos fases una con el contenido graso y otra con el restante de elementos en la leche. 1.2.3.3. Acidez titulable como ácido láctico. La acidez en la muestra de leche se expresó como contenido de ácido láctico, mediante un proceso de titulación con soluciones de hidróxido de sodio y fenolftaleína. Siguiendo el principio de la norma Inen 13 (Ver Anexo 9) Cálculo de la acidez titulable 𝐴 = 0,090 𝑉∗𝑁 ∗ 100 𝑚1 − 𝑚 (2) 𝐴: 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑏𝑙𝑒 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑒𝑛 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑙á𝑐𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑉: 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑢𝑡𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑁: 𝑁𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑚: 𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑎𝑧 𝑣𝑎𝑐í𝑜 𝑒𝑛 𝑔 𝑚1: 𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑎𝑧 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑒𝑛 𝑔 30 1.2.3.4. Sólidos totales, sólidos no grasos y cenizas. Los sólidos totales se definen como el producto resultante de la desecación de la leche mediante procedimientos normalizados. Para determinar estas propiedades nos basamos en el principio de la norma NTE Inen 14, específicamente en el apartado Y.1. (Ver anexo 9) Cálculo de sólidos totales 𝑆 = 250(𝑑20 − 1) + 1,22𝐺 + 0,72 (3) 𝑆: 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑20 : 𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑅𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 20/20 𝐺: 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑎 Las cenizas de la leche se definen como el producto resultante de la incineración de solidos totales mediante procedimientos normalizados. Cálculo de cenizas 𝐶= 𝑚3 − 𝑚 ∗ 100 𝑚2 − 𝑚 (4) 𝐶: 𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 %𝑚/𝑚 𝑚: 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑐á𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎 𝑣𝑎𝑐í𝑎 , 𝑔 𝑚2 : 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑐á𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑒𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 , 𝑔 𝑚3 : 𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑐á𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 , 𝑔 31 1.2.3.5. Punto de congelación. Para determinar el punto de congelación se utilizó el procedimiento establecido en la norma NTE Inen 15, que consiste en colocar una muestra de leche fresca en un Crioscopio determinando su punto de congelación. (Ver anexo 9). El Crioscopio es un instrumento utilizado a nivel de laboratorio que mide el punto de congelación de una solución, la muestra es enfriada por debajo de su punto de congelación y posteriormente cristalizada (Muños,2019, p.34) Figura 7 Esquema general de un crioscopio Nota: Tomada de la norma NTE INEN 15 (p. 3) 32 1.2.3.6. Proteínas. A partir de la norma NTE Inen 16, nos basamos en el principio de obtención de nitrógeno mediante el método de Kjeldahl, para posteriormente determinar la proteína presente en la muestra de leche. Dados los avances tecnológicos la proteína se puede determinar mediante la utilización de distintos equipos, el más efectivo y rápido es la tecnología FTIR denominada espectroscopia infrarroja por transformadas de Fourier. Esta tecnología se encuentra presente en el equipo Milkoscan, que va a ser utilizado en este proyecto de titulación. (Ver anexo 9) 1.2.3.7. Ensayo de reductasa en la muestra de leche. Con base en la norma NTE Inen 18, utilizamos azul de metileno para identificar el grado de desarrollo microbiano en una muestra de leche, este reactivo decolora las enzimas de las células y actúa reduciendo los compuestos orgánicos. A partir del tiempo que se tarda en reducir dichos compuestos determinaremos si la muestra es de buena calidad o no. (Ver anexo 9) El azul de metileno es un colorante orgánico de fórmula química 𝐶16 𝐻18 𝑁3 𝐶𝑙1 𝑆1 , utilizado principalmente en los ensayos de reductasa para determinar la calidad de alimentos (Muños,2019, p.28) 1.2.4. Ensayos cualitativos en muestras de leche Los ensayos cualitativos en muestras de leche se basan en la determinación de distintas adulteraciones, utilizando procedimientos descritos en la norma NTE Inen 1500, esta norma aplica ensayos para la detección de sustancias como formaldehídos, peróxido de hidrogeno, hipocloritos, cloraminas, neutralizantes alcalinos (óxidos, hidróxidos, 33 carbonatos y bicarbonatos), componentes de amonio, urea, jabones, detergentes, almidones, sacarosa y gelatina. (Norma NTE Inen 1500). (Ver anexo 9) Se define a la adulteración de leche como el acto de privar parcial o totalmente sus elementos útiles y característicos reemplazándolos por otros inertes o extraños de cualquier naturaleza para disimular u ocultar alteraciones. Para este proyecto de titulación nos centraremos en los análisis de peróxido de hidrogeno, detección de hipocloritos – cloraminas, Neutralizantes 1.2.4.1. Método para la detección de peróxido de hidrogeno. De acuerdo con la norma NTE Inen 1500, para el análisis de detección de peróxidos en leche se presentan dos procedimientos, el método Arnold y Mentzer que consiste en una solución de óxido de vanadio en presencia de ácido sulfúrico que reacciona con peróxido de hidrogeno y arroja un color rojo o rosado y el método de Yoduro de potasio – almidón, que se usara para la detección de peróxidos en este proyecto de titulación El método de Yoduro de potasio y almidón se basa en que la catalasa natural de la leche destruye el peróxido añadido y el yoduro de potasio reacciona con el peróxido de hidrógeno dando una coloración azul (Norma NTE Inen 1500). Kit de Detección de peróxidos de hidrogeno El kit utilizado para este proyecto de titulación se basa en proceso de detección a partir del método de Yoduro de potasio - almidón, este consta de una tirilla que se aplica directamente sobre la muestra y se observa de manera inmediata si existe la presencia de peróxidos. La cantidad de peróxidos se determinará a partir de la tonalidad que tome la tirilla. 34 1.2.4.2. Método de detección de hipocloritos y cloraminas. Este método se basa en determinar la presencia de Hipocloritos 𝐶𝐼𝑂 − o Cloraminas (𝑁𝐻2 𝐶𝐿) por medio de la acción de ácido clorhídrico y yoduro de potasio. Mediante esta reacción se forma el cloro libre en el cual se observa un cambio de coloración dependiendo de la concentración que tenga la muestra a analizar. (Norma NTE Inen 1500) Kit de detección de hipocloritos y cloraminas El kit de detección utilizado para este proyecto de titulación se basa en una tirilla que contiene los reactivos utilizados en el método de detección de hipocloritos y cloraminas, esta tirilla es de aplicación directa a la muestra de leche y se puede leer el resultado después de 1 min, la concentración de cloruros dependerá de la tonalidad que tome la tirilla. 1.2.4.3. Método para la detección de neutralizantes alcalinos. Este método se basa en que existen diversas sustancias alcalinas que neutralizan el ácido láctico desarrollado por la fermentación, pudiéndose alterar los valores de las pruebas de acides y pH en ensayos de calidad. (Norma NTE Inen 1500) Prueba de ácido rosólico El ácido Rosólico es un indicador de PH con un rango de viraje de 6.8 a 8.0, esta prueba nos permite detectar la presencia de hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos de sodio que se pueden añadir a la leche cruda. 35 1.2.4.4. Método para la detección de almidones y sacarosa. Para la detección de almidones se utilizará el reactivo de lugol que tiene una base yodo - yoduro, este en contacto con la muestra de leche a analizar se tornara de un color azul oscuro en el caso de presentarse positivo para esa adulteración. 1.2.4.5. Prueba de estabilidad de proteína. La prueba de estabilidad de proteína o también denominada prueba de alcohol se basa en observar si la muestra de leche fresca se coagulara al entrar en contacto con una cantidad de alcohol al 75%. 