Planelles-Tomas-Francisco

Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
UNIVERSIDAD
DEALICANTE
INESCCfP
DEPARTAMENTODE QUÍMICA ANALÍTICA
I N S T I T U T OT E C N O L Ó G I C O
DEL CALZADO Y CONEXAS
DETERMINAqÓN
DE BENCIDINA
Y OTRASAMINAS
ARoMÁncas
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500117214
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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DETERMINAqÓNDE BENCIDINA
Y OTRASAMINAS
AROMÁNCNSDE INTERÉS
TOXICOLÓGICO
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PLANELLES
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1998
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Emilio Verdú Sánchez,responsabledel Departamentode Análisis Químico de
INESCOP,JoseMaríaSantiagoPérez,ProfesorTitulardel Departamento
de Química
Analíticade la Universidadde Alicante,y Nuria Crané Teruel,Profesora
Titular del
de QuímicaAnalíticade la Universidad
Departamento
de Alicante.
CERTIFICAN:
Tomásha realizadoen INESCOPy en la Universidad
de
Que FranciscoPlanelles
y
Alicante,el trabajotitulado"Determinaciónde Bencidina OtrasAminasAromáticas
de InterésToxicológicoen CuerosTeñidoscon Azocolorantes"paraaspiraral grado
de Doctoren Ciencias
Químicas.
Alicante,15 de Mayo de 1998
Responsable
del Departamento
de
AnálisisQuímico.INESCOP
Fdo. loseMaría SantiagoPérez
Fdo.
Profesor
TitulardeQuímica
Analítica
Profesora
Titularde QuímicaAnalítica
Univerdidad
deAlicante
Univerdidad
de Alicante
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Agradecimientos
a los Dres.JoseMaríaSantiagoPérez,
Deseoexpresarmi mássinceroagradecimiento
Nuria CranéTeruely, en especial,a EmilioVerdúSánchez,por su acertadadireccióny
valiososconsejosque de elloshe recibido,sin los cualesno hubierasido posiblela
realizaciónde estaTesis.
y a su directorA. CésarOrgilésBarceló,por ponera mi disposiciónel
A INESCOP,
parala elaboraciónde estetrabajo,así como al
materialy la infraestructura
necesarias
Departamentode Química Analíticade la Univeridadde Alicante por su entera
disposición
en todo momento.
y Cienciapor la concesión
de una Becade Formaciónde
Al Ministeriode Educación
Personal Investigadorpara realizar la Tesis Doctoral en Empresasy Centros de
Investigación,
sin la cualno hubierasidoposiblela realización
de la misma.Asimismo,
agredeceral IMPIVA fa ayuda recibida a través de su programa"Desarrollode
y Empresas".
Colaboraciónentre Centrosde lnvestigación
y del Departamento
de QuímicaAnalíticade la
A todos mis compañerosde INESCOP
por
y
que
Universidadde Alicante, todo el apoyo colaboración de elloshe recibido.
Al Departamentode AnálisisQuímico de INESCOPy a todos mis compañerosde
trabajo con los que he convivido a lo largo de estos años, especialmentea Dori
Campelloa quien agradezcola inestimable
colaboraciónprestada
duranteel desarrollo
del trabajo.Agredecertambiéna PedroPérezla ayuda prestadaen la preparaciónde
lasfotocopias.
A mis padresy a mi hermanaque,como siempre,han estadoahí apoyándomedurante
todo estetiempo,y por último,a Marian,por la ayuday grancomprensiónque me ha
demostrado
en todo momento.
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padres,
A mis
^.,X"[ff,i:
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Indice
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
III
Página
t.
Resumen
1
ll.
Introducción
7
11.1.
La Piely su Procesamiento
hastaCuero
9
1 1 . 1 .C
1 .o n c e p t do e P i e l
9
11.1.2.
EstudioHistológico
de la Piel
10
l l .1 . 3 .C o m p o s i c i óQnu í m i c a
11
11.1"4.
Proceso
de Curtición
't2
11.2.
LosColorantes
en la lndustriadel Cuero
17
11.2.1.
Clasificación
de los Colorantes
17
11.2.2.
Síntesis
de losColorantes
Azoicos
1B
11.2.3.
Procesode Tincíónde la Piel
21
y Legislación
11.3.
Toxicologíade losAzocolorantes
23
11.3.1.
Toxicología
de losAzocolorantes
23
' ll.3.2. Legislación Re[ativaa Azocolorantes
28
11.4"
Análisisde Azocolorantes
en Basea lasArilaminasLiberadas
11.4.1.
Libres
Análisisde Arilaminas
32
33
11.4.2.Determinación
de Arilaminasen Colorantes
o Materiales
Teñidos
Ill.
Objetivos
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35
49
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
IV
lV.
Materialesy TécnicasExperimentales
53
|V.1.Materiales
55
lV.1. 1. AminasAromáticas
55
lV.1.2. Colorantes
Azoicos
55
lV.1.3.Reactivos
y Disolventes
56
lV.2.TécnicasExperimentales
56
!V.2.1. Cromatografía
de Casescon Detectorde Espectrometría
de
Masas(CC/MS)
56
lV.2.2"Cromatografía
Líquidade Alta Resolución
con Detectorde
FotodiodosUV-Visible(HPLC/DAD)
v.
5B
lV.2.3.Electroforesis
Capilarcon DetecciónUV-Visible(CEIUV)
59
lV.2"4.Cromatografía
de CapaFina(TLC)
60
(TC)
|V.2.5.Termogravimetría
60
Condicionesde AnálisisCromatográfico
63
V. 1. Introducción
65
y Discusión
V. 2. Resultados
65
V.2.1. Cromatografía
de Cases/Detector
de Espectrometría
de
Masas
65
V.2.1.1ldentificación
de lasAminasAromáticas
66
V.2.1.2.Límitede Deteccióny Factores
de Respuesta
73
V.2.1.3.Estudiode Interferencias
Debidasa lsómeros
75
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V.2.2. Cromatografía
Líquidade Alta Resolución/Detector
de
FotodiodosUV-V|sible
V.2.2.1.Ensayos
Preliminares
BO
V .2.2.2.Establ
ecimientode lasCondicionesCromatográficas
B1
pón
V .2.2.2.a.MezclasMetanol/Tam
B1
V .2.2.2.b.MezclasAcetonitrilo/Tampón
B3
Y .2.2.2.c.MezcIas Tampón/Metano l/AcetonitriIo
B5
V.2.2.3.Condiciones
de Cradiente
BB
V.2.2.4.EstudioEspectroscópico
de lasAminasCoincidentes
93
V .2.2.5.AnálisisCuantitativo
95
V.3. Conclusiones
Vl.
79
101
Preparación de la Muestra y Extracción Líquido-Líquidode las
Arilaminas
105
V1.1.lntroducción
107
V|.2. Resultados
v Discusión
107
Vl.2.1.Preparación
de la Muestra
107
V1.2.2.Extracción
Líquido-Líquido
de lasArilaminas
110
V1.3.Conclusiones
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115
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
VI
Vll. Análisisde Azocolorante
117
V l l . 1 .l n t r o d u c c i ó n
119
Vll.2. Reactivos
v Métodos
119
V|1.2.1.
Reactivos
119
y Extracción
VU.2.2.Procedimiento
Básicode Reducción
122
Vll.3. Resultados
v Discusión
123
Vl1.3.1.Estudio
de la Relación
AgenteReductor/Colorante
123
V|1.3.2.Influencia
del pH del Medioen el Proceso
de Reducción
129
V|1.3.3.
Variacióndel Tiempode Reducción
'135
V|1.3.4.Variaciónde la Temperatura
de Reducción
138
Vll.3.5.Variación
de la Cantidadde AgenteReductor,pH Inicialdel
Medioy Tiempode Reducción
a AltaTemperatura
140
V11.3.6.
EstudioComparativo
entreAcid Red114y Acid Red128
142
V11.3.7.
Estudiode Recuperación
de lasArilaminas
145
Vll.4.Conclusiones
Vlll. Estudiode las ReaccionesSecundariasen el Procesode Reducción
149
153
V l l l . 1 .l n t r o d u c c i ó n
155
y Discusión
Vlll.2.Resultados
156
Vlll.2.1.Estudio
de losProductos
de Reducción
de Azocolorante
156
Vlll.2.2. Detecciónde 4-Aminobifenilo
en Colorantes
BaseAnilina
'163
Vlll.2.3.Detecciónde 2-Naftilamina
17O
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vil
lX.
V l l l . 3 .C o n c l u s i o n e s
172
Análisis de PielesTeñidas
175
lX.1.lntroducción
177
|X.2.Materíales
v Métodos
178
1X.2.1.Reactivos
178
',X.2.2.PielesTeñidas
180
1X.3.Resultados
v Discusión
X.
183
1X.3.1
. Ensavos
Preliminares
183
1X.3.2.
Establecimiento
del Métodode Análisis
187
1X.3.3.
Estudiode Recuperación
de lasArilaminas
192
1X.3.4.
Análisisde PielesPatrón
195
1X.4.Conclusiones
198
Estudio Comparativo con la Norma D¡N 53316
201
X.1. Introducción
203
X.2. Materiales
v Métodos
204
X.2.1"Reactivos
204
X.2.2.PielesTeñidas
204
X.2.3"MétodosparaAnálisisde Pieles
205
X.3. Resultados
v Discusión
X.3.1.Estudiode Recuperación
de lasArilaminas
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206
206
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
VIII
Xl.
X.3.2.Estud
io Comparativo
sobrePielesPatrón
2 ' t1
X.3.3.Estudio
Comparativo
sobrePielesAcabadas.
215
X.4.Conclusiones
221
ConclusionesCenerales
223
Xll. Bibliografía
229
Xlll. Listadode Tablasy Figuras
241
X l l l .1L. i sta ddoeT a b l a s
243
Xlll.2.Listado
de Figuras
248
XlV. Listadode Azocolorantesy Arilaminas
257
XlV"1.Listado
de Azocolorantes
259
XlV.2.Listado
deArilaminas
263
XV. Abreviaturasy Nomenclatura
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277
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l. Resumen
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Resumen
El 15 de julio de 1994,el gobiernoalemánpromulgóuna modificación
del Decretode
(BCV),
por
que
prohibía
la
se
la
fabricación,
Objetosde Consumo
impoftacióny venta
que pudieranliberaralgunade la
de productosde consumoteñidoscon azocolorantes
veintearilaminas
indicadas
en la Tabla1.1,trasreducciónde uno o variosgruposazo
presentes
Losobjetosde consumosobrelos que recaela ley sontodos
en su estructura.
aquellosque puedan estaren contactodirecto con la piel humana/entre ellos los
productosde cuero.
Tablal.l.
Listade las veinte arilaminasprohibidaspor el segundodecreto modificador del
Decreto de Objetos de Consumoalemán @CV).
Compuesto
Nombre Común
4-Aminobifenilo
No o{s
92-67-1
4,4'-Diaminobifenilo
Bencidina
92-87-5
4-Cloro-2-metilanili
na
4-Cloro-o-toluidina
9s-69-2
2-Naftilamina
GAmi no.2r3di metilazobenceno
91-59-8
o-Aminoazotoluerto
2-Amino-4-nitrotolueno
97-56-3
99-55-8
't0647-8
4-Cloroanilina
4-Metoxi-1,3-fenilendiamina
4,4' -Diaminodifenilmetano
2r4-Diaminoanisol
313'-Dicloro-4r4'diaminobifenilo
3,3LDiclorobencidina
91-94-1
3r3'-Dimetoxibencidina
o-Dianisidina
119-904
o-Tolidina
119-93-7
3,3'-Dimetil-4,4Ldiaminobifeni
lo
101-77-9
3,3tDimetil-4,4'diaminodifenilmetano
2-Metoxi-S-metilanilina
838-88-0
p-Cresidina
4,4'-Metilenbis(2-cloroanilina)
4-Aminofeniléter
615-05-4
120-71-8
101-144
4r4'-Oxidianilina
4,4'-Tiodianilina
101-BO-4
139-65-1
2-Aminotolueno
e'Toluidina
95-53-4
4-Metil-1,3-feni
lendiamina
2,4-Diaminotolueno
95-80-7
5-Trimetilanilina
137-17-7
Estehechocondujoa la necesidad
una metodología
de establecer
de análisiscapazde
determ¡narlas menorescantidadesposiblesde dichas arilaminasen este tipo de
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muestras,
objetivoprincipalal que se pretendellegaren estamemoria.
El trabajose ha planteadoen baseal esquemade la Figura1.1,en donde se muestran
las distintasetapas en que puede estructurarse
el procedimientode análisis a
desarrollar.
EtapaI
REDUCCION
DELCOLORANTE
L T B ROE F U A D OA L C U E R O
Etapall
EXTRACCION
L|QUtDO-L|QUtDO
DE LAS
ARILAMINAS
LIBRES
Etapalll
CONCENTRACION
DE LA MUESTRA
Y PREPARACION
PARASU ANALISIS
EtapalV
ANALISIS
CROMATOCRAFICO
Figura I.l.
Etapasseguidasen la determinaciónde aminas aromáticasen azocolorantes
muestrasteñidascon éstos.
que se presentaen estamemoriase ha llevadoa cabo siguiendolos
La investigación
pasossiguientes:
Establecimientode las condicionescromatográficasen Cromatografíade Líquidosde
Alta Resolución con detector de fotodiodos UV-Visible (HPIC/DAD) y en
Cromatografíade Gasescon detector de Espectrometría
de Masas(GC/MS).Se han
puesto a punto las condicionescromatográficas
para la separaciónde las veinte
prohibidas,
arilaminas
tantoen HPLC/DADcomo en GC/MS,encontrándose
la primera
de lastécnicascomo la másidóneaparael análisiscuantitativo
de lasmismas.
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Resumen
Establecimiento
de las condicionesde preparaciónde la muestray de extracción
líquido-líquidode las arilaminas.Se han establecido
la condicionesde trabajoidóneas
parala concentración
y preparación
previa
de la muestra
al análisiscromatográfico,
así
para
la
de
aminas
disueltas
como
extracc¡ónlíquidoJíquido las
en medio acuoso,de
posible.
formaque se obtengala máximarecuperación
Optimizaciónde las condicionesde reducciónde azocoloranfe.Haciendouso del
ditionito sódico como agentereductor,se han estudiadolas condicionesde trabajo
idóneasparala determinación
de arilaminasen azocolorante,
encontrándose
una gran
de aminaobteniday la esperadaen base
concordanciaentrela cantidadexperimental
a la purezadel colorante.Estopareceindicarque la reduccióndel grupo azo tiene un
rendimientomuy cercanoal 100%.
Estudio de las posibles reaccionesy/o procesossecundariosocurridos durante el
proceso de reducción. Se han estudiadolas posibles reaccionesylo procesos
derivadosdel procedimiento
establecido
secundarios
en el apartadoanterior,haciendo
hincapiésobreaquellosque pudieraninfluirde maneranotoriaen el resultado
finaldel
análisis.Así, se estudianla detecciónde 4-aminobifeniloen colorantessintetizadosa
partir de anilína,y de 2-naftilaminaen colorantesderivadosdel ácido 2-amino-1naftalenosulfónico,
encontrándose
como posiblescausasde su aparición,ademásdel
procesode reducción,la síntesis
de los coloranteso la presenciade impurezasen las
materiasprímasempleadas.
Establecimientodel método analíticopara la determinaciónde aminasaromáticasen
pieles teñidas. Se ha establecidoel método de análisispara la determinaciónde
arilaminas en cuero teñido, observándosecomo factor más determinante la
accesibilidaddel ditionito sódico al colorantefijado a la piel. Las condicionesde
trabajo empleadasaseguranuna recuperaciónde la amina presenteen la muestra
similaro superioral B0%.
Estudio comparativo entre la metodología estableciday la norma alemana DIN
53316.Se ha llevadoa cabo un estudiocomparat¡vo
entreel métodoestablecidoen el
apartadoanteriory el especificado
en la normaalemanaDIN 533'16,proponiendoun
tercero alternativoen el que se intenta reunir las ventajasofrecidaspor ambos
procedimientos"
En general,los resultados
obtenidossegúnel métodoestablecidoen
de aplicarla normaDlN.
estamemoria,sonsimilares
a losresultantes
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ll. Introducción
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lntroducción
11.1"La Piel y su Procesam¡entohastaCuero
11.1.1.
Conceptode Piel
La piel es la estructura
externaque envuelveel cuerpode los animales.Setratade una
generalmente
sustanciaheterogénea,
cubiertacon peloso lana,y formadapor varias
capassuperpuestas.
En la industriade curtidosse utilizanprincipalmente
laspielesvacunas,lasde cordero
y lasde cabra;en una proporciónmucho menor,laspielesde caballoy lasde cerdo,y
aún en menorescantidadeslas pielesde reptil y pescado[1]. La piel recuperadapor
desuellode los animalessacrificados
se llamapiel fresca,piel en verdeo piel en tripa.
En una piel se distinguenel lado externo,que una vez eliminadala epidermisy sus
pilosasrecibeel nombrede "ladoflor",y el ladointerno,que se encuentra
formaciones
juntoa la carnedel animaly sedenomina"ladocarne".
a
M e m b r a n aH i a l i n a
o
g
f
3
c
g
()
o
f
ñ
f
c
s
()
FiguraII.l . Corte transversalde una piel vacunafresca.
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10
capítulott
11.1.2.
EstudioHistológicode la Piel
La estructura
de la piel es fundamentalmente
similarparalos mamíferos
talescomo los
bovinos,ovinosy equinos.De acuerdocon éstoy parasu estudio,se tomarácomo
estructura
tipo la correspodiente
a una piel vacunafresca[2], teniendoen cuentaque
despuésde la conservaciónsu estructuravaría.
Como modeloparael estudioestructural
de la piel, en la Figurall.1 se respresenta
un
corte transversal
correspondiente
a una piel vacunafresca.Desdeel exterior hacia
dentrose distinguenlascapassiguientes:
a
a
a
Epidermis
Dermiso Corium
Tejidosubcutáneo.
En fa Fígurall.2 se representa
la seccióntransversal
de la piel de un animal adulto,
donde se puedenapreciarlos grosoresaproximados
de las capasconstituyentes
de la
misma.
I
(1%)
Epidermis
CapaPapilar
PIEt
Dermis(84"/")
CapaReticular
I re¡iao
I
(15%)
Subcutáneo
Figura 11.2. Esquemade la sección transversalde la piel de un animal adulto.
Se puede observarque la dermis forma la mayor parte de la piel y su espesor
representaaproximadamenteel 84% del espesortotal de la piel fresca.Es la parte
parala fabricacióndel cuero.Enella se distinguendoscapas:
aprovechable
¡
La capa flor o papilar: se extiende desde la membrana hialina hasta
aproximadamente
la basede los folículospilosos.Estáformadopor un entretejido
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
lntroducción
11
muy compactode fibrasespecialmente
finas.Químicamente
estáformadopor fibras
de colágenoy por un gran númerode fibraselásticas
que sirvenpara reforzarsu
estructura.
o La capa reticular: se extiendeaproximadamente
desde la base de los folículos
pilososhastael comienzode tejido conjuntivosubcutáneo.
Se designacomo capa
reticularpor estarformadapor un retículoo entrecruzamiento
irregularde fibras
gruesasy fuertesa modo de fieltro.Químicamentesu principalcomponentees la
proteínacolágeno.
Lasotrasfibrasque,junto con lasdel colágeno,formanpartede la dermisson lasfibras
elásticasy las de reticulina.En la composicíónde la dermis,ademásde fibras,se
encuentrantambién otros componentescomo: vasossanguíneos,nervios, células
adiposasy tejido muscular.
| 1.1.3.ComposiciónQuímica
La piel frescaestácompuestafundamentalmente
por agua,proteínas,materiasgrasasy
algunassalesminerales.
Aunquela composiciónquímicavaríade una pielesa otras,a
continuaciónse expone la composiciónporcentualaproximadade una piel vacuna
reciéndesollada[3]:
o Componentesproteicos
Proteínasfibrosas
Colágeno(29'1.)
Queratina(2%l
(0.3%)
Elastina
globulares
Proteínas
Mucinasy Mucoides(O.7"/o)
Albúminasy Clobulinas(1%)
o Componentesno proteicos
Agua (64o1.)
Lípidos(2'/.)
Salesminerales(0.5%)
Otrassustancias(0.5%)
De entre los compuestosmencionados,
son las proteínaslas que jueganel papel ma5
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
importante
en la curticiónde la piel,y de ellas,es el colágeno
quiénestádirectamente
involucradoen la formaciónde la estructura
de la piel curtida.
La moléculade colágeno,o protofibrilla,estáformadapor trescadenaspolipéptidas
llamadasa-hélices,las cualescontienenalrededorde mil aminoácidospor cadena.
Estastres cadenasse enrollanestresí a travésde enlacestipo éstery de puentesde
hidrógeno,formandola triple hélicecaracterística
de la estructura
del colágeno.En su
composiciónquímicaes destacable
el contenidode glicina,aproximadamente
un
tercio del total de aminoácidos,
así como de hidroxiprolinay de prolina.La cantidad
de hidroxiprolinapresenteen esta proteína,es una característica
propia que la
diferenciade lasdemás.
11.1.4.
Procesode Curtición
La curticiónes el procesopor el cual la piel en tripa se transforma
en un productoque
aprovechasu estructurafibrosa:el cuero. En dicho proceso,intervieneun agente
curtientecapazde reticularcadenasproteicasvecinas[4].
Preliminares
Trabajos
Desollado
- I
1 cur"dooconservación
Trabaiosde Ribera
/,----_--------_-
CurticiónalCromo
Remojo
Recurtición
Depiladoo Encalado
IPROCESo.DE
I
IU CURTTCTON
I
Tintura
Engrase
Descarnado
Desencalado
Rendido
Secado
Acabado
Piquelado
Desengrasado
Figura11.3"Esquema
de fabricacióndel cuero.
En la Figurall.3 se muestrael esquemacorrespondiente
a lasdistintasfasescomponen
la fabricaciónde piel curtida,desdela obtenciónde piel frescahastael cuerolisto para
su usoindustrial.
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lntroducción
t3
Desollado
La piel se obtienecomo un desechoen los mataderos,
ya que es la carnela que marca
la nesesidadde mataral animal.Así pues,la ofertade piel en tripa estásiempreen
funciónde lasnecesidades
de carnedel mercado.
Curado o conservación
Básicamente,
se pretendedeshidratarla piel para que el medio no sea propicio al
desarrollobacterianoy evitarasí su descomposición.
Los principalestipos de curado
son el secadoy el salado.Otrasformasde conservación
de pielesson el curadomixto
(secado mas salado), la congelación,la piel piquelada, la deshidratacióncon
disolventes,
la liofilizacióno la aplicaciónde rayosgamma[5].
Remojo
Consisteen el tratamientode las pielescon abundanteaguapara limpiarlas,eliminar
salesy otrasmateriassolubles,rehidratarlas
y suavizarlas.
Con estarehidratación,la
piel empiezaa perderalgunade susproteínas
solubles(globulares)
y la albúminade la
sangre.
Depiladoy Encalado
Estasdos operacionesse hallan estrechamente
relacionadascon la química de la
queratina,proteínaque entraa formarpartedel pelo, lanay epidermisen proporciones
elevadas.
Con estaoperaciónse pretendehidrolizarlay solubilizarla,
y así separarla
del
restode componentesde la piel. Se sueleemplearun agentealcalíno,el Ca(OH)2,
junto con ojro reductor,el Na2S,los cualesprovocanla roturay solubilizaciónde la
queratinasin dañar el colágeno,hecho éste que sólo se produce bajo la acción
prolongadade ácidos y basesfuertes.La elastinatampoco se solubiliza en esta
operación,mientasque las proteínasglobularesson eliminadasduranteel proceso.
También se produce la saponificación
de algunasgrasasde cadenacorta como las
y
cefalinas laslecitinas.
Descarnado
Es una operaciónde cortadomecánicoque tiene por objeto eliminarrestosde tejido
subcutáneoy adiposodel lado carne,asícomo homogeneizar
el grosorde la piel. Se
facilitaasíla entradade compuestos
que seadicionanen lasetapasposteriores.
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Desencalado
Enestemomentola piel en tripatieneun aspectoblanco-azulado,
hinchado,gomosoy
semitraslúcido.Durante el desencaladose produce la solubilizacíónde Ca(OH)z
absorbidopor la piel. Se utilizansalesácidas,como el (NH¿)zSOc
y el NHaCl,que
disminuyenel valor del pH a un puntotal que los enzimasempleados
en la etapa
posteriorde rendido,encuentran
unascondiciones
óptimasde trabajo.
Rendido
Se puede entendercomo otro paso más en la purificaciónde la piel, antes del
tratamientocon los agentescurtientes.Se emplean enzimas proteolíticasque
originalmentese obteníande excrementos
de perro y aves,o del aparatodigestivo,
especialmente
del pancreas.
Hoy en dia, estosproductossonfabricadospor mediode
cultivos adecuados.La acción de estos enzimas catalizan las reaccionesde
degradacióndel restode proteínaspresentes
en la piel (fundamentalmente
elastina)y
otroscomponentes
aún no eliminadoscomofolículos,vasos,epidermisy pelo.
En ocasiones, el desencaladoy rendido son operacionesque se realizan
simultáneamente
en la fabricaciónde la piel curtida.
Piquelado
La piel es tratadaen un bañode ácidoy sal,llevándolaa un pH idealparacomenzarel
procesode curtición(aproximadamente
2). Se suelenemplearlos ácidosclorhídrico,
sulfúrico,fórmico,lácticoo acético.La sal utilizadasueleserclorurosódicoo el sulfato
sódico.
Debido a la gran estabilidadque adquierenlas fibrasde colágenoen esteestado,se
aprovechaen algunoscasosparaalmacenar
la piel.A partirde estemomento,se puede
decir que contamoscon un entramadode fibrasde colágenocon los gruposácido y
amino protonados.
Desengrasado
La piel contiene grasasnaturalesdistribuidasirregularmente.
Estasgrasasno son
convenientespara el procesode fabricaciónde los curtidos,ya que impiden la
absorciónregularde los agentes
y dificultansu reaccióncon el colágeno.
curtientes
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lntroducción
El desengrasado
de la piel se efectuabien mecánicamente,
por prensado,o bien
medianteel empleo de disolventesorgánicosa los que suele añadirseagentes
tensioactivos
coadyugantes
en la accióndesengrasante.
Curticiónal cromo
Esel tipo de curticiónmásextendidoentrelascurtidurías.
En estecaso,la conversión
del colágenoen piel curtida es el resultadode la unión de cadenasde proteínas
vecinaspor complejospolinucleares
de cromo lll. Dichaunión podríacorresponder
a
la estructuramostradaen la Figura11.4,
dondese apreciala formaciónde puentesentre
dos gruposOH y un gruposulfato[6].
/
oHl
T'o
"...I
o
cH2-cH2-"-(1...
lrioHjr:.. o)-cuz
o
lo
üro \r/
NH
q-
// \\
Acido Glutámico
oo
Acido Aspártico
Figura l1.4. Esquemadel posible enlacecromo-colágeno.
La curtición al cromo da cueros ligeros pues, a diferenciade otras curticiones,
incorporaa la piel pocacantidadde materiacurtiente,entre3 y 6% de óxido de cromo
sobrecueroacabado.Laspielescurtidasal cromo sonde granresistencia
hidrotérmica,
siendoademásfácilesde teñir y acabar,dandocoloressólidosa la luz. La curticiónal
para cuerosde empeinede calzado,confeccióny
cromo se utiliza preferentemente
otrosfinesi ndustriales.
Recurtición
La recurticiónconsisteen dotar a las pielesde propiedadesespecíficas
que no se
obtienenfacilmenteen un sólo procesode curtición.Mientrasque la curticiónafectaa
químicasdel cuero,la recurticiónmodificalaspropiedades
laspropiedades
físicastales
como suavidad,finurade grano,firmezade grano,retenciónde la forma,solideza la
luz, facilidad de tinción, etc. Como recurtientesmás comunes,se suelen emplear
taninos sintéticos o vegetales,como por ejemplo la sal sódica del ácido
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naftalenosulfónico,
algunasresinasy el formaldehido.
En la práctica,la recurticiónno puede llevarsea cabo con un simple producto,sino
que se usancombinaciones
de agentescuftientesy agentesauxiliaresde la curtición,
paraproducirlaspropiedades
esenciales
de unadeterminada
clasede piel.
Tintura
La tintura es el procesoconsistente
en aplicarcolorantesal materialcurtido. En el
apartado11.2.3
setrataespecíficamente
estaetapa.
Engrase
Una operaciónimportanteen cuantoa laspropiedades
mecánicas
de la piel curtidase
refiereal engrase[7]. Con el engrasadose le proporcionaa las fibrasde la piel esa
lubricación apropiada que le confiere ciertas propiedadesfísicas como son la
resistenciaal desgarro,a la torsión,comfort,elasticidad,etc. Dentro del grupo de
licoresde engraseempleadosparaestefin, cabe resaltarlos sulfitos,bisulfitosy grasas
naturales.
Secado
Duranteesteproceso,se eliminala humedadque presentala piel unavez superadala
estapade engrase.Despuésdel secado,la piel aún presentaun contenidode agua
alrededordel 15%. El gradode humedadde un cuerodependede la temperatura
y la
humedadrelativadel aireambiente.
Acabado
El acabadoconsisteen una seriede tratamientos
paraobtenerlos siguientes
diseñados
objetivos[B]:
o Protegerla superficiedel cuerocontraefectosquímicosy mecánicos.
a
Uniformarel color y el brillo sobretoda la superficie.
a
lmpartirpropiedadesespeciales,
tantovisualescomo de tacto,a la superficiede la
piel.
Mejorarla utilidadde la piel.
Los agentesde acabadose puedenclasificaren cínco grandesgrupos:pigmentos,
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lntroducc¡ón
17
coloranteslíquidos,ligantes,auxiliaresy lacas.Ceneralmente,las necesidades
del
acabadono son cubiertasni por un sólo agentede acabadoni en una solaaplicación.
Por lo tanto,es necesariala mezclade variosagentesy su aplicaciónen variascapas
que seancompatibles
diferentes
entresíy con la mismapiel.
11.2.LosColorantesen la Industriadel Cuero
11.2.1.
Clasificación
de losColorantes
En la Figura11.5,
se muestrala clasificación
generalde loscolorantes
[9].
Azoicos
Derivados
y Trifemilmetano
de Difenilmetano
Nitradosy Nitrosados
Derivados
de Quinolinay Acridina
COLORANTES
Oxacinas,
Tiacinasy Acinas
AlAzufre
Derivados
de Antraquinona
Indigoides
Figura11.5. Clasificacióngeneralde loscolorantes.
La mayorpá,t" du loscolorantes
empleados
en la industriade los curtidospertenecena
los gruposde colorantesazoicosy del trifenilmetano,
y en menor proporcióna los
gruposde nitrados,nitrosados,
acridina,quinonimina,azufrey antraceno,no siendo
aplicablesparala tinturadel cueroloscolorantesindigoídes.
Los colorantesazoicos,o azocolorantes,
constituyenel grupo más amplio de los
colorantessintéticosy contienenen su estructuraal menosdos átomosde nitrógeno
unidospor un doble enlace,el grupoazo -N:N-, el cual se encuentra
generalmente
entredos sistemas
de anillosaromáticos.
Craciasa lasmúltiplesposibilidades
de unión
entre el grupo azo y las diversasclasesde compuestosorgánicos,el número de
colorantesazoicoses realmentegrande.
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18
cu7ítulo II
Enla Figura11.6,
generalde loscolorantes
se muestrala clasificación
azoicos[10].
Acidos
Básicos
COLORANTES
AZOICOS
Directos
Metalocomplejos
Dispersos
Azopigmentos
Figura11.6. Clasificacióngeneralde los colorantes
azoicos.
11.2.2.
Síntesisde los ColorantesAzoicos
En la síntesis
de los colorantesazoicos,intervienen
principalesque son
dos reacciones
la diazotaciónde una aminaaromáticay su posteriorazoacoplamiento
con un agente
acoplante
[10].
Diazotación
La diazotaciónimplicael tratamientode una arilaminaprimariacon ácidonitrosopara
formarla salde diazoniocorrespondiente,
como se muestraen la reacción(1).
ArNH2 + 2 HCI + NaNO2 --------------ArN2*X- + NaCl + 2H2O
(1)
Puestoque el mecanismode diazotacíónsuponbel ataquede un agentenitrosantea la
aminalibre,no a la salde amonio,se ha de escogerla acidezdel medioque favorezca
la formacióndel agentenitrosante
y a la vez no provoquela ionizaciónde la amina.El
medio de reaccióndebe proporcionartambiénestabilidada la sal de diazonio por
efectosde solvatación.
Mientrasque las salesde alquildiazonioson sumamenteinestables
y se descomponen
con facilidaddesprendiendo
nitrógeno,lasde arildiazonioson establesen disolución
acuosaa temperatura
de bañode hielo.
