UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA *CARACTERIZACIÓN MICROGRÁFICA DE SUSTANCIAS ERGÁSTICAS. *SCREENING FITOQUÍMICO PRELIMINAR DE EXTRACTOS VEGETALES **Martín Aníbal Giménez Arriola. San Lorenzo - Ciudad Universitaria - Paraguay 2019 *Trabajo Práctico N° 1 presentado a la Cátedra de Botánica Económica **Alumno de la carrera de Biología. Encargada de cátedra: Lic. Bonifacia Benitez. Prof. Encargada de laboratorio: Lic. Medes Mendoza INTRODUCCIÓN Las sustancias ergásticas son productos pasivos del protoplasto; algunos son productos de almacenaje, otros son productos de desecho, pueden situarse en el citoplasma o en la vacuola. Estas sustancias pueden aparecer y desaparecer en diferentes momentos a lo largo de la vida de la célula. Algunos ejemplos de sustancias ergásticas son: granos de almidón, cristales, pigmentos antocianínicos, gotas de aceite, resinas, gomas, taninos y cuerpos proteínicos (Esau, 1985). El almidón es la forma de almacenamiento más común de hidratos de carbono por parte de los vegetales. Se encuentra en cualquier parte de la planta siendo más abundante en los órganos de reserva como raíces, tubérculos y semillas. Se presenta en forma de pequeños granos blancos, llamados granos de almidón. La formación de estos granos tiene lugar a partir de pequeños leucoplastos que van aumentando de tamaño a medida que se va acumulando el almidón (Valla, 1993). Los taninos son un grupo heterogéneo de derivados fenólicos, muy frecuentes en el cuerpo vegetal, aparecen en las vacuolas como gránulos finos o gruesos, o cuerpos de formas variadas, de color amarillo, rojo o marrón, o pueden impregnar las paredes (Naab, 2006). Los oxalatos de calcio son corpúsculos sólidos, generalmente de reserva que se encuentran incluidos en la vacuola o en el citoplasma. Los más frecuentes son: drusas, rafidios y los estiloides, también areniscas. Se trata de sales de oxalato de calcio y magnesio, están muy difundidos como producto final del metabolismo (Esau, 1985). Los aceites y las grasas son importantes sustancias de reserva en los vegetales. Se encuentran con frecuencia tanto en semillas como en frutos. Tanto los aceites como las grasas son glicéridos de ácidos grasos. Las grasas y los aceites pueden producirse en eleoplastos o esferosomas. Los ácidos grasos más comunes en las grasas vegetales son el ácido oleico, el linoleico y el linolénico entre los no saturados, así como el palmítico y el esteárico entre los saturados (Valla, 1993). Los mucílagos son comunes en plantas desérticas y absorben agua en gran cantidad (Esau, 1985). El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas que ocurren al interior de las células. En el caso de las células vegetales, el metabolismo acostumbra a ser dividido en primario y secundario. Se entiende por metabolismo primario al conjunto de procesos metabólicos que desempeñan una función esencial en el vegetal, el metabolismo secundario origina compuestos que no poseen una distribución universal, pues no son necesarios para todas las plantas. Como consecuencia práctica, estos compuestos pueden ser utilizados en estudios taxonómicos. Un ejemplo clásico son las antocianinas y batalainas, las cuales no se ven conjuntamente en una misma especie vegetal (Puigdomènech, 1986). OBJETIVOS • Identificar la presencia de sustancias ergásticas en muestras de diferentes especies vegetales. • Aplicar métodos para la identificación de sustancias ergásticas en muestras vegetales, señalando la importancia y las ventajas que ofrece • Reconocer cualitativamente por medio de reacciones químicas algunos metabolitos secundarios presentes en extractos crudos vegetales. MATERIALES - Papa, arroz, maíz, arveja y banana. - Hojas de romero y perejil. - Hoja y tallo de mango y menta. - Hoja y tallo de begonia y tradescantia. - Hoja de aloe. - Tallos de estrella federal - Láminas y laminillas - Gotero - Pipeta - Hoja de afeitar - Lugol - Sudan III - Cloruro férrico al 10% - Acetato cúprico - Azul de metileno - Cloroformo METODOLOGÍA Primera parte 1. Almidón: Lugol Se colocaron las muestras de almidón en un portaobjeto con una gota de Lugol. Se mezcló bien y se cubrió con la laminilla. Se observó al microscopio y se caracterizó el tipo de almidón según la morfología de los granos. 