1.2.4.6. Prueba de detección de sacarosa. Para la prueba de sacarosa se utilizará el método Seliwanoff modificado, se basa en que la fructosa del azúcar (sacarosa) reacciona con resorcinol en ácido clorhídrico y se torna de un color rojo. (Norma NTE Inen 1500). El resorcinol es un compuesto orgánico de formula 𝐶6 𝐻4 ligeramente ácido siendo un reductor leve utilizado en el método Seliwanoff para determinar sacarosa en muestras de leche (Maguin 1925, p.45). 1.2.4.7. Prueba de adulteración de suero de leche. De acuerdo con la norma NTE Inen 2401, este método se basa en la determinación de glicomacropéptidos (GMP) en las muestras de leche, mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Los glicomacropéptidos son péptidos específicos que se liberan cuando la encima renina entra en contacto con la muestra de leche, más específicamente sobre la Kappa caseína durante la producción de queso. Para este proyecto de titulación se utilizará un kit de detección de suero el cual cumple con el principio de la norma NTE Inen 2401. (Ver anexo 9) 36 Kit de detección de adulteración de suero El kit de detección de adulteración de suero se basa en la tecnología inmunocromatográfica de oro coloidal, que es la misma utilizada en las pruebas de SARS cov 19, esta tecnología detecta adulteraciones de manera rápida y confiable. Figura 8 Diagrama de interpretación de prueba de adulteración de suero Nota: Tomada de manual de uso de kit de adulteración de suero 37 1.2.4.8. Residuos de medicamentos veterinarios. Para estos análisis principalmente se basan en tres tipos de residuos que pueden encontrarse en animales que han pasado por un tratamiento médico o han consumido alimentos que alteran de una u otra forma el producto de la leche, estos son antibióticos, aminoglucósidos y aflatoxinas. Estos residuos de medicamentos al igual que el análisis de adulteración de suero se basan en la tecnología de inmunocromatográfica de oro coloidal Tipos de antibióticos analizados en la prueba de residuos Los antibióticos son medicamentos que combaten infecciones bacterianas, esta prueba se realiza como control de calidad para determinar si el producto se ha obtenido de animales que presentan problemas de salud y se encuentran bajo tratamiento veterinario. Betalactámicos Este tipo de antibióticos presentan un anillo B-lactamico en su estructura molecular, son antibióticos de amplio espectro utilizados para microorganismos grampositivos y gramnegativos. Actúan destruyendo la pared de la membrana celular eliminando la infección bacteriana Sulfonamidas Este tipo de antibióticos contiene en su estructura molecular el elemento sulfonamida, actúan inhibiendo la pared celular y generalmente se utilizan en conjunto con antibióticos betalactámicos Tetraciclinas 38 Este tipo de antibióticos presenta en su estructura celular un núcleo tetracíclico, tienen una acción directa en el ADN de réplica de proteínas en las bacterias. Utilizado especialmente en microorganismos anaerobios Procedimiento kit de adulteración de antibióticos El kit de detección de antibióticos entrega resultados confiables en 10 min, de manera inicial se colocan 200 𝜇𝐿 de la muestra de leche directo en el pocillo reactivo el cual se coloca en una incubadora por un tiempo de 3 min, posteriormente se coloca la tirilla indicadora por 6 min. Finalizando este tiempo se da lectura a la tirilla. Figura 9 Diagrama de interpretación de prueba de antibióticos Nota: Tomada de manual de uso de kit de antibióticos 39 Tipos de aminoglucósidos analizados en la prueba de aminos Los aminoglucósidos son fuertes antibióticos que actúan directamente sobre la subunidad 50S desde los ribosomas que impiden su replicación a través de proteínas, evitando que la bacteria continue replicándose. Gentamicina Se le considera un antibiótico de amplio espectro y acción bactericida en infecciones causadas por bacilos gramnegativos. Neomicina y estreptomicina Este tipo de antibióticos están asociados a bacterias gran negativas, estreptococos y diplococos. Generalmente de acción tópica son los más utilizados en el sector ganadero. Figura 10 Diagrama de interpretación de prueba de aminoglucósidos Nota: Tomada de manual de uso de kit de aminoglucósidos 40 Prueba de aflatoxinas Las aflatoxinas se definen como toxinas que se encuentran presentes en alimentos como son maíz, hongos, etc. La presencia de esta toxina puede afectar al sistema nervioso e hígado, puede ser asociada también con un daño hepático. Figura 11 Diagrama de interpretación de prueba de aflatoxinas Nota: Tomada de manual de uso de kit de Aflatoxinas Las pruebas descritas en el apartado anterior serán aplicadas en el proceso de caracterización de las distintas muestras de leche previa a su extracción de caseína, a su vez se analizarán los resultados con base en los valores que se encuentran en la tabla de requisitos fisicoquímicos de la norma NTE Inen 9. 41 Tabla 12 Requisitos fisicoquímicos de la leche Cruda Requisitos Unidad Densidad Relativa A 15°C A 20°C Materia grasa % (fracción de masa) Acidez titulable como % (fracción de ácido láctico masa) Solidos totales Solidos no grasos Cenizas Punto de congelación Proteínas Ensayo de reductasa Reacción de estabilidad proteica (Prueba del Alcohol) % (fracción de masa) % (fracción de masa) % (fracción de masa) °C °H % (fracción de masa) Min 1.029 1.028 Max 1.033 1.032 Método de ensayo NTE INEN 11 3.0 - NTE INEN 12 0.13 0.17 NTE INEN 13 11.2 - NTE INEN 14 8.2 - - 0.65 - NTE INEN 14 -0.536 -0.555 2.9 -0-512 -0.530 - NTE INEN 15 3 - NTE INEN 018 h Para la leche destinada a la pasteurización: No se coagulará por la adición de un volumen igual de alcohol neutro de 68% en peso o 75% en volumen, para la destinada a ultrafiltración esta no coagulará con alcohol neutro al 78% en volumen Negativo - NTE INEN 16 NTE INEN 1500 NTE INEN 1500 Presencia de conservantes - Negativo - NTE INEN 1500 - Negativo - NTE INEN 1500 - Negativo - NTE INEN 1500 Ug/l Negativo - MRL, establecidos en el CODEX alimentarius NTE INEN 2401 Los establecidos en el compendio de métodos de análisis identificados Presencia de neutralizantes Presencia de adulterantes Grasas vegetales Suero de leche Residuos de medicamentos Veterinarios Nota: Tomada de Norma NTE Inen 9: 2012 Quinta revisión 1.2.5. Requisitos microbiológicos en leche Cruda Se definen como una serie de análisis que s-e centran en determinar si una materia prima o producto terminado presenta microorganismos que pueden afectar su integridad y calidad, para este proyecto técnico se realizaran ensayos de e coli, microorganismos aerobios, enterobacterias, mohos y levaduras. 42 Para determinar microorganismos en productos lácteos se utilizarán placas Petri film 3M que son placas que ya cuentan con condiciones ambientales para un crecimiento microbiano especifico. 1.2.5.1. E. coli. La Escherichia coli es una bacteria que se encuentra principalmente en los intestinos de los animales, esta pertenece a la familia de las entero bacterias presentándose con una forma cilíndrica alargada. Son resistentes a antibióticos y se presentan con una gran capacidad de adaptación desarrollándose en temperaturas entre 35°C y 43°C (Sabini 2012).Perteneciente al grupo de los coliformes fecales capaz de fermentar lactosa a 44 °C con producción de gas además es capaz de producir indol a partir de triptófano, reacciona positivamente a la prueba de rojo de metilo (Norma Nte Inen 1529-8) 1.2.5.2. Microorganismos aerobios. Se definen a los organismos aerobios a aquellos que requieren de oxígeno para desarrollarse y vivir (Sabini 2012, p56) 1.2.5.3. Enterobacterias. Pertenecientes a la familia de las bacterias gramnegativas, generalmente se originan en la flora intestinal de los animales. En su mayoría son anaerobios facultativos que utilizan oxígeno para su metabolismo si este se encuentra disponible. 