PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIÓN DE LAS MISMAS, EVALUANDO TRES COMPUESTOS PROTECTORES, PERTENECIENTES AL BANCO GENÉTICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS ANDRES VICENTE CASTAÑEDA RANGEL UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTÁ D.C. 2015 PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIÓN DE LAS MISMAS, EVALUANDO TRES COMPUESTOS PROTECTORES, PERTENECIENTES AL BANCO GENÉTICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS ANDRES VICENTE CASTAÑEDA RANGEL Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Biología Director MSc. MIGUEL Á. PIRAGAUTA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTÁ D.C. 2015 DEDICATORIA “Hay hombres que luchan un día y son buenos. Hay otros que luchan un año y son mejores. Hay quienes luchan muchos años, y son muy buenos. Pero hay los que luchan toda la vida, esos son los imprescindibles”. Bertolt Brech Este trabajo va dedicado a todas aquellas personas cercanas a mí que fueron un apoyo constante durante estos años en la universidad. De igual forma esta dedicatoria concierne a aquellas personas que hicieron difícil mi camino, porque demostrarles que si podía cumplir mis objetivos pese a las adversidades, resultó ser una motivación aún más fuerte para mí. Una dedicatoria especial a mi familia y a mi prometida Adriana Calderón, una investigadora cuyas enseñanzas y apoyo afectivo están muy relacionadas con la finalización exitosa de este proyecto. AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo fue posible gracias a múltiples personas que de forma directa o indirecta intervinieron en su realización: La Universidad Distrital Francisco José de Caldas, por haberme dado una formación integral como Licenciado en Biología a través de sus docentes y sus espacios. A mi director, el docente Miguel Á. Piragauta MSc. por confiar en mí y en mi trabajo, por abrirme las puertas del laboratorio de Microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, por su asesoría y dirección. A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza, por su guía, sus consejos durante el desarrollo del trabajo y su apoyo frente a la realización del mismo. A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castañeda, quienes aportaron valiosa información y experiencia durante mi estadía en el laboratorio a través de su proyecto. A la docente Gloria Stella Acosta Peñaloza MSc., quien amablemente dio su apoyo como revisora y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los científicos solemos enfrascarnos. A Gineth Adriana Calderón, por su colaboración en distintas etapas de este trabajo. He mencionado a grosso modo solo a algunas personas, pido por ello disculpas a aquellos que no mencioné, pues sus aportes también fueron importantes para el éxito de este proyecto. CONTENIDO RESUMEN .................................................................................................................................... 10 ABSTRACT ................................................................................................................................... 10 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 11 2. MARCO REFERENCIAL ........................................................................................................ 13 2.1. IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES MICROBIOLÓGICAS. ........................................................................................................... 13 2.2. CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS. .......................................................... 14 2.2.1. Conservación a corto plazo. .......................................................................................... 14 2.2.2. Conservación a mediano plazo. Criopreservación. ....................................................... 14 2.2.3. Conservación a largo plazo. .......................................................................................... 15 2.2.3.1. Liofilización. .......................................................................................................... 15 2.2.3.2. Control de calidad de un producto liofilizado. ....................................................... 20 2.2.3.3. Equipamiento para liofilizar. .................................................................................. 21 3. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 22 3.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 22 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 22 4. METODOLOGÍA ...................................................................................................................... 23 4.1. FASE INICIAL. ................................................................................................................. 23 4.1.1. Acervo Microbiano. ...................................................................................................... 23 4.1.2. Elección de los protectores. .......................................................................................... 23 4.1.2.1. Crioprotectores. ...................................................................................................... 23 4.1.2.2. Lioprotectores......................................................................................................... 23 4.2. FASE INTERMEDIA 1..................................................................................................... 24 4.2.1. Evaluación de la eficacia del método de conservación. ................................................ 24 4.2.1.1. Viabilidad. .............................................................................................................. 24 4.2.1.2. Estabilidad Morfológica. ........................................................................................ 25 4.2.1.3. Pureza. .................................................................................................................... 25 4.2.2. Recuperación de los microorganismos. ........................................................................ 25 4.2.3. Criopreservación. .......................................................................................................... 26 4.2.3.1. Precriopreservación. ............................................................................................... 26 4.2.3.2. Preparación del inóculo bacteriano y ejecución de la criopreservación................. 26 4.2.4. Liofilización. Etapa 1. ................................................................................................... 26 4.2.4.1. Preliofilización y preparación del inóculo bacteriano. ........................................... 26 4.2.4.2. Ejecución de la liofilización. .................................................................................. 26 4.2.4.3. Posliofilización (Rotulado y almacenaje). ............................................................. 27 4.2.5. Rehidratación o Reconstitución. Etapa 2. ..................................................................... 29 4.3. FASE INTERMEDIA 2..................................................................................................... 29 4.3.1. Liofilización definitiva.................................................................................................. 29 4.3.1.1. Preliofilización y preparación del inóculo bacteriano. ........................................... 29 4.3.1.2. Ejecución de la liofilización. .................................................................................. 30 4.3.1.3. Posliofilización. ...................................................................................................... 30 4.3.1.4. Rehidratación. ........................................................................................................ 30 4.3.2. Control de calidad de la liofilización y ajustes técnicos. .............................................. 30 4.3.2.1. Propiedades físicas generales. ................................................................................ 30 4.3.2.2. Contaminación. ...................................................................................................... 30 4.3.2.3. Tiempo de redisolución o reconstitución. .............................................................. 31 4.3.3. Pruebas adicionales. ...................................................................................................... 31 4.3.3.1. Prueba de higroscopicidad másica. ........................................................................ 31 4.3.3.2. Prueba de estabilidad acelerada.............................................................................. 31 4.3.4. Control de esterilidad. ................................................................................................... 32 4.3.4.1. Medios. ................................................................................................................... 32 4.3.4.2. Ambiente. ............................................................................................................... 32 4.3.4.3. Técnicas de siembra y manipulación de elementos. .............................................. 32 4.4. FASE FINAL...................................................................................................................... 32 4.4.1. Base de datos................................................................................................................. 32 4.4.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 33 4.4.3. Revisión de etiquetas y logística del banco de cepas en el Freezer. ............................. 33 4.4.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 33 4.4.5. Manual de procedimientos. ........................................................................................... 33 5. RESULTADOS .......................................................................................................................... 34 5.1. RECUPERACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIÓN DE LA CRIOPRESERVACIÓN. ......................................................................................................... 34 5.2. CARACTERÍSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO. ................................................................................................................................. 35 5.3. EVALUACIÓN DE LA LIOFILIZACIÓN. PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL. ............................................................................................................................... 38 5.3.1. Viabilidad y selección del lioprotector general. ........................................................... 38 5.3.2. Aspecto físico del liofilizado. ....................................................................................... 41 5.4. LIOFILIZACIÓN DEFINITIVA. .................................................................................... 41 5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIÓN. ................................................ 42 5.5.1. Propiedades físicas generales. ....................................................................................... 42 5.5.2. Contaminación. ............................................................................................................. 45 5.5.3. Tiempo de redisolución................................................................................................. 45 5.6. PRUEBAS ADICIONALES. ............................................................................................ 46 5.6.1. Prueba de higroscopicidad másica. ............................................................................... 46 5.6.2. Prueba de estabilidad acelerada. ................................................................................... 47 5.7. PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIÓN. ...................................................... 47 5.7.1. Base de datos................................................................................................................. 47 5.7.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 47 5.7.3. Revisión de etiquetas y logística del banco de cepas en el Freezer. ............................. 47 5.7.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 48 5.7.5. Manual de procedimientos de conservación. ................................................................ 48 6. ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................................................ 49 7. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 54 8. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 55 9. REFERENCIAS ........................................................................................................................ 56 10. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 60 11. ANEXOS .................................................................................................................................. 62 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema general de la conservación de microorganismos mediante el proceso de liofilización. .......................................................................................................................... 16 Figura 2. Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado ................................. 17 Figura 3. Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua. ........................................... 18 Figura 4. Descripción global del proceso de liofilización .......................................................... 19 Figura 5. Esquema general de un liofilizador y sus componentes. .......................................... 21 Figura 6. Metodología .................................................................................................................. 23 Figura 7. Rótulos creados para los viales liofilizados. .............................................................. 28 Figura 8. Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad, de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego de la descongelación .................................................................................... 35 Figura 9. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados....................................................... 38 Figura 10. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados....................................................... 39 Figura 11. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados....................................................... 39 Figura 12. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados....................................................... 40 Figura 13. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados....................................................... 40 Figura 14. Comparación entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilización definitiva, por cepa bacteriana. .................................................................... 41 Figura 15. Transición física de liofilizados conforme se realizaron los ajustes. ..................... 45 Figura 16. Contenido de agua absorbida (%) en función del tiempo por parte del lioprotector general en viales y crioviales. ........................................................................ 46 Figura 17. Organigrama de la base de datos. ............................................................................ 47 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas. .................................... 24 Tabla 2. Número de repeticiones (y tubos), según lioprotector y concentración. .................. 27 Tabla 3. Código de colores propuesto según la clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS. .................................................................... 28 Tabla 4. Rehidratación de los crioviales..................................................................................... 29 Tabla 5. Prueba de estabilidad acelerada. ................................................................................. 31 Tabla 6. Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados. ...... 33 Tabla 7. Evaluación de la eficacia del método de conservación (criopreservación). ............. 34 Tabla 8. Características macroscópicas de la cepa CM-CR004............................................... 36 Tabla 9. Características macroscópicas de la cepa CM-CR006............................................... 36 Tabla 10. Características macroscópicas de la cepa CM-CR007............................................. 37 Tabla 11. Características macroscópicas de la cepa CM-CR009............................................. 37 Tabla 12. Características macroscópicas de la cepa CM-CR010............................................. 38 Tabla 13. Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad. ............................................................................................................................ 41 Tabla 14. Tabla de convenciones. ............................................................................................... 42 Tabla 15. Liofilizados en la fase intermedia 1. .......................................................................... 42 Tabla 16. Liofilizados de la prueba de estabilidad natural, liofilización definitiva y de la prueba de estabilidad acelerada. ....................................................................................... 44 Tabla 17. Tiempo de redisolución de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado. ............. 46 10 RESUMEN La vida no es posible sin la intervención de los microrganismos y, dada su importancia, se han creado colecciones biológicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia y la tecnología. Existe variedad de métodos de preservación, en este trabajo se determinó el estado de criopreservación de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad, estandarizando e implementando además el sistema de liofilización, teniendo como punto de partida a los mismos, evaluándolos frente a tres compuestos protectores. Se realizó una evaluación de los métodos de conservación teniendo como base tres indicadores, viabilidad, estabilidad morfológica y pureza; encontrando que el sistema de criopreservación implementado en el laboratorio es óptimo y el glicerol al 67%v/v funciona para casi todas las cepas por largos períodos de tiempo; la sacarosa 10%p/v resultó ser el mejor lioprotector de los tres evaluados, designándolo como lioprotector general para el laboratorio. Se creó un manual de laboratorio para la conservación de cepas, que incluye los protocolos de criopreservación y liofilización y de seguridad de los mismos. Este trabajo aporta al campo de la microbiología de la conservación y constituye un peldaño más para el registro del Banco Genético del Laboratorio de Microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC), ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes. PALABRAS CLAVE: Criopreservación, liofilización, lioprotectores, conservación, microorganismos. ABSTRACT Life is not possible without the intervention of microorganisms and, given its importance, have been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science and technology. Exists variety of methods of preservation, in this work was determined the state of cryopreservation five bacterial strains by viability testing, standardizing and further implementing the system freeze-drying, taking as a starting point to them, evaluating them against three protective compounds. An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators, viability, morphological stability and purity was performed; finding cryopreservation system implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67% v/v works for almost all strains for long periods of time; sucrose 10% w/v lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated, designating it as a general lyoprotectant for the laboratory. It was created a manual for conservation laboratory strains, including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of themselves. This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant national and international institutions. KEYWORDS: cryopreservation, freeze-drying, lyoprotectants, conservation, microorganisms. 11 1. INTRODUCCIÓN La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible, pues, como lo menciona Hurtado (2009), la vida no es posible sin la actividad de estos, ya que están involucrados en todas las dinámicas ambientales existentes en el planeta. Sin embargo, su importancia ha ido más allá, desde que fueron descubiertos hace unos 300 años por van Leeuwenhoek, potencializándose su investigación y utilización en distintos campos de la ciencia y la tecnología en los últimos 100 años, iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi & Mayz, 2003). Debido a esto, se han creado colecciones biológicas, como método para preservar la diversidad microbiana fuera de su nicho. Las colecciones de cultivos microbianos están representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt, y a nivel internacional por la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC), en donde existen actualmente 2´520.200 microorganismos en 711 colecciones de 71 países registrados en el Centro Mundial de Datos de Microorganismos (WDCM). Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente registradas ante la WFCC en la WDCM: el CIAT (Rhizobium Collection America) de código WDCM 536 y la CM-PUJ (Colección de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana) de código WDCM 857 (WFCC, 2015). No obstante, varias universidades del país, instituciones públicas o privadas que desarrollan proyectos relacionados con ciencias biológicas, poseen colecciones microbiológicas aun no registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt, como es el caso de la Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia (IBUN); en otros casos las colecciones están en proceso de registro o en formación como en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC), entre otras. En este tipo de colecciones es imprescindible establecer métodos de conservación fiables, que, entre otras cosas, eviten al máximo el riesgo de pérdida o de variabilidad genética de los individuos. Existe variedad de métodos de conservación, según sea el tiempo que estarán en la colección o el tiempo en que tardarán en ser usados; dentro de ellos destacan la criopreservación y la liofilización, métodos utilizados para la colección de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas y que fueron evaluados en este trabajo. Martínez & Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Genético en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC, siglas de la colección microbiológica), utilizando la refrigeración como método primario implementando y estandarizando además el sistema de criopreservación. En este trabajo, se pretendió determinar el estado de criopreservación de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad, implementando y estandarizando además el sistema de liofilización, teniendo como punto de partida a los mismos, evaluándolos frente a tres compuestos protectores. Para ello, en primera estancia, se recibió una capacitación sobre manejo y control de microrganismos, preparación de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los laboratoristas encargados; posteriormente se evaluó el estado de criopreservación de las cinco cepas seleccionadas, utilizando técnicas de recuento en placa estándar, y se evaluó a tres lioprotectores para la liofilización de cepas microbianas del Banco Genético; además, se realizaron 12 los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservación y, se diseñaron los protocolos para la implementación del sistema de liofilización con las cinco cepas y el lioprotector que presentó mejores resultados en este estudio. Para la realización de estos fines, el trabajo fue dividido en cuatro fases, comenzando por los criterios de elección de los microrganismos y los lioprotectores, seguido de la evaluación de los métodos de preservación, utilizando tres indicadores: viabilidad, estabilidad morfológica y pureza; posteriormente, una tercera fase de ajustes a la liofilización para lograr un producto fiable y funcional a largo plazo, utilizando como indicadores las propiedades físicas generales, la posibilidad de contaminación en el proceso y el tiempo de redisolución; finalmente, una cuarta fase, que corresponde al proceso de documentación, este incluye la revisión y modificación de la base de datos, la elaboración de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos liofilizados, así como de fichas resumen para cada trabajo presente en la colección y finalmente la elaboración del manual de procedimientos. Con lo anterior se encontró que el sistema de criopreservación desarrollado por Martínez & Mayorga (2013) es eficiente, y permite porcentajes de recuperación bastante altos, incluso superiores al 90% luego de dos años; sin embargo, no todas las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que están expuestas por este método. De otro lado se determinó la sacarosa al 10% como el mejor lioprotector para bacterias en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las características propias de cada organismo) y se estandarizó el sistema de liofilización. Este trabajo se formula como pilar principal en la implementación de un nuevo método de conservación de microorganismos para el Banco Genético de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, además aporta al conocimiento prexistente de la liofilización en bacterias y ofrece información y/o tips sobre el proceso de liofilización en general, que no suele mencionarse en otros trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso. También se constituye como otro sustento para el proceso de registro del Banco Genético en la comunidad científica, a nivel nacional e internacional. Este documento consta, en su orden, de un capítulo de introducción y un marco referencial; de los objetivos tanto general como específicos alcanzados en este trabajo; una metodología detallada paso a paso perfectamente reproducible; los resultados encontrados así como el análisis de los mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigación; finalmente, un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo, el campo de la conservación microbiana, y los capítulos correspondientes a las referencias y bibliografía utilizada. Se incluye también un capítulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en la comunidad científica del presente trabajo. 13 2. MARCO REFERENCIAL 2.1. IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES MICROBIOLÓGICAS. La vida en la Tierra no sería posible sin la actividad continua de los microorganismos (Hurtado, 2009), ya que están involucrados con las dinámicas en los ecosistemas terrestres, aéreos y acuáticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta. Existen microorganismos que degradan la materia orgánica haciéndola nuevamente disponible para las plantas (Olalde Portugal & Aguilera Gómez, 1998), evitando que el mundo sea un vertedero; mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnológicos de la humanidad. Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en donde, encontramos como primeros representantes a las bacterias, las más numerosas, encargadas de sostener la vida en nuestro planeta. Estos organismos ancestrales han colonizado exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal & Aguilera Gómez, 1998), muchas pueden resultar benéficas para ser utilizadas con fines biotecnológicos, agrícolas, biomédicos, ecológicos y de biorremediación (Morales-García et al., 2010). Otros microorganismos de gran importancia son los micro hongos, estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia distribución en la naturaleza, contribuyendo a la descomposición de la materia orgánica y participando en los ciclos biológicos (Pontón, Moragues, Gené, Guarro, & Quindós, 2002). El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solución de los graves problemas de la humanidad (Gonzáles, de Oca Martínez, Riverón, & Núñez, 2006), en la agricultura, alimentación, salud y en la búsqueda de nuevas fuentes de energía y la conservación del medio ambiente. Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar variedad de funciones bioquímicas; para Atlas (citado por Olalde Portugal & Aguilera Gómez, 1998) dicha capacidad se basa “en la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de reacciones: oxidaciones, reducciones y precipitaciones,… y que de manera directa o indirecta gobiernan todos los procesos en la tierra” (pág. 289). Los recursos microbiológicos (microorganismos, genes e información) son la materia prima esencial para el avance de la tecnología, las ciencias de la vida (Ivshina & Kuyukina, 2013), el desarrollo de medicamentos farmacéuticos, agentes agroquímicos, biocontroles, cosméticos y productos industriales (Ten Kate, 1995). Además, con el surgimiento de los medios de cultivo para el crecimiento y el éxito de los primeros aislamientos de microorganismos, se marcó la necesidad de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la conservación de toda la biodiversidad microbiana, logrando la inclusión de este tema en el desarrollo de las políticas ambientales (Gonzáles et al., 2006). El método de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta, fuera de sus ambientes, ecosistemas y nichos, ha sido la creación de colecciones biológicas, cuyo principal objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfológicos, fisiológicos o genéticos (Montes de Oca et al., 2008). Las colecciones de cultivos microbianos varían en forma, función y tamaño. Pueden ser pequeñas, privadas, mantenidas por un solo investigador y limitado a una fuente o taxones específicos (Durães Sette, Pagnocca, & Rodrigues, 2013). 14 El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura básica de investigación en ciencias de la vida, llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones ex situ (Stromberg, Dedeurwaerdere, & Pascual, 2013) de animales y plantas; pero se cuentan con características específicas para los microorganismos. En primer lugar, los organismos microbianos tienen una variación genética extremadamente alta y altos índices de mutación en la reproducción en las especies; por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex situ (Stromberg et al., 2013) a su lugar de recolección. En segundo lugar, las colecciones proporcionan material para analizar estrategias de conservación, asegurar los recursos genéticos ante futuras necesidades imprevistas e importantes; para proporcionar biomateriales autenticados, para materiales de investigación, exploración y producción así como su uso contemporáneo por parte de las entidades privadas y públicas (Stromberg et al., 2013). Los microorganismos al igual que otros seres vivos, poseen una única e irremplazable secuencia de ADN, por lo que su desaparición implicaría la pérdida irreversible de un conjunto único de información (Olalde Portugal & Aguilera Gómez, 1998), de ahí la gran importancia en la creación de comités, comisiones, federaciones y grupos de microbiología como: World Federation for Culture Collection (WFCC), International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre otros, encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservación ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC, 2010b). 2.2. CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS. En las colecciones es necesario establecer métodos de conservación confiables y especiales, pudiendo realizarse a corto, mediano y largo plazo, para asegurar la óptima viabilidad, almacenamiento y pureza (WFCC, 2010b) de los diferentes microorganismos. Para brindar seguridad y reducir los riesgos de pérdida, cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en mínimo dos métodos (WFCC, 2010b) de conservación, que consideren el tiempo a emplear en la preservación inicial, manipulación y control periódico de las cepas, así como el espacio de almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemán, Díaz Rosa, & Álvarez Molina, 2005). Se debe tener especial cuidado con géneros y especies todavía no conservadas en colecciones (especies nuevas), contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos óptimos (WFCC, 2010a) de conservación de estos. 2.2.1. Conservación a corto plazo. Comúnmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestión será utilizado en un corto periodo de tiempo. Suele utilizarse la técnica de resiembra continua; en este, el microorganismo se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento, es almacenado a 4°C, donde se mantiene para su uso, resembrándolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-García et al., 2010). 2.2.2. Conservación a mediano plazo. Criopreservación. Este concepto agrupa a las técnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los microorganismos de 2 a 5 años (Weng et al., 2005). Existen variedad de técnicas como la desecación el gel de sílice o perlas de vidrio, el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al., 2005) o la congelación. La inclusión de esta última técnica en este grupo es discutida por algunos autores, ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilización como la criopreservación (o 15 congelación) son técnicas de conservación a largo plazo (Perry, 1995; Weng et al., 2005) y otros insisten su inclusión en las técnicas de conservación a mediano plazo (Morales-García et al., 2010). La criopreservación consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas. Esto permite la eliminación del agua libre disponible, y que en el interior de los individuos, “sólo una proporción del total de agua se convierta en hielo” (Perry, 1995, pág. 23), El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 ° C a menudo conduce a un buen nivel de viabilidad, teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta pérdida de la viabilidad del cultivo (Perry, 1995) por parte del laboratorio. Este método es costoso debido a la infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las células a -80°C (Morales-García et al., 2010). Heckly (citado por Perry, 1995) indica que ante estas bajas temperaturas, la viabilidad celular es casi independiente del período de almacenamiento; además se cree que los individuos criopreservados, siguen siendo genéticamente estables. Hubálek (2003), menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de la criopreservación de microorganismos, desde las características propias del individuo (cepa, especie, tamaño y forma de celda, fase de crecimiento al momento de congelar, composición de las células, etc.), así como los factores antes (composición del medio de crecimiento, pH, temperatura de incubación…), durante y posterior al proceso de criopreservación (densidad poblacional, aditivos, temperatura y duración del almacenamiento…), e incluso en su descongelación. “Los aditivos crioprotectores son compuestos químicos de gran afinidad por el agua y son utilizados para disminuir los daños durante el proceso de congelación” (Gonzáles et al., 2006, pág. 16). Estos protectores se pueden clasificar según su peso molecular (bajo o alto) o según su tasa y/o capacidad de penetración: los penetrantes, de bajo peso molecular, que desplazan el agua intracelular evitando la formación de hielo (por ejemplo el glicerol), y los no penetrantes, de alto peso molecular, que promueven la rápida deshidratación de la célula (por ejemplo los glúcidos) (Hubálek, 2003). 2.2.3. Conservación a largo plazo. Este concepto agrupa a las técnicas que además de minimizar al máximo el riesgo de cambio genético en las células, mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 años o más (Weng et al., 2005). La más popular es la liofilización. 2.2.3.1. Liofilización. La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por sublimación del hielo bajo alto vacío y a presiones muy bajas (Gonzáles et al., 2006) utilizando un equipo llamado liofilizador. Si la liofilización es exitosa, se puede asegurar una viabilidad posliofilización por varios años de los microorganismos, sin embargo, dicho éxito depende de múltiples factores, entre otros, como los mencionados por Hubálek (2003) para la criopreservación (puesto que la liofilización posee una etapa de congelación); así mismo el tiempo de liofilización, los parámetros de liofilización, el medio, aditivo o lioprotector usado, tipo de liofilizador o accesorio utilizado, influyen en el producto final. 16 El proceso de conservación de microorganismos por liofilización se puede dividir en múltiples etapas, desde la formulación del protector, hasta el modo en que se recuperarán los individuos de las muestras liofilizadas (Figura 1). Figura 1. Esquema general de la conservación de microorganismos mediante el proceso de liofilización. Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilización. Así mismo, se representa el efecto de cascada en términos de la viabilidad de las muestras. a) Formulación. Se entiende como la mezcla de células con cualquier solución protectora, que tras la eliminación del disolvente, permita obtener un producto (liofilizado) deseado. La solución protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilización. Estas soluciones pueden ser simples (soluciones de glúcidos) o complejas (sueros de animales) (Ops Diagnostics, 2015). Las soluciones protectoras óptimas contienen principalmente un soluto protector, denominado lioprotector que estabiliza las células cuando se elimina el disolvente (agua); y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla o torta) durante y después de la liofilización (Figura 2). Algunos lioprotectores en determinadas concentraciones actúan como su propia matriz, por ejemplo, la sacarosa al 10% (Ops Diagnostics, 2015). La formulación también comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los microorganismos antes de liofilizarse, pudiendo variar de si se parte de un cultivo sólido en agar o de un cultivo líquido, hasta que sean cultivos sólidos densos (edad de 1-2 días) o líquidos en fase estacionaria. Cuando se parte de un medio líquido, y si es posible, las células se centrifugan, retirando el medio de cultivo, y el sedimento se re-suspende con un volumen igual de solución protectora (Ops Diagnostics, 2015), o de lioprotector (Grauer, Grunberg, & Zardo, 2015). Para cultivos desde agar, suele lavarse la placa/tubo con 5-10 ml de medio protector, posteriormente recogido con una pipeta estéril (Ops Diagnostics, 2015). Aunque en esto último se evita la centrifugación, se obtiene un mayor número de células partiendo de cultivos líquidos (Grauer et al., 2015). 17 Figura 2. Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado. Fuente: Adaptado de Jennings, T. A. (2008). Lyophilization, Introduction and Basic Principles (pág. 5). New York: Informa Healthcare USA, Inc. b) Congelación. La congelación es la primera etapa del método de liofilización, y uno de los más importantes para el éxito de este. Su función consiste en obtener una matriz en donde esté separado el disolvente de los solutos. Cuando se congela la formulación, el agua del medio acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la región intersticial entre los cristales de hielo (Jennings, 2008), la matriz entonces formada disminuye el movimiento del agua en la región intersticial a casi 0, además proporciona una estructura con resistencia casi nula, al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings, 2008). Disminuir el flujo de agua rápidamente es importante para evitar así la excesiva concentración de solutos; un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de concentración de solutos, evitando el estrés osmótico y permitiendo una organización espacial de los componentes de la formulación en forma similar a antes del congelamiento (Grauer et al., 2015). La temperatura y el tiempo para una congelación completa de la formulación dependen de la naturaleza de la misma. Nireesha et al. (citado por Grauer et al., 2015) indica que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la microestructura del producto seco, de ahí que una correcta congelación, reduce la desnaturalización térmica del liofilizado, “inmoviliza componentes de la solución, y evita la formación de espuma cuando se aplica el vacío” (Adams, 2007). c) Secado primario. Corresponde a la segunda etapa de la liofilización, además es la de más larga duración. En este etapa, la presión se reduce y la temperatura de la formulación congelada es elevada, dando lugar a la sublimación (Figura 3) y migración de vapor de agua (Grauer et al., 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador. Sin embrago, dicha temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura eutéctica, de colapso, de transición vítrea (Tg), para minimizar el daño de la muestra (Adams, 2007). 18 Figura 3. Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua. Se indican los requerimientos de presión y temperatura que hacen posible la sublimación del agua durante la liofilización. Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pág. 19). Journal of Validation Technology, 18-23. El tiempo para el secado primario depende de múltiples factores, como la composición de la solución protectora, la porosidad del congelado, la calidad o resistencia de la matriz, la cantidad de muestras, así como también el volumen de la formulación entre otros. Respecto al volumen, “para las bacterias, las muestras rara vez tienen que ser grandes y por lo general son de 0,25 a 0,5 ml” (Ops Diagnostics, 2015). Aunque no existe un volumen establecido, hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de más tiempo. Según Ops Diagnostics (2015), un período de secado primario de un día es suficiente, pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras, teniendo como guía un tiempo de liofilización de una noche. La etapa de secado primario finaliza “cuando todos los cristales de hielo se han eliminado de la formulación, y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a la de la matriz congelada” (Jennings, 2008, pág. 6). d) Secado secundario. Es la tercera y última etapa de la liofilización. Al terminar el secado primario, se ha eliminado el agua móvil de la muestra. Sin embargo, existe agua atrapada dentro del sólido amorfo que es más difícil de eliminar (Fetterolf, 2010). La cantidad de agua es discutible, ya que fluctúa en función de la temperatura y las características propias de los 19 constituyentes de la formulación, por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 510% w/w del producto seco (Jennings, 2008) o del 2-4% (Ops Diagnostics, 2015). La reducción del contenido de humedad en la torta se logra por desorción (Adams, 2007), sin reducir el volumen de la misma (Jennings, 2008). Esto se consigue aumentando la temperatura y reduciendo la presión parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings, 2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario, durante el secado secundario (Ops Diagnostics, 2015). Es importante que la temperatura no se incremente velozmente, y que se mantenga por debajo de la temperatura de transición vítrea, la cual, aumenta conforme el agua es eliminada (Fetterolf, 2010). Según Ops Diagnostics (2015), esta etapa es relativamente corta, con una duración de 1 a 2 horas, aunque Grauer et al. (2015) indica que representa entre el 30-40% del tiempo total del proceso; así mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo, con una duración de hasta varios días. Esto resulta importante puesto que “la cantidad de agua residente luego del secado, afecta la tasa de pérdida de viabilidad durante el almacenamiento” (Grauer et al., 2015, pág. 16) Finalmente, al ser removida la humedad residual, la muestra (denominada en adelante liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al., 2015), obteniendo un contenido en forma de torta porosa (Figura 2), o pastel esponjoso con poca (inferior al 1%) o nula humedad residual (Fetterolf, 2010). Las tres etapas del proceso de liofilización, en función de la temperatura y la presión y en contraste con el diagrama de fases del agua, pueden ser observadas en la Figura 4. Figura 4. Descripción global del proceso de liofilización. De 1-3, Congelamiento (1-2 presión atmosférica); de 3-4, secado primario; de 4-5, Secado secundario. Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pág. 19). Journal of Validation Technology, 18-23 20 e) Sellado y almacenamiento. Terminado el proceso de secado secundario, se deben sellar los viales al vacío (de ser posible) o de forma hermética tan pronto como sea posible, debido a que la torta actuará como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf, 2010), aunque también es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams, 2007), e incluso algunos laboratorios depositan perlas de sílice. Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente. Sin embrago, aunque se logre un correcto sellado al vacío, no se puede asegurar una larga vida útil en condiciones ambientales, ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo, y se alcanza mayor supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al., 2015), por ello, lo mejor es almacenar los liofilizados a 4° C en la oscuridad (Ops Diagnostics, 2015), reduciendo las posibilidades de pérdidas aunque haya quedado agua después del secado. f) Reactivación o rehidratación. Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulación original, esto implica la adición de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings, 2008; Grauer et al., 2015). La dilución rápida (inferior a un minuto) y completa de una torta al agregar el diluyente (Jennings, 2008), da cuenta de un correcto proceso de liofilización. “Tiempos de reconstitución excesivamente largos, la pérdida de potencia, o la formación de una solución turbia son indicios de un proceso de liofilización inadecuada o un mal funcionamiento del equipo de liofilización” (Jennings, 2008, pág. 11). La recuperación de las células, sin embrago, también se ve afectada por factores como el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilización), el tipo de diluyente, su temperatura, su pH, la osmolaridad (Grauer et al., 2015), la potencia del lioprotector (Jennings, 2008), entre otras propiedades de la solución resultante. Grauer et al. 2015, sugieren la utilización de medios de cultivo nutritivos no selectivos para la recuperación de los microorganismos, con el fin de evitar el estrés osmótico que pueden causar las soluciones diluidas; sin embargo, algunos laboratorios venden los diluyentes de rehidratación específicos para cada microorganismo o de forma estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato. Ops Diagnostics (2015), indican que una tasa de supervivencia superior al 50% se considera aceptable por muchos laboratorios. 2.2.3.2. Control de calidad de un producto liofilizado. Las propiedades físicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a nivel comercial y tienen en su mayoría un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las condiciones de almacenamiento tendrán sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del mismo. Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinación entre los parámetros de la formulación y el proceso de liofilización, por ello, permiten el seguimiento y la detección de falencias (Jennings, 2008). 21 Esta evaluación permite caracterizar las diferentes propiedades físicas, químicas y el efecto que las condiciones de almacenamiento tendrán sobre dichas propiedades. Jennings (2008) y Ticó G. (1987), recogen algunos de las tópicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto liofilizado, por ejemplo, las propiedades generales físicas de la torta (color, volumen, temperatura de transición, textura, porosidad, densidad, contracción o colapso, estado del vial, entre otras, que en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulación), su grado de higroscopicidad (la capacidad del liofilizado de absorber agua atmosférica), la velocidad de redisolución o reconstitución, la estabilidad (de la torta, el microorganismo o el lioprotector; evaluada de forma natural o acelerada), nivel de humedad residual, posibles contaminantes, entre otras. 2.2.3.3. Equipamiento para liofilizar. Como ya se mencionó inicialmente, el proceso de liofilización, requiere de un equipo llamado liofilizador (Figura 5), este equipo consta esencialmente de tres partes: a) Un sistema o bomba de vacío, que reduce la presión del ambiente de la cámara que contiene el material a secar. Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dañen. “El nivel de vacío requerido debe ser entre 50 y 100 μbar” (Grauer et al., 2015, pág. 9) aunque 200 μbar son aceptables. b) Un condensador con circuito de refrigeración, que comunica con la cámara de secado y condesa el vapor de disolvente producto de la sublimación, sobre una superficie enfriada inferior a los -40°C. c) Cámara o accesorio de secado, que es donde se coloca el material a secar. Según Nireesha et al., (2013) puede ser de tres tipos: - Manifold o colector múltiple. - Rotary. - Tray style, de bandejas con o sin estante de taponado, éste último cuenta con un sistema para sellado al vacío de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas. Figura 5. Esquema general de un liofilizador y sus componentes. En la imagen, el liofilizador usa una cámara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial. Tomado de http://slideplayer.com.br/slide/84760/ el 15 de Agosto de 2015. 22 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GENERAL Determinar el estado de criopreservación de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad, y liofilización de las mismas, evaluándolas frente a tres compuestos protectores. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Evaluar el estado de la criopreservación de cinco cepas bacterianas utilizando técnicas de recuento en placa estándar. Evaluar tres lioprotectores para liofilización de cepas microbianas. Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservación. Diseñar y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilización a partir de las cinco cepas bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados. 23 4. METODOLOGÍA La metodología general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases, como es ilustrado en la Figura 6: Fase intermedia 1 Criterios de elección de los microorganismos así como de los lioprotectores a evaluar. Fase inicial Evaluación de los métodos de conservación (criopreservación y liofilización). Ajustes a la liofilización para la generación de protocolos. Fase intermedia 2 Proceso de Datado Fase final Figura 6. Metodología. Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia lógica de eventos, algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra. 4.1. FASE INICIAL. 4.1.1. Acervo Microbiano. De la colección de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Genético del laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC), se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores resultados individuales en la biodecoloración de una mezcla de colorantes residuales generados por el laboratorio de microbiología; estas corresponden a CR004, CR005 (sustituida posteriormente por CR009), CR006, CR007 y CR010, según los resultados del trabajo de grado desarrollado por Rodríguez (2013). Todas estaban conservadas por el método de criopreservación (o criocongelación) a una temperatura de -85 °C ± 1°C. 4.1.2. Elección de los protectores. 4.1.2.1. Crioprotectores. El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99.999%) (Mallinckrodt, México) en proporción 67% v/v según lo establecido por Martínez & Mayorga (2013). 4.1.2.2. Lioprotectores. Para la elección de los agentes protectores y sus concentraciones en %p/v (Tabla 1), se tuvieron en cuenta diferentes estudios: en contraposición a Hensel (1994), se tomaron concentraciones superiores al 9% de Glucosa (Merck, Darmstadt), de forma aleatoria. En cuanto a las concentraciones de sacarosa (Merck, Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed & Roos (2004) y Palmfeldt, Radström, & Hahn-Hägerdal (2003). Para la leche descremada (Proleche, Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al. (2003). Dichos estudios fueron tomados como referencia teórica, aunque los microorganismos en ellos especificados, no correspondan con los del presente trabajo. 24 Tabla 1. Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas. Lioprotector Glucosa Sacarosa 10% 4% Concentración %p/v 11.7% 10% 27% 15% Leche descremada 10% 15% 20% 4.2. FASE INTERMEDIA 1. 4.2.1. Evaluación de la eficacia del método de conservación. En este trabajo se evaluaron dos métodos de conservación (criopreservación y liofilización), dicha evaluación se realizó en términos de tres (3) indicadores, valorados previamente (pre) y posteriormente (pos) al método en sí. 4.2.1.1. Viabilidad. Para evaluar este indicador se utilizó: a) Conteo directo con cámara de Neubauer 1/10mm (Boeco), siguiendo la metodología planteada por Valencia Z. (2004). Sin embargo, para obtener el número de bacterias, se utilizó la ecuación planteada por Bastidas (2015): No de bacterias/ml= N° Total de bacterias contadas × 250000 Fd* × N° de cuadrados contados *Fd: Factor de dilución = g o ml de muestra g o ml de muestra + g o ml de diluyente El conteo directo con cámara de Neubauer solo se realizó previamente al método de conservación evaluado. b) Conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa, según lo descrito por Valencia Z. (2004) y Camacho et al. (2009). Para el cálculo de UFC/ml se utilizó la siguiente fórmula: 1 1 × Factor de dilución ml de muestra Los cálculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodología planteada por Camacho et al., (2009) y solo para los casos especiales se utilizó los planteamientos del Instituto de Salud Pública del Gobierno de Chile (2008). Estos conteos se realizaron pre y pos en la liofilización, y solo pos a la criopreservación, en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid, England). UFC/ml = N° de colonias × El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre y/o pos al proceso de conservación, fue calculado a través de la ecuación propuesta por Morales-García et al., (2010): Tasa de supervivencia (BSR %) = Log (1 + N° UFC/ml DD*) x 100 Log (N° UFC/ml AD**) *DD: Después de la desecación **AD: Antes de la desecación 25 4.2.1.2. Estabilidad Morfológica. Para evaluar este indicador se realizó: a) Conteo en placa (características macroscópicas): Se elaboró un formato (anexo 1) con las características macroscópicas descritas por Valencia Z. (2004), Pírez & Mota (2006) y Díaz (2009), para las colonias desarrolladas en superficie, a partir del procedimiento de “conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa”. Se utilizó un contador de colonias CC-1 (Boeco). - Se seleccionó solo una de dos placas, de una dilución, conteniendo siempre un número de UFC representativas, según el rango estipulado por Camacho et al., (2009). - Las características macroscópicas fueron observadas en al menos el 80% de las colonias de la placa seleccionada. b) Tinción de Gram (características microscópicas): Posterior al procedimiento anterior, se realizó una “coloración de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfológica con el microorganismo esperado” (Sánchez & Corrales, 2005, pág. 24). Se compararon con las características microscópicas y macroscópicas descritas por Rodríguez (2013) y la información de la base de datos para cada cepa. De igual forma se tomó registro fotográfico para la base de datos a través de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con cámara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue, y un estereoscopio (Zeiss) con cámara Canon G9. 4.2.1.3. Pureza. Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfológica en cada conteo de células viables realizado por el método de conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa. 4.2.2. Recuperación de los microorganismos. Para la recuperación de los microorganismos se tomó un criovial de cada cepa bacteriana, sometido a una temperatura de 37°C (Arcos, Ossa, & Díaz, 2004) en baño serológico, con agua destilada, hasta su descongelación, por aproximadamente cinco (5) minutos (Martínez & Mayorga, 2013). Los crioviales se introdujeron en baño serológico una vez se llegó a la temperatura deseada, no antes. De cada criovial se tomó un (1) ml con micropipeta, previamente agitado con Vórtex Genie 2T (Thomas Scientific) nivel 7 (≈2240rpm) por diez (10) segundos, diluyéndolo en un tubo con nueve (9) ml de medio SMPG (Martínez & Mayorga, 2013). Dicho tubo fue rotulado como T01 y posteriormente fue colocado en incubadora a 25 °C ± 1°C de 18-24 horas. Se realizó evaluación de la eficacia del método de conservación a cada criovial (Thomas Scientific, 5150636) por cepa, luego de preparado el tubo T01, antes de la incubación. Se compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservación consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martínez & Mayorga (2013) y Rodríguez (2013). 26 4.2.3. Criopreservación. 4.2.3.1. Precriopreservación. Pasado el tiempo de incubación, se realizó evaluación de la eficacia del método de conservación al tubo T01, con el fin de determinar el número de células totales y viables de la muestra. El conteo en Cámara de Neubauer se realizó solo hasta el final de los procedimientos de preservación, por lo cual una vez preparadas las diluciones, estas fueron llevadas a nevera a 4°C ± 1°C, para evitar la generación de nuevas células. 4.2.3.2. Preparación del inóculo bacteriano y ejecución de la criopreservación. Se siguió el protocolo de criopreservación establecido por Martínez & Mayorga (2013), consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, con algunas variaciones: Con pipeta estéril de 5ml, se depositaron en cinco (5) crioviales 1,2ml de glicerol anhidro estéril. Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01, previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s; diluyéndolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02). Posteriormente se tomaron alícuotas desde T02 de 600µl, previo Vórtex nivel 7 por 15s, depositadas en cada criovial, para aforar un volumen final de 1800µl. Se rotularon y se realizó Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 5s para su homogenización. Inmediatamente después de la homogenización, fueron puestos en el Freezer Premium U570 (New Brunswick), a una temperatura de -85°C ± 1°C, en los respectivos racks para reemplazar los crioviales existentes de la cepa en cuestión. Este procedimiento se realizó en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la contaminación del medio, procurando además, no sobrepasar veinte (20) minutos (Martínez & Mayorga, 2013), desde la extracción de la alícuota de T01 y la congelación, esto con el fin de evitar la generación de nuevas células. 4.2.4. Liofilización. Etapa 1. 4.2.4.1. Preliofilización y preparación del inóculo bacteriano. Se partió del tubo T01 de cada cepa bacteriana, como inóculo inicial para el proceso de liofilización. Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01, previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, diluyéndolo en nueve (9) ml agua destilada estéril (T03). 4.2.4.2. Ejecución de la liofilización. Partiendo del tubo T03, previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, se extrajeron alícuotas de cien (100) µl, veintisiete (27) veces, depositados en cada uno de los crioviales a liofilizar. En cada criovial, se adicionaron novecientos (900) µl de lioprotector, en tres crioviales por cada concentración de lioprotector, de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2). Con el fin de que la concentración de lioprotector en el interior del criovial fuera lo más exacta posible al adicionarle la alícuota del tubo T03, se utilizaron las siguientes ecuaciones para su preparación: 27 Donde el volumen inicial y la concentración inicial corresponden al protector al momento de ser preparado, en tanto que el volumen final y la concentración final (Tabla 2) corresponden al protector luego de agregada la alícuota del tubo T03. Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (alícuota más protector), se agitó con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por siete (7) segundos para su homogenización. Posteriormente, a los crioviales se les retiraron las tapas plásticas y fueron tapados con Parafilm (Pechiney, PM-996) esterilizado, realizando seis (6) perforaciones concéntricas en la superficie con aguja hipodérmica 21G x 1½”. Los crioviales fueron congelados en nitrógeno líquido por 15min aproximadamente, depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD, Thermo Scientific) de 24-48 horas, a una presión inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45°C, usando el colector múltiple (manifold). Terminado el proceso, se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la cámara de flujo laminar para evitar contaminación de las muestras; allí se les retiró el Parafilm, se les tapó con tapas estériles y se les rotuló. Tabla 2. Número de repeticiones (y tubos), según lioprotector y concentración. Lioprotector Concentración Serie %(p/v) A B C 10% 1 1 1 Glucosa 11.7% 1 1 1 27% 1 1 1 4% 1 1 1 Sacarosa 10% 1 1 1 15% 1 1 1 10% 1 1 1 Leche 15% 1 1 1 descremada 20% 1 1 1 9 9 9 Total crioviales según N° 27 Total crioviales usados por cepa 4.2.4.3. Posliofilización (Rotulado y almacenaje). Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilización, utilizando una etiqueta o rótulo (Figura 7) que contiene la siguiente información: Código de la cepa: Código asignado para cada microorganismo en la base de datos, el Freezer y el banco de liofilizados. Corresponde a la descripción del tipo de colección biológica (colección microbiológica, “CM”), siglas de la colección (Colorantes, “CR”), número de la cepa en la colección (004) y el tipo de vial (Trabajo, “T”). Nivel de riesgo Biológico: Se utilizó una escala de colores para la clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3), con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005). “Esta clasificación por grupos de riesgo 28 es exclusivamente para el trabajo de laboratorio” (OMS, 2005, pág. 1). El grupo de riesgo biológico solo aparece en las muestras liofilizadas, no en las criopreservadas, ya que éstas tienen rótulos distintos. Ubicación en el banco de liofilizados: Muestra la ubicación exacta de cada vial. Corresponde a la bandeja (BAN A), la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1). Adicional a ello, se menciona el lioprotector utilizado y sus concentración en este vial. Fecha: Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la colección. Figura 7. Rótulos creados para los viales liofilizados. Posterior al proceso de rotulado, los crioviales fueron almacenados en una caja con recubrimiento interno de espuma de poliuretano, a temperatura ambiente y protegido de la luz. Tabla 3. Código de colores propuesto según la clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS. C.C.* en Grupos de riesgo Descripción CM-UDFJC Microorganismos que tienen pocas probabilidades de Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y provocar enfermedades en el ser humano o los animales. poblacional escaso o nulo. Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades Grupo de riesgo 2 Riesgo individual humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades moderado, riesgo de entrañar un riesgo grave para el personal de poblacional bajo. laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades Grupo de riesgo 3 humanas o animales graves, pero que de ordinario no se Riesgo individual elevado, propagan de un individuo a otro. Existen medidas riesgo poblacional bajo. preventivas y terapéuticas eficaces. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o poblacional elevado. indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Agentes desconocidos. Para su manipulación referirse al Grupo de riesgo manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS desconocido (2005). Nota: *Código de Color. Fuente: Adaptado de OMS. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio (pág. 1). Ginebra: Ediciones de la OMS. Recuperado de http://www.who.int/csr/resources/publications /biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf 29 4.2.5. Rehidratación o Reconstitución. Etapa 2. Se realizó una prueba de estabilidad natural en términos del aspecto físico y la viabilidad de cada liofilizado luego de un período prolongado de tiempo (Grauer et al., 2015) en almacenamiento a temperatura ambiente. Por ello, la rehidratación de los crioviales se realizó en tres intervalos de tiempo (Tabla 4). Tabla 4. Rehidratación de los crioviales. Primera rehidratación Serie A (3-5) Segunda rehidratación Serie B (32-34) Tercera rehidratación Serie C (56-61) Nota: Intervalos de tiempo medidos en días, contados desde el día de almacenaje, en los cuales se rehidrató cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie, ver Tabla 2). El aspecto físico de cada liofilizado fue datado antes de cada rehidratación y comparado con su estado antes del almacenaje. Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37°C, tomando el tiempo de reconstitución, luego incubados a 25°C ± 1°C por 30min y agitada con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por 7s. Posteriormente, se realizó evaluación de la eficacia del método de conservación. El indicador de viabilidad se evaluó solo con el método de conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa. Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la más alta BSR con cada lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa, se eligió el lioprotector y la concentración de éste, que permitió obtener un mayor número de células viables posliofilización y que ofreció además una menor variación durante la prueba, para la liofilización definitiva de las cepas en estudio. Dicho lioprotector se estableció además como el lioprotector general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados, del Banco Genético del laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC). 4.3. FASE INTERMEDIA 2. Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores, con el ánimo de generar un protocolo funcional, aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo, la estabilidad de los liofilizados y dado que para esta etapa se partió de cultivos puros sobre medios sólidos, se realizaron variaciones en los procesos de preliofilización, liofilización y posliofilización, para la liofilización definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados. 4.3.1. Liofilización definitiva. Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentración óptima, para cada cepa de estudio, se realizó la liofilización definitiva. 4.3.1.1. Preliofilización y preparación del inóculo bacteriano. Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC, se tomaron 4 asadas con abundante crecimiento microbiano, inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector general. Posteriormente se agitó con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 45s. Esto se realizó para cada cepa. 30 4.3.1.2. Ejecución de la liofilización. El tubo T04 de cada cepa bacteriana, como inóculo inicial para el proceso de liofilización definitiva, se extrajeron cuatro (4) alícuotas de un (1) ml, previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass, 62113D-2) posteriormente tapados con tapón de división. Cada vial se agitó con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por 7s para su homogenización. Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitrógeno líquido por 15min aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas, a una presión inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45°C. El proceso de destape parcial y congelación se realizó en cámara de flujo laminar para evitar al máximo la contaminación. El transporte de los viales desde la cámara de flujo laminar al liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitrógeno líquido, para evitar contaminación y descongelación. 4.3.1.3. Posliofilización. Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilización. Dos viales, designados como trabajo (T) y stock (S), fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2) a temperatura ambiente. Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf) (anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4°C ± 1°C. 4.3.1.4. Rehidratación. El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso de rehidratación de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento. Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles cambios en la viabilidad al partir de un medio sólido. 