2. Grasas y aceites: Sudan III Se colocaron cortes transversales de tallo y hoja sobre un portaobjeto. Se agregó la solución. Se dejó actuar 10 minutos. Se lavó rápidamente con alcohol al 70%. Se tiñeron de color rojo las grasas y los aceites. Se observó al microscopio y describió lo que ocurrió. 3. Taninos: Cloruro Férrico al 10% y Carbonato de Sodio Se colocaron cortes transversales de tallo y hoja sobre portaobjeto, se agregó unas gotas de solución acuosa de cloruro férrico al 10% con una pequeña cantidad de carbonato de sodio. Se dejó actuar durante 2-3 minutos. Se lavó con agua destilada. Se tiño de color azul-verdosa lo que indicó la presencia de taninos. Se cubrió con una laminilla y se observó bajo microscopio. 4. Oxalato de Calcio: Acetato cúprico Se agregó 5 gotas de una solución saturada de acetato cúprico a cortes transversales de hojas y tallos previamente colocados sobre un portaobjetos 5. Mucílagos: Azul de metileno Se colocaron los cortes en portaobjetos. Se agregó unas gotas de azul de metileno. Los mucílagos se reconocen por su carácter viscoso y con este tratamiento adquieren una coloración azulada. Se observó al microscopio. 6. Látex Se hizo un corte longitudinal al tallo de Euphorbia sp., se observó los tubos laticíferos y se dibujó. Segunda parte 1. Alcaloides - Se tomó alícuotas de 1 ml de solución de extracto de rutácea en 3 tubos de ensayo separados. - Se agregó a cada tubo por separado, 0.5 ml de Reactivo Dragendorff, Mayer y Wagner - Se anotó las observaciones. 2. Polifenoles - Se tomó una muestra de 2 ml de extracto de rosa mosqueta en un tubo de ensayo. - Se agregó 1 ml de cloruro férrico. - Se anotó las observaciones. 3. Flavonoides - Se tomó una muestra de 2 ml de extracto de rosa mosqueta en un tubo de ensayo. - Se agregó Magnesio en polvo. - Se agregó 2 ml de HCL. - Se anotó las observaciones. 4. Esteroles y Metilesteroles - Se tomó una muestra de 2 ml de extracto de malva en un tubo de ensayo. - Se mezcló con 50 ml de cloroformo. - Se calentó la mezcla. - Se agregó 2 ml de anhídrido acético y 2 ml de ácido sulfúrico. 5. Método de identificación TLC - Se tomó una muestra de extracto crudo de una rutácea en un vaso precipitado. - Se agregó 10 ml de mezcla cloroformo-cetona 9:1 - Se agitó con una varilla y se sembró en una TLC - Se hizo correr la TLC en una fase móvil. - Se dejó secar y se observó al UV - Se anotó lo observado. DESCRIPCIÓN Y DISCUSIÓN Primera parte: • Figura N° 1: Oxalato de Calcio – Muestra de Begonia cucullata – A: 400x Se realizó el corte transversal de tallo de Begonia cucullata. En el parénquima se observaron cristales prismáticos, que se forman generalmente en las vacuolas, y se los considera como productos de excreción. La cristalización está asociada con un sistema de membranas: se forman complejos membranosos en el interior de la vacuola, que luego originan las cámaras en las que se desarrollan los cristales. También pueden formarse en vesículas derivadas de los dictiosomas o del RE o producidas por invaginación de la membrana plasmática (Franceschi & Horner Jr., 1980). • Figura N° 2: Oxalato de Calcio – Muestra de Tradescantia sp – A: 400x Se realizó el corte transversal de la hoja de Tradescantia sp., y en el parénquima, se observaron rafidios en forma de aguja. Según Esau (1985), son corpúsculos sólidos, generalmente de reserva que se encuentran incluidos en la vacuola o en el citoplasma y se trata de sales de oxalato de calcio y magnesio, están muy difundidos como producto final del metabolismo. • Figura N° 3: Taninos – Muestra de Mentha × piperita – A: 100x Se observó el corte transversal del tallo de Mentha × piperita, bajo la epidermis se logró distinguir células teñidas de color verdoso, lo que confirmó la presencia de polifenoles. Según menciona Peralta (2014), Mentha × piperita es usada para tratar diversos padecimientos gastrointestinales y gastritis, así como en la industria farmacéutica y agroalimentaria. También se ha reportado como una fuente importante de compuestos polifenólicos y antioxidantes. • Figura N° 4: Taninos – Muestra de Mangifera indica – A: 400x Se observó el corte transversal del tallo de Mangifera indica, bajo la epidermis se logró distinguir capas de células teñidas de color verdoso, gracias a esto se confirmó la presencia de polifenoles. Peralta (2014), menciona que los taninos sirven para proteger a la planta de la