1.2.5.4. Mohos y levaduras. Ambos se definen como hongos, en el caso de los mohos crecen en filamentos multicelulares mientras que las levaduras se desarrollan como una sola célula. Método de detección de microorganismos 43 Para el recuento de microorganismos en las muestras de leche nos basaremos en la norma NTE Inen 1529-8, utilizando el método de agua peptonada libre de indol como medio. de cultivo. (Ver anexo 9) 1.2.5.5. Recuento de células somáticas. La prueba realizada nos permite identificar la concentración de células somáticas en el ganado, ayuda en la identificación de posibles vacas con mastitis o si se encuentran en una fase de mastitis crónica. De acuerdo con su conteo podremos verificar si el ganado se encuentra en un rango de probabilidad de mastitis entre mínima o significativa. Para este recuento de células al igual que análisis anteriores se utilizará un kit de detección. Kit de detección somaticell CCS Este kit fue desarrollado para determinar el recuento de células somáticas directamente en una muestra de leche cruda, presenta una lectura de 50000 hasta 2 millones de células somáticas en la leche (Manual de uso kit Somaticell) Tabla 13 Requisitos microbiológicos de la leche cruda Requisito Recuento de microorganismos aerobios mesófilos REP UFC/cm3 Límite máximo 1.5 x10 ^6 Método de ensayo NTE INEN 1529-5 Recuento de células somáticas/cm3 7.0X10 ^5 AQAC-978.26 Nota: Tomada de Norma NTE Inen 9: 2012 Quinta revisión 1.3. Pintura Se define a la pintura como una sustancia que puede encontrarse en estado líquido o semi líquido, puede aplicarse a una superficie en capas delgadas y al cabo de un tiempo estas 44 capas se vuelven películas sólidas adheridas a la superficie otorgándole propiedades de recubrimiento o decoración. La pintura se origina al mezclar pigmentos con un líquido que sirve de vehículo para el color, existen muchos elementos que contribuyen a un mayor o menor grado de facilidad con que se manipula la pintura uno de ellos es la naturaleza de la superficie o la base en la que se aplica. (Ralph Mayer, 1981, p.104) 1.3.1. Pintura a partir de caseína La cuajada de la leche se ha empleado como aglutinante o adhesivo desde tiempos antiguos, pero solo en épocas modernas se ha podido disponer fácilmente de este producto, las caseínas comerciales usualmente se obtienen por tres métodos caseína siendo auto – agriada, acida y de cuajo. (Ralph Mayer, 1981, p.76) Las caseínas comerciales más corrientes son las caseínas ácidas que se han elaborado a partir de ácido clorhídrico, este método será aplicado en este proyecto de titulación, adicionalmente para que el producto final tenga una calidad impecable se menciona que se debe quitar todo vestigio de crema o grasa. Una de las desventajas de la caseína es que se deteriora de manera imprevisible y más si se queda expuesta al aire, si esta caseína se mantiene guardada en frascos y con refrigeración adecuada esta puede permaneces inalterada durante tres o cuatro meses. (Ralph Mayer, 1981, p.76) La caseína se presenta como un medio inflexible y quebradizo en medios que presentan mucha flexión por lo cual no es recomendable usarlo sobre lienzos. Los soportes más 45 tradicionales para pinturas de caseína son superficies rígidas como el concreto donde no existe flexión, este tipo de pintura se puede repintar. (Ralph Mayer, 1981, p.79) 1.3.2. Método de extracción de caseína La caseína constituye el 80% de la proteína en la leche de vaca, su extracción se realiza mediante un proceso de acidificación con un ácido fuerte y su posterior filtración separándose del suero de leche. Para una correcta separación de la fase de caseína y suero la solución de leche debe llegar el punto isoeléctrico de la caseína. 46 1.3.2.1. Punto isoeléctrico de la caseína. Tanto en las proteínas como aminoácidos sus cargas pueden ser neutralizadas para que su carga neta sea igual a cero, este proceso se basa en modificar el pH del medio en el que se encuentren las moléculas. Si en una mezcla de proteínas alcanza su punto isoeléctrico esta forma un precipitado, la composición química de cada proteína se caracteriza por presentar distintos grupos ionizables que se neutralizan a un distintos pH. En el caso de la caseína esta se precipita al alcanzar un pH de entre 4.6 y 4.8. (Miller, 2001, p.87). Usualmente el pH de la leche se encuentra alrededor de 6.6 con este valor de pH la caseína se encuentra con una carga negativa y se encuentra solubilizado como sal cálcica, si se añade acido la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza provocando que los grupos fosfatos se protonen y la proteína neutra es precipitada. Debido a la composición de aminoácidos presentes en las proteínas, los radicales que se encuentran libres pueden encontrarse en tres formas dependiendo del pH de la solución en la que se encuentren, siendo catiónicos, neutros y aniónicos. Toda proteína tendrá una carga neta positiva si se encuentra en un medio ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspárticos y glutámicos se encuentran en su forma neutra, pero los grupos amino de arginina y lisina se encuentran protonados. Si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto esta se encontrará cargada negativamente, en este caso los grupos carboxilo se encuentran desprotonados y los aminos en su forma neutra. 47 A partir de esto se deduce que en las proteínas presentes en la leche se puede llegar a un pH característico en la que sus cargas sean cero, al llegar a este equilibrio la proteína se precipitara. Para este proyecto de titulación comprobaremos el punto isoeléctrico de la caseína previa a la extracción de esta mediante soluciones con distintos valores de pH y con ayuda de un procedimiento de bioluminometría. 𝐶𝑎2+ 𝐶𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛𝑎𝑡𝑜 + 2𝐻𝐶𝑙 → 𝐶𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛𝑎 + 𝐶𝑎𝐶𝑙2 1.3.2.2. (5) Bioluminometría en la determinación del punto isoeléctrico de la caseína. El luminómetro es un equipo de diagnóstico portátil y fiable que nos permite verificar la limpieza de equipos o la presencia de residuos en sustancias líquidas, esto de acuerdo con el hisopo de prueba que se utilice. El principio que utiliza este equipo se basa en una reacción entre la luciferina y la enzima luciferasa, que en presencia de ATP produce un compuesto que emite luz visible y puede ser medido. El ATP es un tipo de molécula que se encuentra presente en el material biológico, se le denomina también como la unidad de energía universal que utilizan las células vivas, esta célula es la encargada de producir los procesos metabólicos de los seres vivos como la fotosíntesis, respiración de hongos y fermentación en el caso de levaduras. Reacción luciferina – luciferasa 48 La luciferina se define como una clase pequeña de células que actúan como sustratos utilizados para la obtención de luz en microorganismos o material biológico en conjunto con la enzima luciferasa que actúa como catalizador en la reacción de bioluminiscencia El principio de la reacción se basa en que la luciferina utiliza el ATP que se encuentra en la superficie o sustancia a analizar, para catalizar la oxidación de luciferina en luciferasa produciendo luz que puede ser medida mediante un luminómetro en valores de RLUs (Unidades Relativas de Luz). (Manual de Uso Luminómetro 3M) 1.3.2.3. Requisitos de calidad en pinturas a base de agua. La norma NTE Inen 1544 describe las propiedades que deben poseer las pinturas para su liberación y en las que nos basaremos en este proyecto de titulación. Las pinturas con base de agua se clasifican en 4 tipos dependiendo del uso para el cual se las fabrico. (Norma NTE Inen 1544) Tipo 1 Para exteriores e interiores con alta resistencia al restregado y alta lavabilidad Tipo 2 Para exteriores e interiores con media resistencia al restregado y lavabilidad media Tipo 3 Para interiores con baja resistencia al restregado y no lavable, recomendada para áreas que no deben someterse al lavada 49 Tipo 4 Para cielos rasos e interiores con mínima resistencia al restregado, recomendada para áreas que no deben someterse al lavado 1.3.2.4. Requisitos organolépticos de las pinturas. El color de la película seca de la pintura debe tener una conformidad visual, basada en el patrón de referencia o especificaciones de color que se deseó fabricar. 