4.3.2. Control de calidad de la liofilización y ajustes técnicos. Se llevó un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el ánimo de identificar falencias en el proceso de liofilización. Al identificarlas, se decidió repetir la liofilización definitiva con los nuevos parámetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las cepas estudio. 4.3.2.1. Propiedades físicas generales. Se observaron diferencias en volumen (encogimiento), color, textura, brillo, aspecto de la torta y fractura de los crioviales y viales, teniendo como punto de comparación la formulación luego de congelada. Esto se realizó para: - Crioviales de la fase intermedia 1. - Viales de la fase intermedia 2 (numeral 4.3.1). - Viales de la fase intermedia 2 (numeral 4.3.3). 4.3.2.2. Contaminación. Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad, en búsqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio. 31 4.3.2.3. Tiempo de redisolución o reconstitución. Se midió el tiempo de reconstitución de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase intermedia 1 y, el tiempo de los crioviales que contenían el lioprotector general, fue comparado con el tiempo de reconstitución de los viales de la liofilización definitiva y los viales sometidos a la prueba de estabilidad acelerada. 4.3.3. Pruebas adicionales. Para estas pruebas solo se usó la formulación del lioprotector general y la cepa CM-CR010, por su alta tasa de crecimiento respecto a las demás cepas evaluadas. 4.3.3.1. Prueba de higroscopicidad másica. Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el lioprotector general. Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticó G., 1987), se tomaron los pesos con balanza analítica (AND, GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por una (1) hora y se promediaron sus pesos. El cuarto vial y criovial, se abrieron solo una vez, luego fueron sellados completamente, tomando sus pesos de la misma forma ya descrita. Para determinar si existe un tiempo máximo admisible de cerrado, se midió el contenido de agua absorbida por parte del lioprotector general en función del tiempo, utilizando la ecuación descrita por García C. (2007): *Wt (%) es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min) *Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s) *Mo (kg) es el peso seco de la muestra 4.3.3.2. Prueba de estabilidad acelerada. Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa, uno fue rehidratado a los cero (0) días y el otro luego de siete (7) días en el interior de la cámara de envejecimiento, ambos en las condiciones que se muestran en la tabla 5. Adicionalmente se dataron sus propiedades físicas generales al finalizar el secado y antes de rehidratar. Tabla 5. Prueba de estabilidad acelerada. N° vial t – T° - HR 1 0 - ambiente - 25% 2 7 - 37°C - 100% Nota: Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos. t= Tiempo en días; T°=Temperatura; HR=Humedad relativa. La prueba de estabilidad se realizó en una cámara de envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas. Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37°C, luego incubados a 25 °C ± 1°C por 30min y agitada con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por 7s. Posteriormente, se realizó evaluación de la eficacia del método de conservación midiendo viabilidad con el método de conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa. 32 4.3.4. Control de esterilidad. Todos los medios, reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave Tuttnauer (3850 EL) a 121°C y 210Kpa por 20 minutos; las puntas de micropipetas, los viales, crioviales y sus respectivas tapas, fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presión y temperatura en un tiempo de 15 minutos. Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas), fueron esterilizados en horno Binder a 160°C por 120 minutos. Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo, desde la preparación de medios hasta el sellado de los viales, como se describe a continuación: 4.3.4.1. Medios. Se realizó control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid, England) (en solución de rehidratación y para las diluciones seriadas), al caldo SMPG, al medio SPC, a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro; dejándolos en incubación en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilización. Se determinó como indicador de contaminación cambios ópticos (turbidez u opacidad) en los medios líquidos y presencia de colonias en medios sólidos. 4.3.4.2. Ambiente. a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores. El proceso de control de ambiente se realizó con medio SPC dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (Thermolab, 14-E0107) evitando pasar por encima de estas al abrir las cajas. El periodo de exposición fue de 15 a 30 minutos, dejándolos en incubación de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubación de las cepas de trabajo. b) Cabina de flujo laminar. Se realizó el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento, pero en este caso la caja de control de ambiente se dejó abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requerían el uso de la cabina, esto es, tiempos de exposición de hasta 3 o 4 horas. Este control se llevó a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar. 4.3.4.3. Técnicas de siembra y manipulación de elementos. Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolló en el interior de la cabina de flujo laminar, se procuró mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo, siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina, sino además un riguroso uso de elementos de protección como guantes y tapabocas. Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente con alcohol 70% al iniciar el trabajo con cada cepa. 4.4. FASE FINAL. 4.4.1. Base de datos. Se realizó una revisión a la base de datos del Banco de cepas creado por Martínez & Mayorga (2013) en el programa Access, modificando algunos aspectos generales he introduciendo una sección para la información de los organismos liofilizados. 33 4.4.2. Fichas de resumen. Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la colección, tanto del Freezer como del banco de liofilizados, utilizando el programa Word 2013. 4.4.3. Revisión de etiquetas y logística del banco de cepas en el Freezer. Se realizó una revisión de la información en los rótulos de los crioviales y de etiquetas en las cajas respecto a la base datos, con el ánimo de verificar si se habían cumplido los protocolos y la logística establecida por Martínez & Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles falencias. 4.4.4. Formatos de control del banco de liofilizados. Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013, para el control de cepas en el banco de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martínez & Mayorga (2013) en la sección de criopreservación. Tabla 6. Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados. Código Tipo de registro Ubicación Uso Registro de entrada de Archivero del laboratorio y Base Cuando ingresa una nueva cepa FLf-01 cepas. FLf-02 Proceso de liofilización. FLf-03 Registro de control de calidad. de datos Archivero del laboratorio y Base de datos Archivero del laboratorio y Base de datos a la colección. Cuando se realice liofilización a una cepa. Al rehidratar una cepa de la colección y antes de liofilizar una cepa para la colección. Solicitud salida de Archivero del laboratorio y Base Cada vez que una cepa sea FLf-04 cepas. de datos pedida y salga del banco de liofilizados. Fuente: Adaptado de Martínez Benítez, H. L., & Mayorga Burgos, L. P. (2013). Implementación de un sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (Tesis de pregrado). (pág. 44). Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Bogotá, Colombia. 4.4.5. Manual de procedimientos. Se realizó una revisión de la cartilla de procedimientos elaborada por Martínez & Mayorga (2013). Se tomó la decisión de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013. 34 5. RESULTADOS 5.1. RECUPERACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIÓN DE LA CRIOPRESERVACIÓN. A raíz de la evaluación de la eficacia del método de conservación en cada criovial por cepa, se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004, CM-CR006, CM-CR007 y CM-CR010 utilizando el criovial SS (semistock) de cada uno. En cuanto a CM-CR005, se utilizaron los cinco (5) crioviales dispuestos en el Freezer, pero no fue posible recuperarla, por lo cual fue reemplazada por CM-CR009, la sexta mejor respecto al criterio de elección de cepas. Con los datos del proceso precriopreservación de las cepas de interés correspondientes a la colección de colorantes, consignados en el trabajo de Martínez & Mayorga (2013), en conjunto con los datos de viables poscongelación del presente trabajo, se calculó la BSR para cada cepa (Tabla 7). Se encontró que los porcentajes de BSR son superiores al 70% luego de dos (2) años de estar en criopreservación (Figura 8), salvo CM-CR005. Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de Martínez & Mayorga (2013) (sólo se compararon los datos de la cepa CM-CR010, ya que las demás cepas no figuran en su trabajo) se encontró un porcentaje inferior de recuperación poscriopreservación por parte de las autoras, por lo cual se revisó la metodología, encontrando un error metodológico al calcular la BSR en su trabajo. Usando los datos de “resultados prueba de viabilidad poscongelación, tabla 19” (en Martínez & Mayorga, 2013, pág. 54), se corrigió la BSR para esta cepa, evidenciando ser la cepa más resistente al proceso de criopreservación, entre las evaluadas, con alrededor de 6.6% de caída luego de dos años en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8). Tabla 7. Evaluación de la eficacia del método de conservación (criopreservación). Cepa Células totales Viables precongelación (UFC/ml) de Martínez & Mayorga (2013) viables pos congelación (UFC/ml) BSR real BSR de Martínez & Mayorga (2013) BSR corregido CM-CR004 1,2x1012 6,1 x109 1,3 x107 72,5 % Nrd Nrd 10 10 CM-CR005 1,1 x10 1,1 x10 0 0,0 % Nrd Nrd 10 9 7 CM-CR006 1,4x10 7,5 x10 2,7 x10 75,2 % Nrd Nrd 11 9 8 CM-CR007 1,3x10 4,1 x10 3,1 x10 88,3 % Nrd Nrd 10 9 7 CM-CR009 1,9 x10 4,4 x10 2,3 x10 76,3 % Nrd Nrd 10 9 8 CM-CR010 1,7 x10 4,6 x10 7,2 x10 91,6 % 67.3% 98.2% Nota: Se muestran los resultados al evaluar la conservación de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por el método de criopreservación, luego de dos (2) años. La BSR que Martínez & Mayorga (2013) presentan, corresponde a un valor poscriopreservación luego de dos meses de evaluación. *Nrd= No registra datos. 35 100,0 90,0 Supervivencia 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 Porcetaje CM-CR004 72,5 CM-CR005 0,0 CM-CR006 75,2 CM-CR007 88,3 CM-CR009 76,3 CM-CR010 91,6 Figura 8. Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad, de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego de la descongelación. CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperación (número de células viables). 5.2. CARACTERÍSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO. En las Tablas 8, 9, 10, 11 y 12 se describen las principales características macroscópicas utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfológica de las cepas utilizadas. No fue posible realizar la comparación con los datos de Rodríguez (2013) a nivel macroscópico dado que los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquí utilizados, sin embargo, si se compararon las características microscópicas, las cuales fueron coincidentes, aunque estas no eran del todo claras (descripción inexacta de forma y tamaño y sin un registro fotográfico comparable), por lo cual, se decidió que las características macroscópicas observadas desde la primera siembra posterior a la descongelación de los crioviales, fuesen las de mayor importancia para evaluar la estabilidad morfológica y la pureza. Estas se mantuvieron sin cambio o variación a lo largo del trabajo. Las microfotografías tomadas a cada cepa, usando la coloración de Gram, al igual que las fotografías de las características macroscópicas, fueron anexadas a la base de datos del Banco Genético. 36 Tabla 8. Características macroscópicas de la cepa CM-CR004. CM-CR004 Cepa Características Descripción Ondulado. Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de Borde o Margen crecimiento. Frente a luz Brillante Umbonada Elevación Mediano (18-24h) Tamaño Lisa Superficie Cremosa Consistencia Color Beige, más intenso en el centro y más clara hacia los extremos; en colonias de 48h o más, extremos color blanco hueso. Circular; a más de 48 horas y con medio húmedo desarrollar forma Forma irregular. Grado de Opaca (No transparente) Transparencia Pigmentación o No cromogénesis Ropa húmeda Olor No registra Hemolisis SPC/25°C Medio/T(°C) Tabla 9. Características macroscópicas de la cepa CM-CR006. CM-CR006 Cepa Características Descripción Borde o Margen Semiondulado. A más de 72h, es altamente digitado. Frente a luz Brillante Forma Circular; a más de 72 horas y con medio húmedo, se irregulariza. Luego de una semana, totalmente digitado. Elevación Color Tamaño Superficie Consistencia Grado de Transparencia Pigmentación o cromogénesis Olor Hemolisis Medio/T(°C) Plana con bordes elevados (en cráter). Colonias de más de 72h presentan una ligera elevación en el centro. Amarillo Mediano (18-24h) Escamosa Cremosa Opaca (NO transparente) Si, color amarillo. No registra No registra SPC/25°C 37 Tabla 10. Características macroscópicas de la cepa CM-CR007. Cepa CM-CR007 Características Borde o Margen Frente a luz Forma Elevación Color Tamaño Superficie Consistencia Grado de Transparencia Pigmentación o cromogénesis Olor Hemolisis Medio/T(°C) Descripción Entero. En medio muy húmedo es digitado. Brillante Circular. A más de 48 horas y con medio húmedo, es irregular. Convexa. Colonias con más de 48h y distantes unas de otras (pocas colonias), umbonadas. Blanco. Pequeño (18-24h) Lisa Cremosa Semitransparente en zona externa. No Mentol No registra SPC/25°C Tabla 11. Características macroscópicas de la cepa CM-CR009. Cepa CM-CR009 Características Borde o Margen Frente a luz Forma Elevación Color Tamaño Superficie Consistencia Grado de Transparencia Pigmentación o cromogénesis Olor Hemolisis Medio/T(°C) Descripción Fuertemente ondulado Brillante Circular; a más de 72 horas, se irregulariza. En meseta y ligero hundimiento central (cráter). En colonias con más de 72h, ligera elevación del cráter. Beige. Conforme envejece la colonia, toma una coloración blancuzca de tonalidad café en el centro. Pequeña (18-24h) Ligeramente rugosa Cremosa Opaca. Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h. No No registra No registra SPC/25°C 38 Tabla 12. Características macroscópicas de la cepa CM-CR010. CM-CR010 Cepa Descripción Características Entero. En medio húmedo es suavemente ondulado; en medio muy Borde o Margen húmedo es digitado. Brillante Frente a luz Circular. Después de 48h se irregulariza. En medio muy húmedo, es Forma estrellado (sin importar edad de la colonia). Convexa. Colonias con más de 72h, centro marcado y ligeramente Elevación elevado (forma de huevo frito). Blanco. Color Pequeño (18-24h) Tamaño Lisa Superficie Cremosa Consistencia Opaca. Semitransparente en la zona externa de colonias de más de Grado de 48h. Transparencia Pigmentación o No cromogénesis Sin olor Olor No registra Hemolisis SPC/25°C Medio/T(°C) 5.3. EVALUACIÓN DE LA LIOFILIZACIÓN. PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL. 5.3.1. Viabilidad y selección del lioprotector general. Las Figuras 9, 10, 11, 12 y 13 representan los resultados de la evaluación de la eficacia del método de conservación, realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1, por medio del indicador de viabilidad: Supervivencia BSR en CM-CR004 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 Glucosa 10% Glucosa 11,7% Glucosa 27% Sacarosa 4% BSR en serie A - - - BSR en serie B - - - BSR en serie C 30,76 36,19 - 53,01 Leche descremada 10% 59,58 Leche descremada 15% 68,12 Leche descremada 20% - 45,57 51,00 50,39 36,19 34,18 34,18 58,73 47,23 Sacarosa 10% Sacarosa 15% 59,87 - 36,19 30,76 36,19 30,76 Figura 9. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 6 x108. Se observa que la leche descremada 15% como mejor protector y leche descremada 10% como segundo mejor protector. 39 BSR en CM-CR006 70,00 Supervivencia 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 - 57,31 Leche descremada 10% 54,30 Leche descremada 15% 41,73 Leche descremada 20% 45,13 50,51 47,73 - - 46,22 - - - Glucosa 10% Glucosa 11,7% Glucosa 27% Sacarosa 4% Sacarosa 10% Sacarosa 15% BSR en serie A 41,73 49,62 58,50 61,19 64,15 BSR en serie B 30,46 - - 41,73 47,43 BSR en serie C - - - 30,46 51,47 Figura 10. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 7,3 x108. Se observa a Sacarosa 10% como mejor protector y a Sacarosa 15% como segundo mejor protector. BSR en CM-CR007 100,00 90,00 Supervivencia 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 - 87,35 Leche descremada 10% 90,26 Leche descremada 15% 91,66 Leche descremada 20% 86,48 - 84,13 80,52 80,86 - 86,04 82,02 84,14 Glucosa 10% Glucosa 11,7% Glucosa 27% Sacarosa 4% Sacarosa 10% Sacarosa 15% BSR en serie A 91,49 86,64 65,49 97,12 96,77 BSR en serie B 84,72 - 61,81 - 84,74 BSR en serie C 85,57 74,72 61,93 - 92,72 Figura 11. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 1,25 x1010. Se observa a sacarosa 10% como mejor protector y a glucosa 10% como segundo mejor protector. 40 BSR en CM-CR009 80,00 70,00 Supervivencia 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 - 69,87 Leche descremada 10% 55,85 Leche descremada 15% 54,40 62,12 49,41 40,83 - 75,19 40,83 - 40,83 Glucosa 10% Glucosa 11,7% Glucosa 27% Sacarosa 4% Sacarosa 10% Sacarosa 15% BSR en serie A 54,94 46,09 46,09 66,41 64,01 BSR en serie B 44,15 - - 63,73 60,83 BSR en serie C - - - - - Leche descremada 20% 51,86 Figura 12. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 1,15 x109. Se observa a Sacarosa 15% como mejor protector y la leche descremada 10% como segundo mejor protector. BSR en CM-CR010 100,00 90,00 Supervivencia 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 - Leche Leche Leche descremada descremada descremada 10% 15% 20% 81,53 80,22 83,32 Glucosa 10% Glucosa 11,7% Glucosa 27% Sacarosa 4% Sacarosa 10% Sacarosa 15% BSR en serie A 82,05 - 63,03 95,21 86,34 82,07 BSR en serie B 64,24 - - 79,11 83,12 80,96 77,52 69,07 79,95 BSR en serie C 66,97 - - - 82,30 79,98 79,19 81,13 75,39 Figura 13. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 6,5 x109. Se observa a Sacarosa 10% como mejor protector y a Sacarosa 15% como segundo mejor protector. 41 Tabla 13. Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad. Cepa Mejor Lioprotector Leche descremada 15% CM-CR004 Sacarosa 10% CM-CR006 Sacarosa 10% CM-CR007 Sacarosa 15% CM-CR009 Sacarosa 10% CM-CR010 Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural ofreciera la más alta BSR en la mayoría de cepas (Tabla 13), se determinó la sacarosa al 10% como el mejor lioprotector y se designó como lioprotector general para las bacterias del banco de liofilizados. Sin embargo, se decidió para la liofilización definitiva, utilizar el lioprotector que mejores resultados confirió a cada una de las cinco cepas de estudio. 5.3.2. Aspecto físico del liofilizado. Dado que el principal indicador de evaluación de la prueba de estabilidad natural en esta etapa era la viabilidad en cada liofilizado, no se tuvo en cuenta los cambios morfológicos presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa, pero si fueron tenidos en cuenta para los ajustes técnicos de la liofilización en la fase 3. 5.4. LIOFILIZACIÓN DEFINITIVA. Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilización definitiva con su homólogo de la etapa 2 (es decir, los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de tiempo), se encontraron diferencias significativas, de aumento o disminución, de hasta el 22%, indicado la existencia de variaciones en la viabilidad según el punto de partida de la formulación (medio liquido SMPG vs medio sólido SPC) como lo muestra la Figura 14. Puntos porcentuales BSR comparativa 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 - L. Etapa 2 L. definitiva CM-CR004 CM-CR006 CM-CR004 68,12 73,30 CM-CR006 64,15 76,29 CM-CR007 CM-CR007 84,74 77,57 CM-CR009 CM-CR009 62,12 84,61 CM-CR010 CM-CR010 83,12 72,34 Figura 14. Comparación entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilización definitiva, por cepa bacteriana. Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas según el intervalo temporal de la Serie A, en tanto que CM-CR007, CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron según la Serie B (ver Tabla 4). 42 5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIÓN. 5.5.1. Propiedades físicas generales. Se dataron las propiedades físicas de los liofilizados en la fase intermedia 1, así como los liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 4.3.1 (liofilización definitiva) y 4.3.3.2 (viales usados para la prueba de estabilidad acelerada), en las Tablas 15 y 16 respectivamente; la tabla de convenciones (Tabla 14) permite comprender los símbolos de las anteriores tablas. Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilización y los mismos sirvieron para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilización. Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transición conforme se realizaron los ajustes hasta terminar en un producto físicamente aceptable. Sin embargo, pese a que a las propiedades físicas de los liofilizados en la fase intermedia 1, con los cuales se realizó la evaluación de la liofilización y la prueba de estabilidad natural, no eran los más adecuados, se decidió proseguir con ellos, apoyado por los resultados de Vemulapalli, Bhonsle, & Kumar (2015) y dado que en la primera rehidratación (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperación de microorganismos, además el tiempo de estudio era de tan solo dos meses, tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores. Tabla 14. Tabla de convenciones. Significado Símbolo Significado Símbolo Si, en buen estado Algunos S.BE A. Si, en mal estado Todos S.ME T. No, *en buen estado Ninguno N.BE N. No, **en mal estado No significativo (<20%) N.ME NS. Afirmativo Significativo (20,1%-30,9%) + S. Negativo Muy significativo (>40%) MS. No aplica indeterminado N.A. I. Al finalizar el secado Antes de reconstituir F.S. A.R. Nota: Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15. *Aunque no tenga estructura de torta, el liofilizado es estable y funcional, por ende utilizable. **No tiene estructura de torta y además no es ni estable ni funcional por ende no es utilizable. Tabla 15. Liofilizados en la fase intermedia 1. CM-CR004 Cepa Viales g1 g2 g2sa g2sb g2sc s1 s2 s2sa s2sb s2sc sm1 sm2 sm2sa sm2sb sm2sc N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. Encogimiento %1 %2 %3 N.A. I I I I I I I I I I I S N.A. I I I I I I I I I I I I N.A. N N N N N S N N N NS. N N Color Textura Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Café claro Café claro Café claro Café claro Café claro Lisa I I I I Lisa I I I I Lisa Porosa Porosa Porosa Porosa Brillo Aspecto de Fractura de torta vial + S.BE + N.BE + N.BE + N.BE + N.BE/A + S.BE + N.BE + N.BE + N.BE + N.BE + S.BE S.BE S.ME/A S.BE S.BE - CM-CR010 CM-CR009 CM-CR007 CM-CR006 43 g1 g2 g2sa g2sb g2sc s1 s2 s2sa s2sb s2sc sm1 sm2 sm2sa sm2sb sm2sc g1 g2 g2sa g2sb g2sc s1 s2 s2sa s2sb s2sc sm1 sm2 sm2sa sm2sb sm2sc g1 g2 g2sa g2sb g2sc s1 s2 s2sa s2sb s2sc sm1 sm2 sm2sa sm2sb sm2sc g1 g2 g2sa g2sb g2sc s1 s2 s2sa s2sb N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. N.A. I I I S N.A. I I I I I I I I N.A. N N N N N NS. S S N.A. I I I I I I I I I I I I I I S I MS. I N.A. N N N N N N N N N.A. I I I I I I MS. S N.A. I I I I I I MS. S N.A. N N N N N N N S N.A. I I I I I S I MS. N.A. I I I I I I I I I S I I I MS. I I I I N N NS. S I I I I I I I I S N N N N I I NS. S I I I I N N NS. NS. I I S MS. I I I Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Café claro Café claro Café claro Café claro Café oscuro Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Café claro Café claro Café claro Café claro Café claro Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Café claro Café claro Café claro Café claro Café oscuro Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Traslucido Blanco Traslucido Traslucido Traslucido Lisa I I I I Lisa I I I I Lisa Porosa Porosa Porosa Porosa Lisa I I I I Lisa I I I I Lisa Porosa Porosa Porosa Porosa Lisa I I I I Lisa I I I I Lisa Porosa Porosa Porosa Porosa Lisa I I I I Lisa I I I + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S.BE N.BE N.BE N.BE N.ME/T S.BE N.BE N.BE N.BE N.BE S.BE S.BE S.BE S.BE/A S.ME/T S.BE N.BE N.BE N.BE N.BE S.BE N.BE N.BE N.BE N.ME/A S.BE S.BE S.BE S.BE S.BE S.BE N.BE N.BE N.BE NME/T S.BE N.BE N.BE N.BE N.ME/A S.BE S.BE N.BE N.BE N.ME/A S.BE N.BE N.BE N.ME/A N.ME/A S.BE N.BE N.BE N.BE - 44 s2sc sm1 sm2 sm2sa sm2sb sm2sc A.R. N.A. F.S. A.R. A.R. A.R. I N N N N I N.A. N N N N I N N N N Traslucido Café claro Café claro Café claro Café claro Café claro I Lisa Porosa Porosa Porosa Porosa + + - N.BE S.BE S.BE S.BE S.BE S.BE - Nota: Datos de las propiedades físicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad natural; salvo por el encogimiento, que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa), los demás caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual. Se subrayan las anomalías encontradas a lo largo de la prueba. g. Liofilizados con glucosa como protector. s. Liofilizados con sacarosa como protector. sm. Liofilizados con leche descremada como protector. 1 . Formulación congelada. 2 . Liofilizados almacenados a temperatura ambiente. sa . Serie A (antes de rehidratar). sb .Serie B (antes de rehidratar). sc .Serie C (antes de rehidratar). %1 Concentración uno del lioprotector. %2 Concentración dos del lioprotector. %3 Concentración tres del lioprotector. Tabla 16. Liofilizados de la prueba de estabilidad natural, liofilización definitiva y de la prueba de estabilidad acelerada. Viales a1 N.A. F.S. a2 A.R. b1 N.A. F.S. b2 A.R. N.A. c1 2 F.S. c A.R. F.S. c3 A.R. Encogimiento Color N.A. I I N.A. I I N.A. N NS. N S Blanco Traslucido Traslucido Blanco Traslucido Traslucido Blanco Blanco Blanco Blanco Blanco Textura Brillo Aspecto Fractura de torta de vial Lisa + S.BE I + N.BE I + N.BE Lisa + S.BE I + N.BE I + N.BE Lisa + S.BE Porosa S.BE Porosa S.BE Porosa S.BE Porosa S.ME - Nota: Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquí mencionados, corresponden solo a aquellos que contienen sacarosa al 10% (lioprotector general). Se consignan aquí los datos generales de los liofilizados, indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas. a. Liofilizados de la prueba de estabilidad natural. b. Liofilizados de la liofilización definitiva. c. Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada. 1 . Formulación congelada. 2 . Viales almacenados a temperatura ambiente. 3 . Vial usado en la cámara de envejecimiento. 45 Figura 15. Transición física de liofilizados conforme se realizaron los ajustes. De izquierda a derecha liofilizados de: prueba de estabilidad natural, liofilización definitiva, prueba de estabilidad acelerada. 5.5.2. Contaminación. Se encontró contaminación durante la rehidratación de los viales de la serie A de la cepa CMCR006, en tanto que las siembras preliofilización no presentaban contaminación alguna, por ello se tomaron tres viales más que iban a ser rehidratados en la serie B, encontrado colonias ajenas a la cepa mencionada. Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso para una nueva liofilización de esta cepa. Las demás cepas no presentaron contaminación en ninguna prueba realizada. 5.5.3. Tiempo de redisolución. Al medir el tiempo de redisolución o reconstitución en cada una de las rehidrataciones, se observó que la glucosa tardó más tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros lioprotectores, llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Vórtex en los viales más concentrados, para su total redisolución. Además, se encontró en todos los lioprotectores, que conforme la concentración aumentaba, más tiempo se necesitaba para la reconstitución de la formulación, es decir, que el tiempo es directamente proporcional a la concentración de lioprotector. Al comparar el tiempo de reconstitución de los viales que contenían el lioprotector general en la prueba de estabilidad natural, con los viales de la liofilización definitiva y los viales de la prueba de estabilidad acelerada, no se encontraron diferencias significativas, sin embargo, el vial de la prueba de estabilidad acelerada que duró siete (7) días en cámara de envejecimiento, se reconstituyó un segundo menos aproximadamente, respecto a los otros viales. 46 Tabla 17. Tiempo de redisolución de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado. Lioprotector Tiempo (min) Glucosa 10% 1 Glucosa 11,7% 15 Glucosa 27% 120 Sacarosa 4% 0,5 Sacarosa 10% 0,5 Sacarosa 15% 0,6 Leche descremada 10% 0,25 Leche descremada 15% 0,33 Leche descremada 20% 0,5 Estabilidad natural* 0,5 Liofilización definitiva 0,25 Estabilidad acelerada 0,04 Nota: El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada uno. *liofilizados con el lioprotector general. 5.6. PRUEBAS ADICIONALES. 5.6.1. Prueba de higroscopicidad másica. En la Figura 16 se observa un aumento drástico del peso de los viales dentro de la ventana de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados al vacío). Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vacío), no tuvieron un aumento en peso tan drástico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante. Al cabo de cincuenta (50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente. No se encontró por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vacío. 0,1 AUMENTO DE PESO (W%) 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 y = 0,0365ln(x) + 0,0058 R² = 0,9647 0,02 0,01 0 % vial (5,18055g)* % Criovial (1,9018g)* Promedio 0 0 0 0 10 0,0724 0,0079 0,0401 20 0,0772 0,0158 0,0465 30 0,0782 0,0315 0,0549 40 0,0840 0,0473 0,0656 50 0,0869 0,0578 0,0724 60 0,0849 0,0605 0,0727 Figura 16. Contenido de agua absorbida (%) en función del tiempo por parte del lioprotector general en viales y crioviales. El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua absorbida por parte del lioprotector. La ecuación presentada pertenece a la línea de tendencia logarítmica, de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinación. *Peso inicial de los viales y crioviales en la prueba. 47 5.6.2. Prueba de estabilidad acelerada. Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFC/ml antes de la liofilización, al rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 83,98%, sin embargo, al rehidratar el vial 2 luego de su estadía en la cámara de envejecimiento, la BSR fue de 0%. Las propiedades físicas generales de estos viales, son presentadas en la Tabla 15. 5.7. PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIÓN. 5.7.1. Base de datos. Se eliminó una tabla sobrante (constituía información redundante de las cepas) dentro de la base de datos correspondiente a la sección de criopreservación. Adicionalmente se reorganizó la base de datos al introducir la sección de liofilización y la de refrigeración. Este último método de preservación, fue mencionado en el trabajo de Martínez & Mayorga (2013), pero no fue anexado; sin embargo, aunque se incluyó la sección en el banco de cepas, debe mencionarse que no existen registros de las cepas que se hallan conservado por este método, aun así se decidió dejar la sección para que lo ocupen trabajos posteriores. Además se encontró que en el Freezer existían colecciones que no figuran en la base de datos; no existen registros de ningún tipo ni caracterización alguna en medios digitales. La base de datos quedó organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5. Base de datos del Banco Genético del Laboratorio de Microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Información de los microorganismos de cada colección. Método de conservación de cepas Refrigeración Figura 17. Organigrama de la base de datos. Criopreservación . Liofilización 5.7.2. Fichas de resumen. Las fichas de acceso inmediato, designadas como “fichas de resumen”, para cada colección, fueron ubicadas según el sitio de almacenamiento, tanto para las cepas criopreservadas como para las liofilizadas y refrigeradas. Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas, las fichas resumen de este método fueron dejadas en blanco para futuras colecciones. El formato de las fichas resumen se presenta en el anexo 6. 5.7.3. Revisión de etiquetas y logística del banco de cepas en el Freezer. Se encontró que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulación que permite la fácil confusión entre colecciones criopreservadas; sin embargo, se decidió dejar las etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martínez & Mayorga (2013), entre otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondría una confusión entre nuevas y viejas colecciones. Este problema fue solucionado con la reorganización de la base de datos y las fichas de resumen. 48 5.7.4. Formatos de control del banco de liofilizados. Se decidió que los formatos de control para la sección de liofilización del Banco Genético fueran similares tanto para la criopreservación como para la liofilización, obedeciendo sus diferencias a las características y datos propios de cada método. Se encontró que los formatos de la sección criopreservación no habían sido llenados nunca desde su creación. Estos se muestran en el anexo 7. 5.7.5. Manual de procedimientos de conservación. Se editó la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martínez & Mayorga (2013). Partiendo de esta cartilla se elaboró un manual más completo (anexo 8), introduciendo todos los procedimientos para la liofilización, las diferentes técnicas empleadas en los procesos de criopreservación y liofilización, se complementó también la sección sobre el proceso de refrigeración y se reescribieron algunos conceptos erróneos de la edición anterior. No se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservación, pero si se realizaron pequeños ajustes de forma o de edición. 49 6. ANÁLISIS DE RESULTADOS La recuperación de microrganismos por criopreservación se realizó de acuerdo a los lineamientos establecidos por Martínez & Mayorga (2013) durante todas sus etapas, sin embargo, la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la criopreservación de la cepa o inclusive en la etapa de descongelación. García y Uruburú (citados por Ángel A., 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y estabilidad de los organismos conservados: edad celular, velocidad de congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores. Dado que las cepas CM-CR004, 006, 007, 010 e incluso la 009 (que remplazó a CM-CR005) presentaron muy buenos niveles de recuperación (Figura 8), el factor más probable de falla corresponde al crioprotector utilizado, ya que en el caso del Banco Genético, el crioprotector es general para toda la colección de bacterias, y la elección del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A., 2006), puesto que la efectividad de la criopreservación se puede ver afectada por las características propias de cada cepa (Hubálek, 2003), las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector. Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la viabilidad, los organismos conservados por este método sobreviven largos períodos por la reducción marcada de su ritmo metabólico, incluso por más de 30 años (Gonzáles et al., 2006), lo cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector como elemento de falla en la conservación de la cepa perdida. López T. & Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una única línea celular, por tanto las características morfológicas observadas son constantes y constituyen la primera instancia para la correcta identificación preliminar. Sin embargo, estos mismos autores señalan que estas características no son únicas, ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias similares, como sucedió con CM-CR007 y 010, por ello fue preciso observar las características morfológicas microscópicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y bioquímicas) de las cepas, pero, dada la simplicidad de las descripciones microscópicas de Rodríguez (2013), no se tuvo como principal referencia de identidad. Aunque la morfología de la colonia depende considerablemente de la composición del medio de cultivo y las condiciones de incubación, cuando éstas son controladas, suelen ser invariables, teniendo, por lo general, un valor diferencial considerable (Díaz, 2009), por lo tanto, se tomaron estas características como las principales para la evaluación de los indicadores de estabilidad morfológica y pureza. López T. & Torres (2006) indican que “los medios sólidos impiden el posible movimiento de los individuos de la colonia y favorece su agrupamiento” (pág. 2). Sin embargo, se observaron algunas variaciones, las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio. Esto se observó más en las cepas CM-CR007 y 010 que, al revisar los datos de Martínez & Mayorga (2013) y Rodríguez (2013), estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio húmedo, tendían a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican López T. & Torres (2006) en bacterias móviles; en tanto que sin niveles altos de humedad, las colonias eran circulares y solo se irregularizaban en función del tiempo (envejecimiento de la colonia). Esto derivó en la observación y descripción de características macroscópicas en diferentes tiempos y diferentes niveles de humedad, como son descritas en las Tablas 8, 9, 10, 11 y 12, para evitar los falsos positivos al buscar posibles contaminantes. 50 Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) días que duró la prueba de estabilidad natural, se observó que en general, de los tres lioprotectores, los resultados más bajos se obtuvieron con glucosa en todas sus concentraciones. Esto tiene su explicación en las propiedades reductoras que poseen los monosacáridos, ya que, como lo menciona Cox, C. S. (citado por Hensel, 1994) los efectos letales de la desecación se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteínas de la membrana celular y azúcares reductores que aumentan, conforme avanza la deshidratación (glicación); si las proteínas de membrana integrales o citosólicas se ven dañadas de forma irreversible durante el secado, tendría un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al., 1995), impidiendo la reconstitución de forma adecuada de las bacterias y por ende, generando muerte celular. Sin embargo, las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante alta, especialmente en la concentración más baja, incluso, para CM-CR007, la glucosa al 10% se erige como el segundo mejor protector. Es probable que estas dos cepas presenten una configuración diferente de sus proteínas de membrana que impida la reacción amino-carbonilo o que las cepas cuenten con un mecanismo extra, que proteja a las proteínas de membrana o citosólicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteínas). Es conocido que en general los disacáridos, mejoran las tasas de supervivencia y aunque el tipo de protector depende del microorganismos, la sacarosa es uno de los compuestos que se ha descrito, funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan, Herman, White, & Vesey, 2006), esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13. A diferencia de la glucosa, la sacarosa es un azúcar no reductor, estos, pueden proteger las células al competir por la unión en la membrana con los azucares reductores (Hensel, 1994). Se ha demostrado que la sacarosa mantiene las proteínas secas, igual que en sus conformaciones hidratadas; Leslie et al., (1995) indican que este fenómeno sucede probablemente “mediante la unión a los dominios hidrófilos de las proteínas y la prevención de enlaces de hidrógeno inter e intra proteínas durante el secado y la reconstitución” (pág. 3596), lo cual contribuye a las altas tasas de supervivencia al usar este lioprotector. Para que un protector funcione, éste debe proteger la bicapa lipídica y para ello, debe existir dentro y fuera de las células (Leslie et al., 1995; Palmfeldt et al., 2003); el tiempo antes del secado limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transición de membrana, ya que en ésta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de concentración (Leslie et al., 1995), reemplazando el agua intracelular, lo cual se conoce como la hipótesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al., 2003). Si esto se cumple, la concentración intracelular será alta y el tiempo antes de la congelación y el secado debe ser corto, por lo tanto la cantidad metabolizada es extremadamente pequeño (Leslie et al., 1995) y los productos polares extracelulares serán mínimos. Además, tanto la glucosa y la sacarosa están dentro de la categoría de protectores que forman matrices de vidrio amorfo, este estado vítreo: “Induce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una célula para detener la movilidad molecular a un mínimo. El vidrio amorfo inerte también es capaz de retener los productos de desecho liberados por las células dentro de la estructura de vidrio antes de la congelación, lo que significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquímicos irreversibles en la membrana plasmática durante el almacenamiento”. (Morgan et al., 2006, pág. 186) 51 La retención de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares, es otra propiedad que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilización como en la criopreservación. Cabe mencionar que el proceso de deshidratación y de reemplazo de agua intracelular por parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un límite, ya que como lo menciona Heckly (citado por Perry, 1995) al congelarse el agua del medio, las células sufren deshidratación, reduciendo el punto de congelación en el interior y evitando la formación de cristales de hielo; pero, al seguir bajando la temperatura, las concentraciones de solutos aumentan. Perry (1995), cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelación están posiblemente asociados a estas soluciones excesivamente concentradas, puesto que no se han encontrado evidencias de lesiones mecánicas por hielo extracelular. Esto correspondería con los resultados obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores, como lo fue la glucosa al 27% en casi todas las cepas (exceptuando CM-CR006, Figura 10), recordando que un protector, funciona mejor en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmótico con el interior de las bacterias (conocer la concentración intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilización por parte de éste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo, como se muestra en el trabajo de Palmfeldt et al., (2003). Pese a las buenas propiedades de la sacarosa, no se obtuvieron buenos resultados por parte de todas las cepas ante esta, un ejemplo claro es la cepa CM-CR004, la cual, de hecho, ante los glúcidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentó resultados aceptables. Morgan et al. (2006), mencionan (teniendo como referencia la investigación de Buitink et al.) que la leche descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteínas presentes en esta sustancia, son más estables y juegan un importante papel en la formación del estado vítreo, lo cual induce a pensar, que una óptima mezcla de proteínas y azucares permite una protección más eficiente. Esta posibilidad correspondería a los resultados obtenidos, donde la concentración de los componentes de la leche descremada serían propicios para la cepa CM-CR004, en tanto que para las demás cepas serían más bajas o más altas de lo propicio. Resulta inconveniente entonces que la leche descremada utilizada indica el porcentaje de glúcidos y proteínas que la componen, pero no establece cuales son estos, pudiendo ser positivos o negativos para la liofilización. En general, los cultivos líquidos ofrecen un mayor número de células viables (Ops Diagnostics, 2015), sin embargo, la viabilidad depende múltiples factores, incluyendo la fase de crecimiento en que se encentren los microorganismos. El medio SMPG está diseñado para limitar el crecimiento de las bacterias al agotarse rápidamente la fuente de carbono (glucosa); una bacteria de rápido crecimiento, entrará en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio, una de lento crecimiento, al cabo del mismo tiempo, estará en fase log; no obstante en el medio SPC, los nutrientes tardan más tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas, todas las bacterias estarán en fase log. Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de rápido crecimiento, mientras que CM-CR004, 006 y 009 son de crecimiento un poco más lento (datos obtenidos del conteo con cámara de Neubauer no incluidos en el presente estudio). Morgan et al., 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisiológicos en las bacterias, relacionado generalmente con la privación de carbono y el agotamiento de las fuentes de nutrientes disponibles, desencadenando una respuesta ante el estrés para permitir la supervivencia de la población celular. Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la 52 desecación y las temperaturas menos propicias para su crecimiento, por ello es considerada la mejor fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilización. Sin embargo, la fase de crecimiento óptima para la supervivencia en la desecación es dependiente en gran medida del tipo de organismo (Morgan et al., 2006, pág. 185). Lo anterior en contraste con los resultados de la Figura 14, indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio líquido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada, en tanto que en medio solido se encontraba en fase log; así mismo las cepas CM-CR004, 006 y 009 aumentaron su tasa de supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana. No obstante se desconoce la tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria, pudiendo ser mayor o menor. En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilización definitiva se observó puffing y pitting, y si bien Vemulapalli et al. (2015), indican que estos cambios no afectan la calidad del producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada, Jennings (2008) advierte que su presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada, y que esta puede deberse a un sistema con composición diferente de la formulación principal y podría conducir a interacciones, tales como la agregación de proteínas, además, se observó (Figura 15 izquierda y centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulación inicial de glucosa y sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16), “debido a una acción combinada de la fusión (más o menos importante) y de la presión reducida, dando lugar al puffing” (Ticó G., 1987, pág. 70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings, 2008), según la cantidad del material afectado por el puffing. Esta característica se asocia con un error en los parámetros de liofilización, por ello se revisó exhaustivamente el proceso de liofilización, encontrando que los liofilizados alcanzaron la temperatura de fusión durante el proceso de secado primario por la inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador, el cual no había sido descrito en el proceso piloto de liofilización con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del control de calidad. A causa de esto, los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los únicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha). Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura a los -32 y -42 °C, así como un melting inicial a -32°C y -42°C respectivamente, según lo reporta Moreira, Gutiérrez, & Delgado, (1994). Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento del liofilizador. Las Tablas 15 y 16 que resumen las características tenidas en cuenta para los diferentes liofilizados, muestran que el color, textura, brillo y fractura de viales, están dentro de los parámetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilización correcta con las formulaciones utilizadas, no obstante se detectaron variaciones posliofilización (almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales. Inicialmente se pensó en una falla durante el tiempo de almacenamiento, dado que los liofilizados más afectados fueron de las series B y C, sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y los resultados de la prueba de estabilidad acelerada, se determinó que la causa de fallo yacía en la obtención de humedad por parte del producto liofilizado. La prueba de higroscopicidad (Figura 16) muestra que un vial sellado al vacío absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente, y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron sellados al vacío, estos habían absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados al terminar la liofilización; esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscópica (de igual forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad más bajo que la sacarosa) debido a la 53 “facilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidrógeno con el agua” (Badui Dergal, 2006, pág. 73). “Para reducir el número de moléculas de agua el proceso de liofilización y el sellado de los viales al vacío debe haber sido exitoso y así obtener un producto con el contenido de humedad deseado” (Grauer et al., 2015, pág. 78), por lo cual se descarta la utilización del instrumento manifold para la liofilización cepas en el Banco Genético. Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilización siempre deben ser de vidrio, ya que el vapor de agua atmosférico se puede difundir a través de los tubos de plástico y por ende las muestras secas terminarían absorbiendo agua. Esto se comprobó con la utilización de crioviales, que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vacío, sino que además en la serie C, casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dañados presentaban cambios de coloración (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloración oscura como lo muestra la Tabla 15), o una marcada reducción en el volumen respecto al volumen inicial de los mismos, observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente de la concentración). Esto también se ve correlacionado con la pérdida de viabilidad de los liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008), la humedad es la principal responsable en la pérdida de viabilidad en el producto liofilizado, reduciendo la vida útil de los organismos. La obtención de agua, implica un retroceso del proceso de liofilización, el daño de la matriz formada, el flujo de los residuos extracelulares polares, es decir la reactivación del organismo, ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la actividad bioquímica, el metabolismo (Adams, 2007); finalmente la muerte celular al agotarse esta. El tiempo de redisolución y el tipo de reconstituyente también es de gran importancia. La Tabla 17 muestra tiempos de redisolución bastante altos para las formulaciones de glucosa. Con los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisión del proceso de liofilización se determinó la retrofusión producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de redisolución, causando un efecto grave donde la interacción entre las moléculas es tal que la matriz del liofilizado es casi insoluble (Jennings, 2008). El aumento de la temperatura demasiado rápido en el proceso de la liofilización, o por encima de Tg, resultó en el colapso, haciendo la reconstitución mucho más difícil (Fetterolf, 2010). Jennings (2008) indica que un aumento en el área superficial por unidad de volumen de la torta tenderá a disminuir el tiempo de reconstitución, lo cual sucedió para todos los liofilizados que presentaron melting, puffing y pitting, ya que su volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulación congelada, solo los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulación congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitución. Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados, hay que tener en cuenta las recomendaciones de Zayed & Roos (2004), quienes indican que el uso de solo sacarosa no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo, se sugiere en múltiples estudios además, el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4°C ± 1°C en la oscuridad (Ops Diagnostics, 2015). Se siguió los procedimientos de documentación establecidos por Martínez & Mayorga (2013) para la criopreservación y la elaboración de los nuevos protocolos de liofilización, encontrando como lo menciona Gonzáles et al. (2006), que es necesario contar con sistemas de documentación eficiente, además contar con duplicados de la información en medios físicos y magnéticos, evitado la perdida de información (Montes de Oca et al., 2008) y el rápido acceso a la misma. 54 7. CONCLUSIONES En general el estado de criopreservación de las cepas evaluadas es óptimo, obteniendo tasas de supervivencia satisfactorias. Sin embargo, el criopreservante no funciona de igual forma para todas las cepas debido a las características propias de cada organismo que limitan la acción del glicerol. De acuerdo a la evaluación del método de conservación realizada con los tres indicadores (viabilidad, pureza y estabilidad morfológica), la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres evaluados, siendo la concentración al 10%p/v la más óptima. No obstante, su alto grado de higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo, por ello es indispensable que cada vial usado sea sellado herméticamente y al vacío. El segundo mejor protector corresponde a la leche descremada, aunque no se determinó la concentración más óptima. En cuanto a la glucosa, al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo, se observa que, pese a no ser un buen lioprotector, concentraciones de glucosa entre el 6% y el 10% p/v son funcionales, aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50%. No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservación, estos fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminación de las muestras y a su vez, evitar la contaminación por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso. Se creó el protocolo para el proceso de liofilización en todas sus etapas. Este es metodológicamente funcional y fácilmente reproducible, por ello se estandariza para el Banco Genético, sección liofilización, dentro del nuevo manual de procedimientos de conservación. Se incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservación dentro de este manual, ajustado a las necesidades específicas de seguridad de la liofilización. Es importante mantener actualizado los diferentes medios físicos y magnéticos donde reposa la información de las colecciones y los microorganismos en ellos, dado que estos datos son vitales para la existencia del Banco Genético y la información se puede perder. La falta de la identificación hasta cepa (al menos hasta género) de los microorganismos presentes en el banco genético, limita la información para entender los fenómenos relacionados a los procesos de conservación y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo. 55 8. RECOMENDACIONES Existen parámetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente, como la edad del cultivo, la concentración celular, entre otros. Se propone el estudio de los parámetros faltantes como eje inicial para realizar ajustes al protocolo de liofilización con el fin de lograr altas tasas de supervivencia durante un mayor tiempo de almacenaje. La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo plazo, pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos, por ello se sugiere la creación de un modelo matemático para que sea funcional esta prueba, lo cual generaría datos muy importantes de supervivencia en el tiempo. Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinación de lioprotectores con formadores de matrices y estabilizantes, siguiendo los protocolos establecidos. Mezclas de sacarosa al 10% p/v con leche descremada 10% p/v (de la misma marca usada en este estudio), sacarosa al 10% p/v con leche descremada 10% p/v y carbón activado, así como la utilización de estas mezclas con trehalosa en distintas concentraciones, son sugeridas. Es necesaria la creación de una plataforma online del banco genético una vez este cuente con la identificación de los organismos contenidos, así mismo, es necesario un programa especializado para la base de datos del banco genético distinto a Access, preferiblemente que obedezca a una creación propia de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Es necesaria la creación de una pasantía anual para curaduría del Banco Genético, ya que existen colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro de datos en la recepción de cepas. Además se necesita mantener y revisar las colecciones que se encuentran almacenadas, como aquellas que sean donadas al Banco Genético en el futuro. 56 9. REFERENCIAS Adams, G. (2007). The Principles of Freeze-Drying. En J. G. Day, & G. N. Stacey (Ed.), Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols (págs. 15-38). New Jersey: Humana Press Inc. Ángel A., D. I. (2006). 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Zamora R., Lucero M. (2003). Aislamiento, identificación y conservación de cultivos de bacterias lácticas antagonistas de microbiota contaminante de sangre de matadero (Tesis doctoral). Universitat de Girona, Cataluña, España. 62 11. ANEXOS Anexo 1. Formato para características macroscópicas de las cepas. Cepa Características Borde o Margen Frente a luz Forma Elevación Color CM-XX00Xa Descripción Fotografía Brillante/opaca Tamaño Superficie Consistencia Grado de Transparencia Pigmentación o cromogénesis Olor Pigmentos que desprende la colonia y se observan sobre el medio Hemolisis Medio/T(°C) En conjunto, las publicaciones de Valencia Z. (2004), Pírez & Mota (2006) y Díaz (2009), ofrecen un amplia gama de características macroscópicas para bacterias y hongos. Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma. Es importante siempre señalar las condiciones en que se hace la descripción, pues las características pueden variar en función de la edad del cultivo, la humedad del medio, la temperatura de crecimiento, el pH… a. Código asignado para la cepa en la colección y la base de datos. *Borde, superficie y forma son características diferentes, aunque algunos autores las combinen. **Esta tabla no debe sobrepasar el tamaño de una hoja tamaño carta. ***Solo se debe poner fotografías de las características mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad, de lo contrario es mejor prescindir de ellas. Aun así, pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Genético (funcionan como referencia). 63 Anexo 2. Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados. a) Recubrimiento: (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido, cartón y autoadhesivo de emulsión acuosa. b) Bandeja de liofilizados c) Soporte para bandeja d) Cojín de sílice gel (reemplazo según el tamaño y cantidad de cojines, de 2 meses a 1 año) El banco de liofilizados está dividido en tres secciones: La sección de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A, B y C respectivamente. La sección de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D, E y F respectivamente. La sección de hongos (color café) correspondiente a las bandejas G, H e I respectivamente. 64 Bandeja de liofilizados. Está hecha de poliestireno expandido, viene con 100 compartimientos individuales para un máximo de 100 viales por bandeja. 10 20 30 11 01 40 50 31 21 80 60 51 41 90 70 61 71 100 91 81 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 65 Anexo 3. Esquema general del cepario madre de liofilizados. J K L 8 16 24 8 16 24 8 16 1 9 17 1 9 17 1 9 17 F1 F2 F3 F1 F2 F3 F1 F2 F3 24 J: Hongos K: Bacterias L: Algas F: Fila Números: compartimento correspondiente a cada vial. La numeración va en zigzag. 66 Anexo 4. Cámara de envejecimiento artesanal. Horno de 37°C (cámara externa) Termómetro Tapa de sello hermético Viales Agua o s/n salina Cámara interna Malla de soporte Esta cámara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra. La humedad relativa puede controlarse según si se use agua (100%) o una concentración determinada de solución salina, ver Colmenares R., (2015). 67 Anexo 5. Base de datos en Access. Esquema general de la Base de datos del Banco Genético. Espacio de trabajo con las tablas Organigrama de la base de datos Tablas de datos (equivalente a los formatos de registro con información más detallada) 68 Anexo 6. Formato de las Fichas Resumen. BANCO GENÉTICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FICHA RESUMEN DE LA COLECCIÓN: Ubicación de la presente ficha Otras ubicaciones de fichas Resumen del proyecto Fuente de obtención Fecha de de las cepas ingreso Cantidad de cepas Tipo de organismos Código asignado a Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa) colección Ubicación de cepas (según todos los métodos de conservación utilizados para la colección) Autores o donante Quien recibe Autoriza Nombre Firma Firma C.C. C.C. Nota. Registro fotográfico y demás información en la base de datos y Formatos de control 69 Anexo 7. Formatos de control de la sección liofilización. BANCO GENÉTICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FLf-01. REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS Lugar (Ciudad y País) Origen de la cepa Fecha de ingreso Institución, Organización o Empresa donante Persona que realizó el aislamiento Información de contacto Fuente de obtención de la cepa Cargo Fecha de aislamiento Código asignado a colección SI NO Caracterización microscópica SI NO Restricción de Caracterización distribución microscópica N.1 N.2 N.3 N.4 Nivel de Observaciones Bioseguridad Persona donante Quien recibe Autoriza Nombre Nombre Firma Firma Firma C.C. C.C. C.C. Nota. Registro fotográfico y demás información en la base de datos Identificación genética de la cepa Calidad de la cepa recibida 70 BANCO GENÉTICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FLf-02. PROCESO DE LIOFILIZACIÓN CM-_ _0_ _ Fecha Hora Ciudad Equipo Lioprotector y Temperatura (°C) Proceso concentración Presión (mbar) Duración (min) Accesorio de secado Responsable (s) del proceso Código de la Nombre de cepa la colección Ubicación Viales Tipo S T Lf Total Sello al vacío SI NO almacenados Cantidad Sello de Aluminio SI NO Caracterización Caracterización Concentración celular macroscópica (resumen) microscópica (resumen) (UCF) Preliofilización Posliofilización Pruebas de Viabilidad Bioquímicas Otras Responsable del proceso Nombre Firma C.C. Autoriza Firma C.C. Nota. Registro fotográfico y demás información en la base de datos 71 BANCO GENÉTICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD, PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS CEPAS CM-_ _0_ _ Fecha Ciudad Detalles del Hora Código de cepa Proceso Viales a evaluar T S Lf Temperatura (°C) Viales en mal estado T S Lf Presión (Mbar) Fecha de liofilización Fecha de evaluación Total tiempo (meses) Caracterización Descripción de la cepa Género-especie del microorganismo Nombre de la Colección Microscópica Preliofilización Microscópica Posliofilización Macroscópica Preliofilización Macroscópica Posliofilización Observaciones Viabilidad Concentración Celular (UFC) Preliofilización Observaciones Concentración Celular (UFC) Posliofilización Preliofilización Posliofilización Pruebas Cristal Preliofilización Posliofilización Otras Pruebas Preliofilización Posliofilización Bioquímicas Control de Calidad Observaciones Responsable del proceso Nombre Firma C.C. Autoriza Firma C.C. Nota. Registro fotográfico y demás información en la base de datos 72 BANCO GENÉTICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS CM-_ _0_ _ Fecha Lugar (Ciudad, País) Institución, Organización Información o Empresa del Solicitante Cargo solicitante Teléfono (s) Email Código de Género – especie cepa Microorganismo Descripción de la cepa Colección Utilización de la cepa por parte del solicitante Encargado del Cepario Nombre Firma C.C. Recibe Autoriza Nombre Firma Firma C.C. C.C. Nota. Registro fotográfico y demás información en la base de datos 73 Anexo 8. Manual de procedimientos de conservación para el Banco Genético del Laboratorio de Microbiología, Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad Distrital Francisco José de Caldas (Ver archivo adjunto) Manual de procedimientos de conservación para el Banco Genético del Laboratorio de Microbiología, Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad Distrital Francisco José de Caldas Primera Edición Editado por Andrés V. Castañeda R. Manual de procedimientos de conservación para el Banco Genético del Laboratorio de Microbiología, Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad Distrital Francisco José de Caldas. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Ingeniería Sanitaria Andrés Vicente Castañeda Rangel Licenciado en Biología Universidad Distrital Francisco José de Caldas Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales Niria Pastora Bonza Pérez Docente encargado del Laboratorio de Microbiología y coordinador de Ingeniería Sanitaria Miguel Ángel Piragauta Aguilar Diseño y diagramación Andrés Vicente Castañeda Rangel [email protected] Autoría y Edición Andrés Vicente Castañeda R. 2015 Todos los derechos reservados TABLA DE CONTENIDO TÍTULO: PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS RECEPCIÓN DE CEPAS 2 VERIFICACIÓN DE CEPAS 3 EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4 MEDIOS, REACTIVOS Y PROTECTORES 5 Medios. 5 Reactivos. 6 Protectores generales. 6 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DEL MÉTODO DE CONSERVACIÓN Indicador uno. Viabilidad. Conteo directo con cámara de neubauer (1/10mm). 7 7 7 Conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa. 10 Indicador dos. Estabilidad morfológica. 12 Conteo en placa (características macroscópicas). 12 Tinción de gram (características microscópicas). 13 Indicador tres. Pureza de la cepa. RECUPERACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS 13 14 Criopreservados (descongelamiento). 14 Liofilizados (rehidratación o reconstitución). 14 REFRIGERACIÓN 15 CRIOPRESERVACIÓN 16 Precriopreservación. 16 Preparación del inoculo bacteriano y ejecución de la criopreservación. 16 LIOFILIZACIÓN Preliofilización y preparación del inoculo bacteriano. 17 17 Desde medio sólido. 17 Desde medio líquido. 17 Ejecución de la liofilización. 17 Desde medio sólido. 17 Desde medio líquido. 17 Posliofilización. 18 Variaciones de la liofilización en hongos. 18 RÓTULOS 19 Refrigeración. 19 Criopreservación. 19 Liofilización. 20 TÍTULO 2: PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE CONSERVACIÓN Y EN EL LABORATORIO CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN 23 Medios. 23 Ambiente. 23 Nevera de almacenamiento de los medios y protectores. 23 Cabina de flujo laminar. 23 Técnicas de siembra y manipulación de elementos. 24 ELIMINACIÓN DE RESIDUOS 24 Desechos no contaminados (no infecciosos). 24 Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos). 24 Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado. 24 Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado. 25 Material contaminado destinado a la incineración directa. 25 BIOSEGURIDAD 26 Protección personal. 26 Procedimientos. 27 Áreas de trabajo. 27 Capacitaciones. 27 REFERENCIAS 28 IV LISTA DE FIGURAS Figura 1. Dilución en serie. Figura 2. Conteo directo. Figura 3. Conteo en bacterias. Figura 4. Extensión de la muestra con el asa de Drigaslky. Figura 5. Contador de colonias. Figura 6. Rótulo opcional para tubos inclinados. Figura 7. Rótulos para las cajas del Freezer. Figura 8. Rótulos para los crioviales. Figura 9. Rótulos creados para los viales liofilizados. 