deshidratación, de la putrefacción y del ataque de los microorganismos. De propiedades astringentes, precipitan con las sales férricas y dan productos de color azul, negro o verde. • Figura N° 5: Almidón – Muestra de Oryza sativa – A: 400x Se realizó un corte de Oryza sativa, y se observaron grupos de estructuras poliédricas, sin estriaciones, que corresponde a un almidón compuesto. Según Naab (2006), el almidón es un polisacárido formado por dos tipos de moléculas: amilosa (30%), molécula lineal, que se encuentra enrollada en forma de hélice, y amilopectina (70%), molécula ramificada. • Figura N° 6: Almidón – Muestra de Pisum sativum – A: 400x Se realizó un corte de Pisum sativum, y se observaron estructuras aovadas y un poco alargadas sin estriaciones, estas estructuras de almidón se vieron teñidas de color marrón. Para Naab (2006), durante la maduración de Pisum sativum, el contenido de azúcar disminuye rápidamente y surge un vertiginoso incremento del contenido de almidón y otros polisacáridos y compuestos nitrogenados insolubles. • Figura N° 7: Almidón – Muestra de Musa paradisiaca – A: 100x Se realizó un raspado de Musa paradisiaca. Se observó una estructura de forma oval, con estrías transversales, sin hilo observado, corresponde a un almidón simple. Según Esau (1985), los granos de almidón tratados con Lugol (solución de Iodo) toman una coloración azul intenso. La importancia de los granos de almidón consiste en que, según su forma, tamaño, estructura, sirven para determinar especies y descubrir alteraciones. • Figura N° 8: Almidón – Muestra de Solanum tuberosum – A: 400x Se realizó un raspado de Solanum tuberosum. Se observó una estructura de forma oval, con un hilo puntiforme, excéntrico y con estriaciones concéntricas bien definidas, que corresponde a un almidón simple. Según Peralta (2014), el almidón se encuentra en cualquier parte de la planta siendo más abundante en los órganos de reserva como raíces, tubérculos y semillas. Se presenta en forma de pequeños granos blancos, llamados granos de almidón que presentan un núcleo denominado hilo, de donde se forman anillos concéntricos o estriaciones de distinta densidad debido a la disposición de las distintas capas adicionales de almidón. Poseen formas y características diferentes según las distintas especies vegetales lo que sirve como elemento de valoración e identificación. • Figura N° 9: Almidón – Muestra de Zea mays – A: 400x Se realizó un corte de semilla de Zea mays. Se observó estructuras esféricas con un hilo central con forma alada, sin estrías, corresponde a un almidón simple. El almidón se encuentra en células parenquimatosas de corteza, médula y tejidos vasculares de tallos y raíces; en el parénquima de frutos, hojas, rizomas, tubérculos o cotiledones carnosos y en el endospermo de las semillas (Naab, 2006). • Figura N° 10: Grasas y aceites – Muestra de Petroselinum crispum – A: 400x Se realizó un corte transversal de la hoja de Petroselinum crispum. En las células parenquimatosas se observaron algunas teñidas de color rojo además de la cutícula también se vio teñida del mismo color. Según Naab (2006), son formas de almacenamiento de lípidos; en forma de gotas en el citoplasma (glóbulos lipídicos) o en los eleoplastos y Se observan al microscopio tiñéndolos con colorantes lipófilos como Sudán III o Sudán IV. • Figura N° 11: Grasas y aceites – Muestra de Rosmarinus officinalis – A: 400x En un corte transversal de hoja de Rosmarinus officinalis se observó células parenquimatosas y cutícula teñidos de color rojizo. Naab (2006) ha mencionado que, en los estudios realizados al romero, se ha visto, por ejemplo, el efecto que tiene en el rendimiento y composición del aceite la absorción de hierro, micronutriente que forma parte de la fotosíntesis y la respiración. • Figura N° 12: Mucílago – Muestra de Aloe vera – A: 400x Se realizó un corte longitudinal de Aloe vera, y se observó el mucílago con coloración azulada, que según Esau (1985), es una sustancia vegetal viscosa, coagulable al alcohol. También es una solución acuosa espesa de una goma o dextrina utilizada para suspender sustancias insolubles y para aumentar la viscosidad. • Figura N° 12: Látex – Muestra de Euphorbia milii splendens – A: 100x Se realizó un corte de Euphorbia milii splendens. Se observaron los tubos