Evaluación DPPH: Capacidad Antioxidante y Concentración

ORIGINAL BREVE
Evaluación de la técnica 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH) para determinar
capacidad antio[idante
(PLOLR*XLMD3RPD10LJXHOÉQJHO,QRFHQWH&DPRQHV2-RKQ3RQFH3DUGR2(GZLQ=DU]RVD1RUDEXHQD
RESUMEN
Este estudio evalúa la actividad antioxidante usando el método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
(DPPH). Este método se utiliza para determinar la capacidad antioxidante de alimentos y compuestos
VLQWpWLFRV SDUD HVWH ÀQ VH KD KHFKR XVR GH HVWH UDGLFDO OLEUH HQ FRQFHQWUDFLRQHV FRPSUHQGLGDV HQWUH
\P0DVtPLVPRSDUDOOHYDUDFDERHVWDHYDOXDFLyQVHXWLOL]yORVHVWiQGDUHVGHFDWHTXLQD\
HSLFDWHTXLQDHQXQUDQJRGHFRQFHQWUDFLyQTXHHVWXYRHQWUH[\[P0/RVYDORUHVGH
,&SDUDDPERVHVWiQGDUHVIXHURQGHSHQGLHQWHVGHODFRQFHQWUDFLyQGH'33+KDELpQGRVHREVHUYDGRTXH
el valor anterior aumenta al incrementar la concentración de DPPH. El resultado obtenido en este estudio
indica la importancia de la concentración del DPPH para evaluar la capacidad antioxidante. (Horiz Med
Palabras clave:$QWLR[LGDQWH'33+FDWHTXLQDHSLFDWHTXLQDUDGLFDOOLEUH )XHQWH'H&6%,5(0( $VVHVVPHQWRIGLSKHQ\OSLFULOKLGUD]LOR '33+ 7HFKQLTXHWRGHWHUPLQHDQWLR[LGDQWFDSDFLW\
ABSTRACT
:HDVVHVVHGWKHWHFKQLTXHXVLQJIUHHUDGLFDOGLSKHQ\OSLFULOKLGUD]LO '33+ XVHGWRGHWHUPLQHWKH
antioxidant capacity of foods and synthetic compounds; for that purpose this free radical has been used
LQ FRQFHQWUDWLRQV EHWZHHQ DQG P0 OLNHZLVH WR SHUIRUP WKLV HYDOXDWLRQ WKH FDWHFKLQ DQG
HSLFDWHFKLQVWDQGDUGVKDYHEHHQXVHGLQDFRQFHQWUDWLRQUDQJHRI[ DQG[ P0&, values for both standards were dependent on the concentration of DPPH, having observed that the above
value increases with increasing concentration of DPPH, for which reason it is suggested that all research
XVHDVLQJOHFRQFHQWUDWLRQRI'33+LQWKHUHDFWLRQPHGLXP +RUL]0HG Key words: $QWLR[LGDQW'33+FDWHFKLQHSLFDWHFKLQIUHHUDGLFDO 6RXUFH0H6+1/0 'RFWRUHQIDUPDFLD\%LRTXtPLFD,QVWLWXWRGH,QYHVWLJDFLyQ&HQWURGH,QYHVWLJDFLyQGH%LRTXtPLFD\1XWULFLyQ)0+8603/LPD3HU~
Químico Farmacéutico. ,QVWLWXWRGH,QYHVWLJDFLyQ&HQWURGH,QYHVWLJDFLyQGH%LRTXtPLFD\1XWULFLyQ)0+8603/LPD3HU~
0DJLVWHUHQ%LRTXtPLFD\1XWULFLyQ,QVWLWXWRGH,QYHVWLJDFLyQ&HQWURGH,QYHVWLJDFLyQGH%LRTXtPLFD\1XWULFLyQ)0+8603/LPD3HU~
1
2
Horiz Med 2015; 15 (1):
(QHUR0DU]R
(PLOLR*XLMD3RPD0LJXHOÉQJHO,QRFHQWH&DPRQHV-RKQ3RQFH3DUGR
(GZLQ=DU]RVD1RUDEXHQD
INTRODUCCIÓN
/RV UDGLFDOHV OLEUHV VRQ PROpFXODV R IUDJPHQWRV
de moléculas caracterizadas por tener uno o más
electrones desapareados en su orbital externo,
condición que los torna altamente reactivos (1).
En el ser humano se generan radicales libres en la
cadena respiratoria mitocondrial, cuando reacciona
el peróxido de hidrógeno con el ion ferroso, por
acción catalítica de la ciclooxigenasa, la reacción
GHYLWDPLQD&FRQHOLRQIHUURVRSRUDFFLyQGHOD
1$'3+UHGXFWDVDHWF
En los seres vivientes existen sistemas de defensa
antioxidante que tienen la propiedad de impedir la
acción nociva de los radicales libres, habiéndose
LGHQWLÀFDGR FRPSXHVWRV FRQ SURSLHGDGHV
antioxidantes de naturaleza enzimática como
la catalasa, superóxido dismutasa, glutatión
peroxidasa, etc., así como, sustancias no
enzimáticas: ascorbato, ferritina, ceruloplasmina,
polifenoles, antocianinas.