7 8 8 10 11 19 19 19 20 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Equipos y material a usar según proceso. Tabla 2. Composición medio SMPG. Tabla 3. Compuestos de macroelementos y microelementos. Tabla 4. Reactivos, medios y protectores usados en los diferentes métodos de conservación de microorganismos. Tabla 5. Matriz para el conteo en Cámara de Neubauer. Tabla 6. Código de colores propuesto según la clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS. 4 5 5 6 9 21 LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL kPa. Kilo pascales mbar. milibar min. Minutos g. gramos s. Segundos ml. mililitros µl. microlitros UCF. Unidades formadoras de colonias mm. milímetros rpm. Revoluciones por minuto °C. grados Celsius %v/v. Porcentaje volumen a volumen ¡Precaución! %p/v. porcentaje peso a volumen ¡A tener en cuenta! mTorr. militorricelli V INTRODUCCIÓN Este manual representa en conjunto el trabajo a través del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigación han sentado los pilares para la formación del Banco Genético del Laboratorio de Microbiología, Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC ), cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservación y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigación, que permita a la comunidad académica de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbiológicos en las áreas de biorremediación, biodegradación y biotecnológica para el país. Aquí se presentan los tres métodos de conservación de microorganismos aplicados en este Banco Genético: Refrigeración, criopreservación y liofilización. Se hace énfasis en los diferentes procesos, materiales, equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Genético. VI Protocolos para la conservación de microorganismos RECEPCIÓN DE CEPAS Para que una cepa ingrese al Banco genético, debe contar con las siguientes condiciones mínimas de recepción: La cepa se debe encontrar en estado de pureza. Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Genético: biorremediación, biodegradación y biotecnología. Debe contar con un responsable, entidad o institución donante que respalde la(s) cepa(s) entregadas, además de contar con la información de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad. La cepa o colección debe contar con toda la información que el Banco genético requiera para su mantenimiento, conservación y registro en la base de datos. La cepa o colección debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles de Bioseguridad establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS), siendo el nivel de bioseguridad 2 el máximo permitido por las instalaciones del laboratorio, con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo. Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado, investigaciones, entre otras) se debe pasar con 15 días de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS, al docente encargado. Una vez recibida la cepa, se diligencian los mismos registros en digital, se anexa la información a la base de datos, asignándole un código y se diligencian las fichas de resumen. 2 VERIFICACIÓN DE CEPAS El personal encargado del Banco Genético, debe realizar una verificación de la pureza de la cepa, esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada, sobre una o más cajas de Petri con el medio de cultivo, el tiempo y temperatura de incubación especificados por quien hace la donación. Así mismo a partir de este subcultivo, se debe realizar la evaluación de la eficacia del método de conservación para verificar la información dada por el investigador donante Posterior al proceso de recepción de cepas, es importante tener en cuenta que se debe verificar la fecha de la última siembra, para determinar si es apropiado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder después al proceso de criopreservación o liofilización. Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las cepas por más de dos meses antes de la criopreservación o la liofilización, se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservándola por el método de refrigeración con el fin de evitar que la cepa se pierda. Si se requieren hacer pruebas bioquímicas, pruebas cristal u otras pruebas complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos, se tendrá que pedir la autorización del responsable del Banco Genético y del encargado del laboratorio, debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposición de material en el laboratorio. Nota: Si alguna cepa llegara a presentar contaminación, se debe informar a la persona responsable del Banco Genético y posteriormente a la persona, entidad o institución donante. 3 EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos que se requieren para los procesos de preservación. Tabla 1. Equipos y material a usar según proceso. Proceso o método Refrigeración Criopreservación Equipo Material Nevera Thermolab 14-E0107 Cabina de flujo laminar Esterilizador de asas Cabina de flujo laminar Vórtex Micropipeta graduable de 100-1000 µl Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la colección Pipeteador Esterilizador de asas Vórtex Liofilización Evaluación del método de conservación Recuperación de los microorganismos Cabina de flujo laminar Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile Crimper Micropipetas graduables de 100-1000µl y 20-200µl Cámara de Neubauer 1/10mm Cámara AxioCam ICc5 Microscopio Axio Scope A1 Contador de colonias CC-1 Estereoscopio Zeiss Incubadora de 25°y 37°C Micropipeta graduable 100-1000µl, 20-200µl y 5-20µl Vórtex Micropipeta graduable 100-1000µl y 20-200µl Cabina de flujo laminar Plancha de calentamiento Demás equipos y materiales utilizados en la evaluación del método de conservación Tubo de ensayo tapa rosca Asa redonda Crioviales Puntas azules Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm Frascos Schott con tapa para el glicerol Pipeta de 1ml o 5ml Asa redonda Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm Puntas azules y amarillas Recipiente de poliestireno expandido cerrado Sello de aluminio Pinzas Vial 5mm con tapón de división Laminilla de cuarzo Laminas porta objetos Laminillas cubre objetos Marcador Asa redonda Asa de Drigalsky Puntas azules, amarillas y blancas Goteros Puntas azules y amarillas Tubos de ensayo Cajas de Petri con medio Mechero Beaker Termómetro Cajas de Petri con medio Tubos de ensayo -Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiología. 4 MEDIOS, REACTIVOS Y PROTECTORES El Banco Genético cuenta con medios, reactivos y protectores generales definidos para los métodos de preservación, manutención y recuperación de microrganismos. Estos se describen a continuación y se clasifican de acuerdo al método de conservación en la Tabla 4. Medios. CALDO SMPG: Este medio es empleado para el crecimiento del inóculo inicial y en la formulación de la criopreservación. Su composición se muestra en las Tablas 2 y 3. Tabla 2. Composición medio SMPG. Compuesto Macroelementos Microelementos Peptona Glucosa Porcentaje 7.6% 0.76% 1% 0.1% Tabla 3. Compuestos de macroelementos y microelementos. MACROELEMENTOS MgSO4 NaNO3 KCl CaCl2 Na2HPO4 FeSO4.7H2O Agua destilada Cantidad 2g 2g 0.15 g 2.1 g 0.9 g 0.01 g 1000 ml MICROELEMENTOS CuSO4- 5H2O H3BO3 MnSO4 – H2O ZnSO4 – 7H2O Agua destilada Cantidad 0.05 g 0.1 g 0.1 g 0.1 g 1000 ml SPC (Standard Plate Count): Este medio se utiliza para la técnica de evaluación de la eficacia del método de conservación. También puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas. Agar nutritivo (AN) o medios específicos: Utilizados como medio de mantenimiento o para pruebas bioquímicas y/o fisicoquímicas (si se realizan) en la evaluación de la eficacia del método de conservación. Buffer agua peptonada: Este medio se utiliza en la rehidratación y en la evaluación de la eficacia del método de conservación. 5 Reactivos. Tinción Gram: La batería de reactivos para la Tinción de Gram se utiliza en la evaluación de la eficacia del método de conservación. Alcohol acetona: Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la cámara de Neubauer y la laminilla de cuarzo. Agua destilada: Se utiliza en todos los procedimientos para la preparación de medios, la descongelación y especialmente en la evaluación de la eficacia del método de conservación. Alcohol: Para desinfección en todos los procedimientos (70%) o para mecheros (95%). Aceite de inmersión: Se utiliza para la evaluación del método de conservación durante las observaciones microscópicas. Nitrógeno Líquido: Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilización Protectores generales. Crioprotector: Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservación, en proporción 67%v/v respecto al criovial. Lioprotector: Se utiliza una solución de Sacarosa 10% p/v para las formulaciones en la liofilización bacteriana. En hongos se utiliza leche descremada al 12% p/v. No se tiene detalles de lioprotector óptimo en algas. Tabla 4. Reactivos, medios y protectores usados en los diferentes métodos de conservación de microorganismos. Reactivos Medios Protector Tinción Gram Alcohol acetona Agua destilada Alcohol Aceite de inmersión Nitrógeno Líquido SMPG SPC AN Medios específicos Agua peptonada Glicerol anhidro Sacarosa 10%p/v Refrigeración SI SI SI NO SI Criopreservación SI SI SI SI SI Liofilización SI SI SI SI SI NO SI SI SI OPCIONAL NO SI SI OPCIONAL OPCIONAL SI NO SI OPCIONAL OPCIONAL SI NO SI SI SI NO NO NO SI Nota: Dado que en la refrigeración, criopreservación y liofilización se realiza la evaluación del método de conservación, se incluyen aquí los reactivos implicados en dicha evaluación. 6 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DEL MÉTODO DE CONSERVACIÓN Indicador uno. Viabilidad. Conteo directo con cámara de Neubauer (1/10mm): Se parte de un tubo de dilución (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto, el cual tiene por lo general un tiempo de incubación de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo. Figura 1. Dilución en serie. Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser estériles usando una nueva en cada transferencia. El diluyente es agua peptonada al 0,1% p/v. Tome la cámara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia. Observe las dos cuadriculas de la cámara, que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H). Agite el tubo de dilución seleccionado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 5s, tomando con una micropipeta una alícuota de 10µl y depositándola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla, dejando que se cargue por capilaridad de forma homogénea (Figura 2-A). Posteriormente lleve al microscopio, enfocando desde el menor aumento hasta él objetivo 40x, al tiempo que ajusta la intensidad lumínica para poder observar las líneas de la cámara y las células al tiempo. -Algunos modelos de Vórtex no poseen un rango de velocidad sino de niveles. -Para limpiar la cámara de Neubauer y la laminilla de cuarzo, lave primero con agua destilada, luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada. Deje secar al ambiente. -Para una correcta observación al microscopio, utilice el método de enfoque de Köhler -Procure no limpiar la laminilla con ningún papel o paño, lo puede rayar. -Este procedimiento debe durar máximo 10min, ya que la solución podría secarse debido a la luz del microscopio. 7 Figura 2. Conteo directo. A. Utilización de la cámara de Neubauer: 1. posición de la laminilla; 2. posición de la punta para el deposito de la muestra. B. esquema general de la cámara de Neubauer. Adaptado de Bastidas (2015). http://www.celeromics.com/es/ resources/docs/Articles/Formula-Camara-Neubauer-Concentracion.pdf & Universitat de Barcelona (2015). http://www.ub.edu/LabFisio/images/stories/FisAnimalBiologia/ Sangre/contadorToma.png El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central. Las fórmulas y los cuadros a contar se determinan según el tamaño del microorganismo: Hongos y microalgas: Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes (cuadros 1 y cuadro central, Figura 2-B) de izquierda a derecha. Bacterias: Cuente en el cuadro central, que contiene 25 cuadros secundarios (Figura 2-B), 5 de ellos (Figura 3-A o B). Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios, en estos, las células deben contarse en la dirección que se indica en la Figura 3-C. Los cuadros terciarios contienen tres líneas en los extremos, por ello se deben tener en cuenta las células que estén desde la línea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D. Figura 3. Conteo en bacterias. A y B. Forma de contar los cuadros terciarios. C. Dirección de conteo en los cuadros terciarios. D. Células a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios. 8 Es importante resaltar que las bacterias que estén unidas se contarán como una. Una vez obtenido el número total de células, se realizaran los cálculos correspondientes a los cuadros utilizados. Para obtener el número de bacterias, se utiliza la ecuación planteada a partir de Bastidas (2015): N° Total de bacterias contadas × 250000 Fd* × N° de cuadrados contados N° de bacterias/ml= En el caso de hongos y microalgas, se utiliza la siguiente ecuación a partir de Bastidas (2015): N° Total de células contadas × 10000 Fd* × N° de cuadrados contados N° de células/ml= *Fd: Factor de dilución = g o ml de alícuota g o ml de alícuota + g o ml de diluyente Nota: El método de conteo en cámara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de células en los procedimientos de conservación de microorganismos. Pero, si se requiere la utilización de otro método se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados. -El conteo directo con cámara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al método de conservación evaluado. Consideremos el siguiente ejemplo: Tenemos un tubo con cultivo en medio líquido (10ml) de 36 horas, este será nuestra muestra inicial. Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo, por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con alícuotas de 1ml en 9ml de diluyente. Se realiza el procedimiento descrito en las páginas anteriores, haciendo un solo conteo. Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que: Tabla 5. Matriz para el conteo en Cámara de Neubauer. Cuadro A B C D E Total Fd Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7 9 Aplicando la ecuación para bacterias anteriormente mostrada tenemos que: 16 × 250000 10-7 × 5 N° de bacterias/ml= = 8*1012 bacterias/ml 8*1012 bacterias/ml será la cantidad de bacterias que “existen” en la muestra inicial. Esta en términos matemáticos de las diluciones equivale a 100. Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas, contando en los cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuación tenemos que: 16 × 10000 10-7 × 5 N° de células/ml= = 3,2*1011 células/ml -Si se quieren datos más fiables, se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma alícuota o poner en la cámara cinco alícuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras. -Al realizar el conteo en la cámara de Neubauer obtenemos el total aproximado de células presentes en la dilución utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado y/o las impurezas que pueda contener la muestra, por lo cual no es 100% exacto y no indica las células viables. Conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa: Seleccione tres tubos de la dilución seriada, y de cada uno vierta alícuotas de 100µl (agitando con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) antes de cada extracción) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio. Rápidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky estéril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4. A B 90° Figura 4. Extensión de la muestra con el asa de Drigaslky. A. La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atrás. B. Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro, luego girar 90° la caja y repetir el proceso. 10 Deje secar por mínimo 15min y lleve a incubación en posición invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja). Según el tipo de organismo, las condiciones de incubación para la lectura de las cajas son: Bacterias: temperatura ambiente, 37°C o temperatura óptima de crecimiento si se conoce. Incubación de 18-24 horas. Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas. Casos extremos de crecimiento lento una semana. Hongos: temperatura inferior a 25°C o temperatura óptima de crecimiento si se conoce. Incubación de una siembra de solución de conidios de 4-8 días. Algas: temperatura entre 25-37°C o temperatura óptima de crecimiento si se conoce. Incubación por máximo 7 días en organismos descongelados o rehidratados. Luego de la incubación, las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura 5). Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml). Figura 5. Contador de colonias. La caja de Petri se coloca en posición invertida y se marcan las colinas, el contador cuenta al tacto. -La siembra por tubo, se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador. -Generalmente se toman las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7. Sin embargo, si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3, 10-4 y 10-5. -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70%, flamear, esperar a que el alcohol se consuma. Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar, por último palpe rápida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender, para enfriar totalmente. -Puede usarse una siembra en profundidad u otro método para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie. Sin embargo, los demás métodos de conteo limitan la evaluación del indicador dos. -Si al cabo de 30min las cajas no han secado, el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condición. -Con la punta de la micropipeta no toque el medio. -Siempre use guantes y desinféctelos constantemente durante los procedimientos. 11 En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250, al suponer que cada célula forma una colonia. Para el cálculo de UFC/ml utilizamos una adaptación de la fórmula de Valencia Z.(2004): N° de colonias UFC/ml = (promedio entre las × cajas por dilución) Inverso del factor × de dilución Inverso del volumen de alícuota Ejemplo: 120 X 107 X 10 = 1,2*1010 UFC/ml -La metodología y los criterios de elección de cajas así como el rango, son seguidas de Camacho et al., (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo, todas las placas por dilución por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Pública del Gobierno de Chile (2008). -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilización como en la criopreservación. -El inverso del volumen de alícuota corresponde a una medida de corrección obligatoria para la siembra en superficie, ya que en la práctica se aumenta en 1/10 el factor de dilución al sembrar 0,1ml (100µl) del tubo de dilución seleccionado. El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre y/o pos al proceso de conservación, se calcula a través de la ecuación propuesta por Morales-García et al., (2010): Tasa de supervivencia (BSR %)= Log (1 + N° UFC/ml DD*) x 100 Log (N° UFC/ml AD**) Donde: *DD: Después de la desecación **AD: Antes de la desecación Indicador dos. Estabilidad Morfológica. Para evaluar este indicador se realiza: Conteo en placa (características macroscópicas). Diligenciar el formato para características macroscópicas de las cepas (anexo 1), descritas por Valencia Z. (2004), Pírez & Mota (2006) y Díaz (2009), para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de “conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa”. Hay que tener en cuenta que: - Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas), de una dilución, conteniendo siempre un número de UFC representativas, según el rango estipulado por Camacho et al., (2009). - Las características macroscópicas deben ser observadas en al menos el 80% de las colonias de la placa seleccionada. 12 Tinción de Gram (características microscópicas). Posterior al procedimiento anterior, se realice una “coloración de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfológica con el microorganismo esperado” (Sánchez & Corrales, 2005, pág. 24). En el caso de hongos, realice una coloración simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado. Por último comparar los resultados con las características microscópicas y macroscópicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la información de la base de datos para cada cepa. De igual forma se toma registro fotográfico para la base de datos a través del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con cámara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue, y un estereoscopio con cámara. -Realice una coloración de Gram estándar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotográfico en un lapso no mayor a dos días. -En los hongos es imprescindible el registro fotográfico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonómica. -El formato para características macroscópicas de las cepas exige un registro fotográfico, pero allí solo se consignan si las fotografías son de alta calidad, de lo contrario, solo se dejan en la base de datos como referencia. -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos. -La estabilidad morfológica se evalúa pre y pos tanto en la liofilización como en la criopreservación. -Para comparar las características macroscópicas con la información de origen, se deben usar los mismos medios. El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos. Indicador tres. Pureza de la cepa. Este indicador evalúa la pureza de un vial/criovial rehidratado/descongelado, además permite determinar si existe un cambio genético durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservación. Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfológica en cada conteo de células viables realizado por el método de conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa. Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimática, usando una batería de pruebas bioquímicas o fisicoquímicas diferenciales dependiendo de los requerimientos específicos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio. Se recomienda realizar cada prueba por triplicado. También puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales. Si se confirma variación en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen, y estas confirman la variación genética de la cepa, inmediatamente se saca de la colección origen, se asigna un nuevo código de identificación y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa. Puede incluirse en la colección Prácticas Académicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva colección. 13 RECUPERACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS Criopreservados (Descongelamiento). Se toma un criovial (Semistock preferiblemente), sometiéndolo a una temperatura de 37°C (Arcos, Ossa, & Díaz, 2004) en baño serológico, con agua destilada, hasta su descongelación, por aproximadamente 5min (Martínez & Mayorga, 2013). Los crioviales se introducen en baño serológico una vez se llega a la temperatura deseada, no antes. Del criovial se toma 1ml con micropipeta, previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 10s, diluyéndolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martínez & Mayorga, 2013). Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 °C ± 1°C de 18-24 horas. La evaluación de la eficacia del método de conservación se realiza al criovial, luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubación (viables poscriopreservación). Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservación consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Genético. Liofilizados (Rehidratación o reconstitución). Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37°C los viales a usar, tomando el tiempo de rehidratación, luego incubados a 25°C ± 1°C por 30min y agitando con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por 7s. Posteriormente, se toma un 1ml de este vial, partiendo de esta alícuota se realiza evaluación de la eficacia del método de conservación en medio sólido. El indicador de viabilidad se evalúa solo con el método de conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa u otro método de conteo de organismos viables. -Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investigador donante sugiera otros métodos de recuperación. -La solución de rehidratación puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solución lioprotectora de la formulación. -En el momento en que solo quede un criovial/vial disponible de la cepa, se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservación a partir de este. 14 REFRIGERACIÓN Se implementa el método de resiembra continua; en este, el microorganismo se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento, es almacenado a 4°C, donde se mantiene para su uso, resembrándolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-García et al., 2010) cuando es utilizado, para su almacenado nuevamente. Se debe tener en cuenta los siguientes parámetros: a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las características del microorganismo, ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios después de días, semanas o meses. También depende del tipo de medio de mantenimiento. b) El riesgo de contaminación y de cambios genéticos se incrementa a mayor número de transferencias. De acuerdo a esto, para el laboratorio se determina: a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo tapa rosca con Agar inclinado. b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo, procurando no realizar más de 4 transferencias. c) La temperatura de refrigeración debe mantenerse en un rango de 4±2°C. d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminación cruzada, teniendo en cuenta la organización interna del refrigerador, evitando el amontonamiento de las cajas. e) Se utilizará el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS. f) Las cepas preservadas por este procedimiento serán utilizadas para requerimientos internos del laboratorio, preferiblemente en prácticas académicas. 15 CRIOPRESERVACIÓN Precriopreservación. En el interior de la cabina de flujo laminar, tomar cinco crioviales a los cuales se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina. Posteriormente son llenados con 1200µl de glicerol estéril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados. Preparación del inóculo bacteriano y ejecución de la criopreservación. Partiendo de un cultivo en medio líquido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inóculo inicial para el proceso de criopreservación (Martínez & Mayorga, 2013), se agita con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s y se extrae una alícuota de 1ml, diluyéndolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02). Después, agitar el tubo T02 con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, tomando luego cinco alícuotas de 600µl, depositadas en cada criovial, para aforar un volumen final de 1800µl (Martínez & Mayorga, 2013). Se rotulan los crioviales y se realiza Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 5s para su homogenización. Inmediatamente después de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente según la colección, a una temperatura de -85°C ± 1°C. Por último se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN, culminado el proceso. -No use micropipeta para pipetear el glicerol. -Todo el material debe ser correctamente esterilizado. -Nunca tocar las tapas en el interior. -De ser posible, se recomienda una concentración de 10⁸ - 109 cel./ml. -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminación del medio, procurando además, no sobrepasar 20min, desde la extracción de la alícuota de T0 1 y la congelación, esto con el fin de evitar la generación de nuevas células (si se han determinado cel./ml totales precongelamiento). -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento, para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables, aumentando el número de viables poscongelación. Esto se puede hacer si no se tiene un número determinado de células, a una temperatura de 4°C ± 1°C por 20-30min. -Recuerde realizar evaluación de la eficacia del método de conservación pre y poscriopreservación. Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas. 16 LIOFILIZACIÓN Preliofilización y preparación del inoculo bacteriano. Desde medio sólido. Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio sólido, se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano, inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general. Posteriormente se debe agitar con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 45s. Desde medio líquido. Partiendo de un cultivo en medio líquido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inóculo inicial para el proceso de liofilización, se agita con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra, diluyéndolo en un tubo con 9ml agua destilada estéril (designado como T04). Ejecución de la liofilización. Desde medio sólido. Del tubo T03, como inóculo inicial para el proceso de liofilización y previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, se extraen cuatro alícuotas de 1ml, que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapón de división. Cada vial se agita con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por 7s para su homogenización evitando el contacto con el tapón. Desde medio líquido. Del tubo T04, previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, se extraen cuatro alícuotas de 100µl, depositados en cuatro viales de vidrio. En cada vial, se adiciona 900µl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapón de división. Con el fin de que la concentración de lioprotector en el interior de cada vial sea lo más exacta posible al adicionarle la alícuota del tubo T04, se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparación: Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado, en tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la alícuota del tubo T04. 17 Con un volumen total de 1ml, cada vial se agita con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por 7s para su homogenización evitando el contacto con el tapón. Los viales (indistintamente si se parte de medio sólido o líquido) se destapan parcialmente y se congelan en nitrógeno líquido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ≥15min para ser llevados al liofilizador, de 24-48 horas, a una presión inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45°C. Posliofilización. Luego del desmonte y sellado al vacío de los viales, cada vial debe ser rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper, posterior al proceso de liofilización. Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente. El tercer vial (Lf) se almacena a 4°C ± 1°C en el cepario madre de liofilizados. El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 días, realizando evaluación de la eficacia del método de conservación para saber si fue o no exitosa la liofilización. Por último se debe llenar el registro FLf-02. PROCESO DE LIOFILIZACIÓN, culminado el proceso. -Recuerde realizar evaluación de la eficacia del método de conservación pre y posliofilización. Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas. -Se debe realizar Vórtex cada vez que se vaya a extraer una alícuota. -Los mejores resultados en la liofilización se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria. Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase, se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas, y en caldo SMPG un rango de 24-48h. -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir más tiempo del estipulado para su total congelamiento, tener este dato de ser posible. -El tiempo de liofilización varía según la formulación. Para una formulación con Sacarosa 10% 36 horas es lo ideal. -Debe usarse el accesorio para liofilización Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vacío y de forma hermética. -Los tapones de división deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimación del agua, de lo contrario no será posible la liofilización y pueden incluso quebrarse. Variaciones de la liofilización en hongos. En cuanto a los hongos, el inóculo inicial durante la preliofilización se prepara llenando con 10ml de agua destilada estéril, un cultivo sólido altamente esporulado del hongo. Luego con un asa o espátula estéril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar. Esta suspensión es extraída con una pipeta estéril y depositada en un tubo de ensayo, al cual se le agrega 100µl de solución Tween 80 al 0,1% estéril para preparar la solución de esporas. Se agita con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 20s, y se prosigue de acuerdo a la ejecución de la liofilización desde de un medio líquido. -Si el raspado contiene rastros grandes de agar, se debe realizar un filtrado con gasa estéril, aunque esto disminuirá el número de esporas. -Las esporas en solución pierden viabilidad conforme avanza el tiempo. Se sugiere hacer uso de la solución antes de dos horas de preparada. 18 RÓTULOS Refrigeración. Dado que la refrigeración constituye un método de corto plazo, no se requieren rótulos especiales para este método de conservación. Sin embargo, es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente información, con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha: Fecha de ingreso:__________________________ Medio:___________________________________ Cepa:____________________________________ Código:__________________________________ Figura 6. Rótulo opcional para tubos inclinados. -Es opcional imprimir este rótulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta. Criopreservación. Las Figuras 7 y 8 corresponden a los rótulos de colección usados en las cajas del Freezer y los rótulos para cada cepa criopreservada. Figura 7. Rótulos para las cajas del Freezer. Figura 8. Rótulos para los crioviales. 19 Liofilización. Los rótulos de la Figura 9 contienen la siguiente información: Código de la cepa: Código asignado para cada microorganismo en la base de datos, el Freezer y el banco de liofilizados. Corresponde a la descripción del tipo de colección biológica (colección microbiológica, “CM”), siglas de la colección (Colorantes, “CR”), número de la cepa en la colección (004) y el tipo de vial (Trabajo, “T”). Nivel de riesgo Biológico: Se utilizó una escala de colores para la clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6), con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005). “Esta clasificación por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratorio” (OMS, 2005, pág. 1). El grupo de riesgo biológico solo aparece en las muestras liofilizadas, no en las criopreservadas, ya que éstas tienen rótulos distintos. Ubicación en el banco de liofilizados: Muestra la ubicación exacta de cada vial. Corresponde a la bandeja (BAN A), la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1). Adicional a ello, se menciona el lioprotector utilizado y sus concentración en este vial. Fecha: Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la colección. Figura 9. Rótulos creados para los viales liofilizados. -Los rótulos de las cajas del Freezer, los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo. -Los rótulos deben colocarse antes de su almacenamiento, especialmente los crioviales, ya que una vez congelados, el adhesivo no funciona. 20 Tabla 6. Código de colores propuesto según la clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS. C.C.* en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripción Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y poblacional escaso o nulo. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales. Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Agentes desconocidos. Para su manipulación referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005). Grupo de riesgo 2 Riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo. Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo. Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y poblacional elevado. Grupo de riesgo desconocido Nota: *Código de Color. Fuente: Adaptado de OMS. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio (pág. 1). Ginebra: Ediciones de la OMS. Recuperado de http:// www.who.int/csr/resources/publications /biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf -En la base de datos del Banco Genético se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos, pero el formato y tamaño de letra sea igual para todos los rótulos. -Las etiquetas de liofilización y criopreservación deben imprimirse en papel adhesivo. -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos. 21 Protocolos de seguridad en los procedimientos de conservación y en el laboratorio 22 CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN Todos los medios, reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121°C y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro método de esterilización; las puntas de micropipetas, los viales, crioviales y sus respectivas tapas, deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presión y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min. Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas), pueden ser esterilizados en horno a 160°C por 120min. Sin embargo, se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo, desde la preparación de medios hasta el sellado de viales y crioviales, como se describe a continuación: Medios. Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solución de rehidratación y para las diluciones seriadas), al caldo SMPG, al medio SPC, a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro; dejándolos en incubación en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilización. Son indicadores de contaminación cambios ópticos (turbidez u opacidad) en los medios líquidos y presencia de colonias en medios sólidos. Ambiente. Nevera de almacenamiento de los medios y protectores. El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto), evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas. El periodo de exposición va de 15 a 30 minutos, dejándolos en incubación de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubación de las cepas de trabajo. Se recomienda que con un número superior de cinco colonias en el control, se desinfecte el área de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminación. Cabina de flujo laminar. Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento, pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina, esto es, tiempos de exposición de hasta 3 o 4 horas. Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar. 23 Técnicas de siembra y manipulación de elementos. Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina de flujo laminar, hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo, siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina, sino además un riguroso uso de elementos de protección como guantes y tapabocas. Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70% al inico, durante y al final del trabajo con cada cepa. ELIMINACIÓN DE RESIDUOS Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005), los residuos se pueden clasificar en cinco grupos. La eliminación de residuos en el laboratorio de microbiología no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas, por ello , los desechos se dispondrán de la siguiente forma: Desechos no contaminados (no infecciosos). Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que incluso pueden reutilizarse o reciclarse, como el papel. Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos). Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservación requiere de material corto-punzante, se cuenta con un guardián para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas. Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar, por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plásticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestión Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposición final de este material. Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado. Las cajas de Petri, tubos de ensayo, frascos Schott, crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables, deben ser desactivados mediante autoclave a 121°C y 210Kpa por 20 minutos. Posterior al proceso de autoclavado, se deben someter a un proceso de desinfección con hipoclorito al 15% durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jabón neutro. Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas, en todo caso deberán tener el mismo proceso de desinfección anteriormente mencionado. 24 Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado. Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado, todos los desechos producidos en cajas de Petri, tubos de ensayo, frascos Schott, crioviales y viales inoculados, deben ser desactivados mediante autoclave a 121°C y 210Kpa por 15 minutos, posterior a este proceso se descartará el contenido de las cajas de Petri disponiéndolos en bolsas rojas para residuos peligrosos. Por otra parte los desechos líquidos deberán ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA. Material contaminado destinado a la incineración directa. No es directriz del laboratorio ni del Banco Genético la incineración de ningún tipo de material o residuo peligroso, solo de su disposición y almacenaje, según lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos. 25 BIOSEGURIDAD El laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2, es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos, estos son: “Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado” (OMS, 2005, pág. 1). El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Genético. Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005): Protección personal. El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales contaminantes, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial. Se recomienda el uso de batas blancas, manga larga y bien abotonada, con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar, ensuciar o para prevenir algún accidente. Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas, bufandas o gorras. Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupción. Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como bolígrafos, además de tocarse los ojos y nariz. 26 Procedimientos. Está estrictamente prohibido pipetear con la boca, se deben utilizar pipeteadores mecánicos. Todos los cultivos, stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Áreas de trabajo. Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por día y luego de todo derrame de material contaminante. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos, manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en áreas de trabajo. En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales. Capacitaciones. Los encargados del Banco genético y del laboratorio deberán estar capacitados para que aplique el presente manual de una forma más eficaz y así reducir riesgos en el proceso. Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual, incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado, así como de las maquinas y elementos del laboratorio. 27 REFERENCIAS Arcos, M. L., Ossa, F., & Díaz, T. E. (2004). Criopreservación de aislados nativos de la bacteria ruminal Fibrobacter succinogenes. Revista Corpoica, 5 (1), 60-63. Bastidas, O. (17 de 08 de 2015). Fórmula de la cámara de Neubauer. Recuperado el 2015, de celeromics: http://www.celeromics.com/es/resources/docs/ Articles/Formula-Camara-Neubauer-Concentracion.pdf Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., Palao, M., Serrano, B. & Velázquez, O. (2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. (Segunda ed.). México: Facultad de Química, UNAM. Díaz M., G. A. (2009). Morfología y estructura bacteriana. Recuperado el 2015, de Microbitos Blog: https://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/ morfologia-y-estructura-bacteriana.pdf Instituto de Salud Pública del Gobierno de Chile. (2008). Procedimiento recuento aerobios en placa método bam online 2001. Recuperado el 2015, de Instituto de Salud Pública del Gobierno de Chile: http://www.ispch.cl/ lab_amb/doc/microbiologia_alimentos/PRT-023.pdf Martínez Benítez, H. L., & Mayorga Burgos, L. P. (2013). Implementación de un sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (Tesis de pregrado). Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Bogotá, Colombia. Morales-García, Y.-E., Duque, E., Rodríguez-Andrade, O., de la Torre, J., Martínez-Contreras, R.-D., Pérez-y-Terrón, R., & Muñoz-Rojas, J. (2010). Bacterias Preservadas, una Fuente Importante de Recursos Biotecnológicos. BioTecnología, 14(2), 11-29. OMS. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio (Tercera ed.). Ginebra: Ediciones de la OMS. Pírez, M., & Mota, M. (2006). Morfología y estructura bacteriana. En D. d. UdelaR., temas de bacteriología y virología médica (Segunda ed., págs. 2342). Montevideo, Uruguay: Oficina del Libro FEFMUR. Sánchez L., L. C., & Corrales R., L. C. (2005). Evaluación de la congelación para conservación de especies autóctonas bacterianas. NOV A , 3(4), 21-29. Valencia Z., Hernando A. (2004). Manual de prácticas de microbiología básica (Primera ed.). Colombia: Editorial Universidad Nacional. 28 Anexos y formatos 29 30 31 BANCO DE LIOFILIZADOS 32 CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS 33 FORMATO PARA CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS CEPAS. En conjunto, las publicaciones de Valencia Z. (2004), Pírez & Mota (2006) y Díaz (2009), ofrecen un amplia gama de características macroscópicas para bacterias y hongos. Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma. Es importante siempre señalar las condiciones en que se hace la descripción, pues las características pueden variar en función de la edad del cultivo, la humedad del medio, la temperatura de crecimiento, el pH… a. Código asignado para la cepa en la colección y la base de datos. *Borde, superficie y forma son características diferentes, aunque algunos autores las combinen. **Esta tabla no debe sobrepasar el tamaño de una hoja tamaño carta. ***Solo se debe poner fotografías de las características mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad, de lo contrario es mejor prescindir de ellas. Aun así, pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Genético (funcionan como referencia). 34 FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN. 35 FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIÓN LIOFILIZACIÓN. 36 37 38 39 FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIÓN CRIOPRESERVACIÓN. 40 41 42 43 44 45