laticíferos, individuales que acumulan el látex, y presentaron una forma alargada y tubular. Según Puigdomènech (1986), el látex natural es una suspensión acuosa coloidal compuesta de algunas grasas, ceras y diversas resinas gomosas obtenida a partir del citoplasma de las células laticíferas presentes en algunas plantas angiospermas. Segunda parte: 1. Alcaloides Se comprobó la presencia de alcaloides en un extracto de un ejemplar de la familia Rutaceae. - Prueba de Dragendorff: Al primer tubo de ensayo se le aplicó reactivo de Dragendorff y se observó que la reacción adquirió una coloración naranja, lo cual confirma la presencia de alcaloides, ya que según Bourne & Danielle (1987), la prueba es positiva para alcaloides al dar la placa precipitados de color rojo, naranja o marrón. - Prueba de Wagner: Al segundo tubo se le aplicó reactivo de Wagner, la muestra se tornó de color café. Según Bourne & Danielle (1987), la mayoría de las soluciones aciduladas de alcaloides forman precipitados floculantes de color marrón. - Prueba de Mayer: Al tercer tubo de ensayo se le aplicó reactivo de Meyer. Se observó que la muestra presentó turbidez, siendo éste una reacción positiva. Según Bourne & Danielle (1987), este reactivo se emplea para la caracterización no específica de alcaloides. La mayoría de los alcaloides reaccionan dando un precipitado blanco o amarillo claro, amorfo o cristalino. 2. Polifenoles Se comprobó la presencia de alcaloides en un extracto de Rosa rubiginosa. Se utilizó un tubo de ensayo y se le agregó cloruro férrico y se observó la reacción, la cual formó un precipitado de una coloración pardo. Lo cual indica la presencia de taninos en la muestra, ya que según Bourne & Danielle (1987) es un compuesto que se oxida al contacto con el aire, es inodoro y de sabor agrio, soluble en agua, alcohol o acetona; y reacciona con el cloruro férrico y otras sales. 3. Flavonoides Se comprobó la presencia de Flavonoides en un extracto de Rosa rubiginosa. Se utilizó un tubo de ensayo y se le agregó Magnesio en polvo más HCl, le muestra se tiñó de color fucsia comprobando la presencia de flavonoides. La prueba de Shinoda se utiliza para flavonoides con tengan es su estructura un núcleo benzopireno como las flavonas, flavonoles, flavanonas, etc. Según mencionan Bourne & Danielle (1987) producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o alcohólicas. Se adiciona magnesio seguido de ácido clorhídrico (HCL) concentrado. 4. Esteroles y Metilesteroles Se comprobó la presencia de esteroles en un extracto de Malva sylvestris. Tras agregar anhídrido acético y ácido sulfúrico la muestra se tornó de color verduzco. Según establecen Bourne & Danielle (1987) la prueba de liebermannburchard confirma mediante la presencia de color, la presencia de metabolitos secundarios, si es azul o verde se confirma esteroides y rojo o violeta para triterpenos. 5. Método de identificación TLC Se aplicó la cromatografía de capa fina para un extracto de Rutaceae. Se observaron manchas que luego fueron confirmadas bajo la luz ultravioleta. Según mencionan Bourne & Danielle (1987) las manchas de color son inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante luz UV; si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente CONCLUSIÓN Se identificó la presencia de sustancias ergásticas en muestras de diferentes especies vegetales. También se valoró la importancia de la aplicación de métodos para la identificación de metabolitos secundarios en muestras vegetales durante la práctica. BIBLIOGRAFÍAS - Bourne, G.; & Danielli, J. (1987). International Review of Cytology. Academic Press. 299-315 p. - Esau, K.1985. Anatomía de las plantas con semilla. Ed. Hemisferio Sur. Bs As. - Franceschi, V. Horner, Jr. 1980. Calcium oxalate crystals in plants. Bot. Rev. 46 (4): 361- 427. - Naab, O. 2006. Cátedra de biología. Apunte teórico, vacuolas y sustancias ergásticas. Facultad de Agronomía. - Peralta, I. 2014. Citología III: Sustancias ergásticas. FCA-UNCU. 32 p. - Puigdomènech, P. 1986. Enciclopedia de las Ciencias; Las plantas, el mundo de la botánica. Ediciones Orbis S.A. 132 p. - Valla, J. 1993. Morfología de las plantas superiores. Ed. Hemisferio Sur S.A. Argentina. Indicadores Puntos Entrega a tiempo 1p Puntualidad 1p Responsabilidad 1p Trabaja en clase 1p Trabajo completo 1p Total 5p Logrados