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lntroducción
19
Azoacoplamiento
La reacciónde acoplamientoentre la sal de arildiazonioy un agenteacoplantees el
paso más importantedentro de la ruta sintéticade los colorantesazoicos.Como se
observaen la reacción(2),el arildiazoniocondensacon otro compuesto,normalmente
aromático,dando lugara la formaciónde un grupoazo.
A r N 2 ' C l - +H A r ' + N a O H - - - - *
Ar-N:N-Ar'+ H2O+ NaCl
(21
El azoacoplamiento
se trata de una reacciónde sustituciónelectrofílicaaromática,
como lo son la halogenación,
la nitracióno la sulfonaciónaromáticas.
En estecaso,el
presentes
electrófiloes el catióndiazonio.El efectoque tienen los sustituyentes
tanto
en el arildiazoniocomo en el agenteacoplantesobrela velocidadde acoplamiento,
estáde acuerdocon estemecanisno.
Así, la reacciónes facilitadapor gruposelectrónatrayentesen el diazocompuesto,y por grupos electrón-donantes
en el agente
acoplante.
básico fuefe
/
\
\
bás¡co
l-Naftol
2-Naftol
básico
fuefte
/
Acido 1-amino.2hidroxi-2,4-dísulfón
ico
(Acido Chicago)
Acido 2-amino-1hidroxi naftaIeno-3,6disulfónico
(Acido H)
Acido 2-naftol-3,6disulfónico
(SalR)
básico
\,o'
Hgc--(. I
\-N'a6
v
3-Metil-lJenil-5pirazolona
(PirazolonaT)
d-*@
1-Nattilamina
N,N-Dimetilanilina
Figura /1.7. Agentesacoplantesmás comunesen Ia síntesisde azocolorantes.
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20
Capítulo Il
Puestoque la salde diazonioes un electrófilo
bastante
débil,ha de acoplarcon anillos
aromáticosmuy activados,es decir, con gran densidadelectrónica.Como agentes
acoplantes
se suelenemplearfenoleso aminasaromáticas.
En fa Figura11.7,
se muestraun conjuntode los agentesacoplantes
empleadoscon más
frecuenciaen la fabricaciónde colorantes
posiciones
azoicos,marcandolas
favorecidas
a cadapH.
Lasreglasde orientaciónque sigueel azoacoplamiento
son las mismasque cualquier
reacciónde sustuciónelectrofílicaaromática.En consecuencia,el ataquese favorece
en la posiciónpara del agenteacoplante.Cuandodicha posiciónse encuentraya
ocupada,el ataquese produceen la orto. Cuandoambasposicionesestánlibres,es
posiblela obtencióndel diazocompuesto.
No obstante,el acoplamientoen posición
lugar
orto tiene
siemprecon mayordificultad.Porejemplo,el bencenodiazonio
acopla
con el 1-naftol casi exclusivamenteen posición para en condicionesácidas o
débilmentebásicas,mientrasque en medio fuertementebásicose formancantidades
del colorante2,4-diazo[11].
considerables
En cuantoal efectodel pH, la reacciónde azoacoplamiento
se favorecea pH básicos
puestoque en ellosaumentala activacióndel agenteacoplantefacilitandoel ataqueal
electrófilo,en estecaso el arildiazonio.Sin embargo,una gran basicidaddel medio
puede provocar la formación del arildiazotatoen el equilibrio ácido-basedel
arildiazonio,
como se muestra
en el equilibrio(3)
Ar-N:N.
=
oH-
fi¡-frj:frl-OH
=--oH---
Ar-N-N-O-
(3)
Tantoel hidroxidiazoniocomo el diazotatono son capacesde acoplar,por lo que la
velocidadde reaccióndisminuye.Portanto,el pH escogidoha de conseguirla mayor
activaciónposibledel compuestoaromáticoa condensar,
procurandoque el equilibrio
anteriorno se desplacehaciala derecha.Ejemplosde acoplamiento
en mediobásicoy
medio ácido son las síntesisde los colorantesAcid Orange 7 y BasicOrange 2,
(FiguraIl.B).
respectivamente
Por otro lado, un aumento de la temperaturasuele desfavorecerla reacción de
azocoplamiento,
ya que la velocidadcon que se descompone
el arildiazoniotambién
aumenta.
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Introducción
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BasicOrange 2
Figura 1/.8. Síntesisde los colorantesAcid Orange7 y BasicOrange2.
11.2.3.
Procesode Tinciónde la Piel
Aunquelos mecanismos
de coloraciónde materiales
textiles,talescomo celulosa,lana,
seda,poliamida,acrílicoo poliéster,han sido extensamente
estudiados[12,13], los
ínvolucradosen la coloracióndel cuero no han sido explicadostodavíaen toda su
amplitud.
La mayorpartede colorantesempleadosen la tinturadel cuero son de tipo aniónico,
ofreciendola posibilidadde unionessalinascon la proteínaque constituyela piel
animal.Estetipo de unión,es muy débil y el cueroteñidocon estoscolorantesdestiñe
con facilídad.Paraque un coloranteaniónicotengabuenaafinidadcon el cuero es
convenienteque posea elevado peso moleculary que el número de sus grupos
sulfónicossealo másbajo posible.
En la tintura del cuero entranen juego, segúnsean las características
del colorante
iónico y el tipo de cuero a teñir, variasfuerzasde enlaceque actuán en tres fases
escalonadas
segúnsu radiode acción[14]:
1. En primer lugar,actuanfuerzasde atracciónentre iones de cargacontraria,por
ejemplo,entre los grupossulfónicosde un colorantey los gruposamínicosde la
proteínade la piel, con formaciónde unionessalinas.El radio de acción de estas
fuerzasiónicasesde unos100 Angstroms.
2. Una vez logradala suficienteaproximaciónentre las partesreaccionantes,
o sea,
entreel cueroy el colorante,se iniciauna segundafaseen la que actúanfuerzasde
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22
Capítulo ll
enlacecon un radio de acc¡ónde 5 Angstromsaproximadamente.
Fuerzasde este
tipo son los puentesde hidrógeno,las unionescoordinativasderivadasde los
metalespesados,
y lasfuerzasde atracciónentredipolos.
3. Finalmente,
en una tercerafasedesarrollada
durantelos procesosde deshidratación
y secado,prevalecenfuerzasde muy cortoalcancecomo son lasfuerzasde Van der
Waals,permitiendouna combinaciónadicionalentrecueroy colorante.
Por tanto, la interacciónentre la fibra de cuero y e[ coloranteno es producida
solamentepor la cargade los iones,sino tambiénpor fuerzassecundarias
que son las
que permitenobteneruna buenafijacióndel coloranteal cuero.
La primerafasedel procesode tinciónvienecondicionada
principalmente
por el pH
del sistemade tinturay por la cargaeléctricaen la superficiede las fibrasde cuero.El
colágenode la piel en tripa,por tenercarácteranfótero,puedereaccionar
con cationes
o aniones.El que se combinecon colorantesácidoso básicosdependerádel pH del
sistemade tintura. En el llamado punto isoeléctrico,el colágenotiene la mínima
tendenciaa combinarionescolorantes.
Cuandoel pH del sistemade tinturaes inferior
al punto isoeléctrico,
el colágenose combinacon aniones,y cuandoes superior,con
cationes.Cuantomásalejadose encuentreel pH de tinturadel punto isoeléctrico,
más
rápidamente
se combinaráel colágenocon loscolorantes
iónicos.
Por otro lado, estudiosrecientessobrecoloraciónde polvo de piel modificadacon
agentescurtientesy sin modificar[15,161,han confirmadoque dentrodel procesode
tinción, ademásde las interacciones
ya conocidasentre el colágenode la piel y el
colorante,existenotrasentre los agentescurtientesy las moléculasde colorante.Por
tanto,ef mecanismode la coloraciónno se limitaa la interaccióncolágeno-colorante,
sino que también entra en juego el complejo colágeno-agente
curtiente-colorante,
o
ambossistemas
a la vez.
La presenciade curtientesen el cuero puede influir favorableo desfavorablemente
sobrela capacidaddel cuero parafijar colorantesmediantefuerzassecundarias.
Por
ejemplo, los curtientesvegetales,al bloquearlos grupos peptídicosdel colágeno,
reducenlas posibilidades
de unionesdipolares.Loscomplejosde cromo incorporados
a la piel, ofrecenunas posibilidades
adicionales
de unir colorantespor valencias
coordinativas.
Por otro lado, se han llevadoa cabo estudiostermodinámicos
sobrede la afinidadde
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lntroducción
23
colorantes
y a pielescurtidasal cromof17-191,
ácidosa pielesnaturales
confirmándose
la naturalezaexotérmicay los valoresentrópicosposit¡vosdel procesode tinción, en
amboscasos.Estopareceindicarque la espontane¡dad
de la coloraciónde una piel no
se ve afectadade formaconsiderable
por la curticiónal cromo,lo cual no implicaque
sÍ existandiferencias
a nivel cinético.
11.3.Toxicologíade los Azocolorantesy Legislación
En el oeste de Europa, la industriade los colorantesempezó a investigarlas
propiedades
eco-toxicológicas
de los mismosmuchoantesde que existieranleyesque
regularansu uso. Estudios
al respectovienenllevándose
a cabo desdehacemásde 30
años. Hoy en día, la legislaciónexige a químicosy fabricantes
la evaluaciónde los
riesgospotenciales
de estetipo de sustancias.
11.3.1.
Toxicologíade los Azocolorantes
La necesidadde profundizaren el conocimientode los peligrospotenciales
derivados
de colorantesorgánicos y sus productos de degradación,condujo en 1974 a la
fundaciónde la ETAD (Ecological
and ToxicologicalAssociation
of the Dyestuffsand
Organic PigmentsManufacturinglndustry).Estaorganizaciónse ocupa, coordina y
apoya amplios estudios sobre la toxicidad y ecologíareferentea colorantes.Sus
resultados
periódicosayudana paliarlos posiblesriesgosparala saludhumanay para
el medioambienteque estoscompuestos
provocan.
Losdiferentestestsque puedenrealizarse
paraevaluarel perfil eco-toxicológico
de un
productoqqímicodeterminadoson lossiguientes
[2O,211:
o
r
o
o
¡
o
.
o
Toxicidadcutánea
Toxicidaddespuésde exposiciones
repetidas
Potencialde irritación
Potencial
de sensibilización
Cenotoxicidad(Mutageneidad)
Carcinogeneidad
Toxicidadacuática
Biodegradación
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24
CapítuloIl
A continuación se comentan la mutageneidad,la carcinogeneidad
y la biodegradación,por seréstoslos testsmásdeterminantes
a la horade establecer
el carácter
toxicológicode los colorantes
azoicos.
Mutageneidad
Los peligrosgenotóxicosde los colorantesson analizadosen basea unos testsde
mutageneidad,
entrelos que destacan
el testde Amesy el de Prival[22,23].El primero
de elloses el másutilizado,mientras
que el segundose tratade una modificación
del
anterior.Estosdos ensayosson sólo indicativos,ya que en ocasionesse han dado
resultados
discordantes
trasla aplicaciónde ambostestsobrela mismamuestra.
Carcinogeneidad
El peligrocarcinogénico
de los colorantessólo puedeserevaluadoexperimentalmente
en basea estudiossobreexposiciones
a largoplazoen animales.No existenevidencias
que indiquenactividadcarcinogénica
epidemiológicas
sobreel hombre.En muchos
casos,la carcinogeneidad
del coloranteviene derivadade la presenciade aminasde
conocido poder carcinogénicoen su estructura,las cualespuedenser liberadastras
procesos
de reducción.
Biodegradación
La degradaciónbiológicade colorantesbajo condicionesaeróbicases muy baja. Sin
embargo,bajo condicionesanaeróbicas
su metabolismopuede dar lugar a diversos
productosde degradación.Los mecanismosdegradativosmás importantesde los
azocolorantes,
son la reacciones
de oxidaciónv de reducción.
Los procesos de oxidación metabólica ocurren preferentementeen los colorantes
insolublesen agua y están catalizadospor el sistemamonooxigenasa
microsomal
representado
por el citocromoP-540presenteen el hígado 124,251.
Secaracterizanpor
dejarintactoel grupoazo y puedendiferenciarse
trestiposprincipales
de oxidaciones:
e C-Hidroxilación: se trata de una hidroxilación sobre anillo aromático,
probablemente
vía epoxidacióny posteriorreagrupamiento
al fenol (Figurall.9)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Introducción
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\¿)
-------\
@(,FNs¡-.n
f-)
/V.A!l
+
rl
\-/
FH,
t/*¡".
Oxid.
-\
Figura 11.9. Oxidación metabólicade azocolorantes.C-Hidroxilación aromática.
.
N-Hidroxilación:Tíenefugarsobregruposamino primaríoso secundarios,
o sobre
gruposacetilamino(Figura11.10).
puededar lugar,como producto
Estadegradación
final,a un nitreno,el cual puedeenlazarsecovalentemente
a gruposnucleofílicos
del DNA 125,261,
comose muestra
en la Figura11.11.
O***4DM#
offiffiB*offi
H
R- H, CH3 COCH3
Figura 11.10. Oxidaciónmetabólicade azocolorantes.
N-Hidroxilaciónaromática.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
o
o
'T\\
@R-* ,N -N/-N <=
dRib.
+
lon Nitreno
H
/\
'lI
otl
I
*tT\r
dRi
d-Cuanosina
FiguraILll"
HNA-NAN'
dRib.
Reaccióndel compuestonitrenocon el DNA (guanosina).
o Demetilación:Es el paso siguientea la oxidación de grupos metilo en N,Ndialquilaminas.
El N-hidroxíderivado
puedesera su vez demetiladoo dar lugara
una especienitreno(Figurall.12l.
N-Oxidación SegundaDemetilación
- N \¡cHt
OH
-N
tr
tr
Figura 11.12" Oxidación metabólicade azocolorantes.Demetilación.
Por lo que respectaa los procesosde reducción metabólica,la reaccióndegradativa
más importantees la rupturadel grupo azo, y tiene lugar preferentemente
sobre los
azocolorantes
solublesen agua.La azorreductasa
responsable
por el
estárepresentada
sistemacitocromo P-54OINADPHmicrosomal,con el NADPH como donante de
Dicho sistemase encuentraen el hígadoo es formadopor muchasespecies
electrones.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
lntroducc¡ón
27
de bacteriasanaeróbicas
presentes
en la flora intestinal124,27,281.
Existennumerosos
trabajosen los que se compruebala biorreducción
de azocolorantes
tantoen el hígado
en el tractogastro-intestinal
129-341como
[35-321.El mecanismode la azorreducción
en mamiferosimplica una transferencia
de dos electronescon un radicallibre como
(Figurall.13).
intermedio
t@n'"*@]
f@*'"@l
-
|
Radical tibre
-
J
-¡2O
L-s*"*91
@*n,
Figura Il.l3.
H,N€
Mecanismode Ia azorreducciónmicrosomal.
Los metabolitosmás característicos
tras la azorreducciónmetabólicade los colorantes
son las aminas aromáticas,compuestos a los que se atribuye claros efectos
carcinogénicos
tanto en animalescomo en el hombre. Desde hace tiempo, se ha
comprobadoel potencialcarcinogénicode arifamínastalescomo la bencidinao fa
anilina [38]. Asimismo,la IARC(lnternational
AgencyResearch
for Cancer)estableció
los riesgoscarcinogénicos
potencialesque presentanciertasarilaminaspara la salud
humana[39-41].
Las característicasestructuralesque presentan las aminas aromáticas, influyen
decisivamente
sobresu potencialcarcinogénico:
o Posicióndel grupo amino: una posiciónlibre en para respectoa grupo amino,
permiteuna C-hidroxilación
en el anillo con la consiguiente
destoxíficacíón
de la
molécula.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
.
Presenciade grupossulfónicos:la presenciade estosgruposen la arilamina,hace
que disminuyael tiempode permanencia
de la mismaen el interiordel organismo,
dificultandosu transporte
al núcleocelulary favoreciendo
su eliminación.Una
recienterecopilaciónde datossobregenotoxicidad
y carcinogeneidad
de arilaminas
sulfonadaspreparadapor la ETAD 1421,ha concluidoque estoscompuestos,al
contrariode sus análogosno sulfonados,presentanmuy bajo o ningún potencial
carcinogénico.
o lmpedimentoestérico del grupo amino: se ha comprobadoque los derivados
3,3'-alquilbencidinas
con cadenasCa o mayores,y los 3,3'-alcoxibencidinas
con
cademasC3 o mayores,no son mutagénicos,
al contrariode sus análogoscon
sustituyentes
menosvoluminososcomo son la o-tolidinao la odianisidina[43]
Unavez vistoslos puntosmássignificativos
en la evaluación
del perfileco-toxicológico
de los azocolorante,en la Tabla ll.1 se recogenlos tres grupos en que pueden
diferenciarse
en funciónde su potencialcarcinogénicol2S,44l:
Tabla II.l "
Clasificaciónde los azocolorantessegúnsu potencialcarcinogénico.
Propiedades
Generales
solubilidad
Reacciones
Metabólicas
Presencia
de
Enaguao en
.
Reducción
del grupoazo
arilamina
disolventes
r
N-hidroxilación
de la amina
potencial
+
.-c..qtgit9..gg.l]l_c..1................_..9I9éil.99..:
Mantenimiento
del
grupoazo intacto
Endisolventes
.
C-hidroxilación
orgánicos
¡
N-hidroxilación
.
N-alquilación
.
Reducción
del grupoazo
Presencia
de grupos
SO,H tantoen el
agenteacoplante
Enagua
+/-
o Rápidaeliminacióndel
organismo
comoen arilamina
11.3.2.
LegislaciónRelativaa ColorantesAzoicos
La concienciaciónsobre cuestionesmedioambientales,
junto con el creciente
conocimientosobrela toxicidadde ciertoscolorantes
de
[45], hizoque los legisladores
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Introducción
29
muchospaísesreaccionaran
presentando
y aprobandodistintasleyesy decretosque
regularansu fabricacióny uso.
Legislación
en los EEUU
En 1974, la OSHA (OccupationalSafetyand Health Administration)reguló como
cancerígenas
las aminasbencidina,3,3'-diclorobencidina,
1-naftilamina,
2-naftilamina
y 4dimetilaminoazobenceno/
estableciendo
las siguientesconcentraciones
máximas
olo
que
puedan
en materíalesa los
estarexpuestosfos trabajadores:1 para la I-naftilaminay 0.1% parael resto[46].La FDA (Foodand DrugsAdministration)
ha regulado
en distintasocasionesla presenciade ciertasaminasaromáticascarcinogénicas
en
colorantesempleadospara la manufactura
de alimentos,drogasy cosméticos,como
son el FD&CYellow No5 (Tartracina)
[47] y el FD&CYellow No6 (SunsetYellow FCF)
concentraciones
máximasde 1ng/kgparaalgunasde ellas,como la
[48], estableciendo
bencidina.Asimismo,en 1991 se promulgóun listadode aditivosalimentarios
que
debíanestarsujetosa regulación[49].
Legislación
de la Unión Europea
En la DirectivaCEE62/2645 t50l y sus modificaciones,se fijaron límitesde tolerancia
en el uso de colorantesalimentarioscomprendidosentre una dosisdiaria, referidaa
peso corporal,de 0.1 mg/kg para la curcuminay 2.5 mglkg para la eritrosinaentre
otros.
La normativabásicade las ComunidadesEuropeassobre la proteccióncontra los
riesgosrelacionadoscon la exposiciónde agentesquímicos,físicosy biólogicosse
halla íncluídaen la DírectivaMarco CEE80/11o7 [511,a partir de la cual se han
desarrolladouna seriede directivasespecíficas
sobresustancias
concretas.Entreellas,
la única referentea aminasaromáticases la DirectivaCEE88/364 [52] en la que se
prohibela fabricacióny usode productosque contengan4-aminobífenilo,
bencidinay
sussales,2-naftilamina
y sussalesy 4-nitrobifenilo
en cantidades
superiores
al 0.1%.
Sin embargo,la legislaciónmásprogresiva
se encuentraen la Propuesta
modificadade
Directivadel ConsejoCOM(S9)[53] referentea la protecciónde trabajadores
contra los
riesgosrelacionados
con la exposicióna compuestos
carcinogénicos
duranteel trabajo
(entreellos lasarilaminasy derivadoscomo los colorantes).
En estesentido,se publicó
la Directiva CEE 901394[54], que contiene los requisitosmínimos que han de
cumplirseen las actividadesdonde los trabajadores
se encuentreno puedan estar
expuestos
a agentescarcinogénicos
[55,56].
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Legislación
en España
España,a"aíz de su incorporacióna la ComunidadEuropea,ha ido adoptandoen su
legislaciónlas anterioresnormativas
comunitarias.
Así, la única legislaciónreferentea
aminasaromáticas
queda reflejadaen el BOE N" 24 de fecha 21-1-gO,
derivadade la
DirectivaCEE88/364,donde se prohibela produccióny el uso de 4-aminobifenilo,
bencidinay sussales,2-naftilamina
y sussalesy 4-nitrobifenilo.
La transposición
a la legislaciónespañolade la DirectivaeuropeaCEE90/394,es el
RealDecreto665/1997 de 12 de mayode 1gg7 Í571,referentea la protecciónde los
trabajadores
en la industriaquímicacontra los riesgoscausadospor la exposicióna
agentescarcinogénicos,
como por ejemploarilaminasy colorantesderivadosde ellas
ls6l.
Legislación
en Alemania
La "TechnischeRegeln für Gefahrstoffe(TRCS)"(Regla Técnica para sustancias
Peligrosas)
No 614, publicadaen Alemaniaen septiembre
de 1993[58],recomendaba
no emplearcolorantesazoicosque, por desdoblamiento
de uno o variosgruposazo,
pudieranliberaralgunade lasveintearilaminas
cancerígenas
indicadas
en la Tabla1.1.
Estasaminasfueronextraídas
de las listasalemanas
MAK (máximaconcentración
en el
puestode trabajo)[59], donde se recogenlas sustancias
carcinogénicas
o sospechosas
de serlo,y se establecela máximaconcentración
admisibleen los lugaresde trabajo
agrupándolas
en funciónde su peligrosidad.
Así,se establece
la siguienteclasificación:
MAK f f f: Compuestoscarcinogénicososospechosos
deserlo
o lll A: Con seguridad
carcinogénicos
'
lll A 1: Carcinógeno
en el hombre
lll A 2: Carcinógeno
en animales
o f lf B: Sospechosos
de ser carcinogénicos
De lasaminaslistadas
en la Tabla1.1,la bencidina,
la 4-aminobifenilo,
la 2-naftilamina
y la 4-cloro-2-metilanilina
pertenecenal grupo lll A 1, mientrasque las dieciséis
restantes
pertenecen
al grupolll A 2.
El 15 de julío de 1994,el gobiernofederalalemánhizo suyala recomendación
de la
TRCSNo614,y publicó el segundodecretomodificador[60] del Decretode Objetos
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Introducción
_tl
de Consumo(BCV)[61],en dondese prohibíala fabricación,
importación
y ventade
objetosde consumoteñidoscon azocolorantes
que liberasenalguna de las veinte
arilaminastras la disociaciónde uno o varios grupos azo, a tenor del apartado5,
párrafo1, No6 de la Ley sobreAlimentosy Objetosde Consumo(LMBC) 1621.La
prohibiciónde fabricación
e importación
entrabaen vigora partirdel 1-1-95,mientras
que la de comercialización
lo hacíaseismesesmástarde:el 1-7-95.Posteriormente,
se
fueronpromulgandouna seriede modificaciones
que
en las
se fueronretrasando
estos
plazos.En el Tabla11.2,
se recogeel calendariode la legislación
alemanarelativaa
colorantesazoicos.
Tabla 1I.2. Calendariode la legislaciónalemanarelativaal uso de colorantesazoicos.
Ley/Decreto
Promulgación
BCV [61]
104-92
LMCB [62]
8-7-93
TCRSNo614[58]
1'Modificacióndel BCV [63]
sept-93
2a Modificacióndel BGV [60]
3" Modificacióndel BGV [64]
4" Modificacióndel BCV [65]
5aModificacióndel BCV [66]
114-94
'15-7-94
Prohibición de Ia Prohibición de la
Fabricación e
Venta
1-1-95
1-7-95
16-12-94
30-6-95
31-12-95
10-7-95
31-3-96
30-9-96
B-11-96
31-3-97
31-12-98
Lospuntosmásdestacables
derivadosdel decretoy sucesivas
modificaciones,
son los
,
siguientes:
a
a
Seregulansólo objetosde consumoque entranen contactodirectocon la piel.
Entrelas arilaminasprohibidasno se encuentran
ni la o-anisidina
ni la p-aminoazobenceno,recientemente
reguladas
como seguroscarcinógenos
en animalespor
y la comisónalemanaMAK [62].
la Unión Europea
El azocolorantelibre no se consideracomo objetode cosumo,y por tanto no entra
dentrodel ámbitodel decreto.
Tampocose regulanproductosauxiliaresparael acabado,curtientes,
colorantesno
azoicosy, recientemente,
azopigmentos
de pesomolecularsuperiora 700 [68].
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
32
capítulo II
Es importantehacernotar que en el texto del decretoy modificaciones,
en ningún
momentose especificael métodoanalíticoparala determinación
de lasarilaminas,ni
se establece
concentración
límitea partirde la cual una muestraincumplela normativa
vigente.Así, la presencia
de 1 nglkgde aminaprohibidaen la muestrapodíasignificar
ya existeun normaalemanaDIN al respecto[69] donde se
su rechazo.Actualmente,
estableceun límite de 30 mg/kgsobreproductoacabado.En el apartado11.4.2,
se
tratarácon másdetenimiento
el contenidode estanorma.
El Decretosobreobjetos de Consumoes, en principio,de ámbito alemány no se
aplica en e[ resto de la Unión Europea.A pesar de ello, este decreto tiene
prácticamente
validezmundialya que Alemaniaes uno de los principalesimportadores
de artículosde cuero[38].
Legislaciónen otros paíseseuropeos
En cuanto a la legislacionrelativaa azocolorantes
existenteen el resto de países
europeos,las autoridadessuizasimpusieronen marzo de'1995 restricciones
legales
acerca de cantidadesmáximas de aminas aromáticasliberadasde colorantes
hidrosolublesen contactocon niños [70], estableciendo
límitesde 50 mdkg para el
contenidototal de anilinay sus derivados,y de 5 mg/kgparael total de bencidina,
2-naftilamina,
4-aminobifenilo
y demásaminasde similarcomportamiento
fisiológico.
Por otro lado,el 1 de agostode 1996 se promulgóen Holandauna ley semejantea la
alemana,mientrasque en Dinamarcase planteanregulaciones
en un breveespaciode
tiempo[68].
11.4.
Análisisde Azocolorantes
en Basea lasArilaminasLiberadas
El análisisde colorantesazoicosconstituyeun extensocampode la químicaanalítica
del que se puede recogerinformaciónmuy diversaen cuantoa métodosy a técnicas
instrumentales
utilizadaslTll.Entreestasúltimas,la másfrecuentees HPLCacopladaa
detectoresde MS o UV-Visible[72-85],aunquetambiénse ha utilizadoen ocasiones
CC [81], ElectroforesisCapilar (CE) [86,87], TLC [BB-94]o Espectrofotometría
[95].
Asimismo,se describenestudiosa nivel cualitativo,por medio de la identificación
estructural
a travésde MS Í96,94.
Un caso particulardentro del análisisde azocolorantes
es la determinaciónde las
arilaminasliberadastrassometerlos
a procesosde reducción171,981,
del que se hace
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Introducción
33
uso en estamemoriaparael estudiobien seadel mísmocolorante,o bien de cuero
no se encuentfanen
teñido.Así, lasarilaminasa determinarduranteestainvestigación
en formade azomolécula.
estadolibre,sinoque estáncombinadas
Teniendoen cuentaesto, una distribuciónoportunade la bibliografíadisponible
referenteal análisisde arilaminas,seríala distinciónentreel estudiode las mismasen
en azocolorantes
o materiales
teñidos.
estadolibre,y en estadocombinadopresentes
la informaciónse recogesegúndichadistinción.
En los apartados
siguientes
ll.4.L Análisisde ArilaminasLibres
Respectoal análisisde arilaminasen estado libre, en la bibliografíase pueden
encontrarestudiosrealizadossobremezclaspatrónde las mismaso sobredíferentes
(humode tabaco,aguasde desecho,colorantes,
muestras
biológicas,
tiposde sustratos
extracción.En ciertos trabajosno se lleva a cabo
etc.) tras la correspondiente
por separado.
los compuestos
5in embargo,el análisis
separación
alguna,analizándose
precedido
de
una
separación
medíantetécnicastales
va
normalmente
cromatográfíca
Electroforesis
Capilar[99]. Por
como TLC, HPLCo CC, y tambiénmás recientemente
otro lado, es muy frecuentela derivatizaciónde las aminasen función del tipo de
que facilitansu determinación.
en compuestos
detecciónempleado,transformándolas
previa,se encuentran
Por lo que respecta
al análisisde arilaminaslibressin separación
métodosderivatizantes:
trabajosen los que se haceusode los siguientes
a
a
a
(estructuras
en Figurall.7) tales
con agentesacoplantes
Diazotacióny acoplamiento
sal R [103-105],
ácidochicago[106],1-naftolÍ107,1081,
como ácido H [100-102],
fenolUon, N-(1-naftil)etilendiamina[102,103,110-112],
N-(1resorcinol
Í1O7,1091,
N-sulfatoetil-mtoluidina
ácido
3-hidroxi-2o
naftil)etilendiamina
Í1O21,
[103]
(ED).
naftoico[103],seguidode detecciónespectofotométrica
(cloranilo)[113],seguídode ED.
Reaccióncon tetraclorobenzoquinona
Reaccióncon 9-cloroacridina
[114],seguidode ED.
del cloruro en
Reaccióncon clorurode picrilo [115] y posteriordeterminación
exceso.
y posteriorvaloracióncon
en dímetifformamída
Reaccióncon metilisotiocianato
iodatopotásicoen medioácido[116].
prevíaen TLC,se hacenecesarioel
En cuantoal análisisde arilaminascon separación
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
34
Capítuloll
reveladode las placastrasla eluciónpara su posteriordetecciónespectrofotométrica
(EO¡6 fluorimétrica(FD).Lastécnicasderivatizantes
másempleadas
son lassiguientes:
a
a
Diazotación
y acoplamiento
con resorcinol
[107]o con 1-naftilamina
n1n, seguido
de ED.
Reaccióncon 4-dimetilaminobenzaldehido
(reactivode Ehrlich)Í117-1201,
seguido
de ED.
Reacción
con 4-dimetilcianamaldehido
[121],seguidode ED.
Reacción con
4-fenilespiro(furan-2[3H]-1'-ftalan)-3,3'-diona
(fluorescamina)
[118,122], seguidode FD.
Reacción
con o-ftalaldehido
['t1B],seguidode FD.
En cuantoal análisisde arilaminas
por HPLC,se puedehaceruna primeradistinción
entre uso de cromatografía
de adsorcióny de cromatografía
en faseinversa,aunque
tambiénhaydescritoun estudiomediantecromatografía
por lo
de cambioiónico 11231.
que se refierea la cromatografíade adsorción,todos los estudiosencontradoshacen
referenciaa determinaciones
sin derivatizaciónprevia y haciendouso siemprede
detecciónUV-Visible[1244 2n"
Por lo que respectaal análisispor HPLCen faseinversa,puedenencontrarse
estudios
y
sin
con derivatizaciónprecolumna.Así, analizandolas aminas como tales, se
encuentrantrabajosen los que se emplea detecciónUV-Visible[120,128-141]o
detecciónelectroquímica
Porotro lado,en losestudios
[133,134,142-148].
disponíbles
con derivatización
previa,seempleanlos siguientes
métodosderivatizantes:
Diazotacióny acoplamiento
con sal R [149-152]o con pirazolonaT [149-151],y
posteriordeteccióncon DAD.
Reaccióncon fenilisocianato
[153],seguidode detecciónUV-Visible.
En estoscasos,se emplea siempredetecciónUV-Visibledado que los colorantes
resultantesde la derivatizaciónpresentanuna gran absorbanciaen este rango del
espectro.
Se han descrito también determinaciones
de arilaminassulfonadaspresentesen
colorantesalimentarios,como intermed¡osde reacciónno combinadosdurante su
síntesis,
talescomo el ácido p-sulfanílico
o el ácido p-naftiónico1154-1561,
por medio
de HPLC/UVde par iónicoen faseinversay utilizandoel fosfatode tetra-n-butilamonio
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lntroducción
35
como reactlvcen la formacióndel par iónico.