1.3.2.5. Requisitos físicos y químicos. La norma NTE Inen 1538 presentan los requisitos que debe tener una pintura. Para este proyecto de titulación se hará énfasis a las más relevantes que puede tener una pintura ecológica, dado que dicha norma hace referencia a pinturas preparadas de manera industrial y no a pinturas ecológicas Resistencia al cambio de temperatura De acuerdo con la norma NTE Inen 1538, la pintura aplicada se debe secar en forma de una película lisa y uniforme sin presentar coagulación, aglomeración, espesamiento y separación de color o cualquier otro defecto. Resistencia al agua y álcalis Este requisito es más aplicado para las pinturas del tipo 1 y 2, de acuerdo con la norma Inen 1539 para esta prueba las pinturas no deben presentar arrugamiento, empollamiento ni cambios de color o defecto visible a simple vista. Resistencia a la estabilidad Acelerada 50 A partir de la norma Inen 1540, se denomina que todas las pinturas en emulsión que se encuentren en envases sin abrir y a temperatura ambiente no deben endurecerse, espesarse o formar sedimentos duros ni presentar putrefacción. Tiempo de secado De acuerdo con la norma NTE Inen 1011 se establecerá el tiempo que tarda en secarse una determinada pintura en base al tipo a la cual esta pertenezca, basta con colocar la pintura en la superficie y determinar cuánto se tarda está en formar una película sólida. 51 2. Metodología experimental 2.1. Esquema metodológico El alcance y la estrategia planeada en este trabajo de titulación contemplan la extracción de caseína, los distintos tipos de leche. Para el desarrollo experimental se caracterizó cada tipo de leche, sus propiedades fisicoquímicas y microbiológicas basadas en el principio de la norma NTE Inen 9, además se analizó la influencia de sus propiedades en el proceso de extracción de caseína y la influencia que tienen en las propiedades de la pintura elaborada. 2.2. Primera parte: caracterización de los tipos de leche Se caracterizo las 4 muestras de leche mediante análisis fisicoquímicos y microbiológicos basados en la norma NTE INEN 9, elaborando una muestra general de 2 litros para cada tipo de leche Para la mezcla de leche cruda se utilizaron distintas muestras de proveedores que se reciben a diario en una planta de producción de leche mientras que, para las muestras de leche pasteurizada, semi descremada y descremada se utilizaron muestras de producto terminado de distintas marcas. Tabla 14 Simbología utilizada para los tipos de leche Tipo de leche Cruda Pasteurizada Semi descremada Descremada Simbología MC1 MP1 MS1 MD1 52 2.2.1. Sustancias y Reactivos Leche cruda Leche pasteurizada Leche semidescremada Leche descremada Alcohol potable Ácido clorhídrico 𝐻𝐶𝐿 CAS: 7647-01-0 0.1 [N] Agua destilada 𝐻2 𝑂 CAS:7732-18-5 Hidróxido de sodio 𝑁𝑎𝑂𝐻1 CAS: 310-73-2 0.1 [N] Azul de metileno 𝐶16 𝐻18 𝐶𝐼𝑁3 𝑆 CAS:61-73-4 Ácido rosólico 𝐶19 𝐻14 𝑂3 CAS:603-45-2 Ácido sulfúrico concentrado 𝐻2 𝑆𝑂4 CAS:7664-93-9 98% v/v Resorcinol 𝐶6 𝐻6 𝑂2 CAS:108-46-3 Kit de adulteración de antibióticos, aminoglucósidos, aflatoxinas y suero de leche Kit de adulteración de cloruros y peróxido Reactivos de verificación y limpieza de los equipos Fenolftaleína 𝐼2 Lugol Alcohol isoamílico 𝐶5 𝐻12 𝑂 CAS:123-51-3 Solución de medio de cultivo peptone water ISO Placas Petri film de análisis microbiológico (Aerobios, E. coli, Enterobacterias, Mohos y Levaduras) 𝐾𝐼 CAS: 7681-11-0 2.2.2. Materiales y Equipos Balanza analítica R: (0-1000) [mg] A: ± 0.0001 [mg] Pipeta graduada R: (0-10) [mL] A: ± 0.1 [mL] Pipeta graduada R: (0-5) [mL] A: ± 0.1 [mL] Pera de succión Termómetro R: (-20; 250) [°C] A: ± 1 [°C] Vaso de precipitación R: (0-50) [mL] Vaso de precipitación R: (0-250) [mL] Butirómetro R: (0-8) [mL] Crioscopio Equipo baño maría Milkoscan Estufa Papel filtro Colador 53 Acidómetro Centrifuga Cocineta Gotero Alcoholímetro Pistola de alcohol Lactodensímetro Potenciómetro Cámara de incubación R: (0-100) [mL] A: ± 0.1 [mL] 2.2.3. Procedimiento realizado para la caracterización de los tipos de leche Dado un contrato de confidencialidad que se encuentra en vigencia, el procedimiento e interpretación exacto de caracterización no se puede difundir salvo en la exposición de defensa del proyecto de titulación. 54 3. Cálculos y resultados Figura 12 Diagrama de bloques para la elaboración de pintura ecológica Leche cruda, residuos de leche pasteurizada, semidescremada y descremada Materia Prima (leche) utilizada para el proceso de caracterización Analisis fisicoquímicos y microbiológicos establecidos por la norma NTE INEN 9 𝑁𝑎𝑂𝐻 0.1𝑁 𝐻𝐶𝑙 Determinación del punto isoeléctrico de la caseína 0.1𝑁 𝐻𝐶𝑙 0.1𝑁 Ensayo de Bioluminometria Extracción de caseína mediante acidificación P: 740mm Hg Filtración de caseína T: 21°C 𝐻2 𝑂 Pigmentos Vegetales Disolución de caseína en agua y adición de pigmentos vegetales, elaborando la pintura Aplicación de las pinturas en superficies de concreto, plástico y metal 𝑁𝑎𝑂𝐻 0.1N 𝐻𝐶𝑙 0.1𝑁 Pruebas de calidad basadas en el principio de las normas NTE INEN 1538, 1539, 1540 55 3.1. Caracterización en muestra de leche cruda Corrección de densidad A partir de la ecuación 𝑑20 = 𝑑 + 0,0002 (𝑡 − 20) 𝐸𝑐: 1 Densidad leída en el lactodensímetro 𝑑 = 1,031 𝑔 𝑚𝑙 𝑡 = 15 °𝐶 Densidad corregida 𝑑20 = 1,031 + 0,0002 (15 − 20) 𝑑20 = 𝐸𝑐: 2 1,030 𝑔/𝑚𝑙 Cálculo de la acidez A partir de la ecuación 𝐴 = 0,090 𝑉∗𝑁 ∗ 100 𝑚1 − 𝑚 Cantidad de NaOH 0.1 N utilizado 𝑉 = 14 𝑚𝑙 Diferencia de pesos erlenmeyer 𝑚1 − 𝑚 = 90 𝑔 𝐸𝑐: 3 56 𝐴 = 0,090 14 ∗ 0,1 ∗ 100 90 Acides expresada como ácido láctico 𝐴 = 0,14 % Cálculo de sólidos totales y sólidos no grasos A partir de la ecuación 𝑆 = 250(𝑑20 − 1) + 1,22𝐺 + 0,72 𝐸𝑐: 4 Densidad obtenida a 20°C y grasa mediante el método Gerber 𝑑20 = 1,030 𝑔/𝑚𝑙 𝐺= 4.2 𝑆 = 250(1,030 − 1) + 1,22(4,2) + 0,72 𝐸𝑐: 5 𝑆 = 13,34 % 𝑚/𝑚 Cálculo de sólidos no grasos (SNG) A partir de la ecuación 𝑆𝑁𝐺 = 𝑆𝑇 − 𝐺 𝐸𝑐: 6 𝑆𝑁𝐺 = 13,34 − 4,2 𝑆𝑁𝐺 = 9,14 % SNG: Solidos no grasos 𝑚 𝑚 57 Tabla 15. Resultados cuantitativos en muestras de leche cruda Muestra de leche cruda Temperatura (°C) Densidad leída (g/ml) Densidad corregida (g/ml) Acidez (ml) pH Crioscopía (°C) % Agua % Grasa MC1 15 1,031 1,030 14,0 6,79 -0,522 0,0 4,2 Tabla 16. Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche cruda Muestra de leche cruda % Grasa % Proteína % Lactosa % Sólidos totales % Sólidos no grasos MC1 4,18 3,45 4,64 12,81 8,83 Tabla17. Resultados cualitativos de muestras de leche cruda Muestra de leche cruda MC1 Amino Negativo Aflas Negativo antibióticos Negativo Suero Negativo Alcohol 82% Negativo Almidones Neutralizantes Sacarosa Negativo Negativo Negativo Tiempo de reductasa 5 horas 58 Tabla 18. Resultados microbiológicos de muestras de leche cruda Muestra de leche cruda Aerobios 𝑈𝐹𝐶/𝑐𝑚3 Enterobacterias 𝑈𝐹𝐶/𝑐𝑚3 Mohos y levaduras 𝑈𝐹𝐶/𝑐𝑚3 E. coli 𝑈𝐹𝐶/𝑐𝑚3 MC1 1900000 100000 30000 120000 Tabla 19. Conteo de células somáticas en leche de vaca cruda 3.2. Muestra de leche cruda Células somáticas 𝑪é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔/𝒄𝒎𝟑 MC1 450000 Caracterización en muestra de leche pasteurizada Para la caracterización de las muestras de residuos de leche pasteurizada, semi descremada y descremada se tomaron lotes del laboratorio de calidad UHT que fueron sometidos al proceso de pasteurización y envasado. Corrección de la densidad A partir de la ecuación 𝑑20 = 𝑑 + 0,0002 (𝑡 − 20) 𝐸𝑐: 7 Densidad leída en el lactodensímetro 𝑑 = 1,0305 𝑔 𝑚𝑙 𝑡 = 17 °𝐶 Densidad corregida 𝑑20 = 1,0305 + 0,0002 (17 − 20) 𝑑20 = 1,0299 𝑔/𝑚𝑙 𝐸𝑐: 8 59 Cálculo de la acidez A partir de la ecuación 𝐴 = 0,090 𝑉∗𝑁 ∗ 100 𝑚1 − 𝑚 𝐸𝑐: 9 Cantidad de NaOH 0.1 N utilizado 𝑉 = 15 𝑚𝑙 Diferencia de pesos erlenmeyer 𝑚1 − 𝑚 = 90 𝑔 𝐴 = 0,090 15 ∗ 0,1 ∗ 100 85 𝐸𝑐: 10 Acides expresada como ácido láctico 𝐴 = 0,158 % Cálculo de sólidos totales y sólidos no grasos A partir de la ecuación 𝑆 = 250(𝑑20 − 1) + 1,22𝐺 + 0,72 𝐸𝑐. 11 Densidad obtenida a 20°C y grasa mediante el método gerber 𝑑20 = 1,0299 𝑔/𝑚𝑙 𝐺= 3.2 𝑆 = 250(1,0299 − 1) + 1,22(3,2) + 0,72 𝑆 = 12,09 % 𝑚/𝑚 Cálculo de sólidos no grasos (SNG) A partir de la ecuación 𝑆𝑁𝐺 = 𝑆𝑇 − 𝐺 𝑆𝑁𝐺 = 13,34 − 4,2 𝑆𝑁𝐺 = 8,89 % 𝑚/𝑚 𝐸𝑐: 12 60 Tabla 20 Resultados cuantitativos en muestras de leche pasteurizada Muestra de leche pasteurizada Temperatura (°C) Densidad leída (g/ml) Densidad corregida (g/ml) Acidez (ml) pH Crioscopia (°C) % Agua % Grasa MP1 17 1,031 1,030 15,0 6,58 -0,518 0,4 3,2 Tabla 21. Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche pasteurizada Muestra de leche pasteurizada % Grasa % Proteína % Lactosa % Sólidos totales % Sólidos no grasos MP1 3,17 3,19 4,66 11,68 8,56 Tabla 22. Resultados cualitativos de muestras de leche pasteurizada Muestra de leche pasteurizada MP1 Amino Negativo Aflas Negativo antibióticos Negativo Suero Negativo Alcohol 82% Negativo Almidones Negativo Neutralizantes Negativo Sacarosa Negativo Tiempo de reductasa 8 horas 61 Tabla 23. Resultados microbiológicos de muestras de leche pasteurizada Muestra de leche pasteurizada Aerobios 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 MP1 250 Enterobacterias Mohos y levaduras 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 E. coli 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 100 Ausencia Ausencia 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Tabla 24. Conteo de células somáticas en leche de vaca pasteurizada Muestra de leche pasteurizada Células somáticas 𝑪é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔/𝒄𝒎𝟑 MP1 200000 3.3. Caracterización en muestra de leche semidescremada Corrección de la densidad A partir de la ecuación 𝑑20 = 𝑑 + 0,0002 (𝑡 − 20) 𝐸𝑐: 13 Densidad leída en el lactodensímetro 𝑑 = 1,0325 𝑔 𝑚𝑙 𝑡 = 17 °𝐶 Densidad corregida 𝑑20 = 1,0325 + 0,0002 (17 − 20) 𝑑20 = 1,0319 𝑔/𝑚𝑙 Cálculo de la acidez A partir de la ecuación 𝐸𝑐: 14 62 𝐴 = 0,090 𝑉∗𝑁 ∗ 100 𝑚1 − 𝑚 𝐸𝑐: 15 Cantidad de NaOH 0.1 N utilizado 𝑉 = 15 𝑚𝑙 Diferencia de pesos erlenmeyer 𝑚1 − 𝑚 = 110𝑔 𝐴 = 0,090 16 ∗ 0,1 ∗ 100 110 Acides expresada como ácido láctico 𝐴 = 0,13 % Cálculo de sólidos totales y sólidos no grasos A partir de la ecuación 𝑆 = 250(𝑑20 − 1) + 1,22𝐺 + 0,72 𝐸𝑐. 16 Densidad obtenida a 20°C y grasa mediante el método gerber 𝑑20 = 1,0319 𝑔/𝑚𝑙 𝐺= 2,1 % 𝑆 = 250(1,0319 − 1) + 1,22(2,1) + 0,72 𝑆 = 11,25 % 𝑚/𝑚 Cálculo de sólidos no grasos (SNG) A partir de la ecuación 𝑆𝑁𝐺 = 𝑆𝑇 − 𝐺 𝑆𝑁𝐺 = 13,34 − 4,2 𝑆𝑁𝐺 = 9,15 %𝑚/𝑚 𝐸𝑐: 17 63 Tabla 25 Resultados cuantitativos en muestras de leche semidescremada Muestra de leche semi Temperatura (°C) Densidad leída (g/ml) Densidad corregida (g/ml) Acidez (ml) pH Crioscopía (°C) % Agua % Grasa MS1 17 1,033 1,032 16,0 6,56 -0,522 0,0 2,1 Tabla 26. Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche semidescremada Muestra de leche semi % Grasa % Proteína % Lactosa % Sólidos totales % Sólidos no grasos MS1 2,10 3,43 4,70 10,91 8,86 Tabla 27. Resultados cualitativos de muestras de leche semidescremada Muestra de leche semi MS1 Amino Negativo Aflas Negativo Antibiótico Negativo Suero Negativo Alcohol 82% Negativo Almidón Negativo Neutralizante Negativo Sacarosa Negativo Tiempo reductasa 8 horas 64 Tabla 28. Resultados microbiológicos de muestras de leche semidescremada Muestra de leche semi Aerobios 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Enterobacterias 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Mohos y levaduras 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 E. coli 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 MS1 550 170 7 Ausencia Tabla 29. Conteo de células somáticas en leche de vaca semidescremada 3.4. Muestra de leche semidescremada Células somáticas 𝑪é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔/𝒄𝒎𝟑 MS1 250000 Caracterización en muestra de leche Descremada Corrección de la densidad A partir de la ecuación 𝑑20 = 𝑑 + 0,0002 (𝑡 − 20) 𝐸𝑐: 18 Densidad leída en el lactodensímetro 𝑑 = 1,034 𝑔 𝑚𝑙 𝑡 = 19 °𝐶 Densidad corregida 𝑑20 = 1,034 + 0,0002 (19 − 20) 𝑑20 = 1,0338 𝑔/𝑚𝑙 Cálculo de la acidez A partir de la ecuación 65 𝐴 = 0,090 𝑉∗𝑁 ∗ 100 𝑚1 − 𝑚 Cantidad de NaOH 0.1 N utilizado 𝑉 = 15,5 𝑚𝑙 Diferencia de pesos erlenmeyer 𝑚1 − 𝑚 = 94 𝑔 𝐴 = 0,090 15,5 ∗ 0,1 ∗ 100 94 𝐸𝑐: 19 Acides expresada como ácido láctico 𝐴 = 0,148 % Cálculo de sólidos totales y sólidos no grasos A partir de la ecuación 𝑆 = 250(𝑑20 − 1) + 1,22𝐺 + 0,72 𝐸𝑐. 20 Densidad obtenida a 20°C y grasa mediante el método Milkoscan 𝑑20 = 1,0319 𝑔/𝑚𝑙 𝐺= 2,1 % 𝑆 = 250(1,0338 − 1) + 1,22(0,18) + 0,72 𝑆 = 9,38 % 𝑚/𝑚 Cálculo de sólidos no grasos (SNG) A partir de la ecuación 𝑆𝑁𝐺 = 𝑆𝑇 − 𝐺 𝑆𝑁𝐺 = 9,38 − 0,18 𝑆𝑁𝐺 = 9,21 %𝑚/𝑚 𝐸𝑐: 21 66 Tabla 30 Resultados cuantitativos en muestras de leche descremada Muestra de leche descremada Temperatura (°C) Densidad leída (g/ml) Densidad corregida (g/ml) Acidez (ml) pH Crioscopía (°C) % Agua % Grasa MD1 19 1,034 1,034 15,5 6,54 -0,520 0,0 N/A Tabla 31. Resultados cuantitativos por milkoscan de muestras de leche descremada Muestra de leche descremada % Grasa % Proteína % Lactosa % Sólidos totales % Sólidos no grasos MD1 0,18 3,45 4,78 9,10 8,99 Tabla 32. Resultados cualitativos de muestras de leche descremada Muestra de leche descremada MD1 Amino Negativo Aflas Negativo antibióticos Negativo Suero Negativo Alcohol 82% Negativo Tiempo de reductasa Almidón Negativo Neutralizantes Negativo Sacarosa Negativo 8 Horas 67 El análisis fisicoquímico de grasa en leche descremada, no se puede obtener un resultado exacto mediante el método Gerber (Ver anexo 9) ya que el contenido de grasa es muy bajo para ser medido visualmente en el butirómetro, dado este caso nos guiaremos por el resultado obtenido mediante el equipo Milkoscan. Tabla 33. Resultados microbiológicos de muestras de leche descremada Muestra de Leche descremada MD1 Aerobios 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Enterobacterias 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 780 220 Mohos y levaduras 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Ausencia E. coli 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Ausencia Tabla 34. Conteo de células somáticas en leche de vaca descremada Muestra de Descremada Células somáticas 𝑪é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔/𝒄𝒎𝟑 MD1 300000 Tabla 35 Cuadro comparativo propiedades cuantitativas de los tipos de leche Tipos de leche Temperatura (°C) Densidad leída (g/ml) Densidad corregida (g/ml) Acidez (ml) pH Crioscopía (°C) % Agua % Grasa MC1 15 1,0310 1,0300 14 6,79 -0,522 0,0 4,2 MP1 17 1,0305 1,0299 15 6,58 -0,518 0,4 3,2 MS1 17 1,0325 1,0319 16 6,56 -0,522 0,0 2,1 MD1 19 1,0340 1,0338 15,5 6,54 -0,520 0,0 N/A 68 Tabla 36 Cuadro comparativo resultados cuantitativos por milkoscan Tipos de leche % Grasa % Proteína % Lactosa % Sólidos totales % Sólidos no grasos MC1 4,18 3,45 4,64 12,81 8,83 MP1 3,17 3,19 4,66 11,68 8,56 MS1 2,10 3,43 4,70 10,91 8,86 MD1 0,18 3,45 4,78 9,10 8,99 Tabla 37 Cuadro comparativo resultados cualitativos tipos de leche Tipos de leche MC1 MP1 MS1 MD1 Tiempo de reductasa 5 horas Amino 8 horas 8 horas 8 horas Negativo Aflas antibióticos Suero Alcohol 82% Negativo Negativo Negativo Negativo Almidón Negativo Neutralizantes Sacarosa Negativo Negativo 69 Tabla 38 Cuadro comparativo resultados microbiológicos de los tipos de leche E. coli 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Enterobacterias 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 Mohos y levaduras 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 MC1 Aerobios 𝑼𝑭𝑪/𝒄𝒎𝟑 1900000 100000 30000 120000 MP1 250 100 Ausencia Ausencia MS1 550 170 7 Ausencia MD1 780 220 Ausencia Ausencia Tipos de Leche Tabla 39 Cuadro comparativo de células somáticas en los distintos tipos de leche Células somáticas 𝑪𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔/𝒄𝒎𝟑 450000 Tipos de Leche MC1 MP1 200000 MS1 250000 MD1 300000 Cálculo modelo para determinar cenizas 𝐶= 𝑚3 − 𝑚 ∗ 100 𝑚2 − 𝑚 𝐸𝑐: 22 𝒎𝟑 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝐶𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 𝑐𝑜𝑛 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = 45,19 𝑔 𝒎 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝐶𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 𝑉𝑎𝑐𝑖𝑜 = 45,14 𝑔 𝒎𝟐 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝐶𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝐿𝑒𝑐ℎ𝑒 = 50,14 𝑔 𝐶= 45,19 − 45,14 ∗ 100 50,14 − 45,14 𝐶 = 0,980 % 70 Tabla 40 Cuadro comparativo de contenido de cenizas en los distintos tipos de leche Muestra MC1 MP1 MS1 MD1 3.5. Simbología Peso crisol (g) Muestra (g) Peso total (g) Peso salida (g) Diferencia peso (g) % Cenizas A1 45,14 5,00 50,14 45,19 4,951 0,980 A2 45,20 5,00 50,2 45,25 4,949 1,020 B1 50,98 5,01 55,99 51,01 4,980 0,599 B2 50,62 5,01 55,63 50,65 4,977 0,659 C1 50,05 5,01 55,06 50,07 4,990 0,399 C2 49,51 5,01 54,52 49,54 4,980 0,599 D1 45,14 5,00 50,14 45,15 4,990 0,200 D2 44,86 5,00 49,86 44,88 4,980 0,400 Segunda Parte: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína 3.5.1. Procedimiento utilizado para determinar el punto isoeléctrico de la caseína 3.5.1.1. Aislamiento de la caseína. Para aislar la caseína se utiliza una solución 1N de HCl 1. Colocar 50 ml de leche y gota a gota añadir HCl hasta que se observe un precipitado. 