BILIRRUBINAS INTRODUCCIÓN El principal pigmento de la bilis es el 2,17-Dietenil-1, 10, 19, 22, 23,24-hexahidro-3, 7, 13,18-tetrametil-1,19-dioxo-21-H-bilina-8.12-ácido dipropiónico, conocido como bilirrubina (C33H36N4O6); es un compuesto tetrapirrólico que se forma a partir del catabolismo del grupo hemo en las células del sistema retículo endotelial, hígado, bazo y médula ósea. De acuerdo a Van den Bergh la bilirrubina en suero se presenta en forma de bilirrubina no conjugada o indirecta la cual se caracteriza por ser insoluble en agua y soluble en cloroformo; por ello, en sangre se une a la albúmina para ser transportada hasta el hígado, en donde es conjugada con el ácido glucurónico. Así aumenta la polaridad de la bilirrubina conjugada o directa siendo más soluble en agua lo cual es necesario para que se transporte en la bilis y posteriormente se excrete por las heces. La determinación de bilirrubina es de interés para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades hepáticas, en algunos desórdenes hematológicos y en obstrucciones de vías biliares. El desarrollo de los métodos, para la determinación de bilirrubinas, se inició en 1883, cuando Ehrlich descubrió que la bilirrubina reacciona con el ácido sulfanílico diazoado y forma un compuesto colorido al que llamó azobilirrubina. En 1913, Van den Bergh y colaboradores, utilizaron este método para cuantificar la bilirrubina sérica. En 1937, Malloy y Evelyn diseñaron un método colorimétrico, en el cual ajustaron al 50% la concentración final de metanol para acelerar la reacción, sin precipitación de proteínas. Este método tiene la desventaja de que otros pigmentos presentes en el suero y en la orina, como los carotenoides y la hemoglobina, pueden interferir en las determinaciones, además, la bilirrubina conjugada y no conjugada difieren en sus propiedades de diazotización, en presencia y en ausencia de un acelerador como el alcohol o la cafeína. Para resolver estos problemas, actualmente se han desarrollado diferentes métodos como el de la bilirrubina oxidasa, el de cromatografía en capa fina (TLC) y de alta resolución (HPLC); sin embargo, el método de Jendrassik - Grof es el más económico, accesible y práctico para el laboratorio clínico. En general, a nivel internacional no se han estandarizado los métodos, ni existe un estándar de referencia, debido a que la bilirrubina es un compuesto insoluble en agua y sensible a la luz, por lo tanto, es difícil de manejar y conservar; además, los preparados comerciales varían considerablemente en pureza. Por ello, no se han establecido procedimientos que se consideren adecuados para preparar la solución estándar de bilirrubina. IMPORTANCIA CLÍNICA La bilirrubina es un producto del catabolismo del grupo hemo, por lo tanto, proviene de la destrucción normal o anormal de los eritrocitos, a partir de los cuales se produce el 80% de los 250 a 300 mg que se excretan diariamente; el 20% restante, se produce a partir de otras hemoproteínas como la mioglobina, la catalasa, los citocromos y la peroxidasa. Cuando los niveles de bilirrubina en sangre están por arriba de 1 mg/dL, se habla de una hiperbilirrubinemia. Cuando la bilirrubina en sangre alcanza una concentración considerable difunde a los tejidos y se evidencia por una coloración amarilla de la piel y mucosas, a este signo se le llama ictericia. La presencia de ictericia se comprueba a partir de concentraciones de bilirrubina de 2,5 – 3 mg/dL. El aumento de la bilirrubina en suero se debe a cuatro posibles mecanismos: una sobreproducción de bilirrubina y/o captación hepática inadecuada, por una conjugación defectuosa o por alteración en la excreción de la bilis (intra o extrahepática). Con lo anterior, se desprende la siguiente clasificación en donde se correlaciona la forma de bilirrubina sérica involucrada: Causas de hiperbilirrubinemias TIPOS DE ICTERICIA BILIRRUBINA SÉRICA INVOLUCRADA CAUSAS RELACIONADAS Hemólisis: destruccion excesiva de los eritrocitos, desorden hereditario de los globulos rojos, desorden Bilirrubina no hemolítico adquirido, reacción Pre-Hepática conjugada transfucional, dificultad en la (Bilirrubina indirecta) captación de la bilirrubina por el hígado. Ictericia fisiológica neonatal ENFERMEDADES Amenia de cel. falciformes (hereditario) Talasemia Esferocitosis Paludismo Enf. hemolitica del RN por incorporación de RhEnf. hemolitica del sist. reticulo endotelial Anemia hemolitica autoinmune Sx. Crigler-Najar (ictericia congenita grave) Bilirrubina no Enfermedad de Gilbert conjugada, Sx. Dubin - Jonhson (Ictericia idiopática crónica) Hepática Daño hepatocelular Bilirrubina conjugada Hepatitis ó ambas. Cirrosis Cancer del higado Colelitiasis Bilirrubina conjugada Atresia congenita Post-hepática Desorden estructural del tracto biliar (Bilirrubina directa) Obstrucción biliar por tumores (cabeza del pancreas, ampolla de Vater) Cabe destacar que las hipobilirrubinemias tienen escaso interés clínico y puede observarse en las anemias aplásicas o ferropénicas. Valores de referencia para bilirrubinas