Abeja fosfolipasa A2 del veneno mejora los ácaros del polvo doméstico Extraer Las lesiones cutáneas inducidas Dermatitis Atópica en ratones

La fosfolipasa A2 del veneno de la abeja mejora las
lesiones cutáneas Dermatitis Atópica en ratones
inducidas por los ácaros del polvo doméstico
Kyung-Hwa Jung 1 , Hyunjung Baek 1 , Manho Kang 1 , Namsik Kim 2 ,
Seung Young Lee 1 y Hyunsu Bae 1 , *
1
Departamento de Ciencia en Medicina de Corea, la Universidad de Kyung
Hee, 26 Kyungheedae-ro, Dongdaemoon-gu, Seúl 02447, Corea
2
Departamento de Medicina Clínica de Corea, Graduate School, Kyung Hee
Univeristy, 26 Kyungheedae-ro, Dongdaemoon-gu, Seúl 02447, Corea
*
Correspondencia: Tel .: + 82-2-961-9316; Fax: + 82-2-962-9316
Editores Académicos: Stuart M. Brierley e Irina Vetter
Abstracto
:
La dermatitis atópica (DA) es una enfermedad inflamatoria de la piel bifásica
que es provocado por los defectos de la epidermis de barrera, desregulación
inmune, y el aumento de infecciones de la piel. Anteriormente, hemos
demostrado que bvPLA2 evocado tolerancia inmune mediante la inducción de
células T reguladoras (Treg), y por lo tanto alivia Th2 dominante asma alérgica
en ratones.Aquí, nos gustaría para determinar si el tratamiento con bvPLA2
exacerba las inflamaciones alérgicas como AD-inducidas por el extracto de
ácaro del polvo doméstico (DFE) en un modelo murino. espesor de la epidermis,
infiltración de células inmunes, la inmunoglobulina de suero, y se midieron las
citoquinas.hinchazón del oído, lesiones en la piel, y los niveles de IgE sérica
total y Th1 / Th2 estaban elevados en los ratones AD DNCB inducida DFE /. La
aplicación tópica de bvPLA2 provocó una supresión significativa del aumento
de los síntomas de AD, incluyendo grosor de la oreja, la concentración de IgE
sérica, citoquinas inflamatorias, y los cambios histológicos. Además, el
tratamiento bvPLA2 inhibe la infiltración de mastocitos en el oído. Por otro
lado, la reducción de células Treg abolió los efectos anti-atópicos de bvPLA2, lo
que sugiere que los efectos de bvPLA2 dependen de la existencia de células T
reguladoras. Tomados en conjunto, los resultados revelaron que la exposición
tópica a bvPLA2 agrava la inflamación de la piel atópica, lo que sugiere que
bvPLA2 podría ser un candidato para el tratamiento de la EA.
Palabras clave:
dermatitis atópica; bvPLA2; IgE; mastocitos; lesion de piel
1. Introducción
La dermatitis atópica (AD) es una enfermedad de la piel inflamatoria crónica
y recurrente común que resulta de la respuesta inmune dysregulated debido a
la estimulación excesiva por antígenos externos [ 1 ]. La prevalencia de la EA se
ha incrementado significativamente en los últimos años, y ahora afecta
aproximadamente al 1% -3% de los adultos y hasta un 20% de los niños [ 2 ]. La
patogénesis de la EA se ha atribuido a mecanismos alternativos que incluyen
los contaminantes, las alergias, la constitución genética y la función
inmunológica [ 3 , 4 , 5 ]. Las características clínicas de los pacientes con EA
incluyen placas eritematosas de la piel, erupción, y IgE sérica elevada y T helper
tipo de célula 2 (Th2) los niveles de citoquinas. AD pacientes también presentan
hiperplasia epidérmica y la acumulación de células cebadas y citocinas Th2
[ 6, 7 ].
Muchos casos de AD son tratados con agentes anti-inflamatorios que
modulan las respuestas Th1 y Th2 y la concentración de IgE. Los esteroides
tópicos y otros agentes inmunosupresores se utilizan comúnmente para el
tratamiento de la EA de moderada a grave. Nuevos enfoques terapéuticos
implican componentes que son importantes para el mantenimiento de la barrera
epidérmica, incluyendo la ceramida y otros componentes de enzimas de
diferenciación epidérmica [ 8 ]. Sin embargo, la incidencia y el riesgo relativo
de toxicidad de estos agentes no son insignificantes, especialmente en
niños.Recientemente, varias fuentes, tales naturales como plantas, animales,
microorganismos y hierbas han recibido atención como agentes terapéuticos
alternativos en el tratamiento de la EA debido a sus dispositivos de seguridad
probadas y potentes efectos inmunomoduladores.