El empleo de la derivatizaciónen los trabajosreferentesal análisispor CC, está
condicionado
al tipo de detecciónque se use.Porun lado,sin derivatización
previase
encuentran
estudiosempleandodistintostiposde detectores:
de lonizaciónde Llama
(FfD) [141,157-162],
de MS [163-167],específicode nitrógenoy fósforo (NpD)
de coductividadtérmica(TCD)[169]o de capturaelectrónica(ECD)
[158,162,168],
químicas
transformaciones
de lasaminasparasu posterior
1168].Porotro,se describen
cuantificación,empleando los métodos derivatizantesy sistemasde detección
siguientes:
(TFA),con ECD1170,1711
Formaciónde lastrifluoroacetamidas
o MS 1172,173).
a
(PFP).
Formación
de laspentafluoropropionamidas
con ECD[139,168,170,174-1791
o MS[172,173,1797.
¡ Formación
(HFB),con ECD [136,170,176,180-182]
de lasheptafluorobutiramidas
o
MS 1172,1731.
O
(PFO),con FIDo MS [183]Formación
de lasperfluorooctanamidas
a
(CA),con ECDo MS [123].
Formaciónde lascloroacetamidas
o
(DCA),con ECDo MS [123].
Formaciónde lasdicloroacetamidas
a
(NPM),
Formación
de lasN-permetilaminas
con un FIDt1B4l.
a
Formacióndel derivadotras reaccióncon pentafluoropropionilimidazol
(PFPI),
con
F I Do M S [ 1 B s ] .
a
Formaciónde los derivadosbromados,con ECD[186].
a
Formaciónde losderivadosiodados,con ECDUBn.
a
Sililación con N-(tercbutildimetisilil)-N-metiltrifluoroacetamida
seguido de
trifluoroacetilación
con N-metilbis(trifluoroacetamida),
con MS o AED t1BBl.
a
La utilidadde la derivatización
en la determinación
de las arilaminasse pone de
manifiestoen el casode CC/ECD,cuyo empleoestácondicionadoa la existenciade
elementoshalógenosen los compuestos
analizados.
aa.4.2.Determinaciónde Arilaminasen Coloranteso MaterialesTeñidos
Una vez revisadoel análisisde aminasaromáticas
en estadolibre, a continuaciónse
recoge la informaciónreferentea su determinaciónen colorantesazoicos y en
materiales
teñidosempleadosen la industriadel calzado,como sonel textily el cuero.
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36
Capítulo Il
dentrode
en formade azomolécula
combinada
En estecaso,la arilaminase encuentra
la liberación
la estructura
del colorante,por lo que es necesarioparasu determinación
grupo
reductor
un
agente
medio
de
azopot
de la mismatrasreduccióndel
[189].La
analizada,
biensetratede
segúnel tipo de muestra
información
disponibleseclasifica
colorantecomo tal o bien de muestrateñida, haciendoespecialhincapié en las
empleado.
condiciones
del procesode reducción
los agentes
disponibledonde se analizaazocolorante,
En cuanto a la bibliografía
el cloruro de estaño
reductoresmás empleadosson el ditionito sódico (Na2S2Oo¡,
(H2lPd).
(SnClz)
y la hidrogenación
catalíticaheterogénea
sobrepaladio
s€ recogendiversostrabajosdonde se emplea una
Por lo que respectaal Na2S2Oa,
en peso.En
comprendidaentre 1 y 2O,expresada
relaciónagentereductor/colorante
ambientey con un pH de la
partede ellos,la reducciónse llevaa cabo a temperatura
dado por la propiadisolución
disoluciónacuosadel coloranteentre2 V 3 Í190-1921,
la reducciónse realizaa
estudios
[193],o básico|94,1951.Porotro lado,en diversos
oC,
entre70y 100
empleandoun pH ácido [196],dado
temperaturas
comprendidas
Entodos
entre8.5 y 11.4 Í199-2031
por el propiocoloranteU97,1981,
o comprendido
los casos,el tiempo duranteel cual la muestrase encuentrabajo la accióndel agente
reductorestácomprendidoentremediominutoy una hora.Con ditionitosódicocomo
agente reductor,se han analizadotambién colorantesinsolublesen agua Í2041,
disolviéndolosen metanol caliente y agregando una relación milimolar
un tiempode 5
comprendidaentre14 y 98, dejandoposteriormente
ditionito/colorante
'12
a
minutos.
se utilizan
Respectoal empleo del SnCl2 como agente reductor Í138,204-2061,
entre 1 y 4, disolviendola muestrabien
relacionesmolaresagentereductor/colorante
del colorante.
de la solubilidad
en metanola ebullicióno bien en agua,dependiendo
Posteriormentese agrega el SnCl2 como disolución entre 0.2 y 3 M en HCI
concentrado.
Por último, en cuanto al empleo de hidrogenacióncatalíticaheterogéneasobre
de gasesdonde
paladio,éstase realiza"in situ" en el mismoinyectordel cromatógrafo
se lleva a cabo el análisis[205]. En estecasoel métodose proponecomo técnica
cualitativaparaidentificaraminasaromáticas.
teñidos,talescomo textil o
de arilaminasen materiales
En cuantoa la determinación
cuero, previamentea la reduccióndel colorantese hace necesariala extraccióndel
mismode la matrizestudiada.Hastahacepoco no ha existidoun métodooficial que
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
lntroducción
37
unificarael procedimientoanalíticoen todos los laboratorios.
En consecuencia,
cada
uno de ellosempleabasu propiométodode análisiscon fa consíguiente
varíabílidad
tantoen procedimientos
como en resultados
obtenidos.
La bibliografíadisponibleal respecto,recogetrabajosprincipalmenteorientadosa
análisisde textiles,siendolos estudios
sobrecueromuchomásescasos.
Entodosellos
se haceusodel mismoagentereductor:el ditionitosódico.
En cuantoal análisisde materiales
textiles,se describeun procedimiento
donde la
muestrase humectaen aguaa70 ! 5 "C y, sin ajustarpreviamente
el pH, se agregael
agentereductort2}n. Por otro lado, se encuentrandiversosestudiosL199,208-21O1
donde la muestratextilse hidrolizaen 10-25ml de NaOH 1 M a reflujodurante30
minutos,se adicionade 0.2 a 0.5 gramosde ditionitosódicopor gramode muestra,
y
se mantienedurante30 minutosmásen esascondiciones.
Respectoal análisisde cuerosteñídos,se describeun procedimientoen el que se
(pH alrededor
humectala piel en 200 ml de disoluciónamoniacal
de 1'1.5),
agregando
0.4 g de ditionito sódico por gramode muestray agitandodurante t hora a 60 oC
[201]. Por otro lado, tambiénse recogeun análisisllevadoa cabo en medio ácido,
piel molidaen 15 ml de HCI 2 M y calentándola
humectando
al baño maría,tras lo
gramos
por
cual se agregan0.5
de ditionitosódico
gramode muestray se agitadurante
1 5 m i n u t o st 1 9 6 1 .
Losprocedimientos
empleadosparael análisisde lasarilaminasliberadasasícomo las
técnicasinstrumentales
utilizadas,en términosgeneralesson los recogidosen el
apartadoanterior.
Como puede comprobarse,el procedimientomás extendido en el análisis de
materiales
teñidosse llevaa caboen mediobásicofuertey con una hidrólisispreviade
la muestraen condícionesbastante
La aplicaciónde estemétodoes necesaria
drásticas.
para poder abarcaren el análisisa los azopigmentos
ademásde los azocolorantes
Í199,2091.
Sin embargo,la aplicaciónde talescondiciones
da lugarfrecuentemente
a la detección
de arilaminasque, en principio,no parecenliberarsecomo consecuencia
de la
disociacióndel grupoo gruposazo presentes
en el colorante,provocandolo que se ha
dado en llamar"falsospositivos".Losejemplosde estetipo máscomunesdescritosen
la bibliografía
sonlossiguientes:
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
13_
CapítuloIl
1. Detecciónde 4-cloroanilinaen el PigmentRedB
Sewekowy col. [67,211]y Puntenery col. [38], describenla posibilidadde la
formaciónde la 4-cloroanilinatras el análisisdel colorantePigmentRed B, a
consecuencia
de la hidrólisis
del grupoamídicopresente
en la molécula(Figura11.14).
Cl: PigmentRed8, 12335
Figura 11.14"Liberaciónde 4-cloroanilina,trasel análisisdel PigmentRed B.
2. Detecciónde bencidinaen el Acid Blue150
Los mismosautores,explicanla posibleformaciónde bencidinatrasel análisisdel
colorante antraquinónicoAcid Blue 150, producto de la escisiónde los enlaces
amínicosque la unenal restode la molécula(Figura
11.15).
so3H
C l :A c i d B l u e1 5 0 ,6 1 1 3 0
Figura ll.l5" Liberaciónde bencidina,trasel análisisdel Acid BIue 150.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
lntroducción
39
3. Detección de 2,4-diaminotoluenoy 4,4'-diaminodifenilmetano
en cueros
acabadosde poliuretano
En variostrabajosf67,38,199,200,211,2121,
se alude a la formaciónde estasdos
prohibídas
arílamínas
traseÍ análisisde textilesy cuerosacabados
con recubrimiento
(TDl)o al 4,4'-metilende poliuretanosintetizado
en baseal 2,4-toluendiisocianato
(MDl),
difenilisocianato
como consecuencia
de la hidrólisisde unidadesde uretano
(Figurall.16).
t,4'-Diaminodifenilmetano
Figura II.l6. Liberaciónde 4,4'-diaminodifenilmetano
tras el análisisde materialesacabados
con recubrimientode poliuretanoen baseal 4,4'-metilendifenilisoc¡anato.
4. Detección de 2-naftilamina en azocolorantessintetizadosa partir del ácido
2-amino-1-naftalenosulfónico
VarÍosautoresÍ38,67,21'l
que sufreel ácído2-amino-'lla desulfonación
,2121descíben
naftalenosulfónico
duranteel análisis,tras su liberacióna partir de colorantesque lo
contieneneh su estructura
como aminade partida(Figura11.17).
T------
- l*ru-n'
Azocolorante
derivadodel ácido2-ami no-1-naftalenosu
lfónico
FiguraII.l7. Liberaciónde la 2-naftilaminatrasel análisisde azocolorantessintetizados
a partir
-n
del ácido 2-ami no- I aftalen osuIfónico.
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40
Capítulo ll
con amidasde ácidoacetacético
5" Detecciónde aminasen azocolorantes
y col. [38],describenla posibleliberación
de aminastrasel análisisde este
Puntener
de la hidrólisis
del grupoamídico(Figurall.1B).
tipo de colorantes,
comoconsecuencia
Azocolorantecon amida de ácido acetacético
Figura ll.lB.
Liberación de arilamina tras el análisis de azocolorantes con amidas de ácido
acetacético.
con heterociclos
en su estructura
6. Detecciónde aminasen azocolorantes
heterocíclicas
en
señalanla posiblerupturade estructuras
Losmismosautores138,2131
que lascontienen,con la consiguiente
liberaciónde amínasen ciertoscasos
colorantes
( F i g u r lal . 19 ) .
Azocoloranteheterocícl
ico
con heterociclosen
Figura 11.19. Liberación de arilaminatrasel análisisde azocolorantes
estructura.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
SU
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Introducción
41
a partir de anilina
7. Detecciónde -aminobifeniloen azocolorantes
sintetizados
en los que se detectala 4-aminobifenilo
Existeun determinado
tipo de colorantes
tras
como productode partidaen su
su análisissin haberseempleadoaparentemente
El denominador
común de todoselloses el empleode anilinacomo amina
síntesis.
baseen la manufactura.
se alude al método analítico como el
En diversostrabajos138,67,211,213-2151,
En la Figura 11.20se muestrael
causantede la formaciónde 4-aminobifenilo.
para
postulado
por
y
Puntener col. [213]
explicarla formaciónde la 4-amimecanismo
nobifenilotrasel análisis
de colorantes
sintetizados
a partirde anilina.
intermediode
Dichos autoresse basanen la formaciónde un hidrazocompuesto,
reducciónentre el azocompuestoy las aminas liberadas,como posible fuente de
posteriormente
formaciónde radicalesfenilo 12161.Dicho radicalreaccionaría
con la
anilinaliberadatrasla reduccióndel grupoazo, originandola 4-aminobifenilo.
/A
((
l)
\\J/
,FJ,
((
) )_t¡:t¡_Rr
H
->\/
N-N
\--,/
/\
HAr
Azocolorante
Hidrazocompuesto
/\
t/\
Ar-NH2
+ ((
1-\
\-/
v
)F¡¡H.
I
Y
M*,,
V\r'
4-Aminobifenilo
Figura 11.20. Formaciónde 4-aminobifeniloa partir de azocolorantesderivadosde anilina,
trassu reduccióncon ditionito sódico.
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Como consecuenciade los problemasque acarreabanla existenciade lod "falsos
positivos",en Alemaniase intentó establecerun método que evitaraeste tipo de
resuftados.
La casacomercialBayerhaceuso de un procedimientoparael esludiode
muestrastextilesque, con ciertasmodificaciones
y trasser comprobadocon éxito en
análisisinterlaboratorio,
se incluyeen la colecciónoficialde procedim¡entos
dd ensayo
segúnel apartado35 de la Ley de Alimentosy Objetosde Consumot2171.Dicho
procedimientofue adaptadoparacueros,publicándose
en marzode 1997 l{ norma
alemanaDIN 53316 [69], cuyasdiferenciasmássignificativas
con respectoal lmétodo
en mediobásiconormalmente
utilizado,sonlassiguientes:
.
a
a
a
La reducciónse llevaa caboa 70 oCen lugarde a reflujo
El pH del medioacuosoen la reducciónesde 6, en lugarde 13
Seemplean0.6 g de ditionitosódicopor gramode cuero,en lugarde 0.2 g
Se estableceun concentración
límitede aminaprohibida:30 mglkgreferidda peso
de muestra
Entre muestrastextilesy cueros,la única diferenciaque presentael análisfs
es el
previo
desengrasado
con n-hexanoa que se someteel cuero, para evitarposibles
interferencias
en la posteriordeterminación
de lasaminas.
No obstante,los erroresoriginadosde la detecciónde arilaminastalescor¡1ola 4aminobifenilo
o la 2-naftilamina,
no se consiguen
eliminardel todo con la aplicación
de este nuevo método 138,67,218,2191.
En casode detecciónde uno de estosdos
compuestos
en cantidades
superiores
a 30 múkg, es necesario
disponerde información
adicionalacercade la estructuradel colorantepara poder dar resultadopositivocon
totalseguridad.
Por otro lado, la bibliografía
tambiénrecogeestudiosdondese afirmaque la detección
de ciertasarilaminas,no empleadasa priori en la síntesisdel coloranteanalizado,
pueda ser debida a reaccionesy/o procesossecundarios
ocurridosen la síntesisdel
mismo o el estadode las materiasprimas utilizadas.Así, varios autores[2OO,212]
apuntana la posibilidadde que la 2-naftilamina
detectadaen colorantessintetizados
a
partirdel 2-amino-1-naftalenosulfónico,
puedatratarsede un contaminante
presenteen
éstaúltima como consecuencia
de una sulfonaciónincompletadurantela fabricación
prima
de la materia
[2121(Fieurall.21).
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lntroducción
¿+J
oo--*
H2S04
1 6 00 c
ruu.
l-v\r-NH'
\l,w
Acido 2-amino-1-naftalenosulfónico
2-Naftilamina
Figura II.2l.
o
o-$-o
Síntesisdel ácido 2-amino-\-naftalenosulfónico.
Casossimilaresa éstese han descritoen colorantes
alimentarios
sintetizados
a partirde
aminassulfonadas
de la anilina,p-cresidina
o 1-naftilamina
En estos
[28,149-152].
casos,se alude inclusoa la posibilidad
de que la desulfonación
de las arilaminas
de
partidaocurraduranteel procesode síntesis
de loscolorantes
correspondientes.
Un ejemplode reacciónsecundaria
ocurridadurantela síntesis,
es la formaciónde la
4,4'-nitrobifenilo
en la fabricacióndel DisperseBlack9 (Figura11.22),la
cual se reduce
a la bencidinatrasel análisis
del colorante,
segúnafirmanOh y col. [200].
or*-1fl-*",
\/
NaNo'
1'HCI'
,
,@"<!ü_:ffi
NasH r,*-1-\-*:*-rlA-*a:ru-:*':"
V
V
\cH2-cH2oH
DisperseBlack9
Figura 11.22. Síntesisdel coloranteDisperseBlack 9.
Dicho compuestoseformaríacomo consecuencia
del acoplamiento
entredos radicales
nitroarilo,originados
en la diazotación
de la arilaminaa paftirde la cual se sintetizael
(Figura
la 4-nitroanilina
11.23).
colorante:
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44
ca7ítulo ll
Figura 11.23. -Formacióndel 4,4'-nitrobifeniloa partir de Ia 4-nitroanilina,durantela síntesis
del coloranteDisperseBlack9.
seala detecciónde 4-aminobifenilo
en
Quizás,el casoque planteamayorcontroversia
colorantessintetizados
a partir de anilinacomo amina base.Así, existenautoresque
achacanla aparicióndel 4-aminobifenilo
al procesode síntesis
del colorante[152,200],
al contrariode la hipótesisanteriormente
expuesta.
G*:*.
*"p*ra
Ruptura Heterolítica
o.
/
Homolítica
\
o)-':N-X
I
o"n
I
/A
i
\_-/2..N2+x.
^r@
re
\
(orto, meta y para)
^r@
(orto, meta y para)
@-:*€,",.
Figura 1/.24. Especiesformadas a partir de Ia diazoanilina tras pérdida de nitrógeno según
ruptura homolítica y heterolítica.
La teoría que atribuye la formacióndel 4-aminobifeniloal procesode síntesisdel
colorante,se basaprincipalmenteen los procesosde descomposición
en que se ven
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lntroducción
involucradas
las salesde arildiazonio
traspérdidade nitrógenolibre 1220-2231,
En la
Figura 11.24se muestranlas especiesa que da lugar la díazoanílínatras
(formacióndel carbocatión)
desprendimiento
y
de nitrógeno,segúnrupturaheterolítica
homolítica(formación
del radical).
El que la decomposición
tengalugarde unaformau otra,dependede la naturaleza
del
y
arildiazonio de lascondiciones
de reacción.
Existen
diversas
citasdondese describe
la reacciónde dediazonaciónheterolíticay posteriorreaccióndel carbocatiónarilo
resultantecon un nucleófilo,bajo condicionesácidas1224-2321.
Por otro lado, es
ampliamente
conocidala reacciónde Gomberg-Bachmann,
en la cual se producela
formacióndel radicalarilo a partirde la sal de arildiazonio,
en condicionesbásicas
dandolugara bifenilosen presencia
de disolventes
aromáticos.
[233-240],
Oh y col. [200], paraexplicarla formacióndel 4-aminobifenilo
duranteel procesode
síntesisdel coloranteAcid Creen 114 (Figura11.25),
se basanen la formacióndel
carbocatiónfenilo a partir de la diazoanilinaen condicionesácidas (ruptura
heterolítica).
*"ó**_@*,
ffii",.óü;;e,
,so3H
?"
Tlh
vvr¡lq
NH
nrtr
So.t
SO3Na
A
.-.,r\7,\4"*
r.Hcl, NaNo2
(,^\
i
))-NH" - -2 . A ,p H - e
\-Zl
?" fl'
sz-*- q":_1ffi*:*@*-@*:*_oF*
v/
A-*
^r"o.s/VV\so.^¡" Xo"*"
Acid Creen 114
Figura 11.25. Procesode síntesisdel coloranteAcid Creen114.
Segúnestosautores,la 4-aminobifenilo
se formaríadurantela diazotaciónde la anilina
posteriormente
empleadapara la síntesis
del Acid Creen 114, condensando
con el
agenteacoplanteen mediobásico(Figura11.26).
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46
Capítuloll
Bailey[152]indicaotraposiblevía de formación
del 4-aminobifenilo
durantela síntesis
a partirdel 1,3-difeniltriaceno
formadotrasreacciónentrela diazoanilina
y la anilina.
La descomposición
térmica[2a1] o fotoquímica[2a2] del 1,3-difenildíaceno
puede
conducir,no sólo a la formaciónde biarilostalescomo la 4-aminobifenilo,
la 2aminobifenilo
o el bifenilo,sinotambiéna otrasespecies
(Figura
comola N-fenilanilina
|.2n.
G*
__re'rere?___
@_o__=.__>
lQ,!-q_
HCl, NaNO2
SO3Na
SO3Na
Acid Green114
Figura 11.26. Formación de 4-aminobifenilo durante la síntesisdel colorante Acid Creen l t4.
Una pruebade la formaciónde 4-aminobifenilodurantela síntesisde este tipo de
colorantes,
es la deteccióny cuantificación
de la mismatrasla extracciónde una serie
de azocolorantes
alimentarios
sintetizados
a partirde anilina1149-1521.
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lntroducción
47
@*.
4-Aminobifenif
o
2-Aminobifenilo
N-Fenilanitina
Bifenilo
Figura 11.27" Formación de haminobifenilo, 2-aminobifenilo, N-fenilanilina y bifenilo a partir
de la descomposición del 1,3-difeniltriaceno.
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lll. Objetivos
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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Objetivos
51
El objetivofundamentalde estetrabajoes el establecimiento
de un métodoanalítico
capazde determinar
mínimascantidades
de lasarilaminas
prohibidas
por la legislación
alemana(Tabla1.1)en colorantes
azoicoso pielesteñidas.Asimismo,se tendránen
cuenta también otros compuestos
tales como la anilina, por ser utilizadacomo
productode partidaen la síntesis
de muchosazocolorantes,
o los isómerosm-toluidina,
p-toluidina,2-cloroanilina,
3-cloroanilina,
1-naftilamina
y 2-aminobifenilo,
con el fin
posibles
de estudiarlas
interferencias
que su presencia
provocasobrela determinación
de lasaminasprohibidas.
El procedimientode trabajoque se estimamás apropiadopara el desarrollode la
investigación,
es el siguiente:
1. Establecimiento
de las condicionescromatográficas
en HPLC/DADy en CC/MS
parael análisisde lasaminasaromáticas
tantoa nivelcualitativocomo cuantitativo.
2. Estudiode las condicionesde preparaciónde la muestrapreviasal análisis
cromatográfico
de la misma,y las de extracciónlíquido-líquidode las arilaminasa
partirdel medioacuosoresultante
del procesode reducción.
3. Optimización de las condicionesde reducciónde azocoloranteestableciendo
parámetrostalescomo tipo de agentereductor,relaciónagentereductor/colorante,
pH
inicial del medio, tiempo de reduccióny temperaturade trabajo. Asimismo, se
estudiaránlas posiblesreacciones
y/o procesossecundarios
paralelosa la rupturadel
grupo azo, haciendohincapiéen aquellosque influyande maneradirectaen el
resultado
finaldel análisis.
4. Establecimiento
del métodode análisisparala determinación
de aminasaromáticas
en cuero téñ¡do. Posteriormente,
se llevaráa cabo un estudiocomparativocon el
procedimientoespecificado
en la norma alemanaDIN 53316 haciendouso de
muestraspatróny cuerosacabadoslistosparala venta.
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IV. Materialesy TécnicasExperimentales
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M aterialesy TécnicasExperimentales
55
1V.1.Materiales
A continuación,se indicantodoslos compuestos,
reactivos
y disolventes
empleadosen
estamemoria.Lasestructuras
moleculares
tantode lasaminasaromáticas
como de los
colorantesazoicos,se recogenen el capítuloXlV.
|V.1.1.AminasAromáticas
Lasaminasutilizadasfueronadquiridasa partirde variascasascomerciales
y mientras
no se especifiquelo contrario,todasfueronde calidadparaanálisis.
Aldrich:
sigma:
Fluka:
Merck:
2,4-Diaminoanisol,4-aminofeniléter,o-toluidina, 2-metoxi-5-metilanilina, 4,4'-tiodianilina, 4-cloro-2-metilanilina,
4-aminobifenilo v
o-aminoazotolueno.
2-Amino-4-nitrotolueno,
2,4,S-trimetilanilina,
y 3,3'-diclorobencidina.
2,4-Diaminotolueno,
bencidina,o-dianisidina
y o-tolidina.
4,4'-Diaminodifenilmetano,
4-cloroanilina,anilina, 2-aminobifenilo,
2-naftilamina,2-cloroanilina(parasíntesis)3-cloroanilina,m-toluidina
(parasíntesis),
y p-toluidina(parasíntesis).
CPSChemie
+ Seryice: 3,3'-Dimetil-4,4'-diaminodifenilmetano,
y 3,3'-dicloro.4,4diaminodifenilmetano.
Scharlau:
2-Naftilamina.
TCL
2-Amino-1-naftalenosulfonato
sódico.
|V.1.2.CqlorantesAzoicos
Colorantesinsolublesen medioacuoso:
Aldrich:
solvent Yellow 2, solvent Yellow 3, Disperseorange 25, Disperse
Red 13, DisperseRed 1, SolventYellow14, SolventRed 24 y Solvent
Orange7.
Colorantessolublesen medioacuoso:
Merck:
DirectRed28.
Cromogenia: Negro P.
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Aldrich:
Robama:
Basf:
Acid Blue 29, Acid Orange10, Acid Yellow 11, Acid Orange7, Acid
Red44, Acid RedB, DirectViolet51 y Acid Violet5.
D i r e c tB l u e3 5 ,A c i d B l a c k1 6 8y A c i dC r e e n11 4 .
Acid Orange61, Acid Violet56, Acid Black82, Acid Blue 193 yAcid
Brown 75 (BA).
Bayer:
Acid Brown83.
Sandoz:
Acid Red 114, NegroCarbóny Acid Brown75 (SA).
Colorantes
lndustriales: Acid Red 12By Acid Brown75 (S/).
y Disolventes
|V.1.3.Reactivos
Se adquirierona partir de variascasascomercialesy mientrasno se especifiquelo
contrario,todosfueronde calidadparaanálisis.
Ditionito sódico (Na2SrO*),dihidrogenofosfato
de sodio (NaH2pOa),
hidrogenofosfato
de sodio (Na2HPO4),
n-butanol,n-hexanoy cloroformo.
Romil:
Metanoly acetonitrilo,
de gradoHPLC.
Normasolv: Acido clorhídrico, ácido ortofosfórico,isopropanol,etanol y éter
d ietílico purificadomediantedestilación.
Panreac:
Acido sulfúrico,ácidocítricoy N,Ndimetilformamida.
Merck:
El aguafue destiladay pasadaa travésde un sistemaMili-Q de Millipore.
1V.2"TécnicasExperimentales
A continuaciónse describenlas técnicasexperimentales
y lascondicionesempleadas
en el desarrallo
de la investigación.
1v.2.1.cromatografía de Gasescon Detector de Espectrometríade
Masas(GC/MS)
La Cromatografía
de Cases(CC)es una técnicamediantela cual se puedeconseguirla
separaciónde mezclas muy complejas.Por otra parte, medianteel detector de
Espectrometría
de Masas(MS)se puedeidentificarde formacasiinequívocacualquier
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
M ateÍ ¡ales y Técn¡cas Experi me ntales
57
pura.Portanto,la asociación
sustancia
de lasdostécnicaspuedepermitirla separación
de mezclascomplejasÍ2431.
e identificación
de Masasse pueden detectarde diferentesformas los
Utilizando Espectrometría
compuestosque son separadospreviamenteen la columna cromatográfica.
Por un
lado,el espectrómetro
de masases capazde registrar
el totalde los ionesgenerados
en
la fuente de ionización.En este caso,el cromatograma
obtenidose denominaTIC
(Total lon Current),y se obtendríael espectrode masascorrespondientea cada pico
medianteel cual se podríaprocedera su identificación.
cromatrográfico
Por otra pafte,
si se quiere realizarla detecciónde los picos cromatográficos
de una maneramás
selectivay con mayor sensibilidad,se puede hacerque el espectrómetro
de masas
registrenada más que los ionesmás significativos
de cadacomponente,previamente
En estecaso,el cromatograma
seleccionados.
obtenidose denominaSIM (Se/ected
lon
Monitoring).Estaselecciónde ionespuedeprogramarse
en el tiempode formaque se
puede indicar el tiempo de cambio a partir del cual se registranlos iones
preseleccionados.
De estamanera,si dos o máscompuestos
de una mezclacoinciden
se puedendetectarindividualmente
en su tiempode retención,
siempreque los iones
para cada uno no coincidancon los del restode componentesde la
seleccionados
(de
mezcal ahí su selectividad).
Además,puestoque el númerode ionesregistrados
por
el MS es notablementeinferior a cuando se obtiene el cromatogramaTlC, la
en modoSIM aumentaconsíderablemente.
sensibilidad
En esta memoria,se ha utilizado un cromatógrafode gasesHedett Packard5890A
serie ll de columnascapilares,acopladoa un espectrómetro
de masasde impacto
electrónicoHP 5972A.
de análisis
fueronlassiguientes:
Lascondiciones
.
Columna:HP1 entrecruzada
de 60 m de longitud,0.25 mm de diámetrointernoy
de película.
0.25 pm de espesor
portador:
helio,
con una velocidad constantedurante todo el proceso
" Cas
cromatográficode 21 cm/s.
a
Temperaturade inyección:280 "C.
'1.2
a
Modo de inyección:sin divisiónde flujo, durante min.
a
Volumende inyección:1.4 ¡i.
a
Programade temperatura:
45 "C durante1 min, subir con una velocidadde 50
oClminhasta150 oC, mantenerdurante3 min, subira 10 oClminhasta255 oC,
mantener1 min, subira 1 "C/minhasta280 oCy mantener
5 min.
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.
Temperaturade la interfase:300 oC (alrededorde 170 oC en el Espectrómetrode
Masas).
Losparámetros
en modo SCAN(TlC)fueronlos siguientes:
a
a
a
a
Rangode masas:40-300uma.
Velocidadde barrido:2.6 barridos/s.
Umbralde detección:
400.
Tiempode retraso:
6.5 min.
Losparámetros
en modo SIM fueronlossiguiente:
a
a
a
Tiempode respuesta
de cadaion: 100ms.
N" de vecesque se monitorizan
losionesseleccionados:
2.8 ciclos/s.
Tiempode retraso:6.5 min.
Losparametros
del analizador,asícomo los del filtro de masasdel cuadrupolo,fueron
comprobadosmedianteel programaAutotune,el cual optimiza automáticamente
dichos parámetros utilizando perfluorotributilamina(PFTBA)como patrón de
calibración.
lV.2.2. Cromatografíade líquidos de Alta Resolucióncon Detector de
FotodiodosUV-Visible(HPIC/DAD)
La Cromatografía
de Líquidosde Alta Resolución(HPLC)es una técnicade separación
en la que, a diferenciade la Cromatografía
de Cases,se empleaun líquidocomo fase
móvil. La única,condiciónque han de cumplir las muestras
a estudiarmediante
Cromatografía
Líquida,es que seansolublesen un disolvente,cosaque se cumpleen
la mayoríade los casos.Estohaceque la HPLCpuedacomplementar
lascarenciasque
presentala CC frentea muestrasno volátileso termolábiles,
pero fácilmentesolubles
[2441.
Por otro lado, el Detectorde Fotodiodos(DAD) permitemedir la absorbancia
de los
compuestospreviamenteseparados
a la longitudde onda que se desee,dentro del
rango del espetroultravioleta-visible.
Además,ofrece la posibilidadde realizarun
estudiocomparativoentrecromatogramas
registrados
a distintaslongitudes
de onda.
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M aterialesv TécnicasExperimentales
59
Enestamemoria/se ha utilizadoun cromatógrafo
de líquidosWatersequipadocon una
600E,
de
bomba modelo
capaz efectuardiferentesgradientesde elución,y con un
detectorde fotodiodosUV-V|siblemodelo996.
Lascondiciones
de análisis
fueronlassiguientes:
a
a
a
Columna:Nucleosil120 C18,5pm,25 x 0.46cm.
Volumende inyección:20¡i.
Eluyente:diferentesmezclas de tampón fosfato (NaHrPO*/NarHPOo
30 ffiM,
pH:7), metanoly acetonitrilo.
Flujo: 1ml/min (2000psi).
Parala discusiónde los resultados
obtenidosmedianteestatécnica,en ocasionesse
parámetros
tales como el factor de capacidadpara un
hace necesarioel uso de
(k'),
o
factor
de
selectividad
el
entre paresde componentesque eluyen
componente
juntos y/o contiguos(a). Así, el factor de capacidadde un pico cromatográficose
definecomo:
k, =(tR- t)/to
y fo es el tiempo muerto
Dondef* es el tiempo al que saleun compuestodeterminado
como el tiempoal que eluyeel uracilo12441)
del sistema(establecido
El factorde selectividad
entredoscomponentes
se definecomo:
a=k,/krz
Donde H, y k, son los factoresde capacidadde dos componentescontiguos.