2. Una vez se observe el precipitado, filtrar el sobrenadante 3. Lavar el sobrenadante con 20 ml de etanol para reducir el color opaco amarillento y tener una caseína netamente de color blanquecino. 3.5.1.2. Solución de caseína. 1. Colocar 250 mg de caseína con 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH, hasta presenciar una disolución completa. 71 2. Agregar 5 ml de ácido clorhídrico 1N y mezclar en un matraz de 50 ml adicionando agua destilada hasta su aforo. La solución resultante debe ser clara sin impurezas, si se presenta opaca se procede a filtrar hasta tener una solución transparente. 3.5.1.3. Determinación del punto isoeléctrico. 1. Realizar soluciones con cantidades distintas de HCl y NaOH, de tal manera que estas se encuentren en un rango de pH superior e inferior a 4.6 2. Añadir 1 ml de la solución de caseína previamente preparada 3. La solución que presente un precipitado blanquecino o turbidez se define como el punto isoeléctrico de la caseína 3.5.1.4. Bioluminometria del punto isoeléctrico de la caseína. 1. Si a simple vista no se puede observar una diferencia significativa de tonalidad en las distintas muestras preparadas se procederá a utilizar la ayuda de un luminómetro con hisopos de agua total, el cual en la solución que presente más turbidez o precipitado nos arrojará un valor de RLUs elevado, comprobando así el pI de la caseína. 72 3.5.2. Resultados del punto isoeléctrico de la caseína Tabla 41 Soluciones preparadas a distinto pH y luminometria determinada Cantidad de HCl (ml) Cantidad de NaOH (ml) pH de las soluciones Luminometria (RLU) 3.6. 6 5 2,69 139 6,015 5,015 3,96 169 6,015 5,022 4,76 1621 6 5,02 6,31 196 6 5,14 11,82 477 Tercera Parte: Extracción de caseína en cada tipo de leche Una vez determinado el punto isoeléctrico de la caseína procederemos a extraer la caseína de cada tipo de leche. 1. Tomar 500 ml de leche previamente caracterizada y añadir HCl 0.1N hasta llegar al punto isoeléctrico y observar la formación de un precipitado. 2. Filtrar el precipitado separando la caseína de la parte del suero de leche 3. Pesar la cantidad de caseína obtenida en cada experimentación. 73 Tabla 42 Cantidad de caseína obtenida en función de las propiedades de la leche Tipo de Leche pH Inicial de la Leche Cantidad de HCl utilizado (ml) 6,79 242 MC1 6,58 MP1 6,56 6,54 3.7. % Grasa en cada tipo de leche % Sólidos totales 3,45 4,18 12,81 3,19 3,17 11,68 3,43 2,10 10,91 3,45 0,18 9,10 230 236 MS1 MD1 % Proteína en cada tipo de leche 225 pH Final de la leche Cantidad de caseína obtenida (g) 4,73 176,57 4,68 166,60 4,70 150,09 4,71 142,28 Preparación de pintura a partir de caseína 1. Colocar 4 g de caseína extraída y aplicar 1,2, 3 y 4 ml de agua respectivamente en vasos de precipitación. 2. Añadir 1 g de pigmento natural a elección, y mezclar hasta que se forme una sustancia homogénea. 3. Aplicar la pintura en distintas superficies para analizar sus propiedades. Para diferenciar las pinturas de caseína se utilizó el color blanco, azul, rojo y café para las muestras de leche cruda, pasteurizada, semidescremada y descremada respectivamente. 74 Tabla 43 Aspecto de la pintura en distintos tipos de leche en una solución de 1 ml Tipo de Leche Cantidad de Agua utilizada (ml) Cantidad de caseína utilizada (g) Cantidad de pigmento utilizado (g) MC1 1 4,12 1 MP1 1 4,11 1 MS1 1 4,10 1 MD1 1 4,14 1 Aspecto de la pintura La prueba de caseína con 1ml se observa muy espesa es la más semejante a una pintura de grado industrial, presenta una buena adherencia para distintas superficies Tabla 44 Aspecto de la pintura en distintos tipos de leche en una solución de 2 ml y 3 ml Tipo de Leche Cantidad de agua utilizada (ml) Cantidad de caseína utilizada (g) Cantidad de pigmento utilizado (g) MC1 2-3 4,09 1 MP1 2-3 4,11 1 MS1 2-3 4,09 1 MD1 2-3 4,10 1 Aspecto de la Pintura La prueba de caseína con 2 y 3 ml se observa más líquida que una pintura de grado industrial, pero se puede apreciar una adherencia similar a la pintura diluida en 1 ml de agua Tabla 45 Aspecto de la pintura en distintos tipos de leche en una solución de 4ml Tipo de Leche Cantidad de agua utilizada (ml) Cantidad de caseína utilizada (g) MC1 MP1 MS1 4 4 4 4,12 4,14 4,13 MD1 4 4,03 Cantidad de pigmento utilizado (g) 1 1 1 1 Aspecto de la pintura La prueba con 4 ml de leche se observa muy liquida, se asemeja a pintura de acuarelas además no presenta una buena adherencia en las distintas superficies 75 3.8. Resultados de aplicar la pintura a distintas superficies Posterior a la elaboración de pinturas de caseína estas fueron aplicadas a distintas superficies para determinar su tiempo de secado, adherencia, resistencias al agua, sustancias acidas – básicas y resistencia acelerada. 3.8.1. Resultados de la pintura elaborada a partir de leche cruda Tabla 46 Propiedades de la pintura de caseína cruda en concreto Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al Agua MC1 1 6 Concreto MC1 2 7 MC1 3 4 MC1 Media Resistencia a sustancias ácidas Buena Resistencia a sustancias básicas Buena Concreto Buena Buena Buena 7 Concreto Buena Buena Buena 8 Concreto Buena Buena Buena Tabla 47 Propiedades de la pintura de caseína cruda en metal Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Resistencia a sustancias ácidas Resistencia a sustancias básicas MC1 1 8 Metal Buena Buena Buena MC1 2 9 Metal Buena Mala Mala MC1 3 10 Metal Mala Mala Mala MC1 4 10 Metal Mala Mala Mala 76 Tabla 48 Propiedades de la pintura de caseína cruda en plástico Tipo de leche Disolución en agua (ml) Superficie aplicada Resistencia al agua 1 Tiempo de secado (min) 10 MC1 Mala Resistencia a sustancias ácidas Mala Resistencia a sustancias básicas Mala Plástico MC1 2 9 Plástico Mala Mala Mala MC1 3 10 Plástico Mala Mala Mala MC1 4 10 Plástico Mala Mala Mala 3.8.2. Resultados de caseína a partir de leche pasteurizada Tabla 49 Propiedades de la pintura de caseína pasteurizada en concreto Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Resistencia a sustancias ácidas Resistencia a sustancias básicas MP1 1 5 Concreto Buena Buena Buena MP1 2 6 Concreto Buena Buena Buena MP1 3 6 Concreto Buena Buena Buena MP1 4 7 Concreto Buena Buena Buena Tabla 50 Propiedades de la pintura de caseína pasteurizada en metal Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Resistencia a sustancias ácidas Resistencia a sustancias básicas MP1 1 6 Metal Mala Mala Mala MP1 2 7 Metal Mala Mala Mala MP1 3 7 Metal Mala Mala Mala MP1 4 8 Metal Mala Mala Mala 77 Tabla 51 Propiedades de la pintura de caseína pasteurizada en plástico Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al Agua Media Resistencia a Sustancias ácidas Media Resistencia a sustancias básicas Media MP1 1 10 Plástico MP1 2 9 Plástico Media Media Media MP1 3 10 Plástico Media Media Media MP1 4 10 Plástico Media Media Media 3.8.3. Resultados de caseína a partir de leche semi descremada Tabla 52 Propiedades de la pintura de caseína semidescremada en concreto Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Resistencia a sustancias ácidas Resistencia a sustancias básicas MS1 1 5 Concreto Buena Buena Buena MS1 2 7 Concreto Buena Buena Buena MS1 3 7 Concreto Buena Buena Buena MS1 4 8 Concreto Buena Buena Buena Tabla 53 Propiedades de la pintura de caseína semidescremada en metal Tipo de Leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al Agua Resistencia a sustancias ácidas Resistencia a sustancias básicas MS1 1 6 Metal Buena Buena Buena MS1 2 7 Metal Buena Buena Buena MS1 3 7 Metal Buena Media Media MS1 4 8 Metal Buena Media Mala 78 Tabla 54 Propiedades de la pintura de caseína semidescremada en plástico Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Buena Resistencia a sustancias ácidas Buena Resistencia a sustancias básicas Buena MS1 1 9 Plástico MS1 2 8 Plástico Buena Buena