El veneno de abeja (BV) de Apis mellifera contiene una variedad de péptidos y
proteínas, incluyendo la melitina, fosfolipasa A2 (PLA2), adolapin, apamina, y
degranulación de los mastocitos (MCD) péptido [ 9 , 10 , 11 ]. BV es un fármaco
anti-inflamatorio que se ha utilizado en el tratamiento del dolor, la artritis, la
enfermedad de Parkinson, y esclerosis múltiple [ 12 , 13 , 14 ]. PLA2 es uno de
los principales componentes de BV y juega un papel central en una amplia gama
de respuestas celulares, tales como el metabolismo de fosfolípidos, la
transducción de señales, y la regulación de las respuestas inflamatorias e
inmunes [ 15 , 16 ].
Nuestro estudio reciente demostró que bvPLA2 hace que la tolerancia inmune
aumentando la población de CD4 + Foxp3 + células T reguladoras (Treg) en la
nefrotoxicidad inducida por cisplatino y modelos de asma alérgica [ 17 , 18 ]. Se
encontró que los efectos protectores de bvPLA2 estar relacionado con la
modulación de células T reguladoras. Por lo tanto, la hipótesis de que bvPLA2
podría ser un agente candidato anti-inflamatorio para el tratamiento de
AD. Además, la producción de los marcadores séricos tales como el total de
citoquinas de IgE y Th1 / Th2 se redujo significativamente en los ratones
tratados con bvPLA2 en comparación con el grupo de control DFE / DNCB
sensibilizadas. Además de la infiltración de mastocitos, hiperplasia epidérmica
se reduce tras el tratamiento en ratones bvPLA2 AD. También se determinó el
papel de células T reguladoras en la supresión mediada por bvPLA2 en lesiones
de la piel. El efecto supresor de bvPLA2 fue abolida tras el agotamiento Treg
utilizando PC61 anticuerpo monoclonal anti-CD25 (mAb). Finalmente, este
estudio propone que bvPLA2 es un nuevo agente terapéutico potencial para el
tratamiento de pacientes con EA.
2. resultados
2.1. Tratamiento bvPLA2 Alivia DFE / Lesiones cutáneas DNCB inducido
Se investigaron los efectos de bvPLA2 en el alivio de los síntomas inducidos
tipo-AD-DNCB / DFE. Los ratones fueron sometidos repetidamente a la
irritación química con DNCB y el antígeno de reto con DFE en ambos lóbulos
de las orejas durante cuatro semanas ( Figura 1 A). Como era de esperar, la
administración tópica repetida de / DNCB (grupo AD) DFE aumentado
gradualmente el espesor de la oreja en comparación con los ratones normales
de control (grupo NC) por siete días. El tratamiento con bvPLA2 (16 y 80 ng /
oreja) y DEXA produjeron menores parcialmente grosor de la oreja, en
comparación con el grupo de AD. ( Figura 1 B). Aplicaciones tópicas repetidas
del DFE / DNCB indujeron una hinchazón de la piel en los oídos de los ratones
y se suscitó una mayor gravedad dermatitis como indica la gravedad de los
síntomas, tales como eritema / hemorragia, edema, excoriaciones / erosión, y la
sequedad / escala ( Figura 1 C ,RE). La administración de bvPLA2 mostró la
supresión significativa de las lesiones de la piel similar a AD.
Figura 1. Efectos del tratamiento sobre los síntomas bvPLA2-AD como DNCB
inducida DFE /. ( A ) Diseño experimental del protocolo de estudio. Para
estudiar el efecto de bvPLA2 en la dermatitis atópica, los ratones fueron
tratados con DFE / DNCB durante cuatro semanas y bvPLA2 se inyectaron por
tres semanas durante la sensibilización de antígeno; ( B ) El grosor de la oreja se
midió usando un medidor de espesor de línea 24 h después de la aplicación /
DNCB DFE; ( C ) Las imágenes de las lesiones de la piel del oído de los grupos
de ratones tomadas en el último día del experimento (día 28); ( D ) Los niveles
de gravedad de los síntomas de las lesiones de la piel del oído fueron indexados
al microscopio con el marcador dermatitis, que se especifica como la suma de
los puntos (0 = sin síntomas; 1 Los síntomas = leve, 2 = síntomas moderados, y
3 = grave síntomas) para los síntomas de eritema / hemorragia, edema,
excoriación / erosión, y la sequedad / escalado.Carolina del Norte: grupo de
control normal; AD: DFE / DNCB grupo aplicada; DEXA: DFE / DNCB aplicado
y grupo tratados con dexametasona (0,1 mg / oído, 20 l) como control
positivo; bvPLA2 (16 ng / oído): DFE / DNC aplicado y bvPLA2 (16 ng / oído)
grupo tratado; bvPLA2 (80 ng / oído): DFE / DNC aplicado y bvPLA2 (80 ng /
oído) grupo tratado. Los análisis estadísticos se realizaron con ANOVA de una
vía seguido de pruebas de comparación múltiple de Newman-Keuls
(*** p <0,001 vs. NC y ### p <0,001, ## p<0,01 vs. AD; n = 5).