&XDQGRODGHIHQVDDQWLR[LGDQWHHVLQVXÀFLHQWHSDUD
SURWHJHU DO RUJDQLVPR GHO HIHFWR GDxLQR GH ORV
radicales libres puede conducirlo al estrés oxidativo,
condición que está estrechamente vinculado a una
gran diversidad de patologías como la psoriasis,
cáncer, diabetes mellitus, aterosclerosis, cataratas,
hipertensión arterial. (2-5)
Existe un gran número de estudios epidemiológicos
que vinculan la ingesta de una dieta rica en
frutas y verduras con un disminuido riesgo de
padecer enfermedades cardiovasculares, cáncer,
aterosclerosis, artritis, etc., y ello debido a que
dichos alimentos tienen un elevado contenido de
SROLIHQROHVÁDYRQRLGHVDQWRFLDQLQDVYLWDPLQD&
YLWDPLQD(şFDURWHQROLFRSHQR Se han descrito diversas técnicas para evaluar la
capacidad antioxidante de alimentos y plantas
PHGLFLQDOHV SHUR DTXHOOD TXH KD UHFLELGR
una preferencial atención es la técnica que utiliza
el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo conocido
por las siglas DPPH (11,12).
Este radical libre es susceptible de reaccionar con
compuestos antioxidantes a través de un proceso
+RUL]0HG caracterizado por la cesión de un átomo de hidrógeno
proporcionado por el agente antioxidante.
/RV HVWXGLRV FLQpWLFRV PXHVWUDQ TXH HVWH SURFHVR
ocurre a través de una reacción de pseudo primer
orden la que puede seguirse midiendo la disminución
GHODDEVRUEDQFLDHQIXQFLyQGHOWLHPSR Esta medición permite observar una primera fase
muy rápida, seguida ulteriormente por una reacción
lenta, lo que podría ocurrir debido a un proceso de
dimerización de los productos de la reacción o a
reacciones de los productos de ésta.
/D UHDFFLyQ DQWHV GHVFULWD HQWUH HO '33+ \ XQ
antioxidante, podemos representarla de la siguiente
manera:
>'33+ @>$2+@
>'33++@>$2 @
Por cuyo motivo, las condiciones de ensayo en que
se mide la capacidad antioxidante puede describirse
por la siguiente ecuación:
/D GHWHUPLQDFLyQ GH OD FRQFHQWUDFLyQ GH
compuestos antioxidantes utilizando la técnica
del DPPH ha sido descrita hace más de cincuenta
DxRV SHURKHPRVREVHUYDGRTXHORVDXWRUHV
no utilizan la misma concentración del DPPH en los
medios de reacción y ello no permite realizar una
evaluación precisa, considerando especialmente
que los resultados experimentales se expresan
FRPRHOYDORU,&HVGHFLUODFRQFHQWUDFLyQGHOD
muestra problema que produce una inhibición del
GHOUDGLFDOOLEUH'33+ En tal sentido, podemos considerar que el valor
,& HV GHSHQGLHQWH GH OD FRQFHQWUDFLyQ GHO
DPPH, así como, de la naturaleza del compuesto
antioxidante.
El objetivo del presente trabajo reside en mostrar
que la concentración del DPPH en el medio de
UHDFFLyQ LQÁX\H HQ OD HYDOXDFLyQ GH OD FDSDFLGDG
antioxidante.
Evaluación de la técnica 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH) para determinar capacidad
antioxidante
METODOLOGÍA
El medio de reacción estuvo constituido por
FRQFHQWUDFLRQHV ÀQDOHV GH '33+ FRPSUHQGLGDV
\ P0 GLVXHOWR HQ PHWDQRO JUDGR
+3/& PLHQWUDV TXH ODV FRQFHQWUDFLRQHV GH ORV
estándares catequina y epicatequina se utilizaron
HQFRQFHQWUDFLRQHVFRPSUHQGLGDVHQWUH[
\[P0GLVXHOWDVHQPHWDQROJUDGR+3/&
/DUHDFFLyQVHGHVDUUROOyDWHPSHUDWXUDDPELHQWH
ƒ& GXUDQWHPLQXWRVHQODRVFXULGDGDFX\R
término se procedió a leer la densidad óptica en
XQHVSHFWURIRWyPHWURPDUFD6KLPDG]XPRGHOR89
250. Paralelamente se incubó un tubo blanco que
solamente contenía metanol. Todos los reactivos
utilizados fueron de grado para análisis.