Capilarcon DetecciónUV-Visible(CE/UV)
1V.2.3.Electroforesis
o moléculascargadasen un
Porelectroforesis,
se entiendeel movimientode partículas
medio líquido conductor, normalmenteacuoso,bajo la influenciade un campo
Capilar(CE),se utilizancapilaresde sílicefundidaa través
eléctrico.En la Electroforesis
de losiones[245].
de loscualestienelugarla migración
CapilarWatersmodelo
En estetrábajo,se ha utilizadoun sistemade Electroforesis
4000,equipadocon un detectorUV-Visiblede ondafija (UV).
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Lascondiciones
de análisís
fueronlassiguientes:
Electrolito:tampónfosfato(H3PO450 m/WNaOH40 mM en agua/metanol10/1 p e s o -p; H : 3 . 1 ) "
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
Capilar:sílicefundida,75 pm x 60 cm.
Fuentede alimentación:positiva.
Potencialde análisis:20 kilovoltios.
lntensidadde corriente:50 nanoamperios.
Modo de inyección:hidrostático.
Tiempode inyección:30 segundos.
Temperatura:25 "C.
Constante
de tiempo:0.3segundos.
Tiempode purga automática:2 min.
Longitudde onda de detección:254nm.
[V.2.4.Cromatografíade CapaFina(TLC)
La Cromatografía
de CapaFina(TLC)constituyeuna variedadde cromatografía
plana.
Fundamentalmente
se usacomo técnicacualitativa,aunqueen ocasionesse llevana
cabo también la determinaciónde los compuestosseparados,normalmentepor
métodoscolorimétricos.
En estamemoria,la TLCse ha empleadoparaestimarel grado
de purezade ciertoscolorantes.
Se han utilizadocromatoplacas
de sílicagel 60 F2s4
con un espesorde 0.25 cm y
dimensiones5 x 10 cm (Merck).Lasmezclaseluyentesse han preparadoa partirde
isopropanol,
agua,cloroformo,n-butanoly etanol.
(TG)
1V.2.5.Termogravimetría
(TC)permíteestudiarla evoluciónde la masade una muestraque
LaTermogravimetría
es sometidaa un programade temperaturas.
De estemodo,medianteestatécnicase ha
determinadola riquezade algunosde loscolorantes
estudiados.
En esta investigación,se ha hecho uso de un sistemaMettler equipado con una
termobalanza
modeloTG50, una microbalanza
modeloM3 y un procesador
TC10A.
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M ateriales v Técni cas Expe
r imentales
61
La termobalanzaTG50 permitetrabajaren un rango de temperaturas
comprendido
entretemperturaambientey 1000 oC,con una precisiónde la temperatura
del horno
de + 0.2 "C. Esposibletrabajartantoen condiciones
dinámicas
como en isotérmicas.
En experimentosdinámicos,la velocidad de calentamientoy de enfriamiento
controladopuedevariarentre0 y'100 "C/min.En un enfriamiento
incontrolado,
el
oC
sistemaes capazde enfriardesde1000 hasta100 "C en B min haciendousode un
ventilador.Además,el sistemadisponede una conexiónparagasde purga,asícomo
unaválvulaque permiteel cambioprogramado
del mismo.
Mediantela microbalanza
M3, se determinala masade la muestraduranteel ensayo.
pesada
Permiteuna
máximade 150 mg, siendola precisiónde la medidade I 1pg.
Presentala posibilidadde un tarado mecánicode 2900 mg, de 100 en 100 mg.
Además,tiene íncorporada
una pesade calibraciónde 100 mg. Se han empleado
crisoles
de AlrO, con un volumende 70 pl.
El control de programade temperatura,
así como del gasa emplearcomo purga,se
realizadesdeel procesador
TC10A.Esteprocesador
adquierey guardalos datosde la
curva,analizándolos segúnd iferentes
procedi mientosde evaluación.
Lascondicionesde análisisfueronlassiguientes:
a
a
a
a
a
Rangode temperaturas:
de 30 a 600 oC.
Velocidadde calentamiento:10 "C/min.
Atmósferaen que se realizael análisis:aire.
Fluio de aire: 2O0ml/min.
Cantidadde muestraanalizada:entre7 y 10 mg.
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V. Condicionesde AnálisisCromatográfico
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Condicionesde AnálisisCromato
V.1. Introducción
En el presentecapítulose han estudiadolas condicionescromatográficas
necesarias
para llevar a cabo el análisis,tanto cualitativocomo cuantitativo,de las veinte
a r i l a m i n apsr o h i b i d a isn d i c a d aesn l a T a b l a1 . 1 .S e i n c l u y ea d e m á sl a a n i l i n ap o r s e r
éstauna aminabastantehabitualen la composiciónde los colorantesazoicos.Con el
fin de estudiarlas posiblesinterferencias
a que puedandar lugar la presenciade
isómeros,
compuestos:
1-naftilamina,2-aminose han tenidoen cuentalos siguientes
p-toluidina,
y
2-cloroanilina 3-cloroanilina.Este capítulo
bifenílo, m-toluidina,
la
lV
de
la
metodología
correspondería
a
etapa
a establecer
en la presentememoria
( F i g u r 1a . 1 ) .
recogidaen el capítulo11.4,
lastécnicasanalíticas
Como se desprendede la bibliografía
más extendidasen la deteccióny determinaciónde las aminasaromáticasson las
ya seaCromatografía
de Capa Fina,Cromatografíade Cases
técnicascromatográficas,
con detector de Captura Electrónicao acoplada a Espectrometría
de Masas, o
con detector UV-Visibleo
Cromatografía
Líquidade Alta Resolucióngeneralmente
Electroquímico.
En principioel análisiscualitativoes factiblepor cualquierade las
de Cases/Espectrometría
técnicasmencionadas,
aunquesin duda la Cromatografía
de
Masases la que ofrece mayoresposibilidadesdebido a la gran selectividadque
presentaeste detector en la identificaciónde los compuestosya separados.Sin
embargo, para la determinacióncuantitativade las arilaminas,la Cromatografíade
con detectorUV-Visiblees la técnicamásfrecuentemente
Líquidosde Alta Resolución
empleada.
Teniendo en cuenta esto, el trabajo se centró en las dos técnicasde separación
de Masas,con la
siguientes:f,romatografíade Casescon detectorde Espectrometría
que se abordóel estudiodesdeel punto de vistacualitativo,y Cromatografía
Líquida
de Alta Resolucióncon detectorde FotodiodosUV-Visible,parael análisiscuantitativo
de lasarilamínas.
V.2. Resultadosy Discusión
de Masas
de Espectrometría
V.2.1. Cromatogratíade GasesiDetector
Como ya se comentó en el capítulo lV al tratar la técnica que ahora nos ocupa, el
espectrómetrode masaspermite identificarcasí inequívocamentecualquier compuesto
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orgánicoen basea su espectrode masastomadoen modo TlC, es decir, registrando
todos los iones que genera.Sin embargo,una vez conocido el compuestoo
compuestosque se encuentranpresentes
en una muestra,el registrode la mismaen
modo SlM, o sea/ seleccionandounos iones en concreto, permite aumentar
considerablemente
la sensibilidad
de la técnicaen la detección
de dichoscompuestos,
y por tanto mejorarel límite de detecciónde los mismos.En estesentido,se intentó
trabajarsobre la puestaa punto de las condicionesmás adecuadasde registrodel
cromatograma
en modo SlM, que permitieraidentificarcada una de las aminasde
formaselectiva
y con la mayorsensibilidad
posible.
Asimismo,se estimaronpara las veintearilaminasprohibidasjunto con la anilina,
valoresde cantidadmínimadetectable
y factorde respuesta
paracadaunade ellas.
En el apartado|V.2.1 se indican la instrumentación,
condicionesde análisisy
parámetros
de registro,tanto en modo TIC como SlM, empleadosen el desarrollode
esteestudio.
V.2.1.1. ldentificaciónde las Arilaminas
En la Tabla V.1 se muestranlos tiempos de retencióncorrespondientes
a cada
arilamina.Se puedever que la 4-clorv2-metilanilina
y la 2,4,S-trimetilanilina
eluyen
ambasa 10.18min, y que la 4,4'-metilenbis(2-cloroanilina),
la 3,3'-diclorobencidina
y
la o-dianisidina
prácticamente
(25.1O
eluyen
al mismotiempo
25.21min). Por otra
parte,otrasarilaminaspresentan
tiemposde retenciónmáso menospróximoscomo es
el casode la 4-aminofeniléter,
la bencidinay la 4,4'-diaminodifenilmetano.
Debido a
esto,se establecieron
tres métodosde trabajoen modo SIM seleccionando
los iones
máscaracterísticos
de cadaarilamina,asícomo el tiempode cambioa partirdel cual el
espectrómetrode masasdetectadichos iones.Así, segúnel método empleado es
posible detectarselectivamentela posible presenciao ausenciade los siguientes
compuestos:
o Método 1: 2-metoxi-5-metilanilina,
4-aminofeniléter,4,4'-diaminodifenilmetano,
3,3'-dimetil-4,4'4iaminodifenilmetano,4,4'-liodianilina,
y 4,4'-merilenbis(2-cloroanilina).
. Método 2: 4-cloro-2-metilanilina,
bencidina, o-aminoazotolueno,o-tolidina,
o-dianisidina.
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Condicionesde AnálisisCromatos,ráfico
67
o Método3: 2,4,S-trimetilanilina,
bencidina, o-aminoazotolueno,
o-tolidina, y
3,3'-diclorobencidina.
El restode compuestos
sedetectancon cualquierade lostresmétodos.
y tiemposde cambio paracada
TablaV.l" Tiemposde retención,ionesseleccionados
arilamina,
en modoSlM.
Tiempo de Cambio
(min)
fiempo de
Compuesto
Retención
lones
Seleccionados
Método
(min)
(m/z)
123
Anilina
7.O9
6.70
6.70
6.70
93-92-66
o-Toluidina
7.85
7.40
7.40
7.40
106-107-77
4-Cloroanilina
9.O4
8.20
8.20
8.20
127-129-65
lina
2-Metoxi-5-metilani
9.85
4-Cloro-2-metilani
lina
10.18
9.40
-
2,4,5-Trimetilanilina
10.18
214-Diaminotolueno
11 . 1 0
10.s0 10.50 10.50
122-121-94
2,4-Diaminoanisol
12.18
11.5011.50 11.50
123-138-95
2-Naftilamina
13.38
13.00 13.00 13.00
143-115-116
2-Amino-4-nitrotolueno
13.76
13.6013.60 13.60
152-106-77
122-137-194
9.50
141-106-140
9.50
135-120-134
4-Aminobifenilo
15-71
14.70 14.74 14.70
169-168-170
4-Aminofeniléter
19.s2
200-108-171
Bencidina
19.69
16.50
19.00 19.00
4r4LDiaminodifeni
Imetano
19.79
198-197-106
o-Aminoazotolueno
2'1.86
19.74
21.10 21.10
226-225-211
216-215-184
3,3'-Dimetil-4,4'diaminodifenilmetano 22.O4
o-Tolidina
22.52
21.50
22.10 22.10
4,4'-Tiodianilina
23.17
22.60
lina)
4,4'-Metilenbis(2-cloroani
2s.10
24.00
3,3'-Diclorobencidina
25.16
o-Dianisidina
25.21
1B4-185-92
106-225-134
212-213-106
231-266-195
24.OO
24.OO 252-253-254
244-201-186
Friedrichsy col. l2}9l, empleantambién la técnicaCCTMSpara separarel mismo
muy
conjuntode arilaminas,a excepciónde la anilina,obteniendoun cromatograma
entre compuestos.Por
semejanteen cuantoa tiemposde retencióny coincidencias
y col. 11701,llevan
de anilina,2,4-diaminotoa cabo la separación
otro lado,Skarping
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lueno,2,4-diaminoanisol,
2-naftlamina,
4-aminobifenilo,
bencidina,4,4'-diaminodifenilmetano,o{olidina, 4,4'-metilenbis(2-cloroanilina)
y o-dianisidina,
tras formar las
perfluoroalquilamidas
correspondientes
con anhidrido pentafluoropropiónico
o
heptafluorobutírico,
y haciendousoun detectorde capturaelectrónica(ECD).
(TlC)correspondiente
En la FiguraV.1 se muestrael cromatograma
a una mezclade las
junto
diez arilaminas
indicadas
en la TablaV.2
con el tiempode retención
de cadauna
y la concentración
en la que se encuentranpresentes.
En el cromatograma
se aprecia,
ademásde los picoscorrespondientes
a las arilaminas,
la apariciónde otros picos
debidoa la existencia
de impurezas.
Abundancia
25-13
1 ()00000
aooooo
600000
400000
200000
24'oo
FiguraV.l.
Tiempo
Cromatograma(TIC)obtenidocon CC|MSde Ia mezclade arilaminasindicadaen
la TablaV.2.
En la FiguraV.2 se muestranlos cromatogramas
correspondientes
a dicha mezclapero
(TablaV.1). En
tomadosen modo SlM, segúnlos tresmétodosindicadosanteriormente
la FiguraV.2.A (cromatograma
tomadosegúncondicionesdel método 1), se observa
que no apareceel pico a 10.18min correspondiente
a \a2,4,5-trimetilanilina
y a la
4-cloro-2-metilanilina
ni el pico a 19.69min correspondiente
y
a la bencidina, sí que
se detectaun pequeñopico a 22.50 min que correspondería
a la o-tolidina.Sin
embargo, en éste método no están seleccionadoslos iones de la o-tolidina; la
explicaciónes que en el espectrode estaamina(mostrado
en la página 271),se aprecia
la existencia
del ion a mlz 211, seleccionado
parala 3,3'-dimetil-4,4'diaminodifenilmetano,por lo que se detectaríala o{olidina a pesarde no estarseleccionada
en el
método 1. A 25.1'l min se observala presenciade un pico que correspondería
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Condiciones de Anál isis Cromatosráfico
69
únicamente
a la 4, '-metilenbis(2-cloroanilina),
en funciónde susionesseleccionados
(Figura
V.3.A).
TablaV.2" Listade compuestos
correspondientes
al cromatograma
de la FiguraV.l .
Compuesto
Tiempo de Retención
(min)
Concentración
o-Toluidina
7.86
11.36
4-Cloroanilina
9.06
9.05
10.18
19.75
10.18
20.98
2-Nattilamina
13.39
29.65
Bencidina
19.69
49.63
o-Tolidina
22.s1
49.80
4,4LMetilenbis(2-cloroan
il ina)
25.13
68.30
3r3'-Diclorobencidina
25.13
69.50
o-Dianisidina
25.13
69.60
4-Cloro-2-meti
laniIina
-T
2,4,5 rimetilani Ii na
En la FiguraY.2.B(cromatograma
tomadosegúncondicionesdel método2) se detecta
la presencia
de bencidinaa 19.67min, y el pico a 10.'lBmin correspondiente
a la
(FiguraV.4.A).lgualmente
4-cloro-2-metilanilina
en funciónde susionesseleccionados
se detectala presencia
de o-dianisidina
a 25.15min. en virtudde sus iones(Figura
v.3.8).
Por último, en la FiguraY.2.C(cromatograma
tomadosegúnmétodo3) se puedever
que cualitativamente
se detectanlos mismospicos que en el cromatogramade la
y la 4-cloro-2-metilanilina
FiguraV.2'.8,ya que la 2,4,5-trimetilanilina
coinciden en
y la
cpincidecon la 4,4'-metilenbis(2-cloroanilina)
tiempo y la 3,3'-diclorobencidina
relativasde cada pico no
Sin embargo,se apreciaque las abundancias
o-dianisidina.
cadacompuestotendráunacapacidadde respuesta
son las mismasya que lógicamente
Así, en estecasoel pico a 10.'15min,
distintaen función de su factorde respuesta.
y el pico a
a la 2,4,S-trimetilanilina,
segúnsus iones (FiguraV.4.8), correspondería
en funciónde susiones(Figura
V.3.C).
25.12min a la 3,3'-diclorobencidina,
aceptableentre las parejas
Skarpingy col. l17}l, con ECD,consiguenun separación
y 4,4'-metilenbis(2-cloroanilina)/o-dianisidina,
bencidina/4,4'-diaminodifenilmetano
previa derivatizaciónde las arilaminasformando las correspondientes
amidas con
ico o heptafluorobutírico.
anhidridopentafluoropropión
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Abundancia
25.11
1 éOOOO
a < oooo
60000
20000
o
Tiempo
7.86
Tiempo
Abundancia
25.12
250000
200000
450000
100000
soooo
Tiempo
Figura V.2. Cromatograma (SIM) obtenido con CC\MS de Ia mezcla de arilaminas indicada en
la Tabla V.2, (A) según método t, (B) según método 2 V G) según método 3.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Condiciones de Análisis Cromatográfico
Abundancia
'14000
'12000
10ü00
8000
É000
4000
2000
0
Abundancia
5500
4500
3500
2500
1500
500
0
Abundancia
'19ú00
16000
13000
10000
7000
4000
1000
FiguraV.S. Espectrosde los iones se/eccionadosen modo SIM para las arilaminas(A)
(B) o-dianisidinay (C) 3,3'4iclorobencidina.
4,4'-metilenbis(2-cloroanilina),
se puede decir que, en las condicionesde trabajo
A la vista de los cromatogramas
es mayor que la del 4-cloro-2indicadas,la respuestade la 2,4,S-trimetilanilina
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72
Capítulo V
puestoque a concentraciones
metilanilina,
similares
la abundancia
es muchomayoren
la primera.Asímismo,la respuesta
parala o-dianisidina
seríamenorque la respuesta
de
-metil
la 4,4'
enbis(2-cloroan
i Ii na)y que la del 3,3'-diclorobencid
i na.
25000
'15000
s000
0
Abundancia
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
Figura V.4. Espectrosde los iones se/eccionadosen modo SIM para las arilaminas(A) 4-cloro2-metilaniIi na y (B) 2,4,s-tri metiI anilina.
Esto indicaríaque la capacidadde detectartrazasde dichas arilaminasestaríaen
funciónde la concentración
a la que se encuentre
cadaunade ellasen la disolución
final,del factorde respuesta
de las mismasy de la cantidadde muestrainyectada.Así,
se puede observarque la respuesta
de la bencidinaes mucho menorque la de la
o-toluidina,inclusosiendola concentración
de la bencidinadel ordende cinco veces
mayorque la concentración
de la o-toluidina.
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Condicionesde Análisis
V.2.1.2. Límite de Detección y Factoresde Respuesta
Con el fin de estimarla cantidadmínimadetectablede cada arilamina,así como su
sensibilidad y rango de linealidad, se han realízado los cromatogramas
correspondientes
a disoluciones
cadavez másdiluidasde las mismas.En la FiguraV.5
se representael área de pico de cada una de ellas frente a la cantidad de muestra
inyectada.
En la FiguraV.s.A. se puedever que la o-aminoazotolueno
es lineal hasta5.6 ng, la
2-naftilamina
presentalinealidadhasta7 ng, la 4,4'4iaminodifenilmetano
hasta10 ng,
y la 4-aminofeniléter
hasta14 ng. En la FiguraV.5.C.se apreciaque la 4-aminobifenilo
presentalinealidadhasta8,8 ng, y la 3,3'diclorobencidinahasta8,2 ng. El restode
presentalinealidaden todo el rangode cantidadde muestraestudiado.
componentes
En la TablaV.3 se indica la cantidadmínimadetectabley el factorde respuesta
para
cada una de las arilaminasestudiadas.
La cantidadmínimadetectablese ha estimado
experimentalmente
de formaque la señalobtenidaparacadapico fuesesuperiora tres
vecesel ruidode fondo.
Lógicamente,
se puedever que los compuestos
con tiemposde retenciónmás bajos
presentanvaloresmás pequeñosde cantidadmínima detectable,ya que los picos
cromatográficos
son másagudos.Porotra partese puededecir que, por lo general,las
arilaminasque tienenen su estructura
dos gruposaminopresentan
valoresmayores,ya
que los picosson másanchos,posiblemente
debido a efectosde adsorciónde dichos
por
compuestos la faseestacionaria
de la columna.
Losfactoresde respuesta
se expresancomo cantidadde muestrapor unidad de área.
Paraaquelloscompuestos
que presentan
una linealidadlimitadaen el rangoestudiado,
se ha tenido.encuentasólo el rangolineal.Dichosvaloresindicanque, en general,las
arilaminasque poseenen su estructura
dos gruposaminoson lasque presentanmayor
factorde respuesta,
y por tantomenorsensibilidad.
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Capítulo V
90
100
u,
6
16
-q
ít
'tr
80
i:
-=
.o
T2
ñ
5
t
L
854
Eoo
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X
Jtt
-lE
3
3
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€18
q.
f
-r't---
----'F
----"----
36912
Canüdad
deMuesra(nd
Cantidadde Muesfa (nB
't50
m
6
a
rú
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o
q)
ro
rú
56
42
28
x
r!
l!
=
3
c.
f
o
-S rzo
E 14
Ee0
E
rlt
3
C
Joo
3
x
rll
930
FiguraV.S. Areade pico de cada unade las arilaminasindicadasen /a Tabla V.l, frentea Ia
cantidadde muesÚainYectada.
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Condicionesde AnálisisCrcmatográfico
Tabla V.3.
75
Cantidadesmínimas detectablesy factoresde respuestaobtenidas con CCIMS,
para cadauna de las arilaminas.
CantidadMínima
Facfor de
Compuesto
Detecfable
Respuesfa
o-Toluidina
0 . 11 6
0.03873104
4-Cloroanilina
o.177
0.0753910'4
2-Metoxi-5-meti
laniIina
0.285
0.06925104
4-Cloro-2-meti
lanilina
o.346
0.06584104
2,4,5-Trimetilanilina
o.367
0.06866104
2,4-Diaminotolueno
3.482
1.165 104
2r4-Diaminoanisol
6.734
1.426
2-Naftilamina
o.667
0.2072 10-4
2-Amino.4-nitrotolueno
0.963
o.1760 10-4
4-Aminobifenilo
0.698
0J740 104
4-Aminofeniléter
1.535
0.8896 10-4
Bencidina
3.545
0.4342 10-4
4r4'-Diaminodifenilmetano
3.468
0.5224 104
o-Aminoazotolueno
o.707
0.1462 104
3,3'-Dimetil-4,4'-diaminodifenilmetano
2.346
0.8222 104
o-Tolidina
3.217
0.6139 10-4
4,4'-Tiodianilina
2.676
0.9916 104
4,4'-Metilenbis(2-cloranilina)
1.345
0.2078 104
313'-Diclorobencidina
1.368
0.1639 10-4
o-Dianisidina
2.820
0.9571 10-4
104
V.2.1.3. Estudiode lnterferenc¡asDebidas a lsómeros
Entrelasposiblesintederencias
se ha estudiadocómo puedeinfluir,en la identificación
prohibidas,
de lasveintearilaminas
la presencia
de los isómeros'l-naftilamina,2-aminobifeni lo, 2-cloroan
i Ii na, 3-cloroani
Iina,m-toluidinay p-toluidina.
(13.19min) y la 2-naftilamina
En la FiguraV.6.A se puedever que la l-naftilamina
(13.37min) se diferencianperfectamente.
(15.70min) y la 2-amino.
La 4-aminobifenilo
bifenilo(13.87min) tambiénse resuelven;
sin embargoéstaúltimasalepróximaa la
(13.76min) pero susespectros
2-amino-4-nitrotolueno
de masasson diferentes,con lo
que no habríaningúnproblemaen su identificación.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
/b
.-^ítulo
Abundancia
V
t3.87
400000
300000
20000()
100000
o
Tiempo
7.86
Tiempo
Abundancia
17.24
21.42
25c,ct('C)
200000
r 500clc¡
26.51 26.76
1 00000
21.76
22.12
Tiempo
FiguraV.6. Cromatograma(SIM) obtenido con CC|MS de las ar¡lam¡nas(A) l-naftilamina,
2-naftilamina, 2-amino4-nitrotolueno y 4-aminobifenilo, (B) 2-cloroanilina,
3-cloroanilina,4-cloroanilina,o-toluidina, m-toluidina y p-toluidina y (C) las
mismasgue en B perocon diferentescondicionescromatográficas.
En la bibliografía,se han encontradotrabajosdonde se separanlos isómeros1-naftilaminay la 2-naftilamina
estandoambospresentes
en la mismamuestra,trasformarlos
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Condiciones de Anál isis Cromatográfico
derivados siguientes:las PFP o HFB correspond¡entes
empleando un EcD
o n F I D[ 1 8 3 ] ,y l a sN P M ,h a c i e n d ou s od e u n F I D
[ 1 7 4 , 1 7 6 , 1 8 5l ]a, sP F o u t i l i z a n d u
También
se han separadosin derivatización
previa,empleandoun detectorde
[145].
MS [200,209]o un FID [1571.Encuantoa la 2-aminobifenilo
y la 4-aminobifenilo,
se
describenseparaciones
trasformarlos derivadossiguientes:
PFPo HFB utilizandoun
ECD[175,176,179]y
derivados
trasreacción
con PFPIempleando
un detectorde MS o
un FID [159,185].Asimismo,se han separado
sin derivatizar
haciendouso de un FID
t1sel.
En la FiguraV.6.B se muestrael cromatograma
correspondiente
a la o-toluidina,
m-toluidina
y p-toluidina
que eluyentodasellasa7.86 min, la 2-cloroanilina
que eluye
junto
a 8.40 min, y la 3-cloroanilina,
que
con la 4<loroanilina,
eluyea 9.05 min. Se
que
observa
la 2-cloroanilina
se separaperfectamente
bien de lasotras;sin embargo,el
restode las aminascoincidenentre si en el tiempo de retención,por lo que sería
prácticamente
imposibledistinguirlas
en lascondicionescromatográficas
en las que se
hanestudiado.
En la FiguraV.6.Cse muestrael cromatograma
correspondiente
a las mismasaminasde
la FiguraV.6.8, peroutilizandoun gradiente
de temperatura
diferenteal mencionado
anteriormente.
En estecasose puedever que la 2-cloroanilina
(21.42 min) se sigue
separando
bien del restode componentes,
que la 3-cloroanilina
(26.5'lmin)y
mientras
(26.76
Ia 4-cloroanilina
min) se puedendiferenciar.
Paralos isómeros
de la toluidina,
(
1
7
.
2
4
q
u
e
s ea p r e c i a
la o-toluidina
m i n )y l a m - t o l u i d i n a ( 1 7 . m
7 7i n )s e s e p a r a b
nien,
y ademássus tiemposde retencióncoincidenprácticamente
con los tiemposque
presentan
cuandose inyectanpor separado,
17.25min y 17.8Omin, respectivamente.
En lo que respectaa la p-toluidina,
cuandose encuentraen presenciade los otros
isómeros
eluyea 17.39min;sinembargocuandoseinyectasolaeluyea 12.5'lmin.
Por otro lado,al inyectarseparadamente
los isómerosde la toluidinase comprobóque
l a r e l a c i ó ne n t r el a sa b u n d a n c i adse l i o n M * - 1 ( 1 0 6 )y d e l i o n m o l e c u l aM
r * (1OZ)
presentaban
valoresdiferentes
segúnel isómero.
Así,el valormediode dicharelación,
junto con el intervalode confianzaal 99"1o,
resultaser de 1.334t 0.011 para la ot o l u i d i n a ,1 . 0 6 6t 0 . 0 2 4 p a r a l a m - t o l u i d i nya 1 . 5 1 1+ 0 . 0 1 5 p a r a l a p - t o l u i d i n a ,
estimadosobre un número de diez determinaciones.
Valoressimilareshan sido
indicadospor Scholzy col. en un estudioparalelot1631.
E n l a F i g u r a Y . Ts e m u e s t r a
c ó m ov a r i al a r e l a c i ó ne n t r ee l i o n M * - 1 ( 1 0 6 )y e l i o n
(1OZ)
molecularM*
con respecto
al tiempo,parael casoen que se encuentren
los tres
juntos(circulos
(cuadrados
isómeros
rellenos),
sólo la o-toluidina
rojos),sólo la p-tolui-
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Capítulo v
78
amarillos).
Asimismose ha
dina (círculosazules)y sólo la m-toluidina(triángulos
reproducido,a partirde la abundanciadel ion M*-1 (106),los picoscromatográficos
correspondientes
a la o-toluidina,la p-toluidinay la m-toluidinacuandose inyectanpor
separado.
1.70
13,00
o-Toluidina
1. 5 8
10,40
\D
e
t\
€
F
7.80
1,42
o
o
\o
e
F
tr
o
E
s
E
ct
U
r m-Toluidina
1. 2 8
c,
5 . 2 0 Eñ
-o
2.60
1,14
1.00
0.00
1/.30
17,50
17.70
17,99
Tiempo(minutosl
FiguraV.T. Variaciónde la relación entre el ion M+-1 (106) y el ion molecularM+ (107)
obtenidacon CCIMS,para la o-toluidina, p-toluidinay m-toluidina.
Se puede ver que la relaciónentre los ionescoincidebastantebien en el casode la
o-toluidina,ya sea cuando estásola o en presenciade los otros isómeros.Para la
entredichosvalores.Sin embargo,
m-toluidinatambiénhay una buenaconcordancia
que
los valoresde la relaciónentre los iones son
para la ptoluidina, se observa
ligeramenteinferiorescuando estáen presenciade los otros isómeros(1.441 como
sola(1.511como valor medio),observándose
valor medio)que cuandose encuentra
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Condiciones de Análisis Cromatoeráfico
79
ademásun ligerodesplazamiento
de dichosvaloreshaciatiemposmenorescuandose
encuentraen presenciade la otoluidina y la m-toluidina.Estoindicaríala posible
con la o-toluidina,
lo que justificaría
de una interaccion
de la p-toluidina
existencia
el
observado
en el tiempode retenciónde la ptoluidinacuandoestáen
desplazamiento
presenciade los otros isómerossobretodode la o+oluidina.Por otra parte,estudiar
cómo varíala relaciónentredichosionespodríaserun criterioparacomprobarsi la otoluidinase encuentrasolao en presenciade los otrosisómeros,sobretodoen el caso
presente
la p-toluidina.
en que seencuentre
trabajosdonde se separanlos tres isómerosde la
En la bibliografía,
se encuentran
lasTFA PFPo HFB utilizandouno
cloroanilinatrasformarlos derivadossiguientes:
y
ECD [173], las PFPempleandoMS [166] lasCA o DCA con ECD[173]Tambiénse
han separadosin derivatizaciónprevia,empleandodiversosdetectores:FID o NPD
de los isómeros
[158],TCD [169]o MS [167].Enotros,se llevaa cabola determinación
previa,formando:las PFPutilizandoun ECD Í1791,
de la toluidinatrasderivatización
N-permetilados
losderivados
bromados
con ECD[186],losderivados
con FID 11451,
o
bien los derivadostrasreaccióncon PFPIhaciendouso de un detectorde MS o uno
FID [185].No obstante,en todosestostrabajosse llevaa cabo la separación
específica
de derivadosde anilina sin el problemaañadidoque suponela presenciade la
bencidinay sus derivadosen la misma muestra.Por contra,Scholzy col. [163]
determinanmedianteCC/MS un conjuntode anilinasy bencidinassustituidas
sin
previa,empleandodistintostipos de faseestacionaria
líquidabien se
derivatización
(Carbowax
(DB-5,0.33
pm)
las
anilinas
20-M-AM,
0.25
o
bien
las
bencidinas
estudien
presentes
pm). Entrelas primeras,
los isómeros
se encuentran
de la toluidinay de la
satisfactoria
de todosellos.
cloroanilina,obteniendouna separación
V.2.2. Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución/Detectorde
FotodiodosUV-Visible
El establecimiento
de lascondiciones
cromatográficas
en HPLC/DAD,suponela puesta
a punto de las condicionesde elución en cuantoa la composiciónde la mezcla
en la composiciónde la
eluyentese refiere,asícomo el uso de un posiblegradiente
misma.Por tanto,en estecasoel estudiose encaminóa la optimizaciónde uno o
varios programasde elución que permitieransepararsatisfactoriamente
las veinte
que
posible
prohibidas,
de forma
fuera
su determinación
mediantelas
arilaminas
de calibradocorresoondientes.
ecuaciones
lasposiblesinterferencias
Al igualque en la técnicaanterior,se estudiaron
debidasa la
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a n i l i n ay a l o s i s ó m e r o1s - n a f t i l a m i n2a- ,a m i n o b i f e n i lm
o t, o l u i d i n ap, t o l u i d i n a , 2 - c l o roaniIinay 3-cloroan
i Iina.
En el apartado|Y.2.2de estamemoria,se indicantantola instrumentación
como las
condiciones
de análisis
empleadas
en el estudio.
V.2.2.1. EnsayosPreliminares
Una serie de ensayospreliminares,
realizadoscon el HPLC/DAD,pusieronde
manifiestoque algunasde lasaminasproporcionaban
picoscon muchacola.Así, para
la bencidinay la o-tolidinase encontraronfactoresde asimetríade 3.5 y 3.9
respectivamente.