2.2. Inhibe bvPLA2 / DNCB inducido por Th1 y Th2 producción de citoquinas y la IgE
sérica Niveles DFE
Para determinar los efectos de bvPLA2 sobre las respuestas / DFE DNCBinducida por AD como inflamatorias, que mide la expresión de Th1 (TNF-α, IL6 e IFN-γ) y citocinas Th2 (IL-4 e IL-13) en la proteína extraída de los tejidos del
oído. El grupo AD mostró aumento de los niveles significativos de Th1 ( Figura
2 A-C) y Th2 ( Figura 2 D, E) citoquinas, mientras que los grupos expuestos
bvPLA2 reducen significativamente los niveles de Th1 / 2 citoquinas en
comparación con el grupo de AD. Además, el grupo DEXA reduce
notablemente la expresión de citoquinas Th1 / 2 y dio como resultado un patrón
de inhibición similar a la observada para el grupo bvPLA2 (80 ng / oreja).
Figura 2. Efectos de bvPLA2 sobre la expresión de citoquinas y la IgE total en
suero. Los niveles de ( A ) IL-4; ( B ) IL-13; ( C ) IFN-γ; ( D ) TNF-α; ( E ) IL-6 en
el oído y ( F ) IgE total en el suero se cuantificaron por el ratón CBA (Th1, 2, y
17) y kit kit ELISA. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con un ANOVA
de una vía seguido por pruebas de comparación múltiple de Newman-Keuls
(*** p<0,001, ** p <0,01 y * p <0,05 vs. NC y ### p <0,001, ## p<0,01 y # p <0,05 vs.
AD; n = 5).
A continuación, se analizó el nivel de IgE total en suero. Hyper-producción
de IgE en suero se sabe que es un rasgo característico importante de AD
[ 19 ]. Como se muestra enla Figura 2 F, los grupos bvPLA2 mostraron una
reducción significativa de la concentración sérica de IgE total en una forma
dependiente de la dosis. Como se esperaba, el control positivo (grupo DEXA)
mostró una supresión dramática del aumento de Th1 / 2 citoquinas así como la
secreción de IgE total en suero. En conjunto, estos resultados sugieren
fuertemente que bvPLA2 ejerció un efecto inhibidor significativo en Th1 / 2 la
producción de citoquinas y la hiper-producción de IgE total en suero en lesiones
de la piel-AD como en el modelo de ratones / DNCB inducida DFE.
2.3. Inhibe bvPLA2 DEF / DNCB inducido AD-Como histopatológico cambios
DFE de desafío / DNCB causó cambios histopatológicos potentes que incluyen
el engrosamiento de la epidermis, la fibrosis en la dermis, y la infiltración de
células inflamatorias en la dermis [ 20 ]. Para analizar los efectos de los cambios
histopatológicos en bvPLA2 / DFE DNCB inducida en los tejidos del oído, se
evaluó el espesor epidermis, dermis, y el índice inflamatoria de las lesiones
cutáneas ( Figura 3 A, C-E). El grupo AD aumentó significativamente la
epidermis, dermis, y la infiltración de células inflamatorias en los tejidos del
oído en comparación con el grupo NC. Curiosamente, los oídos de los grupos
tratados con bvPLA2 exhibieron menos hiperplasia epidérmica y dérmica en
comparación con el grupo de AD. Específicamente, la evaluación histológica
usando H & E tinción reveló que la infiltración de linfocitos y la hiperplasia
epidérmica ejercida por inducción AD fueron atenuadas por el tratamiento
bvPLA2 de una manera dependiente de la dosis (16 y 80 ng / oreja). Estos efectos
de la bvPLA2 no eran más significativamente diferentes que las del grupo
DEXA. A continuación realizó tinción con azul de toluidina para investigar el
efecto de bvPLA2 sobre la infiltración inducida por DNCB DFE / de los
mastocitos y eosinófilos en lesiones de la piel del oído. Los mastocitos actúan
como célula efectora importante en la hipersensibilidad a través de la activación
a través del receptor de IgE en AD [ 21 ]. Como se muestra en la Figura 3 B, F,
la acumulación de mastocitos se redujo significativamente en los grupos
tratados con bvPLA2. Tomados en conjunto, estos datos indican que el
tratamiento bvPLA2 presenta un efecto dependiente de la dosis en los cambios
histopatológicos contra AD inducida por DNCB DFE /.