Buena MS1 3 7 Plástico Media Buena Buena MS1 4 8 Plástico Media Media Media 3.8.4. Resultados de caseína a partir de leche descremada Tabla 55 Propiedades de la pintura de caseína descremada en concreto Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Resistencia a sustancias ácidas Resistencia a sustancias básicas MD1 1 7 Concreto Buena Buena Buena MD1 2 8 Concreto Buena Buena Buena MD1 3 8 Concreto Buena Buena Buena MD1 4 9 Concreto Buena Buena Buena Tabla 56 Propiedades de la pintura de caseína descremada en metal Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Resistencia a sustancias ácidas Resistencia a sustancias básicas MD1 1 8 Metal Buena Buena Buena MD1 2 8 Metal Buena Buena Buena MD1 3 6 Metal Buena Buena Buena MD1 4 7 Metal Buena Buena Buena 79 Tabla 57 Propiedades de la pintura de caseína descremada en plástico Tipo de leche Disolución en agua (ml) Tiempo de secado (min) Superficie aplicada Resistencia al agua Buena Resistencia a sustancias ácidas Buena Resistencia a sustancias básicas Buena MD1 1 9 Plástico MD1 2 8 Plástico Buena Buena Buena MD1 3 7 Plástico Buena Buena Buena MD1 4 8 Plástico Buena Buena Buena Las distintas pinturas elaboradas poseen una buena resistencia al agua y buena resistencia al su degradación si se mantienen en refrigeración, si no existe una buena refrigeración la caseína se torna de un color amarillento y toma un olor desagradable. La caseína de los cuatro tipos de leche presento una buena adherencia a todas las superficies en la que se colocó la pintura, mientras que su resistencia al agua fue disminuyendo al paso del tiempo presentando una decoloración en la superficie pintada 3.8.5. Características generales de la caseína extraída Tabla 58 Características organolépticas de la caseína obtenida Tipo de leche Color Olor Sabor MC1 Todas las muestras de caseína se presentaron de un color blanquecino – opaco Olor característico a leche cortada a cuajo Sabor semejante a leche acidificada o echada a perder MP1 MS1 MD1 80 Todas las características organolépticas de la caseína pueden mantenerse estables al permanecer en refrigeración, si no se mantienen a una temperatura adecuada la caseína se torna de un color amarillento, aumentando también el olor a leche echada a perder. 3.8.6. Humedad en la caseína y extracto seco La caseína extraída en los distintos tipos de leche presento un gran porcentaje de humedad, para determinar la humedad correspondiente se realizó una prueba con crisoles y ayuda de una estufa para eliminar el porcentaje de agua presente en la muestra. Cálculo del extracto seco 𝐸𝑠 = (𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐷𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑃𝑒𝑠𝑜) 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐸𝑐: 23 (5,01 − 3,77) 5,01 𝐸𝑠 = 0,245 𝐸𝑠 = Cálculo de la humedad en la caseína 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = 1 − 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = 1 − 0,2475 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = 0,7525 𝐸𝑐: 24 81 Tabla 59 Humedad de la caseína y extracto seco Código MC1 MP1 MS1 MD1 Peso crisol (g) Muestra (g) Peso total (g) Peso salida (g) Diferencia peso (g) Extracto seco (g) % Humedad 49,53 5,01 54,54 50,77 3,77 0,2475 0,7525 46,81 4,99 51,8 48,08 3,72 0,2545 0,7455 45,19 5 50,19 46,42 3,77 0,2460 0,7540 45,16 5 50,16 46,36 3,8 0,2400 0,7600 45,12 4,99 50,11 46,28 3,83 0,2325 0,7675 44,84 5 49,84 45,99 3,85 0,2300 0,7700 50,99 5,01 56 52,32 3,68 0,2655 0,7345 50,62 5 55,62 51,95 3,67 0,2660 0,7340 82 4. Discusión El presente trabajo de titulación se realizó en cuatro etapas, la primera etapa comprende el proceso de caracterización de los cuatro tipos de leche mediante pruebas físicas, químicas y microbiológicas. Los ensayos se fundamentan en la norma NTE Inen 9. Las principales diferencias entre las muestras de leche fueron su valor de pH, grasa y conteo microbiológico. En el caso de la leche cruda se presentó un conteo de aerobios de 1900000 𝑈𝐹𝐶/𝑐𝑚3 y un valor de células somáticas de 450000 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑐𝑚3 esto se debe a que al ser leche cruda y según lo establecido por la norma NTE Inen 9, no ha sido sometida a ningún proceso de tratamiento térmico para eliminar dicha carga microbiana a diferencia de las muestras de leche entera, semidescremada y descremada que ya pasaron por un proceso de pasteurización, cuyo valor en conteo aerobio fue menor a 1000 𝑈𝐹𝐶/𝑐𝑚3 y menor a 300000 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑐𝑚3 . El valor de pH en la muestra de leche cruda fue de 6.79 mientras que en el resto de las muestras fue inferior a 6.58 esto se debe a su carga microbiana ya que el valor de pH se encuentra ligado a la proteína de leche y a la carga microbiana de la muestra. Según Rodrigez,2008, los microorganismos presentes en las muestras de leche son encargados de la degradación de la proteína produciendo su acidificación. El porcentaje de grasa para la leche cruda fue de 4.18 % mientras que en el resto de las muestras fue inferior al 3.17 %, esto se debe a procesos y requerimientos específicos en la industria para la elaboración de cada producto. El análisis de estas propiedades influyo en la cantidad de ácido clorhídrico utilizado para la acidificación de las muestras, para la leche cruda se utilizo 242 ml de HCl para disminuir el pH de 6.79 a 4.76 y para las muestras de leche pasteurizada, semidescremada y descremada se necesito 83 230 ml, 236 ml y 225 ml de ácido respectivamente para alcanzar su punto isoeléctrico de 4.76 y la caseína se precipite para su extracción. La segunda parte del trabajo consistió en demostrar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína según Miller, 2001, el pI de la caseína se encuentra en un rango de 4.6 – 4.8, tomando como referencia estos valores se formuló una disolución de caseína en NaOH y HCl, posteriormente se formularon soluciones con distintas cantidades de HCl y NaOH, de tal manera que los valores de pH de estas estuvieron en el rango de 2.69 a 11.82. A cada solución se le adiciono 1 ml de caseína disuelta y se observó en que valor de pH se presenta un precipitado, en este caso se observó dicho precipitado en una solución que tenía un pH de 4.76. Con ayuda de un luminómetro podemos asegurarnos de este valor ya que el precipitado nos dará un valor de RLU elevado en este caso fue un valor de 1621 RLU como se puede observar en la tabla 41. Adicionalmente se demostró que si a la leche se la lleva a un medio muy acido en este caso pH 2.69 o muy básico pH 11.8 la caseína presente en la misma se encuentra disuelta completamente, es decir no existe precipitado de caseína ya que sus cargas no se han neutralizadas lo que impide el proceso de filtración de esta. Según Miller 2001, si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que los grupos carboxilo estarían desprotonados y los grupos amino en su forma neutra, mientras que si se encuentra en un medio muy ácido los grupos carboxilo se encontraran en su forma neutra y sus grupos amino se encontraran protonados. Una vez que se demostró el punto isoeléctrico se procedió a acidificar todas las muestras de leche hasta alcanzar un valor de pH de alrededor de 4.76, usando una base de 500ml de muestra de leche en cada experimentación. 