Estosvalorespuedenocasionarerroresa la hora de integrardichos
por lo que se decidió mantenerun pH :7 ufilizandoun tampónfosfato
componentes,
NaH2POa/Na2HPOo
en una concentración
30 mM cada uno. En estascondicionesse
que
comprobó
lasaminaspresentaban
factoresde asimetría
comprendidos
entre 1.11 y
1.49,que ya sonvaloresmásaceptables
parala integración
de los picos.
Por otra parte,el usodel tampónfosfatopuededar lugara problemasde precipitación
en funciónde la composición
del eluyente,pudiéndose
producirobstrucciones
en el
sistemacromatográfico,por lo que en primer lugar se prepararonmezclas de
metanol/tampón
y acetonitrilo/tampón
para ver a part¡rde qué composiciónde fase
orgánicase observaba
apariciónde precipitado.
Enfunciónde los resultados
obtenidos
se estableció
como nivel máximode faseorgánicaun B0%de metanolparael eluyente
metanol/tampón
y un 60% de acetonitriloparael eluyenteacetonitrilo/tampón.
Paraseleccionarla longitudde onda media,se realizaroncromatogramas
de cadauno
de los componentes
por separado,
y se recogióel espectrode cadauno de ellosen la
regióncomprendidaentre200 nm y 400 nm. En virtud de los espectros
obtenidos,se
puededecirque la máximaabsorción
se presenta
en la zonade 210 nm; sin embargo
estazona es muy críticaya que puedehaberalgún problemacon la línea baseasí
como bastantesinterferencias.
Por otra parte,se ha encontradoque 2BB nm es la
longitudde onda más extremaen la que todos los componentes
presentanuna
absorciónsuficientepara su análisis.No obstante,en casosparticularespodría ser
interesante
teneren cuentaotraslongitudesde onda,como es el casode los derivados
de anilina,que en generalpresentan
mayorabsorbancia
a 24Onm, lo que en ciertos
casospuedepermitiraumentar
el límitede detección,
siemprey cuandono interfieran
otrassustancias.
Loscomponentes
2-naftilamina,
2-amino-4-nitrotolueno,
y la o-aminopresentan
azotolueno
absorbancia
a 360 nm sin que losotroscomponentes
absorban
a
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CgltqlgS:j
e A nat¡s¡s Cro^ atol,
dicha longitudde onda, lo que podríaser una formaselectivaparadetectarlos
si se
produjese
algunainterferencia
a 2BBnm.
Por último se constatóque ciertasaminastalescomo: 4-aminobifenilo,
3,3'-dicloroy
bencidina o-aminoazotolueno,
presentaban
tiemposde retenciónmuy altos(mayores
de 60 min en algunoscasos)cuando se trabajabaen condicionesisocráticascon
composiciones
de eluyentesque permitieranuna separación
aceptabledel restode las
aminas. Así, para el establecimientode las condiciones cromatográficasse
seleccionaron
inicialmente
sieteaminas:2,4-diaminotolueno,
bencidina,o-dianisidina,
o-tolidina, o-toluidina, 2-amino-4-nitrotolueno
y 2-naftilamina.Posteriormentese
ajustaronlascondicionesen funcióndel restode comoonentes.
V.2.2.2. Establecimientode las CondicionesCromatográficas
Parael establecimiento
de las condicionescromatográficas
se estudiarondiferentes
mezclasen la composicióndel eluyente,determinandoen cada caso el factor de
capacidadparacada componentey el factorde selectividad
entre los paresde ellos
que eluíanjuntosy/o contiguos.En el apartado1V.2.2se indicanlos conceptosde los
parámetros
mencionados.
Comotiempomuertodel sistemasetomó el correspondiente
al del uracilopor serésteun solutono retenido12441.
Y.2.2.2.a.MezclasMetanol/Tampón
Se han realizado los cromatogramas
de las 7 aminas indicadasanteriormente,
correspondientes
a ocho composiciones
(75/2s, 7o/3o,
diferentesde metanol/tampón
65/35,60/40,57/43,55/45,50/50,
y a3157).
En la FiguraV.B.Ase muestrala evolución
del factorde capacidadde cadacompuesto,en funcióndel porcentajede metanolen
lasdiferentesmezclasmetanol/tampón
utilizadas
comoeluyentes.
Se observaque en generallos valoresde factorde capacidaddisminuyenparatodos
los componentes
conformeaumentael porcentajede metanolen el eluyente.Paralos
compuestos2,4diaminotolueno,
bencidina,y 2-naftilamina
se obtiene una buena
separaciónhastaun 65% de metanol,mientrasque paravaloressuperioresa éste la
2,4-diaminotolueno
y la bencidina
tiendena coincidir.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
82
Capítulo v
2,4-Diaminoblueno
Bencidina
o-Toluidina
+
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o-Dianisidina
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2.Amino4-nitoioluenaúo-Dianisidina
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60
70
oó Metanol
Figura V.8. Variación(A) del factorde capacidady (B) del factor de selectividadobtenidoscon
HPLCIDAD,en función del porcentajede metanol.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
cpt4 tS,
utos$fico
"!St d94!lé!j:!_t_9!p-
B3
Por otra parteen la FiguraV.B.Bse muestrala evolucióndel factorde selectividad
para
diferentesparesde compuestosen funcióndel porcentajede metanol.Se puede ver
que el par o-dianisidina/o-toluidina
y el par 2-amino-4-nitrotolueno/o-tolidina
se
separanpeor conformeaumentael porcentajede metanol,pasandoambos por un
mínimo(c¿:1)paraun 65% de metanola partirdel cual se inviertenlos órdenesde
elución. En cuanto al par otolidina/o-toluidina,
sigue una evoluciónsimilar a la
pero
descrita
toma un valorde cr:1 a partirde un 70olo
de metanolen adelante.Sin
embargo,parael par 2-amino-4-nitrotolueno/o-dianisidina
la inversiónen el orden de
elución se producealrededordel 50% de metanol,mejorandola separación
entre
dichasaminasa partirde dichoporcentaje
de metanol.
A la vista de estosresultadosse puede decir que para una composición57/43 de
metanol/tampónse produce la separaciónde todos los compuestosestudiados.Sin
embargoal considerarel restode aminas,podríanproducirseinterferencias
ya que la
separaciónque hay entre las aminasestudiadasno es suficiente.Por otra parte la
que se observatrabajando
separación
a una composición43/57de metanol/tampón
es
bastantemejor, por lo que en este caso cabría esperar menos problemasde
interferencias;
pero en estascondicionesel análisisde todos los compuestossería
demasiadolargoy habríaque utilizargradiente.
V .2.2.2.b.MezclasAcetonitrilo/Tampón
Se han realizado los cromatogramas
de las 7 aminas indicadasanteriormente,
correspondientes
(55/45,50/50, 48/52,
a seis composiciones
de acetonitrilo/tampón
46/54, 40/60, y 35/65). En la FiguraV.9.A se muestrala variacióndel factor de
capacidadde cada compuestoen función del portentajede acetonitrilo en las
diferentesmezclasacetonitrilo/tampón
utilízadas
como eluyente.
En estecasotambiénse observaque, en general,conformeaumentael porcentajeen
acetonitrilodisminuyenlos valoresde factor de capacidadpara todos las aminas
estudiadas,
encontrandoque la 2,44iaminotolueno,
la bencidinay la 2-naftilamina
se
separanbien del resto de componentesen todo el intervalo de composiciones
estudiado.
Sin embargo,la2,4-diaminotolueno
coincideprácticamente
con el tiempo
muertodel sistemaa porcentajes
elevadosde faseórganica.
En la FiguraV.9.8 se puedever la evolucióndel factorde selectividadparadiferentes
paresde compuestos
en funcióndel porcentaje
de acetonitrilo"
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Capítulo V
84
8.m
+
2,4'DÉminoiolueno
Bencidlna
l,
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4.50
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o-Dianisidina
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Acetonitrilo
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1.65
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o-Tolidin¡y'o-Toluidina
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24mino,{-nitobluenodo-Dia¡risidina
L
o-Dienlsldlna/o-Toluidlna
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2.Amino-*-nitoblueno/o-Tolidina
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37.50
45.00
52.50
60.00
0,6Acetonitrilo
Figura V.9. Variación(A) del factorde capacidadV B) del factor de selectividadobtenidoscon
HPLCIDAD,en función del porcentaiede acetonitrilo.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Condiciones de Anál isis
B5
Seobservaque el par o-tolidina/o-toluidina
por unaparte,y el paro-dianisidina/o+oluidina por otra, se separanpeor conformeaumentael porcentajede acetonitrilo,
llegandoa coincidirel par odianisidina/o-toluidina
parael 55% de acetonitrilo.En
cuanto al par 2-amino-4-nitrotolueno/o-tolidina,
se observa que al aumentar el
porcentajede acetonitrilo,dichoscompuestos
tiendena coincidirde formaque cuando
el eluyentelleva un 40% de acetonitriloprácticamente
coinciden,invirtiéndose
el
orden de elución conformeaumentael porcentajede acetonitrilo.Por último, el par
2-amino-4-nitrotolueno/o-dianisidina,
en generalse separamejorconformeaumentael
porcentajede acetonitri
lo.
Al igual que sucedíacon las mezclasmetanol/tampón,
la mejor separación
se obtiene
paraaquellacomposiciónde eluyenteen la que la faseorgánicaes menor;es decir,
35% de acetonitrilo
y 6501.
de tampón.
Comparandolas FigurasV.B.Ay V.9.A se puedever que, en general,los valoresde
factor de capacidadson menorespara las mezclasacetonitrilo/tampón
que para las
mezclasmetanol/tampón,
lo cual indicaque todoslos componentes
eluyenantesen el
casode las mezclasacetonitrilo/tampón,
y por lo tanto los tiemposde análisisserían
más cortos;por contra podría haber más problemasde interferencias
en el caso de
considerarel resto de componentes.Por otra parte, en el caso de las mezclas
metanol/tampónserían necesariostiemposde análisismuy largos,por lo cual se
procedióal estudiomezclasternarias
de eluventes.
Y .2.2.2.c.MezclasTampón/Metanol/Acetonitrilo
Para tres composicionesdiferentesde tampón: 32, 48 y 55olo,se han estudiado
diferentesrelacionesde metanol/acetonitrilo.
En la FiguraV.10 se muestrala variación
de los valoresde factor de capacidadpara cada una de las aminasestudiadasen
funciónde la relaciónmetanol/acetonitrilo.
Se puedever que parael 32o/ode tampón
(FiguraV.10.A),aunqueen principiolos componentes
parecegue se separanbien y
que los valoresde factorde capacidadaumentanligeramenteconformeaumentala
relaciónmetanol/acetonitrilo,
en todos los casosse obtienenvaloresinferioresa 1, lo
cual indicaque todos los componentes
saldríanmuy próximosal volumen muertodel
sistema"
Cuando el porcentajede tampón es del 48% (FiguraV.'10.B)se apreciauna mayor
influenciade la relaciónmetanol/acetonitrilo,
ya que losvaloresde factorde capacidad
aumentana medidaque se incrementa
dicharelación.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
86
Capítulo V
1.50
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Metanol/Acetonitrilo
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+
+
01234
Metalml/Acetonitrilo
FiguraV.l0.
Variación del factor de capacidad obtenido con HPLCIDAD, en función de la
relación metanol/acetonitr¡lopara diferentesporcentaiesde tampón fosfato: (A)
32%, (B)48% y (C)55%.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
bencidina,o-toluidina,2-naftil5e observaque los componentes2,4-diaminotolueno,
separados.
Sin embargo,la separaciónentre
estánperfectamente
aminay o-dianisidina
la 2-amino-4-nitrotoluenoy la otolidina está afectada por la relación
metanol/acetonitrilo,
de forma que al aumentardicha relación se separanmejor,
aunquela primeraseaproximaa la o-dianisidina.
En el casodel 55o/"de tampón(FiguraV.10.C)los valoresde factorde capacidadson
sobre
una mayorinfluenciade la relaciónmetanol/acetonitrilo
mayores,observándose
éstos. Para esta composiciónde tampón se aprecia que la separaciónentre los
y o-tolidinaestámuy influenciada
2-amino-4-nitrotolueno
componenteso-dianisidina,
de formaque cuandoéstaes iguala 3.5, todaslas
por la relaciónmetanol/acetonitrilo
y con valoresde factorde capacidad
aminasestudiadas
se encuentranbien separadas
aceptables.
+
5
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123
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Metanol/Aeetonitrilo
FiguraV.tt.
Variación del factor de capacidadobtenido con HPLCIDAD, en función de la
relaciónmetanol/acetonitriloparaun porcentajede tampón fosfatodel 55%.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
BB
Capítulo V
A la vistade los resultados
obtenidos,se seleccionóel eluyentecon una composición
del 55% en tampóny se estudiaronotrasaminastalescomo anilina,4-aminofeniléter,
4,4'-diaminodifenilmetano,
4-cloroanilina,
2-metoxi-5-metilanilina
, y 4,4'-tiodianilina
conjuntamente
con las anteriores,
a excepciónde la 2,44iaminotoluenoy la 2-naftilamina,ya que teniendoen cuentala diferenciaentresusvaloresde factorde capacidad
se consideróque estabansuficientemente
resueltas.
En la FiguraV.11 se muestranlos
valoresde factor de capacidadde todas las aminasindicadaspara un intervalode
metanol/acetonitrilo
comprendidoentre0.8 y 3.5. Se observaque parauna relación
metanol/acetonitrilo
igual a 3.5, la bencidinacoincidecon el 4-aminofeniléter,
la
2-metoxi-5-metilanilina
coincidecon el 2-amino-4-nitrotolueno,
y la 4,4'-tiodianilina
salepróximaa la o-tolidina.
Conformela relaciónde metanol/acetonitrilo
disminuyese puedever que la bencidina
y el 4-aminofeniléter
quedandoéstaúltimaentrela anilinay la
tiendena separarse,
bencidina,mientrasque la 4-cloroanilina,
y la o-dianisidina
la 2-metoxi-5-metilanilina
tienden a coincidir.En cuanto al restode las aminasque eluyen en un tiempo
razonableutilizandocondicionesisocráticas,
puede decirseque empleandocomo
eluyenteuna mezcla de tampón/metanol/acetonitrilo
55/35/10el 2, -diaminoanisol
saleincfuso antesque el 2,4-diaminotolueno
y la 4-cloro'2-metilanilina
eluyedespués
que la 2-naftilamina.
Todos estos resultadosparecen indicar que es difícil conseguir una única mezcla
eluyente que nos permita separar satisfactoriamente todas las arilaminas
simultáneamente.
V.2.2.3.Condicionesde Gradiente
El restode aminasno incluidashastaahorapresentaban
volúmenesde eluciónmuy
grandescuando se trabajabaen condicionesisocráticas,
por lo que se tuvo que
establecer
un gradientede eluciónparaacortarel tiempodel análisis.La limitación
fundamentalal operaren gradientees que se produzcaprecipitación
de los fosfatos,
dandolugara una obstrucción
en el sistemaal aumentaren el eluyenteel porcentaje
de la faseórganica.Trasuna seriede pruebasy teniendoen cuentalo dicho en el
apartadode ensayospreliminares,
que la composición
se estableció
finaldel eluyente
fueseuna mezclade tampón/metanol/acetonitrilo
de composición25/67/8.
En un primerensayose estableció
un gradiente
linealcon tiempo6 min y se encontró
que todaslas aminasse separaban
bien a excepciónde la 3,3'diclorobencidina
y la
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Condicionesde AnálisisCromatográfico
B9
4,4'-metilenbis(2-cloroanilina).
Paraestablecer
las condiciones
óptimasde separación
entreestasdos aminasse estudióla evoluciónde su resolución
a diferentes
tiemposy
tipos de gradientes.
En la FiguraY.l2 se puedever que al aumentarel tiempo de
gradientese obtienen mejoresvaloresde resolución,y para un tipo de gradiente
convexose obtienenpeoresvaloresque en el casode utilizarun gradientelinealo
cóncavo.Empleandoun gradientelinealduranteun tiempode 13 min se obtenían
valoresde resolución
aceptables.
¿.¿u
ffi
ffi
1.65
I
CradienteLineal
CradienteConvexo
CradienteCóncavo
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tt7
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0.55
nññ
I
10
13
Tiempode Cradiente(minutos)
FiguraV.l2.
Variaciónde Ia resoluciónentreIa 3,3'-diclorobencidinay Ia 4,4'-metilenbis(2cloroanilina)obtenida con HPLCIDAD,en función del tiempo y del tipo de
gradiente.
En la FiguraV.13.Ase muestrael cromatograma
obtenidoa 2BBnm parauna mezcla
de todaslasaminasestudiadas,
segúnlassiguientes
condiciones:
el eluyenteiniciales
una mezcla de tampón/metanol/acetonitrilo
55135110
durante un tiempo de 13
gradiente
minutos,traslos cualesse establece
un
linealde 13 minutoshastallegara
obteneruna mezclade composición
25/67/8la cual se mantienedurante14 minutos.
De esta forma el cromatograma
total transcurreen un tiempo de 40 minutos.Los
númerosque figuranencimade cadapico corresponden
a lasarilaminas
indicadas
en
la TablaV.4. Sepuedever que en estascondiciones
seconsiguela separación
de todas
(5)que coincidecon la bencidina(4)y del
lasaminasa excepcióndel 4-aminofeniléter
(9 que coincidecon la 2-metoxi-S-metilanilina
(l_0).
2-amino-4-nitrotolueno
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Sin embargo,cuando se obtieneel cromatograma
en las mismascondicionespero a
360 nm (FiguraV.13.8), sólo se detectala presenciade 2-amino-4-nitrotolueno
(9),
(l4.l,
(21).
2-naftilamina
y o-aminoazotolueno
24
40
Tiempo(minutos)
FiguraV.l3.
Cromatogramasobtenidoscon HPLCIDADcorrespondientes
a la mezclade las
arilaminas indicadasen la Tabla v.4 (A) a 2BB nm y (B) a 36o nm, en las
siguientescondiciones:mezcla inicial de tampónlmetanol/acetonitrilo
5Sl35/10
durante 13 minutos, y gradiente lineal en 13 minutos hasta obtener una
composición25/67/8,que se mantienedurantel4 minutos.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
En la FiguraV.14.Ase muestrael cromatograma
obtenidoa 2BB nm para la misma
mezclade aminasque en el casoanteriory utlizandoel mismoprograma
de elución,a
excepciónde la mezcla incial en condicionesisocráticas,
que correspondea una
mezclatampón/metanol/acetonitrilo
53/37/10.En estascondicionesse apreciaque la
separaciónentre la 4,4'-tiodianilina02) y la o{olidina (1Í!) mejoracon respectoal
cromatograma
de la FiguraV.13.A.Sin embargo,la 4-aminofeniléter
(E)y la bencidina
(9 y la 2-metoxi-5@) siguencoincidiendo,al igual que la 2-amino-4-nitrotolueno
(10).lncluso,éstasúltimastiendena coincidircon la o-dianisidina
(11).
metilanilina
fabla V.4.
N" de referenciade las arilaminas estudiadaspara el establecimiento de las
condicionescromatográficasen H PLC/DAD.
No Referencia
1
2
Compuesto
4-Metoxi-1,3-fenilendiamina
4-Metil-1,3-fenilendiamina
Nombre común
2,4-Diaminoanisol
2,4-Diaminotolueno
3
Anilina
4
4,4'-Diaminobifenilo
Bencidina
5
4-Aminofeniléter
4,4,-Oxidianilina
6
2-Metil-1-aminobenceno
o.Toluidina
7
4,,4'-Diaminodifenilmetano
8
4-Cloroanilina
9
2-Amino-4-nitrotolueno
10
2-Metoxi-5-metilanilina
p-Cresidina
11
3r3'-Dimetoxi-4r4'-diaminobifenilo
o-Dianisidina
12
4,4'-Tiodianilina
13
3,3'-Dimetil-4,4'diaminobifenilo
14
2-Naftilamina
15
4-Cloro-2-metilaminobenceno
16
2,4,5-Trimetilanilina
17
3r3'-Dimetil-4,4'-diaminodifenilmetano
18
4-Aminobifenilo
19
3,3'-Dicloro-4,4'-diaminobifenilo
20
4,4'-Metilenbis(2-cloroanilina)
21
4-Amino-2,3-dimetilazobenceno
o-Tolidina
4-Cloro-o-toluidina
3r3'-Diclorobencidina
o-Aminoazotolueno
En la Figura V.'14.8 las condicionesisocráticasi n i c i a l e sson una mezcla de
tampón/metanol/acetonitrilo
55/17/28. 5e aprecia que hay muchas aminas que
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
92
Capítulo V
(D y la bencidina(4 se
coincidenentresí; sin embargoen estecasola 4-aminofeniléter
(19
consiguendiferenciar,
e inclusola 3,3'-diclorobencidina y la 4,4'-mefilen-bis(2(2o)
cloroanilina)
se separanmejor que en las condicionesindicadaspara el
cromatograma
de la FiguraV.13.A.
8,10,11
9,12,13
B
21
l
fl
Jl.
16
24
32
40
Tiempo(minutos)
FiguraV.l4.
Cromatogramas
obtenidoscon HPLC|DADcorrespondientes
a la mezcla de las
arilaminasindicadasen Ia TablaV.4 a 2BBnm, en las mismascondicionesque la
Figura V.l3 pero utilizando una mezcla inicial de tampónlmetanollacetonitrilo
(A) de 53137110
v @)de 55117128.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Condicionesde AnálisisC
Winkeler y col. [208] estudianla separación
de las veinte arilaminasprohibidas,
registrando
el cromatograma
a 245 nm y empleandoun tiempototalde 60 minutos.La
secuenciaen el orden de elución de los compuestoses distinta,y entre las aminas
correspondientes
a los números11 a 17 se obtiene peor resolución.Sin embargo,
y la 2-metoxi-5-metilanilina
compuestos
como la 4-aminofeniléter
consiguensepararlas
del resto satisfactoriamente.
En otros trabajosse llegan a estudiar mezclasde entre
cinco y once aminasaromáticas,
empleandodetecciónUV-Visible1128,132,2O21o
un
(ED)
detectorelectroquímico
En todos ellos,el orden de elución coincide
[145-1471.
presente
con el obtenidoen el
estudio.
2.2.4. Estudio Espectroscópicode las Aminas Coincidentes
El cromatograma
obtenidosegúnlas condiciones
de la FiguraV.13.A es el que en
general evidencia una mejor separaciónde todas las aminas,a excepciónde la
4-aminofeniléterque coincide con la bencidina,y la 2-amino-4-nitrotolueno
que
coincide con la 2-metoxi-5-metilanilina.
No obstante,como los espectrosde
ultravioletade estos productospresentandiferenciassignificativas,resulta posible
estudiarla purezade cadapico en funciónde la presenciao ausenciadel compuesto
que interfiera.
En la FiguraV.15.A se muestracómo varíala concentración
relativade bencidinaen
una mezclade éstay la 4-aminofeniléter,
en funciónde relaciónentrela absorbancia
a
2BBnm y la absorbancia
a 24Onm, medidasen el espectrocorrespondiente
al máximo
del pico cromatográfico.
Se observaque conformeaumentala concentraciónrelativa
de bencidina en la mezcla, se produce un incrementoen dicha relación de
absorbancias,
de formaque los puntosse ajustana una función polínómicade tercer
grado:
y=-2,757 + 36.600x - 5.400x2 + 0.356x3
(r2=0.999)
En donde y representael porcentajerelativode la bencidinaen la mezclay x la
relaciónentrela absorbancia
a 2BBnm v la absorbancia
a 240 nm.
y 2Si se realizaun estudiosimilaren el casode una mezclade 2-amino-4-nitrotolueno
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
(FiguraV.15.B),
metoxi-S-metilanilina
se obtieneque la relaciónentrela absorbancia
a
2BBnm y la absorbancia
a 240 nm, medidasen el máximodel pico cromatográfico,
no
sufreningunavaríacióncon la composiciónrelativade la 2-amino-4-nítrotolueno
en fa
mezclade éstacon la 2-metoxi-5-metilanilina.
100
.F 1ü0
o\
o
tr
t¡¡
=80
E
s;80
rÉ
A
tr
E
'fi
B
tr
r= 60
Ttr 6 0
Etr
t¡¡
tr
.{
tr
'E
rÉ
f Ab Zee nm/AbZSOnm
E Ab 288 nny'Ab240 nm
ru
T40
.o
tr
rÉ
E
í¡
{¡
a
E20
U
E20
E
tu
l¡
tr
o
UO
o.00
2.33
4.67
7.Oü
Ab 28S nm/Ah 240 nm
FiguraV.l5.
0.60
1.oo
1.40
Rel¡ciónde Ah¡orb¡nci¡s
Variaciónobtenidacon HPLCIDAD(A) entreel porcentajerelativode bencidina
para diferentesmezclasde ésta y 4-aminobifenilo,en función de la relaciónde
absorbancias(2\Bnm/240nm) y @) entre el porcentajede la 2-amino-4nitrotolueno para diferentesmezclas de ésta y 2-metoxi-5-metilanilina,
en
función de Ia relaciónde absorbancias(2\Bnm/240nm)y (288nm/250nm).
Sin embargo,la relaciónentrela absorbancia
a 2BBnm y la absorbancia
a 25Onm sí
que variade formaque dicharelacióndisminuyeconformeaumentala concentración
relativade la 2-amino-4-nitrotolueno
en la mezcla.Al igualque que en el casoanterior,
dichavariaciónse puedeajustara unafunciónpolinómicade tercergrado:
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Condicionesde Análisis Cromatográfico
y =618.440 - 1799.569x + 1807.620x2- 622.637x3
95
(r2=O.997)
En donde y representa
el porcentajerelativode 2-amino-4-nitrotolueno
en la mezclay
a 2BBnm y la absorbancia
x la relaciónentrela absorbancia
a 250 nm.
Dichasecuacionespermitenestimarel porcentajerelativode bencidinaen una mezcla
y el porcentajerelativodel 2-amino-4-nitrotolueno
de éstacon la 4-aminofeniléter,
en
de
la
2-metoxi-5-metilanilina.
una mezcla éstacon
V .2.2.5. Anál isis Cuantitativo
Parael análisiscuantitativode lasaminasaromáticas,
en primerlugarse obtuvieronlas
ecuacíonesde calibrado para cada una de ellas en las condicionescromatográficas
correspondíentes
al cromatograma
de la FiguraV.13.A Dichasecuaciones
se realizaron
comprendidoentreO.1y 20 ppm, exceptopara la
en un intervalode concentraciones
4,4'4iaminodifenilmetano, 4-cloroanilina, 4-cloro-2-metilanilina, y
2,4,5que
y
ppm.
Todasellas respondena la
trimetrilanilina,
se realizaronentre 0.25 20
forma genérica:
Concentración x (Volumen de Inyección) = A + B * (Area)
El volumende inyecciónfue de 20 pl en todoslos casos,A es la ordenadaen el origen
y B es la pendiente.En la TablaV.5 se muestranlos diferentesparámetros
obtenidos
del ajustede la ecuaciónanterioren función del área de los picos, así como los
paracada una de
de correlación(r2)y lascantidadesmínimasdetectables
coeficientes
lasarilaminas"
En generalse puede decir que, en función de las pendientesobtenidas,todas las
amínas presentanuna capacidadde respuestadel mismo orden de magnitud,a
excepciónde la bencidinay la o-tolidinaque sonde un ordenmayor.
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96
Capítulo V
Tabla V.5.
Parámetrosde las ecuacionesde calibrado y cantidades mínimas detectables
obtenidascon HPLCIDAD, paracada una de ias arilaminas.
OrdenaCompuesto
da en el
Pendiente
Coeficiente
Cantidad
de
Mínima
Correlación
Detectable
Origen
(A)
@)
214-Diaminoanisol
1.592
6.749104
o.9993
2.OO4
2,4-Diaminotolueno
4.535104
>0.9999
2.O72
Bencidina
0.4550
- 0 . 11 2 1
6.89810-5
>0.9999
2.O70
4-Aminofeniléter
4.1579
5.526104
>0.9999
1.990
o'Toluidina
o.05412 6.617104
>0.9999
1.990
4,4'-Diaminodifenilmetano
1 . 0 3 1 0 6.025104
>0.9999
4.954
4-Cloroanilina
0.07843 8 . 4 2 7 ' t O 4
0.9999
4.884
2-Amíno-4-nitrotolueno
0.8681
2.614104
0.9998
2.066
2-Metoxi-S-metilanilina
0.5316
>0.9999
2.O40
GDianisidina
0.3890
3.931104
'tO4
1.229
> 0.9999
2.120
4,4'-Tiodianilina
o.4904
2 . 1 3 01 0 4
>0.9999
1.950
o-Tolidina
0.3993
8.40010-5
>.0.9999
2.'t28
0.08569 2.965 10-4
> 0.9999
2.118
2-Naftilamina
4-Clor t2-meti lani Ii na
0.4580
7.3691Ú
0.9999
4.740
2,4,S-Trimetilanilina
0.7202
5.869104
> 0.9999
5.036
3,3'-Dimetil-4,4'-diaminodifenilmetano o.2120
5.405104
>0.9999
2.096
>0.9999
2.2't6
4-Aminobifenilo
0.1071
1.00810-4
3r3'-Diclorobencidina
o.4087
1 . 1 2 91 0 4
>0.9999
1.955
0.1774
-o.4572
6.093104
>0.9999
2.314
5.56610{
>0.9999
2.O22
4,4'-Meti lenbis(2-cloroaniIi na)
o-Aminoazotolueno
En cuanto a la cantidad mínima detectable,en el caso de la 2,4diaminoanisol,
2,4-diaminotolueno,bencidina, 4,4'-tiodianilinay o-tolidina, presentan valores
ligeramenteinferioresa los obtenidoscon CC/MS (TablaV.3). Sin embargopara el
restode aminasse han obtenidovaloresmayorescon HPLC/DAD,siendoel casomás
es de 4.89 ng, frentea
ina cuyacantidadmínimadetectable
notableel de la 4-cloroanif
fos 0.177 ng detectadoscuandose determinapor CC7MS,es decir,28 vecesmayor.
Estopone de manifiestola importanciaque tiene la técnicade análisisutilizadaen la
de dichasaminas,ya que puededarseel casode que a concentraciones
determinación
o no en funciónde la técnicautilizada.
muy bajas,éstaspodránserdetectables
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Condicionesde AnálisisCromatográfico
Tabla V.6.
97
Valores calculados a partir de las ecuaciones de calibrado obtenidas con
HPLCIDAD,para cadauna de las arilaminas.
Paracadauno de loscompuestos
examinados
se ha determinadola repetibilidadde los
paradosconcentraciones
valorescuantitativos
diferentes,
calculándose
el valor medio,
el coeficientede variación,y los intervalos
de confianzaal95olo
sobrela basede cinco
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98
Capltulo V
determinaciones.
Los resultados
se muestranen la TablaY.6, y se puedever que en
Seneralexiste una buena concordanciaentre los valores teóricos y los valores
calculadosa partirde lasecuaciones
de calibrado"
22.O0
6
o
17.80
ll
o
{J
13.20
CL
o
E
rE
8.80
=
=
4.40
0.00
1.05
2.1CI
10.00
11.O0
etoxi-5-meti lanilinal
[2-Ami no4ti t roto luenol/[2.r\4
E
-g
r!
E
-E
=
11.00
8.80
srÉ
6.60
tr
\o
4.40
B
(J
(J
r!
o
2.20
(J
c
o
u
o.00
4.40
6.60
8.80
11.OO
Concenlración Real (ppm)
FiguraV.Í6.
(A) Variación obtenidacon HPLC|DADde la alturade pico correspondientea la
2'amino4-nitrotolueno medida a 360 nm, en función de Ia relación entre
concentraciónesde ésta y 2-metoxi-5-metilanilina.(B) Relación obtenida con
HPLC|DAD entre la concentración real y Ia calculada para la 2-amino-4nitrotolueno,medidaa 360 nm.
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Condicionesde AnálisisCromatoFráfico
a
--q
Por otra parte,cabedestacarel estrechointervalode confianzaobtenidoen la mayoría
de los casos.Sólo para la 2,4-diaminoanisol
se ha obtenido un valor ligeramente
elevado debido probablementea que eluye muy próximo al tiempo muerto del
sistema,lo cual puededar probfemasa la horade integrarsu pico cromatográfico.
Hay que recordarque en las condicionesde elución anteriorespara la que se han
obtenido las ecuacionesde calibrado,existendos parejasde aminasque coinciden
(2-amino-4-nitrotolueno/2-metoxi-5-metilanilina
y bencidina/4-aminofeniléter),
por lo
que es necesariorecurrira lascondicionesdondesí se resuelvenpara llevara cabo la
determinación
de lasmismas.