Figura 3. Efectos de bvPLA2 sobre los cambios histológicos de las lesiones ADcomo DNCB / DFE-inducidos en la piel. ( A ) Las secciones del oído (4 m de
espesor) se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E) y ( B ) azul de toluidina
(TB) y tomada con × 200 y 400 × magnificación; ( C ) Los espesores de la
epidermis y ( D dermis) se cuantificaron basan en las secciones teñidas con H &
E utilizando el software Image Pro-Plus 5.1 como se describe en los Materiales
y Métodos; ( E ) La evaluación de la gravedad de la oreja cambio histológico se
cuantificó usando un sistema de puntuación de cinco puntos; ( F ) El número de
mastocitos por cinco sitios seleccionados al azar se contaba con las secciones del
oído con TB manchado. ( G ) La expresión de Foxp3 en el tejido de la oreja se
determinó mediante PCR en tiempo real.Los análisis estadísticos se llevaron a
cabo con un ANOVA de una vía seguido de Newman-Keuls prueba de
comparaciones múltiples (*** p <0,001 y * p<0,05 vs. NC y ### p <0,001, ## p <0,01
y # p <0,05 vs. AD; n = 5).
2.4. bvPLA2 Contribuye a la inducción de células T reguladoras en DFE Lesiones
cutáneas similar a AD / DNCB inducido
Hemos informado anteriormente de que bvPLA2 puede inducir Foxp3 que
expresan CD4 + células T reguladoras (Tregs) en el asma inducida por OVA y
aguda modelo de lesión renal [ 17 ]. Estudio reciente ha sugerido que Tregs
inhiben Th1 y Th2 respuestas de células específicas de alérgeno, jugando un
papel en la respuesta inmune fisiológica a alergenos [ 22 ]. Para confirmar la
implicación de bvPLA2 en la inducción de células T reguladoras a las lesiones
de la piel, la expresión de Foxp3 en el tejido de la oreja se determinó mediante
PCR en tiempo real. Como era de esperar, el tratamiento bvPLA2 mostró un
aumento significativamente el nivel de ARNm de Foxp3 en las lesiones de AD como ( Figura 3 G).
2.5. Efectos de bvPLA2 en DFE Lesiones cutáneas similar a AD / DNCB-inducida a
través de la inducción de células T reguladoras
Para investigar si bvPLA2 tiene el potencial de mejorar las lesiones cutáneas
AD-como a través de la inducción de células T reguladoras, que agotados Tregs
utilizando
un
mAb
anti-CD25
(clon:
PC61)
y
determinados
CD4 + CD25 + poblaciones en el bazo en el día 1 y 7. Tratamiento de anticuerpo
PC61 eliminado completamente CD25 + células después de un día de la
inyección y el agotamiento se mantuvo durante siete días ( Figura 4 a). Los
resultados mostraron que la (isotipo IgG) grupo bvPLA2 redujo
significativamente grosor de la oreja en la oreja inflamada ( Figura 4 B). Sin
embargo, el grupo con reducción de Treg bvPLA2 (PC61) no mostró grosor de
la oreja disminuyen, pero también se agravó comparación con el grupo bvPLA2
(IgG). Todas las citoquinas se upregulated en el grupo AD (IgG), y bvPLA2
suprimen la expresión de todas las citoquinas Th1 y Th2. Encontramos un
patrón consistente de niveles más altos significativos de citocinas Th1 y Th2 por
bvPLA2 en ratones-agotado Treg ( Figura 4 C-G). En conjunto, estos datos
indican que aunque bvPLA2 puede suprimir el aumento de espesor del oído y
de citocinas Th1 y Th2 en ratones la expresión de la lesión de la piel similar a
AD, no se observaron estos efectos tras el agotamiento de las células T
reguladoras.