Bilirrubina total Bilirrubina directa (conjugada) Bilirrubina indirecta (no conjugada) Recién nacido: Bilirrubina total hasta 1 mg/dL hasta 0.25 mg/dL hasta 0.75 mg/dL mayor 5.8 mg/dL OBJETIVO El alumno determinará la bilirrubina sérica directa (conjugada) y la bilirrubina total y calculará la bilirrubina indirecta (no conjugada). FUNDAMENTOS PARA LA DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA La prueba de bilirrubina total en suero es la prueba de función hepática (PFH) clásica, tiene la ventaja de que es fácil de determinar y se encuentra automatizada, además tiene alta especificidad, sin embargo, presenta escasa sensibilidad por ello, no debe ser utilizada para la detección de enfermedades hepáticas. Los métodos utilizados para la determinación de las distintas fracciones de bilirrubina son poco fiables, en especial cuando la bilirrubinemia no supera los 5 mg/dL, pero si se toman en consideración los factores que pueden modificar los resultados, como por ejemplo la hemolisis y/o lipemia de la muestra, fármacos (alopurinol, esteroides anabólicos, antibióticos), vitamina A, cafeína, penicilina, salicilatos, tiempos de reacción, preparación de soluciones, uso de reactivo blanco, etc., los resultados suelen ser aceptables. De los diferentes métodos disponibles para la determinación de bilirrubina en suero, el de Malloy y Evelyn sigue siendo el más satisfactorio y el más difundido, al paso de los años ha sufrido algunas modificaciones, pero se conserva el principio original en los nuevos métodos de determinación de la bilirrubina. Cuando el ácido sulfanílico en solución de ácido clorhídrico es tratado con nitrito de sodio, se convierte en ácido diazo-bencenosulfónico, usualmente llamado ácido sulfanílico diazoado o simplemente diazo reactivo, este en presencia de bilirrubina se produce un color que varía con el pH del medio. Para la determinación de la bilirrubina no conjugada, la reacción con el reactivo diazo se llevará a cabo solo en presencia de una solución alcohólica. Segunda reacción con otra molécula de Reactivo de Ehrlich liberando ácido fórmico Reacción del método de Malloy y Evelyn para la determinación de bilirrubina. Reacción del método de DCA para la determinación de bilirrubina. En el método de Van Den Bergh, la bilirrubina se conjuga con el ácido sulfanílico diazoado, para formar la llamada azobilirrubina. En la reacción, la bilirrubina en medio alcohólico, se divide en dos compuestos dipirrólicos, el ácido vinil-neoxantobilirrúbico y ácido vinil-isoneoxantobilirrúbico, los cuales tienen posiciones alfa libres y pueden dar fácilmente la reacción con el reactivo diazo. La adición de sustancias que contienen grupos alcohólicos como por ejemplo el alcohol metílico es esencial para que tenga lugar la reacción completa in vitro. Cabe destacar que la reacción clásica de Van den Bergh se lleva a cabo a un pH entre 2 y 4 y dado que se conoce que el complejo bilirrubina-albúmina se disocia a un pH inferior a 5 , ambas bilirrubinas se encuentran libres de la proteína, por lo que el acoplamiento con el reactivo diazo con o sin alcohol, no depende de una diferente unión con las proteínas séricas sino que la reacción directa se debe a los mono y diglucoronatos de bilirrubina, solubles en agua y la bilirrubina libre no conjugada es responsable de la reacción indirecta. La bilirrubina hidrosoluble reacciona de forma directa con el ácido sulfanílico diazoado, en ausencia de un acelerador, solo la bilirrubina conjugada reacciona, mientras que la determinación de bilirrubina total, en presencia de un acelerador como el benzoato de cafeína, la bilirrubina no conjugada se desprende de la albúmina, además de la conjugada, reaccionan con el ácido sulfanílico y se produce azobilirrubina total. MATERIAL Y EQUIPO 1 Gradilla 1 Pipeta semiautomática de 20 μL 1 Pipeta semiautomática de 100 μL 1 Pipeta semiautomática de 200 μL 1 Pipeta semiautomática de 1000 μL 2 Pipetas de 5 mL graduadas en centésimas de mL. Espectrofotómetro MATERIAL BIOLÓGICO Para la determinación de bilirrubina se puede utilizar: • Suero libre de hemólisis • Plasma. BIBLIOGRAFÍA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Bhagavan, N. (2002). Biochemistry, 2nd. Ed. J. B. Lipnocott, Co. Philadelphia. USA. Devlyn, T. M. 2006. Texbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 6th. Ed. J. Willey & Sons, Inc. Pub., N.Y. USA. Gaw, A. et al., (2015) Bioquímica Clínica (Texto y atlas en color) 5a ed Ed. Elsevier. Barcelona España. González, A. (2014) Principios de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. 2 a ed Ed. Elsevier. Barcelona España. Kaplan, L. and Pesce, A. (2002). Clinical Chemistry, Theory, Analysis, Correlation. 3a ed. Ed. Mosby. NY. USA. King, M. (2014) Integrative Medical Biochemistry Examination and Board Review. Ed Mc Graw Hill Medical. NY. USA. Murray, R. K. & cols. 2009. Bioquímica de Harper, 28 Ed. El Manual Moderno, México, D. F. Pacheco, D. (2002). Bioquímica Estructural y Aplicada a la Medicina 2 a ed Ed. Inst. Politécnico Nacional. México, D. F.