Tal y como se mostróen la FiguraV.13.8,si se registrael cromatograma
a 360 nm sólo
se aprecia la aparición de un único pico debido a la 2-amino-4-nitrotolueno.
Representándose
la altura del pico de la 2-amino-4-nitrotolueno
frente a la relación
entrela concentración
de éstay de 2-metoxi-5-metilanilina
(Figurav.16.A), se observa
que existe una variación lineal conforme aumentadicha relación, y permanece
prácticamente constante cuando la concentración de 2-metoxi-5-metilanilina
disminuyeal tiempo que la de 2-amino-4-nitrotolueno
permanececonstante.En la
FiguraV.16.8 se muestrala relaciónentrelasconcentraciones
realesy lascalculadasa
partirdel calibradode la 2-amino-4-nitrotolueno
a 360 nm, en basea la alturadel pico.
Se puede ver que prácticamente
todos los puntosse alineanen la diagonal,lo cual
indicauna buenaconcordancia
entrelosvaloresrealesy loscalculados.
Tabla V.7.
Concentracionesrealesy calculadasobtenidascon HPLC/DAD, para la mezcla
ham i nofeni I éter v bencidi na.
*Aminofeniléter
Bencidina
Concentración
Concentración
Concentración
Concentración
Real
Calculada
Real
Calculada
9.9
10.0
10.1
9.9
9.8
10.4
'1o.2
0.99
0.96
10.3
10.5
5.0
5.1
10.3
10.2
9.9
10.3
5.1
5.3
9.9
10.0
1.0
0.9
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10.1
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Porúltimo,cuandose realizael calibradode la bencidinay la 4-aminofeniléter
en base
a la altura de los picos y en las condicionesen que se separan(mezclainicial de
tampón/metanol/acetonitrilo
55/17/28),se puedendeterminarambassi se encuentran
en la mismadisoluciónproblema.Se toma la alturacomo respuesta,
ya que los picos
parcialmente.
se solapan
Así,en la TablaV.7 se indicanlos valoresrealesy calculados
de dichasaminasparadiferentescomposiciones.
Se puedever que existeuna buena
correlaciónentrelosvaloresrealesy loscalculados
a partirde lasrectasde calibrado.
En cuantoa las posiblesinterferencias
debidasa la presenciade isómerostalescomo
1-naftilamina,
2-aminobifelino,
2-cloroanilina,
3<loroanilina,m-toluidinay p-toluidina,se observólo siguiente:
o La 2-aminobifenilo
y la 4-aminobifenilo
se separanentresí presentando
tiemposde
y
retenciónde 26.1 28.5 minutosrespectivamente.
Lo mismoocurrecon la 4-cloroy 2-cloroanilina,
que presentan
anilina,3-cloroanilina
tiemposde 11.6, 12.3y 12.9
minutos respectivamente.
Por tanto, en estoscasos no cabe la posibilidadde
interferencias
debidasa isómerosen la determinación
tanto de la 4-aminobifenilo
como de la 4-cloroanilina.En la bibliografía,
se encuentranvariostrabajosen los
que se separan la 2-aminobifeniloy la 4-aminobifenilohaciendo uso de la
líquidaen faseinversa.Así, Lancaster
cromatografía
y col. [190,191]las determina
trasdiazotacióny aclopamiento
con SalR empleandoun DAD, si bien la resolución
empeorarespectoa la obtenidaen estamemoría.Whangy col. [14G1,consiguen
separarlas
con buena resoluciónsin derivatizaciónalguna,utilizandoun ED. En
los
tres isómerosde la cloroanilina,se describenseparaciones
cuantoa
utilizando
cromatografíalíquida de adsorcióncon detecciónUV-visible[124-127f,o en fase
inversacon ED Í'1441.
o En cuanto a la'l-naftilaminay la 2-naftilamina,
eluyen ambasa 1B.B minutos
haciendoimposiblela determinación
de la 2-naftilamina
si se encuentrapresentesu
isómeroen la misma muestra.En la bibliografía,se encuentranseparaciones
de
ambasaminashaciendousode cromatografía
líquidaen faseinversa.Así, Lancaster
y col. [19'1,193]las determinantras diazotacióny acoplamientocon Sal R,
utilizandoun DAD. Pacey col. [129]y Concialiniy col. [145],consiguenseparalas
sin derivatizaciónalguna, empleandoun DAD y un detectorde fluorescencia
respectivamente.
Sin embargo,en el estudiorealizadopor Bürgiy col. [128] ambos
isómeroseluyen simultáneamente.
Por otro lado, Chow y col. [12fl emplean
cromatografíalíquida de adsorcióncon detección UV-visiblepara separarlas,
mientrasque Mefford y col. [123] lo hacen mediantecromatografíalíquida de
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Condicionesde AnálisisCromatográfico
101
intercambioiónicocon detecciónelectroquímica.
Por último, la o-toluidina,m-toluidinay p-toluidinapresentan
tiemposde retención
muy cercanosentresí (8.54,B.B1y 8.86 minutosrespectivamente)
lo cual dificulta
la determinaciónde la o-toluidinacuandose encuentranpresentesuno o sus dos
isómeros.No obstante,se comprobóque la cuantificaciónde la otoluidina en
presenciade la p-toluidinaseríaposiblesi se empleacomo respuestala altura de
píco en lugar del área. En la bibliografíaencontradadonde se describen
separaciones
de estostres isómerosf124-12fl,se empleasiemprela cromatografía
líquida de adsorciónutilizandodetecciónUV-visible,si bien en ninguno de los
casosse consiguemejorarla resolución.
V.3. Conclusiones
De los resultadosobtenidos en el presentecapítulo, se pueden deducir las
conclusiones
siguientes:
1. Se ha verificadoque la Cromatografía
de Casescon detectorde Espectrometría
de
(CCIMS)
Masas
es una técnicaadecuadapara la determinacióncualitativade las
veintearilaminasprohibidas,permitiendodetectarde una formabastantesegurala
presenciao ausenciade lasmismascon límitesde detecciónaceptables,
sobretodo
paracompuestos
talescomo la o-toluidinay la 4-cloroanilina.
2. Lascondicionescromatográficas
más adecuadas
en Cromatografia
de Líquidosde
Alta Resolucióncon detector de FotodiodosUV-Visible(HPLC/DAD)para la
determinacióntanto cualitativa como cuantitativade las veinte arilaminas
prohibidas,son lassiguientes:
Como eluyente inicial, una mezcla de tampónlmetanol/acetonitrilo55/35/10
duranteun tiempo de 13 minutos,trasel cualse estableceun gradientelineal de
l3 minutos hastaobteneruna mezcla de composición25/67/8 que se mantiene
durante l4 minutos.
Asimismo, se han determinadolas ecuacionesde calibrado para todas ellas,
encontrándose
una buenaconcordancia
entrelos valoresteóricosv los calculadosa
partirde éstas.
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3. En lo que respectaa la cantidadmínimadetectable
de lasarilaminasestudiadas,
se
puede afirmar lo siguiente:la o-toluidina,4-cloroanilina,2-metoxi-S-metilanilina,
4-cloro-2-metilanilina
y 2,3,5-trimetilanilina,
presentan
valoresde cantidadmínima
detectablebastantemás bajos con CC/MS que con HPL(7DAD, mientrasque la
2,4-diaminoanisol,2,4-diaminotolueno,
bencidina 4,4'-tiodianílinay o-tolidina,
tienen valores de cantidad mínima detectablesignificativamente
menorescon
HPLC/DAD.En cuantoal restode arilaminas,los valoresencontrados
no presentan
diferenciasnotablesde una técnicaa otra,detectándose
todasellascon límitesde
detecciónsimilares.
4. Se han estudiadolas posiblesinterferencias
que, en la determinación
de las veinte
arilaminas,puede producir la presenciade los siguientescompuestos:anilina,
2-aminobifenilo,
2-cloroanilina,
3-cloranilina,
m toluidina,p-toluidinay 1-naftilamina,obteniéndose
los siguientes
resultados:
o La anilina se separabien de todas las aminasprohibidas,no interfiriendola
identificación
con CC/MSni la cuantificación
con HPLCTDAD
de todasellas.
¡ La 2-aminobifeniloy la 4-aminobifenilo,así como la 2-cloroanilina,3-cloroanilina y 4-cloroanilina,se identificanbien con CC/MS y se resuelvenlo
suficentecon HPLC/DADparala correctadeterminación
de la 4-aminobifenilo
y
la 4-cloroanilina.
o La o-toluidina, m-toluidina y p-toluidina, con GC/MS se identifican sin
problemas,mientrasque con HPLC/DAD los tB son demasiadopróximos
dificultandoasí la determinacíón
del isómeroorto. No obstante,sí es posiblela
cuantificaciónde ésteen el casode la mezclao-toluidinacon p-toluidina,si se
toma la altu¡ade pico como respuesta
en lugardel área.
o Por último, la 1-naftilamina
y 2-naftilamina
se identificanbien con CC/MS,pero
coincidentotalmentecon HPLC/DAD,por lo que la cuantificación
de la 2-naftilamina,en casode estarpresentesu isómero,tendríaque realizarsemediante
CC/MS.
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Condicionesde Anál isisCromatográfico
103
5. La metodología
de trabajoparala deteccióny posteriorcuantifícación
de arilaminas
prohibidasen una muestraproblema,puedeplantearse
de la siguientemanera:en
primer lugar,un análisisa nivel cualitativomedianteCC/MScon el fin de conocer
qué aminaspuedenestarpresentes
en la muestra,y seguidamente
el análisisa nivel
cuantitativode las mismas mediante HPLCTDAD,confirmándoseademás la
presenciao ausenciade algunaotra aminaque presentemejor límite de detección
por estaúltimatécnica.
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Vl. Preparaciónde la Muestray ExtracciónLíquidoLíquidode lasArilaminas
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de Ia Muestray Extracciónde las Arilaminas
V|.1. Introduccion
Una vez fijadas las condicionescromatogriíficas
para la determinacióncualitativay
cuantitativade las veinte arilaminasprohibidas,en estecapítulose va a exponerel
efectoque tiene la preparaciónde la muestray la extracciónlíquido-líquidosobrela
recuperación
de lasmismas.
parael estudiode estasetapasfue necesario
Lógicamente,
disponerde disoluciones
de
las arilaminasen estadolibre y en concentraciones
perfectamente
conocidas,paraque
pudieran ser manipuladasy de esta forma poder estudiar el efecto de dicha
manipulacionylo tratamiento
sobrela recuperación
de lasmismas.
Parala realizaciónde esteestudiose hizo uso de la Cromatografía
de Líquidosde Alta
Resolucióncon detector de FotodiodosUV-Visible,empleando las condiciones
cromatográficas
establecidas
en el capítuloanterior.
y Discusión
V|.2.Resultados
V1.2.1.Preparaciónde la Muestra
Es sabido que muchasaminasaromáticaspuedensufrir procesosde oxidacióncon
cierta facilidad [246,24n, por lo que se consideróque en primer lugar se debían
establecer las condiciones de preparación de la muestra para su análisis
cromatográfico,suponiendorealizadaslas etapasI y ll del método indicado en el
capítulo l, de forma que las aminas obtenidassufriesenla menor oxidación y
degradació¡posibles.
Paraello se partió de una disoluciónde sieteaminasaromáticas(bencidina,o-toluidina, o-dianisidina,o-tolidina,2-naftilamina,
4-aminobifenilo
y 3,3'-diclorobencidina)
disueltasen un volumen determinadode éter dietílico (50-60m1),
de forma que la
concentraciónde cada una de ellas en la muestrafinal preparadafuese perfectamente
conocida (alrededorde 10 ppm). Posteriormente
se trataronsegún las condiciones
siguientes:
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108
Capítulo Vl
Preparaciónde muestra(métodoA):
La disolución etéreade las aminasse concentraen rotavapora 45 oC sin llevara
sequedad,se trasvasaa un vasode 50 ml y se lleva a sequedadbajo lámpara de
infrarrojos en campana extradora. Finalmente se redisueven en la mezcla
metanolltampón llI y se inyectaen el HPLCIDAD.
Preparaciónde muestra(método B):
La disolución etérea de las aminasse lleva a sequedad,en campana extractora,
bajo lámpara de infrarroiosy burbujeando niuógeno. Finalmentese redisuelven
en Ia mezcla metanolltampón Ill y se inyectaen el HPLCIDAD.
Preparaciónde muestra(método C):
En campana extractorase concentrala disolución etéreade aminasburbujeando
corriente de nitrógeno, sin lámpara de infrarrojos y sin llevar a sequedad,
adicionando alícuotas de metanol de forma que al final queden disueltasen la
mezcla metanolltampón I lt, traslo cual se inyectaen el HPLCIDAD. Asimismo,
se evita en lo posible que la luz incida directamenteen la muestrapara lo cual
se envuelveelvaso de precipitadosen papelde aluminio.
TablaVl.l.
Recuperaciones
obtenidaspara las arilaminasbencidina, o-toluidina, o4ianisidina, o-tolidina, 2-naftilamina,4aminobifenilo y 3,j'-diclorobencidina, según las
condicionesde preparaciónindicadas.
Recuperaciónsegúnla Preparaciónde Muestra
Componente
(%)
A
B
c
Bencidina
88.5
102
o-Toluidina
0
100.7
't5.9
o-Dianisidina
88.0
96.6
10'l
78.5
o-Tolidina
90.7
98.2
102
2-Nattilamina
85.8
81.6
97.9
4-Aminobifenilo
93.0
94.9
95.5
91.6
96.8
101
3,3'-Diclorobencidina
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Preparaciónde la Muestray Extracciónde las Arilaminas
r09
En la Tabla Vl.1 se recogenlas recuperaciones
mediasobtenidaspara las díferentes
condicionesexperimentadas.
Se apreciaque las mejorescondicionesde preparación
de muestrapara su posterioranálisiscromatográficocorrespondenal método C, sobre
todo en lo que respectaa la o-toluidinaya que éstapasade perdersepor completoen
el caso de llevar la disolucióna sequedad,a recuperarse
cercadel 80% cuando se
concentrala disoluciónsin llevara sequedad.
Estotienesu explicación,pueses sabido
que ciertasaminasaromáticasprimariaso secundarias,
como lo es la o-toluidina,se
oxidancon relativafacilidadcuandose exponenal airecomo consecuencia
del ataque
que sufrenpor el oxígenoatmosférico1246,2471.
Losdiarilosy susderivados,así como
la 2-naftilamina, presentan sin embargo mayor resistenciaa estos procesos de
degradación.
Tabla VI.2
Recuperacionesobtenidas para las veinte arilaminasprohibidas, junto con Ia
anilina, según las condiciones de preparación de muestra (método C) (n" de
medidas)6J.
Valor
Coeficiente de
Intervalo de
Medio
(7')
Variación
Confianza
2r4-Diaminoanisol
87.9
3.9
al 95 lo
+ 4-4
2r4-Diaminotolueno
90.9
1.1
+ 2.3
Bencidina
99.6
1.6
4-Aminofeniléter
98.6
1.5
+ 1.9
+ 1.8
o-Totuidina
81.4
6.7
+ 3.9
4,4'-DiaminodifeniImetano
97.8
2.3
4-Cloroanilina
84.6
2.7
!2.1
+ 2.8
2-Ami no-4-nitrotol ueno
97.3
1.2
J-Metoxi-5-metilanil i na
81.3
1.1
+ 1.4
+ 1.1
o-Dianisidina
97.3
3.2
!2.3
4,4'-Tiodianilina
91.1
2.9
o-Tolidina
99.9
1.7
!3.2
+ 2.1
2-Nattilamina
94.3
4.2
+ 3.3
4-Cloro'2-metilanilina
81.5
o.7
+ o.7
2,4,5-Trimetilanilina
80.4
1.5
313'-Dimetil-4r4'-diaminodifeni
lmetano
97.0
2.9
+ 1.5
+ 3.0
Compuesto
4-Aminobifenilo
96.0
2.6
+ 2.1
3,3'-Diclorobencidina
98.2
2.4
x2.2
4,4'-Metilenbis(2-cloroaniIina)
96.4
3.O
95.8
2.O
x2.7
+ 2.3
o-Aminoazotolueno
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
110
CapítuloVI
Según las condicionesde preparaciónde muestra(método C), se han obtenido los
porcentajes
parael restode lasarilaminas
de recuperación
estudiadas.
En la TablaVl.2
se recogenlos valoresmediosde recuperaciónobtenidos,así como el coeficientede
variacióny el intervalode confianzaal 95%. Se puedever que para la o-toluidina,
4-cloroanilina,
2-metoxi-5-metilanilina,
4-cloro'2-metilanilina
y 2,4,S-trimetilanilina,
se
obtienenporcentajesde recuperación
comprendidosentreun B0 y un 85%. Parael
2,4-diaminoanisol
y 2,4 diaminotolueno
se obtieneun valor entornoal 90o/o,mientras
que parael restode lasaminasse obtienenvaloresigualeso superiores
al 95%.
Si se observanlas estructurasde los compuestosque presentanrecuperacionesmás
bajas,resultanser todos derivadosde la anilina,mientrasque el restode arilaminas
presentanestructura
diarílicao derivada,ademásde la 2-naftilamina.
Portanto,parece
haber una correlaciónentre la recuperación
de la arilaminay la existenciade uno o
dos anillosaromáticosen su estructura,
confirmándose
que los derivadosde la anilina
estánsujetosa procesosde degradación
con mayorfacilidad,como se describeen la
bibliografía.
Los antecedentesbibliográficos sobre datos de recuperacióntras preparación de
muestraprevia a su análisiscromatográÍico,
son escasos.Friedrichsy col. [209]
estudian la recuperaciónde las veinte arilaminasprohibidas,concentrandoel
disolvente(acetatode etilo) de dos formasdistintas.Por un lado, empleandoun
evaporadorrotatorío Zymark (14O "C y 180 mbar), obtienen valores muy dispares
(entre 12 y B9%). Por otro, utilizando un evaporadorrotatorio turbovap 500, y
tomando como condicionesde trabajo50 oc y 8000 r.p.ffi.,obtienenlos mejores
resultados,
entre82 y 99olo,paratodos los compuestos.
sin embargo,si toman como
oC
y 4000 f.p.ffi.,lasrecuperaciones
condiciones40
bajanhastavalorescomprendidos
e n t r e1 2 y 3 5 o / . .
Vl.2.2. ExtracciónLíquido-Líquido
de lasArilaminas
En el apartado anterior se han establecidolas condicionesde trabajo para la
preparaciónde la muestrapreviaal estudiocromatográfico,
evitandoen la medidade
lo posíblecualquierprocesode degradación
que pudierainfluir negativamente
en el
resultadofinal del análisis.Unavez hechoesto,la siguienteetapaobjetode estudiofue
la extracciónlíquido-líquidode las arilaminasa partir del extractoresultantede la
-Figura1.1-).
reducción(etapall de la metodología
de análisis
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
ación de la Muestray Extracciónde las Arilaminas
Una vez efectuadala reduccióndel colorante,ya sea como tal o fijado al cuero, se
tendríauna disoluciónacuosade las arilaminasasí como otroscomponentesque se
extrajerandel cuero.En principiose pensóen un primerprocesode purifícacióndel
extractoacuoso,haciendouna extracciónprevia líquido-líquidoen medio ácido con
un disolventeorgánico,con el fin de eliminarla posiblemateriagrasaque se extrajera
del cuero. Posteriormente
se llevaríaa cabo la propia extracciónde las arilaminas
realizandouna segundaextraccióncon éterdíetílicoen mediobásico.
Con estefin se preparóuna disoluciónacuosaen medioácidode lasmismasarilaminas
empleadasen el apartadoanterior(bencidina,o-toluidina,o.dianísidina,o-tolidina,
2-naftilamina,
4-aminobifeniloy 3,3'-diclorobencidina),
y se sometióa las siguientes
condicionesde extracción:
Extracciónde arilaminas(métodoA):
La disolución acuosa de las arilaminasse extrae previamenteen medio ácido
(pH<2) con éter dietílico(3x20 ml). Posteriormente
se basificacon NaOH 2 M
hastapH: | 0 - | 1 y se extrae por segundavez con éter dietílico (3x20 ml)"
Extracciónde arilaminas(método B):
La disolución acuosade las arilaminasse extrae previamenteen medio ácido
(pH<2) con n-hexano(3x20 ml). Posteriormente
se basificacon NaOH 2 M
hastapH:10 11 y se extraepor segundavez conéter dietílico(3x20 mt).
Extracciónde arilaminas(método C):
La dis,oluciónacuosade las arilaminasse extrae directamentecon éter dietílico
(3x20 ml)previabasificacióncon NaOH 2 M hastapH:10 - I l .
En todos fos casos,con la disoluciónetérearesultantese operasegúnla preparaciónde
muestra(métodoC) descritaen el apartadoV1.2.1.Con la primeraextracciónen medio
ácido, empleadaen los métodosA y B, se pretendepurificarel extractoacuoso
previamente
a la extracciónde lasarilaminas
en mediobásico.
En la Tabla Vl.3 se recogenlas recuperaciones
mediasobtenidaspara cada amina
según las condicionesde la extracciónde arilaminas(métodoA) v la extracciónde
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
112
CapítuloVI
arilaminas(método8). En cuantoa la primerade ellas,se apreciaque la purificación
del extracto acuoso, extrayéndoloen medio ácido con éter dietílico, no es muy
puestoque la 4-aminobifenilo,
recomendable
y sobretodo la 3,3'diclorobencidina,
se
extraeríanen partedisminuyendosu recuperación
final en medio básico.El restode
arilaminaspresentanrecuperaciones
siempresuperioresal 95% a excepciónde la
otoluidina que se recuperaalrededorde un 80%. Estetipo de purificaciónpreviaa la
extracciónen medio básico, se ha llegado a utilizar para la determinaciónde
4,4'-diaminodifenilmetano
en muestras
sanguíneas
117 11.
Tabla V|.3. Recuperacionesobtenidas para las arilaminas bencidina, o-toluidina, o-dianisidina,o-tolidina,2-naftilamina,4-aminobifeniloy 3,3'-diclorobencidina,según
Iascondicionesde extracciónde arilaminas(métodosA V B).
Recuperaciónsegúnla Extracciónde Arilaminas
Compuesto
(7o)
Medio Acido
Medio Básico
Medio Acido
Medio Básico
Bencidina
99.7
97.6
o-Toluidina
80.9
89.2
o-Dianisidina
100.4
97.4
o-Tolidina
100.8
97.3
2-Naftilamina
96.8
95.s
4-Aminobifenilo
3,3LDiclorobencidina
8.6
88.7
o.2
97.6
64.0
34.5
4.1
94.1
En cuanto a la extracciónde arilaminas(método B), se observaque la purificación
previade la disoluciónacuosacon n-hexanoda lugara mejoresresultados;
puestoque
la 4-aminobifeniloy la 3,3'-diclorobencidina
apenasse extraenen medio ácido,
obteniéndosepara todas las aminas recuperaciones
finales del orden del 95o/" o
superiores.
Solo la o-toluidinapresentauna recuperación
algo inferioral resto,con un
89.2o/'.En cualquiercaso,parececlaro que ante la necesidadde llevara cabo una
purificacióndel extracto,obtenidotrasla reducciónde una muestrade cueroacabado,
el n-hexanopodríaser el disolventemás recomendable
para la extracciónpreviaen
medioácido.No obstante,en el análisisde pielesteñidas,tal vez seríamásapropiado
extraercon n-hexanola muestrapreviamente
a la reducciónde la misma,como así se
i n d i c ae n l a n o r m aD I N 5 3 3 1 6[ 6 9 ] .
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Preparaciónde Ia Muestray Extracciónde las Arilaminas
I tJ
En la TablaVl.4 se recogenlas recuperaciones
mediasobtenidassegúnla extracción
de arilaminas(métodog. Seapreciaque las recuperaciones
obtenidasson aceptables,
rondandosiempreel 100%, a excepcióndel o-toluidinaque presentaun valor del
BB.3%.
Tabla V1.4. Recuperacionesobtenidas para las arilaminas bencidina, o-toluidina, o-dianisidina, o-tolidina, 2-naftilamina,4-aminobifenilo y 3,3'-diclorobencidina,según
Iascondicionesde extracciónde arilaminas(métodoC).
Compuesto
Recuperación
(%lo)
Bencidina
99.3
o-Toluidina
88.3
o-Dianisidina
98.4
o-Tolidina
98.4
2-Naftilamina
98.0
4-Aminobifenilo
-Diclorobencidina
99.4
98.9
Tomandocomo óptimaslascondicionesde extraccióncorrespondientes
al métodoC,
se completóel estudiode recuperación
con el restode lasarilaminas.En la TablaVl.5
se recogenlos valoresmediosde recuperaciónparatodasellas,asícomo el coeficiente
de varíacióny el intervalode confianzaal 95%.
Al igualque ocurríaanteriormente
con la preparación
de muestra,se apreciaque en la
mayoriadg los casoslas recuperaciones
se encuentranentreel 90 y el 95%, mientras
que para los derívadosde anilina están alrededordel B5%. Sin embargo, las
recuperaciónesde la 2,4-diaminoanisol
y de la 2,44iaminotoluenodisminuyen
drásticamente
valoresdel 23.5 y 34.3 % respectivamente,
obteniéndose
lo cual podría
deberseal disolventeempleadoen el procesode extracción.Así, el 2,4diaminotolueno se extrajo con acetatode etilo, cloroformoy diclorometano,obteniéndose
respectivamente
recuperaciones:
lassiguientes
42.4, 57.0y 72.Oo/".
En la TablaVl.6 se muestranlos valoresmediosde recuperación
para la 2,4-diaminoy
anisof la 2,4-diaminotolueno
cuandola extracciónse realizacon diclorometano,así
como el coeficientede variacióny el intervalode confianzaal 95%. 5e puedeobservar
que las recuperaciones
de dichasaminasaumentansustancialmente
respectode los
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114
Capítulo VI
valoresobtenidoscuandose empleaéterdietílico,disminuyendoinclusolos valoresde
coeficientede variacióny de íntervalode confianzaal 95ol".
Tabla V1.5. Recuperacionesobtenidas para las veinte arilaminas prohibidas, ¡unto con la
anilina, según las condiciones de extracción de arilaminas(método C) (no de
medidas26).
Compuesto
Valor
Coeficiente de
Intervalo de
Medio
Variación
Confianza
(7o)
2,4-Diaminoanisol
23.5
2,4-Diaminotolueno
34.3
Bencidina
96.5
4-Aminofeniléter
90.7
o-Toluidina
84.6
414'-Diaminodifenilmetano
93.s
4-Cloroanilina
85.5
2-Amino-4-nitrotol ueno
93.3
2-Metoxi-S-metilaniIi na
86.4
o-Dianisidina
96.1
4,4'-Tiodianilina
93.4
o-Tolidina
95.6
2-Naftilamina
94.6
4-Cloro-2-metilanil
ina
-T
2,4,5 rimetilani Ii na
88.4
3,3'-Dimetil-4,4'-diaminodifenil
metano
93.5
4-Aminobifenilo
96.4
3,3'-Diclorobencidina
84.9
95.3
414'-Metilenbis(2-cloroanil
ina)
94.6
o-Aminoazotolueno
93.9
al95%
9.4
10.3
3.1
4.1
4.5
3.0
5.7
2.5
4.7
3.0
3.0
3.6
3.'l
3.9
5.5
3.4
3.7
3.0
4.5
4.5
t2.o
+ 2.4
+ 2.9
+ 3.1
+ 2.9
!2.1
+ 3.5
+'1.7
+ 4.3
+ 2.O
+ 2.9
t2.5
+ 2.1
+ 3.2
+ 4.9
+ 3.0
+ 2.5
+ 2.O
+ 3.9
+ 3.9
En la bibliografía,se puedenencontrantrabajosdonde se estudianlos porcentajes
de
recuperaciónde algunade las aminasprohibidastras extracciónlíquido-líquidocon
disolventes tales como éter dietllico [128,134,171], cloruro de metileno
cloroformof147,148,150,1511,
1128,134,148,1581,
acetatode etilo 1177,1781,
n-pentano [186], n-hexano[166],benceno1161,168,1767,
tolueno 11721,
tolueno/piridina
95/5 (volumen)[163]o heptano/alcohol
isoamílico99/1 (volumen)[i71]. En general,
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Preparaciónde la Muestrav Extracciónde las Arilaminas
I tJ
se obtienenrecuperacíones
comprendidasentre el 70 y el lO}o/o,si bien en ciertos
para
la
casos
bencidina,odianisidinay o-tolidinase indicanvaloresentre el 30 y el
7ool".En cuantoa la extracciónmedianteel uso de columnascon rellenode tierrade
diatomeas ("Extrelut 20"-Merck-), empleando cloroformo como disolvente de
extracción[149,150] y aplicadaa compuestostales como 2-metoxi-5-metilanilina,
bencidina o 4-aminobifenilo,proporcionarecuperaciones
superioresal 80%. En
ocasionesse hace uso tambiénde la sonicaciónseguidade centrifugación
[129,1571,
paraaminastalescomo la 2-naftilobteniéndose
recuperaciones
entreel 93 y el 103o/o
y recuperaciones
amina,bencidinay 3,3'diclorobencidina,
entreel 67 y el 106% para
y la o-toluidina.
la 2,4-diaminotolueno
Tabla V1.6" Recuperacionesobtenidas para la 2,44iaminoanisol y la 2,4-diaminotolueno
extraídascon diclorometano,según las condicionesde extracción de arilamina C
(n" de medidas2 6).
Medio
Coeficienfede
Variación
Confianza al 957o
2r4-Diaminoanisol
67.9
2.0
+ 1.4
2,4-Diaminotolueno
72.5
2.3
+ 1.7
Compuesfo
Valor
Intervalo de
V|.3. Conclusiones
De los resultadosobtenidos en el presentecapítulo, se pueden deducir las
conclusiones
siguientes:
1. Lascondicionesde preparación
de muestrapreviaal análisiscromatográfico,
son las
siguientes:
En campana extractora se concentra la disolución etérea de las arilaminas
burbujeando una corriente suave de nitrógenoy sin |levar a sequedad. Se
adicionan alícuotas de metanol de forma que al final queden disueltas en la
mezclametanolltampónI /1, traslo cual se inyectaen el HPLCIDAD.Asimismo,
se evita en la medida de lo posible que la luz incida directamentesobre la
muestra,para Io cual se envuelveel vasode precipitadosen papel de aluminio.
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Volver al índice/Tornar a l'Index
2. Las condicionesde extracciónlíquido-líquidode las arilaminasa partir de un
extractoacuoso,son lassiguientes:
La disolución acuosade las aminasse ajustaa pH:rO - fi con NaoH 2 M y
posteriormentese extraecon éterdietílico (3x20 ml).
3. Los resultadosobtenidostras la extracciónlíquidolíquido de las arilaminasy
la preparación
de la muestra,son los siguientes:
¡
Las arilaminascon dos anillos aromáticosen su estructura,junto con la
2-nafilamina,
se recuperanentreun 90 y un 95o/o.
r Losderivadosde anilinase recuperanalrededorde un B5o/o,
á excepciónde la
y la 2,4-diaminotolueno
2,4-diaminoanisol
que lo hacenen un 23.5y un 34.3o/o
respectivamente.
.
Cuandola extracciónlíquido-líquidode la 2,4-diaminoanisol
y de la 2,44iaminotolueno se realiza con diclorometanoen lugar de éter dietílico, su
recuperaciones
aumentanconsiderablemente
obteniéndose
valoresde 67.9 v
72.5o/.respectivamente.
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Vll. Análisisde Azocolorante
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Análisis de Azocolorante
t19
Vll.1. Introducción
Una vez establecidaslas condicionesde preparaciónde muestray extracciónlíquidolíquido de las arilaminas,se procedióa estudiarlas condicionesde reducciónde
azocolorantelibre como pasoprevioal análisisde las pielesteñidas.Se estudiócómo
influían sobre el rendimientode las arílaminasuna seriede parámetrosde trabajo
como son fa proporción agente reductor/colorante,
el pH del medio, el tiempo de
y
reducción la temperaturade trabajo.
Por lo que respectaal agente reductor a emplear en el estudio, la bibliografía
consultadareferenteal análisisde colorantesazoicostrasprocesosde reducción,indica
que el másutilizadoes elditionito sódico(NazSzOr)
[190-204],aunquelascondiciones
de reducciónempleadasen cadacasodifierenbastanteentresí. Sin embargo,también
hay descritosalgunos trabajosen los que se ha empleadootro tipo de agentes
reductores,como por ejemplo el SnCl2f138,204,2051
o la hidrogenacióncatalítica
heterogénea
sobrepaladiorealizada"in situoen el mismoinyectordel cromatógrafode
gases[205].El SnCl2en principiono pareceserun agentereductorrecomendable
para
abordarel estudio,ya que lascondicionesen que se emplea(medioHCI concentrado
y
alta temperaturade reducción)puede provocaruna excesivadisgregacióndel cuero,
llegandoinclusoa producirsu total hidrólisis.En cuantoa la hidrogenación
catalítica
en el inyectorcromatógrafode gases,es un métodopensadofundamentalmente
parael
análisiscualitativode lasarilaminasen azocolorantes,
y no solucionabien el problema
de la cuantificaciónen la piel teñida. En consecuencia,
se seleccionóel ditionito
sódicocomo el agentereductormásapropiadoparaabordarel estudio.