Figura 4. Efectos de bvPLA2 sobre lesiones de la piel similar a AD de ratones
CD25 agotados. La ratones hembra BALB / C ratones recibió una vez con una
dosis de 0,25 mg / kg de rata anti-ratón CD25 (PC61) o IgG total de rata en los
días 3, 4, 11, 17, y 25. ( A ) CD4+ CD25 + poblaciones se midieron utilizando
FACS en el día 1 y 7; ( B ) El grosor de la oreja se midió utilizando un medidor
de espesor de línea 24 h después de la aplicación / DNCB DFE. La concentración
de ( C ) IL-4; ( D ) IL-13; ( E ) IFN-γ; ( F) TNF-α; y ( G ) IL-6 se midió por el ratón
CBA (Th1, 2, y 17) y kit kit ELSA. Carolina del Norte: grupo de control
normal; AD: DFE / DNCB grupo aplicada;bvPLA2: DFE / DNC aplicado y
bvPLA2 (80 ng / oído) grupo tratado. Agotado ratones no CD25;: IgG PC61:
ratones anti-CD25-agotado. Los análisis estadísticos se realizaron con un
ANOVA de una vía seguido de Newman-Keuls prueba de comparaciones
múltiples (** p <0,01 y * p <0,05, ## p <0,01 y # p <0,05; no significativas = ns, n = 3
).
2.6. bvPLA2 Suprime los cambios histopatológicos a través de la inducción de células T
reguladoras
También se investigó los cambios morfológicos de los tejidos del oído en
respuesta a bvPLA2 y Treg agotamiento ( Figura 5 A). El grupo bvPLA2 (IgG)
mostró una supresión significativa de los niveles elevados de la epidermis y la
dermis de espesor y la infiltración de células inflamatorias en los tejidos del
oído. Aunque bvPLA2 pueden suprimir las lesiones de la piel epidérmica en el
modelo de ratones DFE / DNCB inducida, estos efectos no se observaron en el
grupo empobrecido células Treg. Tomados en conjunto, estos datos demuestran
que bvPLA2 tiene potencial para contrarrestar la lesión de la piel AD-como
asociado respuestas inflamatorias a través de la inducción de células T
reguladoras.
Figura 5. Efectos de bvPLA2 sobre los cambios histológicos en lesiones de la
piel similar a AD de ratones CD25 agotado. ( A ) Sección del oído Representante
imágenes fueron teñidas con H & E para evaluar los cambios histológicos (x 200
aumentos); ( B ) los espesores de la epidermis; y ( C ) dermis se cuantificaron en
base a las secciones H & E manchadas utilizando el software Image Pro-Plus 5.1
como se describe en los Materiales y Métodos; ( D ) La evaluación de la
gravedad de la oreja cambio histológico se cuantificó usando un sistema de
puntuación de cinco puntos. Los análisis estadísticos se realizaron con un
ANOVA de una vía seguido de Newman-Keuls prueba de comparaciones
múltiples (*** p <0,001 y * p <0,05 y ## p <0,01 y # p <0,05; no significativas = ns, n =
3).
3. Los debates
La dermatitis atópica (AD) es una enfermedad de la piel inflamatoria crónica,
que se caracteriza por prurito y lesiones cutáneas eccematosas. El aumento de
la incidencia de AD en los niños está estrechamente relacionada con una historia
potencial de eczema y se ha sugerido que un fondo genético es importante en
la patogénesis de la AD [ 23 ]. Los activadores inmunológicos difieren entre
individuos e incluyen varios alimentos, alérgenos en el aire, irritantes y
contactantes, hormonas, el estrés, el clima y los microorganismos. AD está
estrechamente relacionada con otras enfermedades atópicas, lo más
frecuentemente como parte de la tríada atópica de la dermatitis infantil de la
enfermedad alérgica, el asma y la rinitis alérgica [ 24 ]. En general, 50% -80% de
los pacientes de AD a desarrollar asma y / o rinitis alérgica.
En el presente estudio, hemos adoptado un modelo de ratón de AD-como
lesiones en la piel inflamación a través de la aplicación epicutánea de ácaros del
polvo doméstico, un alérgeno común asociado con AD humana. Hemos
demostrado claramente que no se observaron síntomas típicos de AD después
de la aplicación repetida de DFE / DNCB.Hinchazón de la oreja y no se
detectaron cambios fibróticos, y la IgE total y los niveles de citoquinas Th1 / Th2
aumentado de manera espectacular. El análisis histopatológico reveló también
la infiltración de mastocitos, que son células efectoras importantes y una fuente
de la histamina en las lesiones de la piel. tratamiento bvPLA2 suprimió
significativamente estos síntomas de AD, lo que sugiere que el efecto
beneficioso de bvPLA2 en lesiones de la piel similar a AD.