84 Una vez acidificadas las muestras se procedió a su filtración con lo cual se separó la parte de caseína de la parte de suero de leche, en el caso de la leche cruda se obtuvieron 176.57 g de caseína, en el caso de la leche pasteurizada, semidescremada y descremada este valor fue de 166.60 g , 150,09 g y 142.28 g de caseína respectivamente, si bien el porcentaje de proteína en las muestras se mantiene casi constante como se puede apreciar en la tabla 42, el peso de la caseína en cada muestra fue variable dado su porcentaje de grasa ya que este fue distinto en cada muestra de leche influyendo en su composición y al momento de su filtración la caseína se encuentra con el contenido graso. Según Bachman 1992, al analizar la proteína láctea, el efecto dependerá del origen de la grasa o aceite, con fuentes de origen vegetal se observa una disminución del porcentaje de proteína, con una fuente de origen animal no se observan efectos significativos o son mínimos. Finalmente, en la cuarta etapa se procedió a la elaboración de pinturas a base de caseína, estas se elaboraron en distintas disoluciones de agua con pigmentos, y fueron probadas en tres superficies distintas, concreto, metal y plástico. Todas las pinturas presentaron una buena adherencia al concreto, mientras que su adherencia al metal y plástico disminuyó, esto se debe en parte a la rugosidad de la superficie de prueba, el concreto al ser una superficie rugosa ayuda a la adherencia de la pintura mientras que el plástico y el metal al ser superficies lisas presentan una mayor dificultad en la prueba de adherencia. Según Meinel, 1982 la rugosidad crea una mayor superficie de adherencia con una sustancia permitiendo una mejor unión. Otro factor influyente en la adherencia es la disolución de la caseína ya que la pintura con mayor adherencia fue la diluida en 1 ml de agua, obteniendo una mezcla de pintura más espesa y con mayores propiedades de adherencia. Al analizar los ensayos de 85 adherencia se determinó que las mejores propiedades de pintura fueron obtenidas a partir de las muestras de leche semidescremada y descremada, esto se debe a su bajo contenido de grasa y según, Ralph Mayer,1981 la caseína adecuada para la formulación de pintura y pegamento es la proveniente de la leche desnatada ya que con un bajo contenido de grasa la caseína tiene una mayor adherencia. Al comparar los resultados podemos apreciar que la caseína con peores propiedades fue la extraída a partir de leche cruda según Zabildea, 2012, el problema de los fijativos orgánicos como la caseína es que envejecen mal provocando levantamientos de los estratos y constituyen un caldo de cultivo propicio para microorganismos, sin embargo, una caseína mejorada mediante preservantes o procesos podría presentar mejores resultados. Para las pruebas de resistencia a ácidos y bases, las distintas muestras de pintura se presentaron estables y se obtuvieron buenos resultados en el caso de la resistencia al cambio climático y de temperatura. Las pinturas presentaron una buena resistencia al almacenamiento siempre y cuando estén en refrigeración, ya que se mantienen estables mientras se encontraban en refrigeración a 8°C durante más de una semana, mientras que las muestras que no se encontraron en refrigeración se degradaron adquiriendo un color amarillento al cabo de 24 horas sin refrigeración siendo este un punto negativo. Según Rodríguez 2008, los microorganismos en la leche son los encargados de la degradación de la caseína, al tener una mayor temperatura esto influye en el crecimiento de la carga microbiana acelerando el proceso de degradación. 86 5. Conclusiones 5.1. De la caracterización se determinó que el valor de pH y acidez de las muestras de leche se ven influenciados directamente por la carga microbiana, esta carga al ser responsable del proceso de desnaturalización de la proteína modifica dichas propiedades, como se pueden apreciar en las tablas 35 y 38. 5.2. De la aplicación sobre distintas superficies, se puede determinar que la pintura elaborada a partir de caseína de leche descremada presenta mejores propiedades de adherencia, resistencia al agua, soluciones acidas y básicas, al ser comparada con las muestras de leche cruda, pasteurizada y descremada como se puede apreciar en la tabla 55. 5.3. De la tabla 42 se aprecia que la grasa influye en la cantidad de caseína extraída en cada muestra, si bien el porcentaje de proteína es similar para cada tipo de leche el contenido graso influye en los pesos ya que la caseína va a presentar un mayor porcentaje de contenido graso. 5.4. El punto isoeléctrico adecuado de la caseína es de 4.76 como se puede observar en la tabla 41, este es un valor critico ya que en este punto la caseína se encuentra con una carga neutra y tiende a precipitarse, la solución ácida formulada con un pH de 2.69 y la básica con un pH 11.8 hacen que la caseína se encuentre disuelta completamente evitando que esta se precipite y pueda filtrarse. 87 6. Recomendaciones 6.1. Realizar el mismo proceso de experimentación con muestras de leche estandarizada, reconstituida y compuesta, para analizar si esos tipos de leche pueden presentar propiedades superiores a las analizadas en este proyecto de titulación. 6.2. Realizar la extracción de caseína mediante un proceso de acidificación natural, dejando las muestras de leche sin refrigeración a una temperatura ambiente. 6.3. Agregar diversos aditivos como espesantes, dispersantes, antisedimentantes y emulsionantes a la pintura ecológica para determinar cuál mejora sus propiedades. 6.4. Aplicar la pintura ecológica en superficies de madera, poliéster y algodón, para analizar su comportamiento. 88 REFERENCIAS Lanzarini, Alberto. "La Caseína: contribución a su estudio químico e industrial.". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1907. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0052_Lanzarini.pdf 2. PRIMO, E. 1997. La leche y los productos lácteos En: Química de los Alimentos. Editorial Síntesis. Madrid, España. Pp. 344 – 354. 3. Blowey R., y P. Edmondson. 1995. Control de la Mastitis en Granjas de Vacuno de Leche. Acribia. Zaragoza. 87 p. 4. Rocío Ruiz Romero “Análisis microbiológico de leche de origen orgánico: atributos deseables para su transformación” México 2013. http://www.scielo.org.mx/pdf/asd/v10n4/v10n4a3. 5. Argudo D. Factores que afectan la susceptibilidad antibiótica de Staphylococcus aureus aislado de mastitis bovina [Internet]. Universidad de Cuenca; 2017. 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Instituto Interamericano de Cooperación para la agricultura. 1982 Available from: Tecnología de la Leche - Aurelio Revilla - Google Libros 91 ANEXOS 92 Anexo 1 Materia prima utilizada en el proceso de caracterización 93 Anexo 2 Ensayos físicos para la caracterización de los tipos de leche Ensayo de densidad Ensayo de acides 94 Continuación Ensayo de crioscopia 95 Continuación Determinación de pH Determinación del contenido de grasa por método gerber 96 Continuación 97 Anexo 3 Resultados cuantitativos a partir del método FTIR 98 Anexo 4 Análisis cualitativos en los tipos de leche Análisis de peróxidos y cloruros 99 Continuación Ensayo de almidones, neutralizantes y sacarosa 100 Continuación Ensayo de aminoglucósidos, antibióticos y aflatoxinas 101 Continuación Ensayo de Alteración de suero de leche 102 Continuación Ensayo de estabilidad a la proteína Ensayo de reductasa 103 Anexo 5 Ensayos microbiológicos en muestras de leche Ensayos de microorganismos aerobios, E. coli, enterobacterias y mohos 104 Continuación Ensayo de conteo de células somáticas 105 Anexo 6 Determinación del punto isoeléctrico de la caseína Solución de caseína Formulación de Soluciones con distintos valores de pH 106 Continuación Determinación experimental del punto isoeléctrico Prueba de bioluminometria en las soluciones de caseína 107 Continuación 108 Anexo 7 Extracción de caseína de los distintos tipos de leche Acidificación de la caseína Filtración de caseína 109 Continuación Suero filtrado en la caseína caseína obtenida en cada tipo de leche 110 Anexo 8 Elaboración de pinturas a partir de caseína y aplicación en superficies Pintura a partir de leche cruda Aplicación de Pintura de leche cruda en concreto Aplicación de Pintura de leche cruda en plástico 111 Continuación Aplicación de pintura de leche cruda en metal Elaboración de pintura a partir de leche pasteurizada Aplicación de pintura de leche pasteurizada en concreto 112 Continuación Aplicación de pintura de leche pasteurizada en metal Aplicación de pintura de leche pasteurizada en plástico Elaboración de pintura a partir de leche semi descremada 113 Continuación Aplicación de pintura de leche semi descremada en concreto Aplicación de pintura de leche semi descremada en metal 114 Continuación Aplicación de pintura de leche semi descremada en plástico Elaboración de pintura a partir de leche descremada 115 Continuación Aplicación de pintura de leche descremada en concreto Aplicación de pintura de leche descremada en metal Aplicación de pintura de leche descremada en plástico