La técnicade separación
utilizadafue la Cromatografía
de Líquidosde Alta Resolución
con detectqrde FotodiodosUV-Visible,empleandolas condicíonescromatográficas
establecidas
en el capítuloV.
Vll.2. Reactivosy Métodos
V|1.2.1.
Reactivos
En el presenteestudiose han utilizadocuatrocolorantes
azoicoscomerciales:
a
a
DirectRed28 (Merck)
Acid Red 114 (Sandoz\
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120
Capítulo VII
. DírectBlue35 (Robama)
o Acid Red 128 (/C/)
Las estructurasmolecularescorrespondientes
a cada colorantese encuentranen el
(capítuloXIV),identificados
listadode azocolorantes
por su nombrey númerode Color
lndex(Cl).
Para estimar la pureza de dichos colorantesy a modo de confirmaciónde sus
estructuras,
se llevó a cabo un estudiode los productosde reducciónde cada uno de
ellos, según el método propuesto por Kralicek [2O7f, mediante Cromatografíade
Cases/Espectrometría
de Masas(CC/MS).De esta forma, tanto en el Acid Red 128
como en el Direct Blue 35 se detectócomo productomayoritariola o-dianisidina
que
es la arilamina base correspondiente
a ambos. En el Direct Red 28 se detectó
mayoritariamente
la bencidina,mientrasque en el Acid Red 114, ademásde la o-tolidina, se detectóuna pequeñacantidadde bencidinaque tambiénse tuvo en cuentaen
el estudiode estecolorante.En lasreducciones
del Acid Red114 y del Acid Red 128,
se detectaronademásdos picos con los mismostiemposde retencióne idénticas
refacionesmlz para sus iones moleculares(248 y 263 respectivamente),
lo cual
confirmala analogíaexistenteentre lasestructuras
moleculares
de los dos colorantes.
Tabla VII.I
Purezay contenidode amina basede los colorantesDirect Red 28, Acid Red I l4,
Direct Blue 35 y Acid Red 128, según el contenido de nitrógenoorgánico total
Kjeldhal y su análisistermogravimétrico.
Pureza Estimada
ContenidoEstimado
de Colorante
(7"1
de Amina Base
(7")
Colorante
Tt
Direct Red 28
Acid Red114
Direct Blue35
Acid Red128
Tt
41.6 (5.O2')'
36.2 (2.44)-
40.0
10.8
10.3
45.0
9.'l
11 . 3
10.3(0.67).
32.4(2.1O)-
10.0
2.9
2.8
34.8
9.0
9.7
(*) Losvaloresen paréntesis
indicanel porcentaje
de nitrógenoreferidoa colorante,obtenidos
segunel métodoKjeldhal.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
An álisis de Azocol orante
121
Por otro lado, para estimarel grado de purezade cada azocolorantesometidoa
estudio,se determinósu contenidoen nitrógenoorgánicototal mediantedigestióny
posteriorvaloraciónsegúnmétodo Kjeldahl.De igual manera,se realizósu análisis
termogravimétrico
entre 30 y 600 oC en atmósferade aire. En la Tabla Vll.1 se
muestranlos resultadosobtenidosen basea cadamétodo.
Se puede ver que para el Direct Red 28 se estimóuna purezadel 41.6 y del +Ool'
respectivamente,
lo que traducidoa contenidoen su aminabase(bencidina)
expresado
como tanto por cientosobrepesode colorante,significaría
unosvaloresaproximados
de 10.8y 10.3%.Parael Acid Red 114 se estimóuna purezadel 36.2 y del 45.0o1",
que representarían
un 9.6 y un 11.3%de o-tolidina.Parael DirectBlue 35 se obtuvo
una purezadel 10.3 y del 10.0%,que correspondea una cantidadaproximadade
o-dianisidina
del 2.9 y del2.Bolo,
mientrasque parael Acid Red128 se tuvieronvalores
que corresponden
de 32.4y 34.8o1o,
a un 9.0 y un 9.7olo
de o-dianisidina.
+
t
Frentedel eluyente
t
ü
:
+
ab
Figura Vll.l.
Aplicación de la muestra
d
Cromatografíade capa fina de los colorantes(a) Direct Red 28, (b) Acid Red 114,
(c) Direct Blue 35 y d) Acid Red 128, empleandocomo eluyentela mezcla
cloroformollsopropanollagua1I 3/ 1.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
122
CapítUIo VII
Otro procedimientoque se llevó a cabo, como estimaciónde pureza, fue la
Cromatografía de Capa Fina, empleando como eluyente una mezcla
cloroformo/isopropanol/agua
1/3/1(volumen)[89,90,92].Losresultados
se muestranen
l a F i g u rV
all.1.
que el Acid Red114,el DirectBlue35 y el Acid Red128dan lugara
Puedeobservarse
la apariciónde una manchamayoritaria
acompañada
de otrasde menorintensidad,lo
cual demuestrala existenciade una mezclade compuestos.Sin embargo,para el
Direct Red 28 se apreciauna mayorpurezaen su composición,puestoque aparece
una solamanchacorrespondiente
al propiocolorante.
V11.2.2.ProcedimientoBásicode Reducciónv Extracción
Parael estudiode las condicionesde reducciónse han tomado los azocolorantes
siguientes:
DirectRed28, Acid Red1'14y DirectBlue35.
El procedimientogeneralde reducción,que ha servidocomo esquemade partidapara
el estudiode lascondiciones
de análisis,
fue el siguiente:
.
(peso)
Se preparauna disoluciónde coloranteen distintasmezclasde agua/metanol
(% en peso),dependiendo
y en distintas
concentraciones
de la solubilidad
de cada
uno. Parael Direct Red 28, se partede una disoluciónal 1.25olo
preparadaen
agua./metanol
en la proporción 511;en todos los ensayosrealizadosse pesa la
cantidadcorrespondiente
a 50 mg de colorante
comercial.
Con el Acid Red1i4, se
prepara una disolución al 0.1% en agua/metanol2/1, tomándosecantidades
comprendidas
entre10 y 15 mg de colorante
segúnel ensayo.Porúltimo,
comercial
parael DirectBlue35 se partede una disoluciónal 0.1% en agua/metanol
2/1, de
la que se pesancantidadescorrespondientes
a entre 10 y 50 mg de colorante
comercial.
o De la disoluciónanteriorse pesauna cantidadde muestra
determinada,
se llevaa
50 ml con aguay se ajustael pH inicial(pH¡)al valordeseadocon disoluciónde
H2SO4
0.25 M o disoluciónde NaOH0.5 M, mediante
un pH-metro.
o La muestraasípreparada,
se mantienedurante5 minutosbajo agitaciónmagnéticaa
temperatura
ambiente,
traslo cualseadicionael ditionitosódicoen formasólida.En
los casosen que la reducciónse realicea temperaturas
superiores,
la disoluciónse
calientahastala temperaturadeseadabajo agitaciónmagnética,y se adicionael
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde Azocolorante
123
agentereductor;en estoscasosla temperatura
se controlamedianteun termómetro
de inmersiónque llevaacopladoel agitadormagnético.
Transcurrido
el tiempode reacción,se cortala agitaciónmagnéticay se enfríabajo
el chorro de agua, midiéndoseposteriormente
el pH final (pH¡).La extracción
líquido-líquido
de las aminasy la preparación
de la muestrapara su análisis
medianteHPLC/DAD,se llevaa cabotal y como se estableció
en el capítuloVl.
Vll.3. Resultados
y D¡scusión
Parallevara cabo el estudiode optimizaciónde las condiciones
de reducciónde
azocolorantelibre, se tomó el procedimientogeneralde partida expuestoen el
apartadoanteriorcomo esquemade trabajobase,a partirdel cual se efectuóel estudio
por separadode cada uno de los factoresque podíaninfluir en el resultadofinal del
proceso.
V!1.3.1.Estudiode la RelaciónAgenteReductor/Colorante
Para estudiareste factor, se procedió a la adición en forma sólida de distintas
cantidades
de ditionitosódico,a un pH¡ determinado.
Entodoslos casosla reducción
se llevó a cabo a temperatura
ambiente(28 + 2 "C), y como t¡empode reducciónse
tomaron15 minutosde agitación
en agitadormagnético
después
de añadirel ditionito
sódico,traslos cualesse midióel pH¡.Estosuponeque el tiemporealde reducciónes
superiora los 15 minutosde agitación,
que estaría
estimándose
comprendido
entre30
y 40 minutos,ya que éstees el tiempomediotranscurrido
desdeque se adicionael
agente reductorhastaque se procedea la extracciónlíquido.líquido,que sería el
momentoen que realmentese paralizael procesode reducción.
En lo que respectaal primerode los colorantesestudiados,
el Direct Red 28, en la
FiguraVll.2 se representa
el tantopor cientode bencidinaobtenidarespectoa pesode
colorantecomercial,paracuatropH¡ distintos(2.4,5.0, B y 'l 1.0),en funciónde la
relación agente reductor/colorante
puro empleado (dit/col), expresadaen mg
ditionito/mgcolorantepuro.Se puedever que, independientemente
del valor de pH¡
ajustado,a medidaque aumentala relacióndit/col empleadatambiénlo hace la
cantidadobtenidade bencidina,hastaalcanzarun valor máximodel 10.4% a una
relacióndilcol de 2.4,a part¡rde la cualse mantiene
prácticamente
constante,
aunque
se apreciaun ligerodescenso
a medidaque se va empleandomayor cantidadde
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
agentereductor.Porotro lado,se observaunadisminuciónapreciableen los valoresde
al restode pH¡, para
a los correspondientes
bencidinaobtenidosa pH¡:11, respecto
por debajode 2.4. sin
una mismarelacióndilcol, siemprey cuandoéstapermanezca
embargo, para relaciones superiores,la cantidad de bencidina obtenida es
del pH¡del que se parta.
independiente
2
315
i¿fJ
GolorantePuro
mg D¡t¡onito/mg
de bencidinafrentea la relaciónditionitolcolorante
FiguraVII.2. Variacióndel porcentaie
puro, parael coloranteDirectRed28, partiendode lospH¡ (.) 2.4,(o) 5.0, (l)
28 oC'
8.0 Y (t¡ | t.0. TemPeratura:
a los otros dos
En la Figura Vll.3 se muestranlos resultadoscorrespondientes
el tanto por ciento de las aminas
azocolorantesestudiados,representándose
en funciónde la relacióndilcol puro. En amboscasosel estudiose
correspondientes
de PH¡:5.
llevóa cabopartiendo
de su arilaminabase
por lo que respecta
al DirectBlue35, se apreciaque el porcentaje
a su valormáximo,alrededorde un 2.5o1o,7
(la o-dianisidina)
llegamuy rápidamente
constanteal aumentarla
de forma prácticamente
relacióndilcol 5.1, manteniéndose
cantidadde agentereductorempleado.
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Análi sisde Azocolorante
125
En cuantoal coloranteAcid Red 1 14, se observaque los porcentajes,
tanto de o-tolidina como de bencidina,aumentancon el incrementode la relacióndit/colhastallegar
a unosvaloresmáximosde 8.0% parala o-tolídinay de un 0.12o1,
parala bencidina,
en un intervalodilcol comprendido
entre8.5 y 13.8.Trasestosmáximos,se aprecia
un claroefectonegativosobrelosvaloresobtenidosparamayorescantidades
de agente
reductor.
10
0 .e 0
0,16
t"
a
ql
r#l
c
a
E
qt
I
{
s
t
0.12
lll
t---------+
a
I
I
0.0E
t
T
T
--l
0,04
ñn
0,00
tü0
150
r n g D i t i o n i t o l r nC
g o l o r a n t sP u r o
FiguraVtt.3. Variación del porcentajede arilamina frentea la relación ditionitolcolorante
puro. pH¡:5, Temperatura:28oC.(o) o-to/idina(Acid Red 114),(.) bencidina
(Acid Red114),E) o-dianisidina
(DirectBlue 35).
<-
: Valor correspondiente
al ejede ordenadas
izquierdo.
: Valor correspondiente
al ejede ordenadas
derecho.
En estesentidocabemencionar
la aparición
de un pico cromatográfico
con tiempode
retención(tn)36 minutos,que comenzabaa detectarse
precisamente
a partir de las
condiciones
en lasque losporcentajes
obtenidos
de lasaminasempezaban
a disminuir
(relacióndit/col13.8),alcanzando
un máximocuandola relacióndit/colera de 34.5.
Con el fin de identificardichocompuesto,
se analizaronmedianteCC/MSdos muestras
preparadas
a tal efecto:unase redujoen lascondiciones
dondese producíala máxima
cantidadde dicho compuestoy otra,en las condicionesen que no se detectaba.Sin
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Capltulo Vll
126
lo cual indica
embargono se apreciódiferenciaalgunaentreamboscromatogramas,
que dicho compuestono se puede detectarmedianteCC/MS, bien porque no se
o bien porque queda
volatilizao se descomponeen el ¡nyectordel cromatógrafo,
retenidoen la columna.
parael Acid Red 114,la variaciónque experimentan
En la FiguraVll.4 se representa,
al pico
de las aminasobtenidasjunto con la correspondiente
las áreasnormalizadas
mencionadocon tp 36 minutos,respectoa la relacióndilcol. La normalizaciónde las
por el volumen final al que se llevó cada
áreasse llevó a cabo multiplicándolas
por el pesode colorantedel que se partió.
muestray dividiéndolas
EO
a
6
g
60
a
6
.N
d
E
o
z
40
a
t
a
a
I
t
lao
6
o
20
llr
I
29
58
a
a
a
I
I
AT
116
145
m g D ¡ t ¡ o n i t o / mcgo l o r a n t eP u r o
Figura VII.4. Variación del área normalizada (a.n.) frente a la relación ditionitolcolorante
puro, parael coloranteAcid Red 114.pH¡-5, Temperatura-28 oC. (o) a.n. de
'104,(r)
a.n.de bencidinax 104, (.) a.n. del pico con tR36 minutosx
o-tolidinax
10-s.
En la gráficase observacómo en el mismomomentoen que lasáreasde los picosde
el áreadel pico a
lasarilaminascomienzana decaer,va aumentandoprogresivamente
36 minutoshastaalcanzarun valor máximoa partirdel cual comienzaa descender
que la aparición
paulatinamente.
de dichopico puedeser
Enprincipio,podríapensarse
por
originado una posiblereacción
debidaa la formaciónde un productointermedio
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Anál isis de Azocolorante
127
de lasarilaminascon otroscompuestos
derivadosde la estructura
del azocolorante.
Sin
parece
ya
que
embargono
serasí,
se apreciacómo la disminuciónque experimentasu
áreauna vez alcanzadoel máximo,no va acompañado
del correspondiente
aumento
en las áreasde las aminascomo debieraocurriren tal caso.Por tanto, lo más lógico
seríapensaren la existencia
de una impurezapresente
en el propiocoloranteque diera
lugara la apariciónde estepico durantela reducción,paralelae independientemente
a
la formaciónde las arilaminasy sin afectaren nadaa suscomportamientos.
Hay que
tener en cuenta que el colorante,al ser de origen comercial,puede presentaruna
composiciónbastantecomplejay difícil de conocercon toda la exactituddeseada.
Por otra parte, si se observanlas cantidadesmáximasde amina base obtenidaspara
cada colorante, se puede estableceruna primera comparación con los valores
esperados
segúnlos criteriosde purezautilizados.Porun lado,se observaque tantoel
Direct Red 28 como el Direct Blue 35 presentan
valoresmuy próximosa los teóricos
estimadospor amboscriterios,mientrasque en el casodel Acid Red 114 se obtieneun
valor inferiora los estimados.
De lo dicho anteriormente,
se deduceque cada colorantepuede presentardistintas
relacionesóptimasdilcol con las cualesse obtengala máximacantidadde arilamina
posible,e inclusopuedeocurrirque un excesode agentereductorocasionase
efectos
negativosen el rendimientode la reducción.Resultados
análogoshan sido indicados
por Lancaster
y col. [191].
A la vista de los resultados
obtenidospara los tres azocolorantes,
se vislumbrandos
comportamientos
distintosfrenteal empleode distintascantidades
de ditionitosódico
en la reducción.Una es la que presentan
y
el Direct Red28 el Direct Blue 35, en los
que se obtiene la cantidadmáximade amina muy rápidamentey con una relación
dilcol bastantebaja, a partir de la cual se mantienenprácticamenteconstante.Otra es
la que presentael Acid Red 114 en el que se apreciaun aumento gradual del
porcentajede arilaminaobtenidoa medidaque se incrementala relacióndit/col,hasta
alcanzarun valor máximoa partirdel cualse produceun descenso
de dicho valor"
Portanto,a la horade abordarel análisisde un problemadesconocidose han de tomar
solucionesde compromiso,máxime cuando se desconocetanto la estructuradel
colorantecomo toda su historia,en cuantoa su procesode síntesisse refiere.No
obstante,de los valores consultadosen la bibliografía[190-204],así como los
obtenidosen el presentetrabajo se puede indicar que relaciones,en peso, de
ditionito/colorante
comprendidasentre 2 y 15 puedenser valoresapropiadospara
obtenerunosrendimientos
adecuados
en el procesode reducción.
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Un dato impoftantea teneren cuentaes el hechode que, en la mayoríade los casos,
el pH al final del procesono coincide con el ajustadoen un principio antes de
adicionarel agentereductor.En concreto,por lo que respecta
al Direct Red28, en la
TablaVll.2 se muestranlos valoresde pH¡ medidos,paracada pH¡ y relacióndilcol
empfeados.Como se puede ver, cuando se parte de pHi 2.4 no se producen
(5, B y 11).
variacionessignificativas,
cosaque sí ocurreparael restode pH señalados
En estoscasos,cuandose empleanrelaciones
dilcol hastade 2.4,|a caídaes de una
unidadde pH aproximadamente
si se partede pH 5 y B, y de cuatrounidadescuando
se partede 11; mientrasque cuandose trabajacon relacionesmayores(16.8y 23.8),
quedandosiempreentre2.6 y 3. En
los pH¡ en todos los casosse asemejanbastante,
cuanto al Acid Red 114, los valoresde pH¡ estáncomprendidosentre 3.5 y 4.5,
partiendosiemprede pH' 5; mientrasque parael DirectBlue 35 se encuentranentre
3.3 y 4.1, partiendoigualmentede 5. Portanto,la caídade pH paraestosdos últimos
colorantesno es demasiadoacusada.En cualquiercaso/parececlaro que no se puede
asegurarnunca un pH constantedurantetodo el procesode reducción,por lo menos
ajustándolode la maneraen que se haceen estamemoria.
TablaVII.2. Valores de pH¡ alcanzadosen Ia reducción del Direct Red 28, para diferentes
relacionesditlcol y diferentespH,. Temperatura:28 oC.
Valoresde pH¡según los siguientesvaloresde pH,
Ditlcol
2.4
5.0
8.0
| 1.0
0.5
2.5
5.3
7.1
9.2
1.0
2.7
4.9
6.7
7.5
1.3
3.0
5.1
6.7
7.2
1.8
3.0
4.9
6.5
7.O
2.4
2.8
4.2
6.2
6.7
16.8
2.4
2.6
2.8
3.0
2.8
2.8
2.7
23.9
Un hecho importantea resaltarparael coloranteDirectRed 28, es que en los únicos
casosen que el pH¡ se aproximao superael valor de siete(pH,de 11, a relaciones
dilcol inferioresa 2.4), es precisamente
cuandose observauna disminuciónde los
porcentajes
de amina respectoa los obtenidosen otroscasos,para igualescantidades
de agentereductor.Estopareceindicarque el pH del mediopuedetenerinfluenciaen
el procesode reducción.
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Análisis de Azocolorante
129
vl¡.3.2. Influenciadel pH del Medioen el Procesode Reducción
Una vez elegidaslas relacionesdilcol óptimascorrespond¡entes
a cada colorante,se
estudióla influenciadel pH del mediosobreel resultado
final del análisis,
tomando
como cantidades
óptimasde agentereductorlasdeducidasanteriormente.
Paraello, se
ajustael valordel pH¡ mediante
disoluciones
de ácidosulfúrico0.25M o de hidróxido
sódico0.5 M. Tantoel pH¡ajustadocomo el pHl trasla propiareducción,se controlan
haciendouso de un pH-metro.Todaslas pruebasse llevarona cabo a temperatura
ambiente(28x2 "C) con agitaciónmagnéticadurante
15 minutos(portanto,de 30 a
40 minutosen tiemporeal).
Losresultados
obtenidos
se representan
en la FiguraVll.5,en dondese muestran
junto
con los valoresde arilaminaobtenidos,expresados
en tanto por cientosobrepesode
colorantecomercial,los pH¡y pHr correspondientes.
En lo que respecta
al DirectRed
28 (FiguraVll.5.A),se apreciaque mientras
pH¡
por
el
esté
debajode 7, el valorde la
bencidinase mantienealrededor
y a medidaque el pH¡sobrepasa
del 10.5oio,
el valor
de 7, el porcentaje
de bencidinava disminuyendo
hastaalcanzarun 6.6% cuandoel
pHies de7.27. Portanto,parecehaberunarelaciónentreel valorquetomael pH a lo
largodel procesoy el resultado
de la reducción.
Otro casototalmente
distintoes el del DirectBlue35. Como puedeverseen la Figura
Vll.5.B,ni el pH¡ ni el pH¡ parecentenerinfluenciaalgunasobreel porcentaje
de su
arilaminabase(lao-dianisidina),
manteniendo
siempreun valoren torno al2.5olo.
Con el Acid Red 114 (FiguraVll.5.C) se apreciala existenciade dos efectos
simultáneos.
Por una parte,se observaque a medidaque el pH¡ va aumentandose
produceun decrecimiento
en los valoresobtenidosde o-tolidinay de bencidina,
pasandode un 9.Bol"y de un o.22ol.respectivamente,
cuandoel pH¡ es de 1.33,a un
7 . 1 o l yo u n 0 . 1 0 % ,c u a n d oe l p H ¡ e s d e 1 1 . 0 ,s i e m p r eq u e e l p H ys e m a n t e n g a
en
valorescomprendidos
entre 3.5 y 4.0. Por otro lado, cuandoel valor del pH¡ se
aproximao superael valorde 7, se produceun fuertedecrecimiento
en losvaloresde
otolidina y bencidina,de tal maneraque cuandoel pH1alcanzael valor de 8.9 se
o b t i e n e nu n 0 . 9 %d e o t o l i d i n ay u n 0 . 0 5 %d e b e n c i d i n a .
Estodenotauna mayorinfluenciadel pH en estecaso,puesno sóloes importanteel
valorfinal que toma,sinoque un aumentode su valorinicialen el medíoacuosotiene
un efectonegativosobreel resultado
final,si bien es ciertoque dicho efectose acentúa
cuandoel valordel pH¡es mayorquesiete.
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130
Capítulo vll
1Z
{o
I
E
4
2
o
12
ffi
pH inicial
ffi
pH final
I
YoBencidina
14
15,
10
I
0
4
2
0
123
ffi
pH inicial
45
ffi
PH final
I
q¡oo-Dianisidina
12
t0
t
0
4
z
o
mpH
12346678
inicial repH
final nasqi/oTolidina l9ro
Bencidina
FiguraVII.S.lnfluencia del pH¡ sobre el porcentaje de arilamina, para |os colorantes (A) Direct
Red 28, (B) Acid Red 114, (Q Direct BIue 35. Temperatura:28 oC.
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Anál isis de Azocolorante
131
Al igual que en el apartadoanter¡or,en el Acid Red 114 también se detectó la
presenciadel pico con tp 36 minutos.En la FiguraVll.6 se representa
su área
junto con la de las arilaminas
normalizada
obtenidas,
en funcióndel pH¡. Se puede
apreciarque, a partirde pH¡:11.5, la disminución
que experimenta
el áreade dicho
pico no se acompañasimultáneamente
de un aumentode lasáreascorrespondientes
a
lasaminasliberadas,lo cual concuerdacon lo afirmadoanteriormente,
atribuyendola
pico
aparicióndel
en cuestióna una posiblecontaminación
del colorante.
E
U
d
.N
d
E
o
z
úú
o
{
0
0,0
2.5
5,0
7.5
l0 rr.0
I 1.5
12,0
pHi
FiguraVII.6. Variacióndel áreanormalizada(a.n.)frenteal pH¡ para el coloranteAcid Red
oC.(o) a.n. de o-tolidina
114.pH¡:S, Temperatura:28
x 106, (r) a.n.de
'!0s,
(a)
bencidina
x
a.n.del picocontr 36 minutos
x l0-6.
Con el fin de estudiarla variacióndel pH duranteel procesode análisis,se llevó a
cabo un control de éste duranteel tiempo de reacción,partiendode distintospH
inicialesy de distintascantidadesde agentereductor,en presenciade los colorantes
DirectRed 28 y Acid Red 114. En cuantoal primero,los resultados
se muestranen la
FiguraYll.7, en dondese representa
la variaciónde pH que sufreel medioacuosocon
respectoal tiempo,partiendode distintospH inicialesy a distintasrelacionesdit/col.
En ellasse observaque la tendenciageneraldel pH es a descendero a mantenerse
en
el tiempo.Parececlaroque cuantomayores la cantidadde d¡t¡onitosódicoempleado,
mayor es la caídade pH producida.En la FiguraYll.T.C(relacióndi/col:1.4) se
apreciaque, al partirde pH 11, se llegaa un valorfinal ligeramente
por encimade
siete,cosaque no ocurrecuandose ajustainicialmente
a B, 5 o 2.4, en donde los
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132
Capítulo Vll
a pH¡:'11 dondela cantidad
valoresfinalesse mantienen
entre3 y 6. Esprecisamente
de bencidinaobtenidaes menor respectoal resto de pH¡, para la misma relación
dit/col. Por otro lado, los valoresfinales de pH observadosen todos los casos,
en los distintosensayos.
coincidencon los medidosexperimentalmente
¡¡
A
.to
I
pH l=l I
6
o.
4
3
2
.14
z1
Tiempofninutosl
12
11
'to
g
-¡3.'.'.r.¡r-'rr.a.¡.-..-o.-r{=jt-
o"
sBota3eoaooo¡Goacoa¡eeco¡Eocga
pH¡¡6
4
3
Ittalrrrlltrl¡lt¡rrrrrl
I
t
2
10
I
Tien{po(rninutos}
C
l0
o.
_
-lrigogr¡g.J
ó !_.L
!-
PjL=]1.!]
oesosooessgoeooscaooeoeoooo pflFa
pHi=6.0
.
l0
FnF2.4
20
Tiempo(minutos)
FiguraVII.T" Variacióndel pH de reduccióndel Direct Red 28, partiendode distintospH¡y
ditlcol (A) 24, (B) 2.4 y (q L4. Temperatura:28 oC.
tomandolas relaciones
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde Azocolorante
133
En la FiguraVll.B,se muestrala variacióndel pH con respectoal tiempoen el casodel
(13.8y
Acid Red 114. En la FiguraVll.B.Ase muestran
dos relaciones
di/col distintas
34.5) partiendoen amboscasosde 5 como pH inicial. Se observaque, a pesardel
comportamiento
anómaloproducidoa los 30 minutospararelacióndit/col34.5,el pH
va cayendo gradualmentehasta llegar a un valor que coincide con el medido
experimentalmente
en los ensayos.
En la FiguraVll.B.Bse partede distintosvalores
pH
inicialesde
manteniendo
constante
la relacióndít/colen 13.8.En ella se aprecia
que el valorfinal de pH alcanzado
rondasiempreel 3.5,a excepcióndel casoen que
se partede 11.5,en dondese alcanzaun valorfinal cercanoa siete;es precisamente
a
partirde esepH¡ de 11.5 dondese produceunafuertecaídaen el porcentajede amina
obtenida.
O iUGoF34.6
E
!5
q.
4
.sb"o'=-..r,"gJloo
E@r
3
2
30
40
Tiempo(minutos)
12,
JO
I
=oe
pHi=5.0
4
g.
o
26
3S
Tiempo(minutos)
Figura VIL&. Variación del pH de reducción del Acid Red 114, (A) empleando distintas
relaciones
diÜcoly (B) partiendode distintospH¡. Temperatura:28oC.
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I oqx.
6
cLo
cororante
t ¡:
]....
Sin Goloranta
a/con
"-..:'::lr:,o...o1
t0
t5
20
30
TiernPo(rninutos)
presencia
de 500mg de
Figuravll.9. variación delpH det medioacuosofrenteal tiempo,en
28'
dition¡tosódico,cony sinla adiciónde 49.8 mg del coloranteDirect Red
oC.
TemPeratura:28
la variacióndel pH en el medioacuoso,partiendode I
En la FiguraVll.9 se representa
en ausenciay en
como valor inicial,ante la adiciónde 500 mg de ditionitosódico,
5e desprendede ella que la
presenciade 49.8 mg de Direct Red 28 respectivamente.
la presenciade
caídade pH se debe básicamenteal propio agentereductor.si acaso,
pH¡ al que se
colorantelo que provocaes una caídamássuaveen el tiempo,aunqueel
de la presenciade colorante.
llegaen amboscasoses el mismo independientemente
puede
Estopuedeteneruna explicación,ya que el ditionitosódico,en medioácido,se
de la manerasiguienteL247,24812
dismutándose
descomponer
--'--;>
3 S2Oa2-+ 3 H2O
--'---->
2S2Oa2'+ H2O
52- + 5 SO32-+ 6 H*
S + 3 SO32-+ 2 H*
medio,
El que lo haga de una forma u otra depende del grado de acidez del
la primeradismutaciónfrentea la segundacuantomayorseael pH' En
favoreciéndose
medio
cualquiercaso,parececlaro que el ditionitosódicoprovocareacciónácidaen
de pH duranteel procesode reducción.
acuoso,lo cualda lugara unadisminución
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Análisis de Azocolorante
135
A la vistade estosresultadosse podríadecirque, paraciertoscolorantes,
cuanto más
básico sea el medio, el procesode reduccióndel grupo azo se encuentramenos
favorecido.Estosresultados
concuerdancon las condicionesde reducciónutilizadas
por Tomasselliy col. [201,202], que llevana cabo la reducciónen medio básico,a
60 "C y durantet hora. Estoes una pruebamásde lo diferenteque puedenser los
comportamientosde un colorantea otro, frente a unas condicionesde análisis
determinadas.
A modo de conclusiónrespectoal factorde pH, pareceevidenteque mientrasse
trabajecon pH¡ ácidoso ligeramente
ácidos(por ejemploentre3 y 6), el procesode
reduccióndel grupoazo se encuentrafavorecido,de formaque un pH¡ de 5 se puede
tomar como un buen valor inicialpara llevara cabo la de reduccióncon ditionito
sódico.
V!1.3.3.Variacióndel Tiempode Reducción
Una vez estudiadoslos parámetros
de relacióndilcol y pH del medio,un tercerfactor
a teneren cuentaes el tiempode duraciónde la reducción.
Paraello se tomaronlas
cantidades
de agentereductoróptimasencontradas
paracadacolorantey un pH¡ de 5.
Antesde comentarlos resultados
obtenidosen esteapartado,convendríadejar claro
cómo se llevó a cabo el controldel tiempode reacción.Como ya se ha dicho, el
tiempo realde la reducciónno coincidecon el de agitaciónen la placaagitadora.por
tantose decidióque a la horade controlarel parámetro
tiempo,se debíaprescindirde
medir el pH al final del procesoy añadir la sosa inmediatamente
despuésde
transcurridoel tiempo seleccionado,
paraextraeracto seguidocon éter dietílico.De
estaforma, el tiempo queda controladode maneramás precisa.Como en los casos
anteriores,
la temperatura
empleadafue de 28 ! 2 oC.
En la FiguraVll.10se muestrael porcentaje
de aminaobtenidoparalostrescolorantes,
función
en
del tiempode reducción.En principio,se observan
dos comportamientos
distintos.
Por un lado,el DirectRed28 y el DirectBlue35 (pH,:5) muestran
siempre
el mismo porcentajede arilaminaindependientemente
del tiempo empleadoen la
reducción(entornoal 10.4y 2.5olo
respectivamente).
Porotro,en el Acid Red 114 se
observaun aumentode los valoresde la o-tolidina
y de la bencidinaa medidaque se
emplean tiempos cada vez mayores/observándose
que los porcentajesde ambas
aminasse estabilizan
en un 8.0 y un 0.12% respectivamente,
a partirde los 30-40
minutos.Estosvaloresdel Acid Red114,coincidenbastante
biencon los obtenidosen
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
paralasmismascondicionesde relacióndit/coly pH, ya que el
anteriores
losapartados
tiempo transcurridodesdela adicióndel ditionitosódicohastala extraccióncon éter
dietílicose estimóque estabacomprendidoentre30 y 40 minutos.
o.go
1?