Lesiones cutáneas AD se caracterizan por la sobreexpresión de las citocinas
Th2 las citoquinas Th22 IL-4 e IL-13 e IL-22. La sobreexpresión de citoquinas
Th2 (IL-4, IL-5, y IL-13) conduce a una respuesta inmune que resulta en niveles
de IgE en suero elevado y desarrollo de eosinófilos [ 25 ]. Otro grupo informó
de que el desarrollo de la EA se asocia con la sobreexpresión de las citocinas
Th2 y Th22, mientras que las respuestas inflamatorias crónicas están mediados
por un IFN-γ y el componente Th1-12 productoras de IL y se caracterizan por
el aumento del número de células de IgE que llevan en la epidermis y la
dominación de los macrófagos en la infiltración de células mononucleares
dérmicas [ 26 ]. En nuestro modelo de lesiones de la piel similar a AD, la
expresión de citocinas Th1 y Th2, y el nivel sérico de IgE fueron marcadamente
elevados. Además, bvPLA2 suprime tanto las respuestas Th1 y Th2 tanto la
inflamación aguda y crónica de la piel provocadas por lesiones en la piel similar
a AD.
Las células Treg juegan un papel crítico en la supresión de las respuestas
inmunes aberrantes contra antígenos propios [ 27 ]. Disminución del número de
células T reguladoras en los sitios de inflamación está relacionada con la
enfermedad inflamatoria, incluyendo AD. Bae et al., Informó que los ratones
que tienen AD inducida por los ácaros del polvo mostraron una reducción en la
expresión de Foxp3, tanto en el sitio inflamado y DLN [ 28 ]. La pérdida de
células T reguladoras causada por deficiencia de Foxp3 provocó una respuesta
inflamatoria multiorgánica incluyendo inflamación de la piel que se asemeja
AD asociado con los niveles de IgE en suero elevada, eosinofilia, la producción
de citoquinas Th1 y Th2 dysregulated, y otros síntomas autoinmunes
[ 29 , 30]. El agotamiento de las células Treg durante la sensibilización
epidérmica llevó a exacerbado significativamente lesiones de la piel, incluyendo
el aumento de expresión de citocinas Th2 y los niveles de IgE en suero. Estos
informes sugieren que la falta de células T reguladoras podría contribuir a
recapitulatation de características inmunológicas importantes de la EA. En el
estudio anterior, se informó de que el papel protector de bvPLA2 como una
novela Foxp3 + Treg inductor de células en un modelo de ratón de la
enfermedad de Parkinson [ 31 ]. Por otra parte, se determinó que la
participación de las poblaciones Treg en los efectos protectores de bvPLA2 en
DFE.DNCB inducida por lesiones en la piel similar a AD. El agotamiento de
células T reguladoras utilizando PC61 anti-CD25 mAb dio como resultado una
reducción significativa de espesor de la epidermis y Th1 / 2 citoquinas tales
como IL-4, IL-13, IFN-γ, y IL-6 en los ratones tratados con AD bvPLA2. Así, el
tratamiento mejora los bvPLA2 lesiones de la piel a través de la inducción de
las células Treg, que tienen un papel importante en el control de la inflamaciónAD similares.
No se conoce ninguna cura de pacientes con EA, pero las lesiones de la piel
tratada con éxito por una variedad de agentes tópicos y / o sistémicos. Estos
incluyen la prevención de respuestas Th2, aumento de las respuestas Th1 y
disminución de la concentración de IgE. glucocorticosteroides tópicos son
remedios importantes y eficaces para el tratamiento de enfermedades alérgicas
de la piel. Sin embargo, es bien sabido que el uso prolongado de altas dosis de
glucocorticoides causa una variedad de adversos efectos.En este estudio, hemos
examinado los efectos de bvPLA2 sobre lesiones de la piel similar a AD
utilizando el modelo de ratones Balb / c. El tratamiento con bvPLA2 suprimió
significativamente el aumento de los niveles de suero de IgE y citoquinas Th1 y
Th2. Los cambios histológicos y la infiltración de mastocitos se atenuaron por
aplicación bvPLA2.Los resultados de este estudio revelaron que la exposición
tópica a bvPLA2 agrava inflamación de la piel atópica.