HALLAZGOS
3DUD OD HYDOXDFLyQ GHO YDORU ,& GH OD FDWHTXLQD
VHXWLOL]DURQWUHVFRQFHQWUDFLRQHVGH'33+
\ P0 PLHQWUDV TXH OD FDWHTXLQD
se utilizó en concentraciones comprendidas
HQWUH [ \ [ P0 KDELpQGRVH
REVHUYDGR TXH ORV YDORUHV ,& IXHURQ \ õ0 UHVSHFWLYDPHQWH FRQIRUPH VH REVHUYD
en la Tabla 1, en la que es posible apreciar que
cuando se incrementa la concentración del DPPH
SDUDOHODPHQWHDXPHQWDHOYDORU,&
7DEOD 9DORUHV ,& GH FDWHTXLQD HQ IXQFLyQ GH OD FRQFHQWUDFLyQ GH
DPPH.
$VtPLVPRVHHYDOXDURQORVYDORUHV,&GHFDWHTXLQD
y epicatequina utilizando dos concentraciones
distintas de DPPH: 0.100 y 0.200 mM; en estas
condiciones de ensayo cuando la concentración del
'33+IXHP0HO,&GHODFDWHTXLQDIXHGH
õ0PLHQWUDVTXHHOGHODHSLFDWHTXLQDIXH
õ0SHURFXDQGRVHXVyXQDFRQFHQWUDFLyQÀQDOGH
DPPH correspondiente a 0.200 mM, la catequina y
epicatequina mostraron prácticamente un mismo
YDORU ,& FRPR VH PXHVWUD HQ OD 7DEOD GLFKR
valor se obtuvo por extrapolación, ya que en las
Horiz Med 2015; 15 (1):
condiciones experimentales se observó que la
Pi[LPDLQKLELFLyQDOFDQ]DGDIXHGH\
para la catequina y epicatequina respectivamente,
SRU FX\R PRWLYR QR SXGR DOFDQ]DUVH HO GH
inhibición del DPPH.
7DEOD 9DORUHV ,& GH FDWHTXLQD \ HSLFDWHTXLQD HQ IXQFLyQ GH OD
concentración de DPPH.
DISCUSIÓN
&RQIRUPH VH KD REVHUYDGR ODV FRQFHQWUDFLRQHV
XWLOL]DGDVGHO'33+SDUDHYDOXDUHOYDORU,&GHORV
antioxidantes catequina y epicatequina estuvieron
FRPSUHQGLGDV HQ XQ DPSOLR UDQJR \ mM, habiéndose obtenido resultados que fueron
dependientes de la concentración del radical libre
DPPH; el hecho de obtener valores diferentes
GH ,& SDUD ORV DQWLR[LGDQWHV DQWHV FLWDGRV
sugiere que es necesario realizar una revisión de
las evaluaciones de la capacidad antioxidante de
alimentos con DPPH, publicadas desde hace más de
DxRV Hemos observado que cuando se utiliza
concentraciones altas de DPPH (0.2 mM) se
torna menos sensible la determinación del valor
,& FRQIRUPH VXFHGH FRQ ODV HYDOXDFLRQHV GH
catequina y epicatequina determinadas con dicha
concentración, mientras que cuando se utilizan
FRQFHQWUDFLRQHV PHQRUHV GH '33+ P0 HO
YDORU ,& HV HO PiV EDMR \ HOOR QDWXUDOPHQWH
conduce a una apreciación errada de las propiedades
antioxidantes de un alimento o planta medicinal, ya
que para efectos de comparación aquella muestra
TXHWLHQHHOPHQRUYDORU,&HVODTXHSRVHHXQD
mejor actividad antioxidante.
En diversos trabajos de investigación en los que se
realiza un análisis cinético del comportamiento del
radical libre DPPH, se observa que cuando se evalúa
la capacidad antioxidante de epicatequina con una
FRQFHQWUDFLyQ GH '33+ P0 VH REWLHQH XQ
YDORU,&GHõ0 HQFDPELRFXDQGRHVWD
(QHUR0DU]R
(PLOLR*XLMD3RPD0LJXHOÉQJHO,QRFHQWH&DPRQHV-RKQ3RQFH3DUGR
(GZLQ=DU]RVD1RUDEXHQD
HYDOXDFLyQVHUHDOL]DFRQXQDFRQFHQWUDFLyQ
P0VHREWLHQHXQYDORUGHõ0 DVtPLVPR
OD HYDOXDFLyQ GHO ,& GH FDWHTXLQD XWLOL]DQGR
XQDFRQFHQWUDFLyQP0GH'33+PXHVWUDXQ
YDORU GH õ0 PLHQWUDV TXH HO YDORU TXH
hemos obtenido en nuestro laboratorio usando una
FRQFHQWUDFLyQGH'33+P0HVGHõ0
&RQIRUPH VH KD PRVWUDGR DQWHULRUPHQWH H[LVWH
una amplia variedad de concentraciones de
DPPH que se utiliza para la determinación de la
capacidad antioxidante de compuestos naturales y
sintéticos, por cuyo motivo, consideramos que sería
FRQYHQLHQWH DGRSWDU XQD GHÀQLGD FRQFHQWUDFLyQ
del DPPH para todas las determinaciones analíticas
la que podría ser 0.1 mM, ya que a concentraciones
mayores disminuye la sensibilidad de esta técnica
para evaluar la capacidad antioxidante de una
muestra.
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