4. Materiales y Métodos
4.1. animales
los ratones Balb / c de 7-8 semanas de edad, hembras fueron adquiridos de
Charles River Corea (Orient Bio, Seungnam, Corea). Los animales fueron
alojados en condiciones libres de patógenos con aire acondicionado en un 12 h
luz / oscuridad ciclo con acceso libre a comida y agua durante el período
experimental (ad libitum). El estudio se realizó de conformidad con las Reglas
de Cuidado de Animales y los principios rectores del experimento con animales
y fueron aprobados por la Universidad de Kyung Hee Cuidado de Animales y
el empleo Comisión (KHUASP (SE) -12 a 015, 15 de julio de 2012).
4.2. reactivos
El veneno de abeja fosfolipasa A2 (bvPLA2, Apis mellifera ) y dexametasona
(DEXA) fueron adquiridos de Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). El
ácaro del polvo doméstico estadounidense en forma de crudo
liofilizados Dermatophagoides farinaeextracto (DFE) (Greer Laboratories, Lenoir,
Carolina del Norte, EE.UU.) se utilizó como se utilizó un antígeno y 2,4dinitroclorobenceno (DNCB) (Sigma-Aldrich) como sensibilizador para inducir
la EA en los ratones. bvPLA2 se disolvió en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) y DFE se disolvió en PBS que contiene 0,5% de Tween 20. DNCB
se disolvió en acetona y aceite de oliva (AOO) en una proporción de 3: 1. AOO
o AOO que contiene 0,5% de Tween 20 se utilizó como un vehículo.
4.3. Dermatitis Atópica Modelo
La inducción de las lesiones de AD se realizó según un protocolo experimental
descrito previamente [ 32 ]. Para inducir lesiones de AD, los ratones se
dividieron en cinco grupos de la siguiente manera ( n = 5 por grupo). Carolina
del Norte: grupo de control normal; AD: DFE / DNCB grupo aplicada; DEXA:
DFE / DNCB aplicado y grupo tratados con dexametasona (0,1 mg / oído, 20 l)
como control positivo; bvPLA2 (16 ng / oído): DFE / DNC aplicado y bvPLA2
(16 ng / oído) grupo tratado; bvPLA2 (80 ng / oído): DFE / DNC aplicado y
bvPLA2 (80 ng / oído) grupo tratado. El pelo se eliminó con loción depilación y
cinta quirúrgica (Nichiban, Tokio, Japón). Después de la eliminación del vello,
20 l de solución de DNCB 1% se aplicó a cada oído y después 20 l de 10 mg / ml
DFE se aplicó para la sensibilización cuatro días más tarde. El tratamiento de la
DFE o DNCB se repitió una vez a la semana durante cuatro semanas. Para el
tratamiento bvPLA2, los ratones fueron tratados con bvPLA2 (16 y 80 ng / oído,
aproximadamente equivalente a 0,2 y 1 picadura de abeja) aplicado con un
cepillo de cuatro veces por semana durante tres semanas. Dexametasona (50 mg
/ oreja) se trató como control positivo. En el día 28, el grosor de la oreja se midió
usando un medidor de espesor de línea (Kori Seiki MFG, Co., Tokio, Japón) y
los ratones se evaluaron con una puntuación dermatitis por medio de una
prueba ciega y se sacrificó. Las muestras de sangre se recogieron mediante
punción orbital y los tejidos del oído se retiraron para el análisis adicional. Los
experimentos se realizaron por duplicado.
4.4. El agotamiento de Treg
Anti-ratón CD25 (clon: PC61) se produjo en la casa a partir de hibridomas
obtenidos de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA,
EE.UU.). Hembra Balb / C ratones recibieron una dosis de 0,25 mg / kg de rata
anti-ratón CD25 o control IgG de rata (Sigma-Aldrich) en los días 3, 4, 11, 17, y
25. La eficacia de la depleción de Treg se analizó en 28 días por FACSCalibur
(BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.) para la expresión de CD4 y CD25.
4.5. Evaluación de la Lesión de la Piel
Los niveles de gravedad de las lesiones de la piel similar a AD-inducidas
DBCB / DFE fueron clínicamente evaluados utilizando métodos previamente
establecidos [ 33 , 34 ].Las lesiones de la piel en las orejas se puntuaron según
los siguientes cuatro síntomas: eritema / hemorragia, edema, excoriación /
erosión, y la sequedad / escalado. Puntuación Dermatitis se definió como la
suma de las puntuaciones individuales, que se calificaron sigue: 0, sin
síntomas; 1, síntomas leves; 2, síntomas moderados; y 3, síntomas graves.
4.6. La determinación de IgE en suero Los títulos
Las muestras de sangre se recogieron por centrifugación a 2500 g durante 20
min. El suero se diluyó (1: 250) con 5% de suero bovino fetal (FBS) en PBS
(diluyente de ensayo) y los niveles séricos de IgE se midieron utilizando un
ratón IgE ELISA kit (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.Brevemente, una placa de microtitulación de 96
pocillos (Costar, NY, EE.UU.) se recubrieron durante la noche a 4 ° C con antiIgE de ratón mAb. Después del lavado con PBS que contenía 0,05% de Tween
20, las placas se bloquearon con 5% de FBS en PBS durante 1 h a TA. Los 100 l
de muestras de suero diluidas se incubaron durante 2 h a TA.Secondary
marcado con peroxidasa biotinilada anti-IgE de rata mAb se incubó en tampón
de bloqueo durante 1 h. La reacción enzimática se inició por adición de solución
de sustrato TMB (BD Biosciences) durante 30 min, y la reacción se detuvo
mediante la adición de solución de parada 50 l a cada pocillo. La densidad
óptica se midió a 450 nm con un lector de microplacas (SOFT max PRO, versión
3.1. Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). El límite inferior de detección
para el ELISA de IgE fue de 1,5 ng / ml.
4.7. Evaluación de citocinas Th1 y Th2 en los tejidos del oído mediante ELISA
Los niveles de IL-4, TNF-α, IFN-γ, IL-6, y IL-13 en los tejidos del oído se
determinaron utilizando un kit de ELISA (BD Biosciences y R & D, Minneapolis,
MN, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante . Cada muestra de
tejido de la oreja se preparó por homogeneización en la proteína del tejido
reactivo de extracción (T-PER; Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, EE.UU.)
con 1 mg / ml de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania). placas de microtitulación de 96 pocillos se recubrieron durante la
noche a 4 ° C con anti-ratón IL-4, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-6 o IL-13 mAbs en
tampón de recubrimiento. Las placas se lavaron dos veces con PBS que contenía
0,05% de Tween-20 y se bloquearon con 5% de FBS en PBS durante 1 h a
TA. Después de dos lavados, las placas se incubaron durante 2 h a TA con los
homogeneizados de tejido de la oreja. El marcado con peroxidasa secundario
biotinilado anti-ratón de IL-4, TNF-α, IFN-gamma, IL-6 o IL-13 mAbs en
diluyentes ensayo se incubaron durante 1 h. Finalmente, las placas se trataron
con solución de sustrato TMB durante 30 min y la reacción se terminó mediante
la adición de solución de parada. La densidad óptica se midió a 450 nm
utilizando un lector de microplacas (SOFT max PRO).Las concentraciones de
proteína total se determinaron usando un kit BCA (Pierce Biotechnology
Inc.). Los resultados se normalizaron a la cantidad total de proteína de tejido de
la oreja en cada muestra.
4.8. Análisis histológico
Para los exámenes histopatológicos, el oído lesionado de la piel de cada ratón
se retiró y se fija con 10% de formalina tamponada neutra durante 24 horas a 4
° C. Los tejidos se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortan en
secciones de 4 micras de grosor utilizando un microtomo rotatorio. Las
secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & E; Sigma-Aldrich) para
evaluar la hiperplasia epidérmica y la infiltración de las células inmunes en la
dermis. azul de toluidina (TB) tinción se realizó para medir el grado de
infiltración de mastocitos. Las imágenes de las secciones de tejido del oído
fueron adquiridos utilizando un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Tokio,
Japón) y se cuantificaron utilizando Image Pro-Plus de software 5.1 (Media Inc.
cibernética, Silver Spring, MD, EE.UU.).
4.9. Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos se realizó usando Prism software 5
(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU., versión 5.0). Los datos se
presentan como la media ± SEM se determinaron las diferencias entre los grupos
de estudio usando ANOVA de una vía seguido de Newman-Keuls pruebas de
comparaciones
múltiples. p <0,05
fue
considerado
estadísticamente
significativo. Los experimentos con dos grupos se analizaron con dos colas
unpaired t -pruebas.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea
(NRF) subvención financiado por el gobierno de Corea (Ministerio de
Educación, Ciencia y Tecnología (MEST)) (Nº 2013-068954).
Contribuciones de autor
K.-HJ y MK llevaron a cabo los experimentos y se analizaron los datos; HB
escribió el documento; NK realizado los experimentos de revisión; SYL
contribuyó de reactivos y materiales; HB concebido y diseñado los
experimentos.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
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