't0
e
a
0.25
o
6
c
<-o
o
0.20
o
E
ql
ñ
t
+-'
0.15
o
T
O I
<_
Il
't0
r+I
I
0,10
+O
0.05
0.00
20
40
50
70
TiamPo{rninutos)
FiguraVII.I0.
oCVariación de! porcentajede arilaminafrenteal tiempo. Temperatura:28
(o) bencidina(Direct Red 28),(') o-tolidina(Acid Red 114),F) bencidina
(Acid Red n4), (.) o-dianisidina(Direct Blue 35, PH¡-5), ()) o-dianisidina
(DirectBIue35, PH¡:12).
+izquierdo.
al ejede ordenadas
: Valor correspondiente
--'---'-:> : Valor correspondiente
al eie de ordenadasderecho.
Por otra parte,cuandoel DirectBlue 35 se reducea un pH¡:12 y se deja sólo 30
segundosde agitación,el porcentajede odianisidina(1.6%)disminuyeun 38%
respectodel valor obtenidocuando el tiempo de agitaciónes'de 15 minutos,gu€
coincide con el máximo (2.6"1').Esto pruebaque cuando el medio acuoso es
y por
básico,la velocidadde reaccióndisminuyeconsiderablemente
marcadamente
pequeño, se
tanto, cuando la reducciónse detiene a un tiempo suficientemente
al máximo.La pruebaes que a PHi:5, a pesarde
puedenobtenervaloresinferiores
de o-dianisidina.
empleartiemposcortos,se sigueobteniendoel máximoporcentaje
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A nálisis de Azocol orante
137
Se puededecirque el tiempode reducción,dependiendodel tipo de colorante,puede
estarafectadopor el pH del medioy posiblemente
por otrosparámetros
talescomo la
temperatura.Sin embargo,en ningún caso se ha observadoque tiempos largosde
reducción produzcan algún efecto negativo en el rendimientode la arilamina
correspondíente.
Sin embargo,Lancasterycol.[190]en la reducciónde los colorantes
FD & C Yellow No 5, FD & C Yellow No 6 y FD & C YellowNo 40 indicanque un
incrementoen los tiemposde reducciónpuede afectara la recuperacióny utilizan
tiemposentre30 y 45 segundos;no obstanteel pH de la reducciónestabaajustadoa
2 . 1- 2 . 3 .
zo0
g
H
i6o
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I
TI
ü)
30
40
50
Tiempo(mlnutos)
Figura vll.l1.
Variacióndel área normalizada(a.n.) frentetiempo, parael colorante Acid Red
114, tomando como relación ditlcol (A) t3.B y G) 34.5. pH¡:5,
Temperatura:28oC. (.) a.n. de o-tolidinax 10's,(¡) a.n. de bencidinax 10-5,
(a) a.n. delpico contR 36 m¡nutos
x 105.
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138
capíturovtt
En el estudiodel factortiempo,tambiénse hizo un seguimientodel pico con tq 36
minutosque se muestraen la FiguraVll.11, en cuyasgráficasse representan
las áreas
normalizadas
de la o-tolidina,bencidinay pico a 36 minutoscon respectoal tiempo,
empleandodos realcionesdit/col distintas:13.8 (FiguraVll.11.A)y 3a.5 (Figura
v i l . 11 . B ) .
La tendenciadel compuestodesconocido
es clara:en los primeros10 minutossu área
normalizadaaumentaprogresivamente
hastaalcanzarun máximo,a partir del cual
disminuyehastaprácticamente
desaparecer.
Por otro lado, las áreasnormalizadas
de
lasaminasaumentandesdeel principiohastallegara un máximoasintótico
a partirde
los 30 minutos aproximadamente.
Esto coincide con lo indicadoanteriormente
respectoa Ia atribuciónde estepico a una impurezapresenteen el colorante.Como
erade esperar,se apreciaque parala relacióndilcol 34.5 su máximode áreaobtenido
a los 10 minutoses mayorque el correspondiente
a la relación13.8(aproximadamente
el doble). Lógicamente,con la relación 34.5 se requiere más tiempo para su
eliminaciónpuestoque seformamayorcantidad.
V|1.3.4.Variaciónde la Temperatura
de Reducción.
Para estudiarel efecto de la temperaturasobre el procesode reducción,ésta se
controlómedianteuna placatérm¡caagitadora,la cual disponede un termómetrode
inmersiónconectadoa la mismaque controlaen todo momentola temperaturadel
medio,ajustadapreviamente.
De estaforma,se asegurade que no hayanvariaciones
importantes
(+ 1 oC).Al igualque en el
de temperatura
duranteel tiempode reduccíón
apartado
anterior,el pH6no se midió.Unavez transcurrido
el tiempode reducción,se
basificórápidamente
con NaOH 2 M, y se extrajocon éterdietílicotrasenfriarbajo el
chorrode agua.En cuantoal restode condicionesde trabajoempleadas,
se tomaron
como relacionesdilcol las óptimasencontradas
para cadacolorante,como pH¡ 5 y
comotiempode reducción15 minutos.
En la FiguraVll.12 se representan
los porcentajes
de arilaminaobtenidosparalos tres
azocolorantes
en funciónde la temperatura
aplicada.En ella se puedenobservarque,
al igual que pasabacon el factortiempo,existendos comportamientos
muy distintos.
Por un lado, tanto el Direct Red 28 como el Direct Blue 35 presentanen todo
momentoel mismovalor máximoalcanzado
ya a temperatura
ambiente;es decirque
el resultadodel análisispara estoscoloranteses independiente
de la temperatura
empleadapues se obtienesiemprela máximacantidadposible.Cosamuy distinta
ocurrecon el tercercolorante,
el Acid Red 114,en el que se puedeapreciarcómo la
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Análisis de Azocolorante
139
bencidinay la otolidina aumentanprogresivamente
conformelo hace la temperatura,
pasandode unosvaloresmínimos,a28oC, de 0.10 y 6.3% respectivamente,
a otros
oC,
prueba
y
que
máximos,a70
cual
de 0.27 11.Oo/o,lo
en estecasoes necesario
la
para
obtener,
en
el
mismo
aplicaciónde alta temperatura
intervalode tiempo, el
máximorendimiento
trasla reducción.
12
0,50
f::
-af
t0
0.40
a
6
.=
E
0.30
Il
+-a
6
I ---+
0.20
s
t
¡
l0
20
30
40
<_r
50
0.10
70
80
0.00
90
Temperatura(oG)
FiguraVII.I2. Variación del porcentaje de arilamina frente a Ia temperatura.pH¡:5,
Tiempo:l5 minutos.(o) bencidina(DirectRed 28), (.) o-tolidina (Acid Red
(DirectBlue 35).
114),(.) bencidina(Acid Red1l4), (.) o-dianisidina
+al ejede ordenadas
: Valor correspondiente
izquierdo.
--------------Valor
al
eie
de
:
correspondiente
ordenadasderecho.
Estoes una pruebamásde que el Acid Red 114 precisade condicionesde trabajomás
enérgicasque los otrosdos colorantes.Por tanto,a la hora de analizarun colorante
realizarla reduccióna temperatura
desconocido,seríaconveniente
elevada(70 oC por
ejemplo),máximeteniendoen cuentaque en el casode pielesteñidas,el colorantese
del ditionito sódico a éste puede verse
encuentrafijado a la piel y la accesibilidad
d ificultadaconsiderablemente.
Con respectoal Acid Red114, hayque decirque el pico con tp 36 minutosdetectadoa
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140
Capítulo vll
temperaturaambiente,dejó de detectarse
cuandola reducciónse realizóa 40 "C, lo
cual deja másclarosi cabesu escasaimportancia
en cuantoa los porcentajes
finalesde
que es lo que realmente
lasarilaminas
trasel proceso
de reducción/
nosocupa.
V¡¡.3.5. Variaciónde la Cantidadde AgenteReductor,pH lnicial del
Medio y Tiempode Reduccióna Alta Temperatura.
Una vez estudiados
los factores
relacióndiVcol,pH del medioy tiempode reducción
en el análisisde azocolorante
a temperatura
ambiente,
se intentóver la influenciaque
podía tener la temperaturasobre los efectosproducidospor dichos factoresen el
resultado
final.Al mismotiempo,seestudiala conjunciónde unaseriede condiciones
enérgicasque son las que probablemente
se necesiten
de caraal análisisde las pieles
teñidas.
En la TablaVll.3 se muestranlos resultados
obtenidosen esteapartado.En primer
lugar,se puede apreciarque en los tres azocolorantes,
cuandose empleangrandes
excesosde agentereductor,se produceun ligeroefectonegativosobrelos porcentajes
finales.Enconcreto,en el DirectRed28, la bencidina
disminuyeligeramente
conforme
aumentala relacióndit/col,de tal formaque cuandoéstapasade 2.4 a 24.1,el valor
de la bencidina
disminuye
d e 1 O . 4a 1 0 . 1 % q
, u e e s e l m i s m oo r d e nd e d i s m i n u c i ó n
que experimenta
a 28oC paralasmismasrelaciones
dit/col,pasando
de 10.5a 10.0%.
Lo mismoocurrecon el Acid Red 114;así,cuandola relacióndilcol aumentade '13a
1 3 8 ,s e p r o d u c eu n a d i s m i n u c i ódne l a o - t o l i d i n da e l o r d e nd e u n 1 5 % ,p a s a n d o
de
10.8 a 9.2"1o,
similaral ocurridotambiéna28"C paralas mismasrelaciones
dilcol,
pasandode B.1o/o
a 6.4olo.En cuantoal Direct Blue 35, se apreciatambiénuna
d i s m i n u c i ódne l a o d i a n i s i d i ndae l o r d e nd e u n 1 6 % ,p a s a n ddoe 2 . 5 a 2 . 1 % ;e n e s t e
caso a 28 "C no se apreciaefecto negativo.Estosresultadosconcuerdancon lo
indicadopor Lancaster
y col. [.191]en cuyotrabajose afirmaque el usode un exceso
de agentereductorpuedeprovocarefectosnegativosno deseados
sobrelos resultados
finales.
Cuandola reducciónse realizaen mediotamponado,
a pH 4.6 (tampónacético/acetato
(tampón
0.1 M) y pH 6
ácido cítrico0.06 ltvVNaOH
0.16 M), se observaque los
resultadosen los tres colorantesse mantieneninvariables
respectoa los valores
máximosobtenidosa pH¡:5, lo cual indicaque mientras
se estédentrode un margen
preferiblemente
de pH determinado,
ácidoo ligeramente
ácido,se tendrásiempreel
máximo rendimientoen el análisis.Por otro lado, se constataque el mantener
constanteel pH durantetodo el procesode reducción,empleandodisoluciones
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Anál isisde Azocolorante
141
reguladoras,
no produceincrementoalguno en los resultados
obtenidos;es decir, el
hecho de que el pH varíe no es contraproducente.
Por tanto, no es necesariotamponar
el medio acuosoparallevara cabo la reducción.
Tabla VII.3. Estudiode las condicionesde reducción a 70 oC de los colorantesAcid Red 28,
Acid Red114y DirectBlue35.
Dit/co)
2.4
24.1
96.2
2.4
2.4
2.4
13.6
Tiempo
(min)
Direct Red28
J
15
10.4
5
5
15
10.1
15
10.0
4.611
15
10.3
6.0(.')
5
15
10.4
60
10.4
PH¡
Bencidina
Acid Red114
eTolidina
Bencidina
)
15
10.8
11 . 0
o.29
o.27
Direct BIue35
o-Dianisidina
34.9
5
15
110.1
5
15
10.1
0.19
137.9
5
15
9.2
0.'t5
552.5
5
15
8.9
o.17
34.5
4.6(\
15
10.7
34.5
6.0('-)
15
10.7
34.1
5
30
11.0
35.0
5
45
11.1
o.26
0.20
o.29
0.28
48.6
5
15
2.5
5
15
2.1
48.6
4.6rt
15
2.6
49.6
6.0(")
15
2.4
60
2.3
1940.0
48.6
(*)
(**)
Tampónácidoacético/acetato
sódico,0.1 M (pH:a.6).
Tampónácidocítrico0.06 tWNaOH0.16 M (pH:6).
Asimismo,se compruebaque el empleode un granexcesode tiempotampocoparece
afectaral porcentajede aminaobtenidoen ningunode los colorantes,al contrariode
y col. en uno de sustrabajostl901.
lo afirmadoLancaster
parecenindicarque cuandola reducciónse realizaa 7O oC,el único
Estosresultados
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142
CapítuloVII
factorque habríaque controlar,en cuantoque estásujetoa una posibledisminución
en los resultados
finales,es el de la relacióndit/col,puestoque tantoel pH¡ como el
tiempono parecenprovocarningúnefectonegativosobreéstos.
Por otra parte, si se comparan los valores promedio máximos obtenidos
experimentalmente,
trasla reducciónde los colorantes
(1O.4'1"
estudiados
de bencidina
parael DirectRed28, 11.Ool"
de o+olidinaparael Acid Red 114y 2.501.
de o-dianisidinaparael Direct Blue 35), con los valoresteóricosestimados
que se indicanen la
puede
TablaV|.2,
verseque parael Acid Red 114,la cantidadde o.tolidinaobtenida
experimentalmente
se encuentradentro del intervalode concentraciones
teórico
estimado,el cual estácomprendidoentre9.1 y 11.3"/o,
mientrasque en los otrosdos
colorantes,los valoresobtenidosexperimentalmente
se aproximanbastantebien a los
valoresteóricosestimados.
Encualquiercaso,estodenotaun rendimientode la ruptura
reductivadel grupoazo con ditionitosódico,muy próximoal "100o/o.
Las condicionesde reducciónde azocolorantedescritasen la bibliografíadifieren
bastanteunasde otras.Sin embargo,lo que convienetenerpresentees que en general,
y sobretodo cuandose estéante un colorantecuyahistoriaseadesconocida,
el usode
unascondicionesde trabajoque no seanlo suficientemente
enérgicas,
como puedeser
el trabajara temperaturaambiente,podría suponer la no obtencióndel máximo
rendimientotrasel análisis(comoocurriríaen el casoconcretodel Acid Red 114).
v|1.3.6.EstudioComparativoentreel Acid Red114y el Acid Redt28.
Con el fin de compararlos comportamientos
frentea la reducciónde dos colorantes
con estructuras
molecularesmuy similares,se estudióel Acid Red 128, cuya única
díferenciacon respectoal Acid Red 114 es la presenciade odianisidina como
arilaminabaseen'lugarde o-tolidina,
siendoigualel restode la molécula.
En lasFiguras
Vll.13y Vll.14se representan
los resultados
obtenidosparael Acid Red
128 referentes
al estudiode variaciónde la relacióndit/coly del pH¡ respectivamente,
tomandocomo tiempode reducción15 minutos.Losvaloresde arilaminaobtenidosse
expresanen tantopor cientosobrepesode colorantecomercial.
En la FiguraVll.'13,se apreciacómo el porcentaje
de odianisidinava aumentando
paufatinamente
a medidaque lo hacela cantidadde agentereductor,hastaalcanzarun
valor máximode 8.9% parauna relacióndit/colde 38.4,a partirdel cualse mantiene
prácticamete
constante.
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Anál isisde Azocolorante
143
ct
=
'6
c
.q
o
o
s
4
120
235
mg D¡tionito/mgGolorante Puro
FiguraVII.I3. Variacióndel porcentaie
de o-dianisidina
frentea Ia relaciónditlcol, parael
oC.
pH¡-5,
Acid Red128.
colorante
Temperatura:28
Tomandola relacióndit/colde 38.4 como óptima,se procedióal estudiode variación
del pH¡ del medioacuoso,cuyosresultados
se reflejanen la FiguraVll.14.En ella se
observaque mientras
el pH¡ no sobrepase
el valor límitede siete,el rendimiento
de la
o-dianisidinano se ve afectado,obteniéndose
siempreel valor máximo alrededordel
9%. En el momentoque el pH¡ alcanzael valor de sieteo lo sobrepasa,
el porcentaje
de aminasufreuna claradisminución,
llegandoa ser de 2.5% cuandoel pH¡ es de
7.73.
tt
{ñ
123
ffiffi pH inicial
FiguraVII.I4.
45
ffil
PHfinal
I
? oD i a n i s i d i n a
lnfluenciadel pH y del medio sobreel porcentajede o-dianisidinaobtenido,
parael coloranteAcid Red 128.Temperatura-28 oC.
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CaDítuIo VII
En la Tabla Vll.4 se muestranlos resultados
de las distintaspruebashechasa alta
(70
temperatura "C) con el Acid Red 128. En ella se apreciaque el único factorque
pareceafectarligeramente
al rendimientofinal de la o-dianisidina
cuandose trabajaa
70 "C, es el empleode un granexcesode agentereductor.En el restode casos,ya sea
pH o empleando
tamponando
el medioa distintos
tiemposaltos,el porcentaje
finalde
la aminasiguecoicidiendocon el valormáximoen tornoal 9%. Estecomportamiento
es análogoal ya vistoparalos trescolorantes
anteriores.
Tabla VII.4. Estudio de las condiciones de reducción a 70 oC del colorante Acid Red 128.
Dit/Col
(*)
(**)
Tiempo
(min)
PH¡
38.4
l)
4.92
8.9
617.2
t)
4.71
8.4
38.8
t5
4.69(.)
9.1
38.1
t)
6.29('l
9.3
38.4
60
o-Dianisidina
(o/')
4.72
Tampónácidoacético/acetato
sódico,0.1 M (pH:4.6).
Tampónácidocítrico0.06A//NaOH0.16M (pH:6).
8.9
Observando los resultadosobtenidos para este colorante, se aprecia que su
comportamíento
frentea la reducciónes completamente
análogoal mostradopor el
DirectRed 28, a pesarde tenerestructuras
moleculares
muy distintas.
Por otro lado,
dicho comportamientoes totalmentediferenteal que presentasu homólogo,el Acid
Red 114, a pesarde tratarsede estructuras
análogas.
Efectivamente,
mientrasque en el
Acid Red 114 se necesitacondiciones
de reducciónbastante
extremasparaobtenerlos
máximosrendimientos
de sus aminas,en el Acid Red 128 no son necesarias
tales
puedensersuficientes
condiciones,
sino que otrasmenosdrásticas
paraconseguirlos
resultados
óptimos.
que la estructura
Estopone de manifiesto
molecular
de un coloranteno tienepor qué
estarrelacionadacon su comportamiento
frentea la reduccióncon ditionitosódico,y
que sean posiblemente
otro tipo de factores,
como el procesode fabricacióndel
coloranteo la calidadde las materiasprimasempleadas
en su síntesis,
los que mayor
influenciapuedanteneren dichocomportamiento.
Por otro lado, el porcentaje promedio experimental de o-dianisidina (9.01%),
concuerda bastante bien con los valores teóricos estimados según los criterios del
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde Azocol orante
t4)
(9.0 y 9.7olorespectivamente),
nitrógenoKjeldhaly la termogravimetría
al igual que
ocurríacon los tresazocolorantes
estudiadosanteriormente.
Convieneindicarque duranteel estudiode estecoloranteno se detectóningún pico
de comportamiento
cromatográfico
similaral descritoen el Acíd Red 114 con tq 36
minutos,lo cual estáde acuerdocon la suposiciónde que dicho pico puedetener su
origen en una impurezao contaminantepresentedicho colorante,ya que si tuviera
relacióndirectacon la estructuramoleculardel mismo,deberíade aparecertambién
trasla reduccióndel Acid Red128 como corresponderfa
a su similarestructura.
V|1.3.7.Estudiode Recuperac¡ón
de lasArilaminas.
Una vez establecidoel proceso de análisis para azocolorante,sería conven¡ente
aplicarloal conjunto de las veinte arilaminasprohibidas,con el fin de estudiarsu
influenciasobre la recuperaciónde las mismas.Estosvalorespodrían servir como
factoresde correcciónpara cada arilaminaen los resultadosfinalesde un análisis
determinado.
Previamenteal estudio,se analizaronen CC/MS los productosformadostras aplicar el
procesode reduccióna cada una de las arilaminas.Se comprobóque la 2-amino-4nitrotoluenose reduceala2,44iaminotolueno,mientrasque la o-aminoazotolueno
lo
hacea la o-toluidínay a la 2,5-diaminotolueno.
Estoes consecuencia
de la reducción,
por partedel ditionito sódico,del grupo nitro a grupo amíno y del grupo azo a dos
gruposamino.El restode aminasno sufríanningunatransformación,
al no tenergrupos
susceptibles
de ser reducidos.Resultados
análogosse han descritoen variostrabajos
En consecuencia,
estasdos aminasno se tuvieron en cuenta en el
1204,205,2091.
ya que nuncasedetectarían
estudiode recuperación,
trasun análisis.
Parallevara cabo tal estudio,se partede una disoluciónacuosade las arilaminasde
perfectamente
concentración
conocida(10 ppm aproximadamente),
ajustándose
el pH
oC,
inicialmente
a 5. Unavez calentada
la disolución
a 70
seagregan1.2g de dition¡to
sódico manteniendola disoluciónbajo agitaciónmagnéticadurante15 minutos,tras
los cualesse procedea la extracciónde lasarilaminas
y a la preparación
de la muestra
tal y como se ha establecído
en el capítuloVl.
En la TablaVll.5 se recogenlos valoresmediosde recuperación
paratodaslas aminas
y la o-aminoazotolueno,
estudiadasexcepto la 2-amino-4-nitrotolueno
así como los
coeficientes
de variacióny los intervalos
de confianzaal 95o/o.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
146
CaDítulo VII
Tabla Vll.S. Porcentajesde recuperaciónde las aminas tras el procesode reducción (n" de
medidas2 6).
Valor
Coeficiente de
Intervalo de
Medio
(Yo)
Variación
Confianza
2,4-Diaminoanisol(*)
50.4
2,4-Diaminotolueno(*)
62.6
3.8
't.6
Bencidina
91.1
2.5
+ 1.'l
+ 1.2
4-Aminofeniléter
Compuesto
89.7
1.3
t 1.1
o-Toluidina
69.3
8.4
4,4'-Diaminodifenilmetano
89.3
2.2
r 6.'l
+ 2.O
4-Cloroanilina
75.9
6.1
+ 4.9
2-Metoxi-5-meti
lanilina
76.5
3.6
+ 2.6
o-Dianisidina
90.0
1.7
r 0.9
4,4'-Tiodianilina
90.9
o-Tolidina
93.2
1.3
't.2
+ 1.1
+ 0.6
2-Nattilamina
79.5
1.0
+ 0.6
4-Cloro-2-meti
tanilina
69.3
3.4
+ 2.2
2,4,5-Trimetilani Ii na
74.1
6.1
+ 4.7
3,3'-Dimetil-4,4'-diaminodifeni
Imetano
92.9
2.O
+ 1.9
+ 0.9
4-Aminobifenilo
3,3'-Diclorobencidina
'-Metilenbis(2-cloroani
Iina)
(*)
al 95 %o
+ 2.0
92.4
1.6
96.0
1.1
96.0
o.7
+ 1.1
+ 0.6
Extraído
con diclorometano.
Si se comparanlos valoresde recuperación
con los obtenidosen la extracciónlíquidolíquidode lasaminas(TablaVl.6),se observalo siguiente:
.
Todaslas arilaminascon dos anillosaromáticos
presentanvalores
en su estructura,
y
comprendidosentre un 90 95oloen la extracción,y entre un 89 y 96'1.tras la
reducción, lo cual significaque el procesoreductivo no parece provocar efecto
negativoen sus recuperaciones.
La 2-naftilaminasí sufreuna disminuciónen su
pasandode un 94.6 aun 79.5o/o
recuperación,
trasla reducción.
.
Las arilaminaso-toluidina,4-cloroanilina,2-metoxi-5-metilanilina,
4-cloro-2-metilanilina y 2,4,S-trimetilanilina,
también sufren una ligera disminuciónen sus
pasandode valorescomprendidosentre un B0 y 85% en la
recuperaciones,
extracción,a valorescomprendidos
entreun 69 y 77'1.trasla reducción.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisis de AzocoIo rante
.
147
Por rSltimo,la 2,4diaminoanisoly la 2,44iaminotolueno(extraídasambas con
diclorometanoen lugarde éter dietílico)disminuyendesdeun 67) y 72.5olo
en la
extracción,a un 50.2 y 62.4o/"trasla reducciónrespectivamente.
Friedrichsy col. I2O9l,estudiaronla recuperación
de lasveinteaminas,obteniéndose
parec¡dos
a excepciónde la 2,4diaminoanisolque se
resultados
muy
a los anteriores,
recuperaen un 94olofrente al 50.4olode la TablaVll.5. No obstante,el procedimiento
de análisisfue distinto:una disoluciónde todas las aminasjunto con 2 gramosde
muestra(textil)para simularefectosde matriz, se calientaa reflujo en medio alcalino
(NaOH 1 M) durante30 minutos,traslos cualesse agrega1 gramode ditionitosódico
a reflujo 30 minutos más; se extraecon 40 ml de acetatoetilo en
manteniéndose
cartucho "Extrelut 20" y se concentra hasta 0.5-0.7 ml en evaporador rotatorio
Turbovap500 (50 "C y 8000 r.p.m).Sin embargo,no se comprobósi el empleode un
medio fuertementealcalinopodía suponeruna disminuciónen el rendimientode la
ruptura del grupo azo. Por otro lado, es sabido que condicionesde análisistan
indeseablesdurante
drásticaspuedenfavorecerel desarrollode reaccionessecundarias
el mismot1991.No obstante,el empleode estemétodose hacenecesarioparapoder
abarcardentrodel análisisa los pigmentosademásde losazocolorantes,
segrfnindican
algunosautores1199,2091.
Por contra,en otros trabajosdonde se estudiala recuperaciónde arilaminatras aplicar
procesos
de reduccióncon ditionitosódico,se llegana obtenervaloresno superiores
al
lo cual demuestraque la dispersiónexistenteentre los datos
52lo f2O7,21O,249,25Of,
recogidosen la bibliografíaal respectoes bastantegrande.
Por otro lado, en la norma DIN 53316 [69] se especificaque la 2,4-diaminoanisol
puede flegar a recupararse
menosde un 2Oo/",la 2-metoxi-5-metilanilina,
4-aminofeniléter,o-toluidinay 2,44iamínotolueno,deben hacerlo al menos en un 50?o,
mientrasque el restode compuestos
se han de recuperarcomo mínimo en un 70%.
Losvaloresmostradosen la TablaVll.5 mejorantodaslas recuperaciones
dadaspor la
norma,paracadaunade lasaminas.
En cuanto a los intervalosde confianzaal 951o obtenidospara cada arilamina,
mostrados
en la TablaVll.S,se observaque son todosvaloresaceptables,
a excepción
y
de los correspondientes
a la o-toluidina,4-cloroanilina 2,4,5-trimetilanilina.
Con el
fin de dilucidarlos motivospor los cualesse producíaesteaumentoen la dispersíónde
para este grupo de aminas,se llevaron a cabo las siguientes
las recuperaciones
experiencias:
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
148
Capítulo VII
A:
que lasempleadas
Reducciónen las mismascondiciones
en laTablaVI\.S.
B:
Aplicación de todo el proceso en las mismas condiciones que A, pero a
temperaturaambiente.
C
Aplicación de todo el proceso en las mismas condicionesgue A, pero en
ausenciade ditionito sódico.
D:
Aplicación de todo el procesoen las mismascondicionesque A, perollevado
a cabo en medio tampón (ácidocítrico 0.06MlNaOH 0.16M,pH-6).
En lasTablasVll.6 a Vll.B se muestranlas recuperaciones
mediasobtenidasparacada
junto con los coeficientes
amina en basea seisdeterminaciones,
de variacióny los
intervalosde confianzaal 95%"
Tabla VIl.6. Recuperaciónde Ia o-toluidina tras diferentestratamientosde reducción.
Valor
Coeficiente de
Intervalo de
Medio
Variación
Confianzaal 95%
A
B
69.3
8.4
83.0
3.0
+ 6.1
+ 2.7
c
74.9
7.7
+ 6.0
D
68.3
7.8
+ 6.6
Tabla VII.7. Recuperaciónde la 4-cloroanilina tras diferentestratamientosde reducción.
Valor
Coeficientede
Intervalo de
Medio
Variación
A
75.9
6.1
Confianzaal 95%
+ 4.9
B
84.2
2.1
c
78.1
5.7
+ 1.9
+ 4.7
D
76.8
6.1
t 4.9
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An ál ísis de Azocolo r ante
149
De la observaciónde estos resultados,se aprecia que al realizar la reducción a
temperaturaambientese incrementanlos valoresde recuperación
de dichasaminas
(83.0?"parala o-toluidina,84.2o/o
parala 4-cloroanilinay84.60/o
parala 2,4,S-trimetilanilina),ademásde disminuírla dispersiónde los datos.Por tanto, la temperatura
pareceser un factorque provocauna disminuciónen la recuperación
de estasaminas,
ademásde causardispersiónen el resultado.
Tabla VII.8. Recuperaciónde la 2,4,s-trimetilanilinatras diferentestatamientos de reducción.
Factor
Valor
Coeficiente de
Interualo de
Medio
Variación
A
B
74.1
6.1
Confianzaal 95"/"
+ 4.7
84.6
2.2
t 1.9
c
80.1
8.0
D
71.5
6.9
t 6.7
+ 5.2
Cuando se realizael procesoen ausenciade ditionito sódico pero manteniendola
y de dispeisiónson similaresa los ya
temperatura
a 7OoC, los valoresde recuperación
obtenidos,aunquepareceobservarse
un ligero incrementoen las recuperaciones.
Es
posibleque la presenciadel agentereductortengaun pequeñoefectonegativoen su
recuperación.
Por último, el empleode tampóncitratoen la reducciónno pareceprovocarningún
efectosobreel resultadofinal respectoa lascondicionesnormales.Portanto,en lo que
respectaa la recuperaciónde estasaminastras la reducción,es indiferenteel tamponar
o no el medioacuoso.
V1.4.Conclusiones
De los resultadosobtenidos en el presentecapítulo, se pueden deducir las
conclusíones
siguientes:
1. El procedimientode análisispara la determinaciónde aminas aromáticasen
azocolorantes,
es el siguiente:
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150
Capítulo Vll
Se disuelveuna cantidaddeterminadade coloranteen 50 ml de agua, aiustando
el pH¡ a 5 con H2SO4 0.25 M. La disolución se calienta hasta Z0 oC bajo
agitación magnética y se agregael ditionito sódico en forma sólida (proporción
ditionitolcolorante puro, en peso, entre 2 y I5), agitandose entre 15 y 20
minutos, tras los cualesse enfría el medio de reducciónbajo el chorro de agua.
La extracción líquido-líquido de las aminasy la preparación de la muestra para
su análisisoomatográfico se realiza tal y como se estab/ecióen el capítulo Vt.
2 . La estructuramolecular de un azocolorantedado no parece condicionar su
comportamiento
en el procesode reduccióncon ditionitosódico.Estees el casode
los colorantesAcid Red t14 y Acid Red 128: la única diferenciaexistenteentre
amboses la arilaminabase(o-tolidinay odianisidinarespectivamente);
sin embargo
en el primero se necesitan70 "C de temperaturadurantela reducciónpara obtener
el máximo rendimiento,mientrasque en el segundocon temperatura
ambienteya
es suficiente.
3 . Los valoresmáximosexperimentales
obtenidospara los porcentajesde arilamina
base en los cuatro azocolorantesestudiadosse aproximan bastantebien a los
valoresteóricosestimados,lo cual pareceindicarque la rupturadel grupo azo con
ditionitosódico,en lascondicionesde trabajoestablecidas,
presentaun rendimiento
cercanoal 100o/o.
4, Se han estudiado las recuperaciones
de las veinte arilaminasprohibidastras
paraazocolorante,
aplicarlesel procesode reducciónestablecido
exceptuandola 2y la o-aminoazotolueno
amino-4-nitrotolueno
por producirsetransformación
de las
mismas.Losresultados
son los siguientes:
o Lasarilaminascon dos anillosaromáticos
en su estructura/
se recuperanentreun
89 y un 96%, mientrasque la 2-naftilamina
lo haceen un 79.5o1".
¡
Losderivadosde anilinase recuperanentreun 69 y un 77o/o,
a excepciónde la
y
2,4-diaminoanísolla 2,44iaminotoluenoque lo hacenen un SO.4y un 62.6olo
respectivamente.
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Análisis de Azocolorante
151
5. La aplicaciónde temperaturaduranteel procesode reducciónpuede provocar un
efecto negativosobre las.recuperaciones
de las arilaminasderivadasde anilina
(sobretodo la o'toluidina,la4-cloroanilina,
y la 2,4,5-trimetilanilina),
ademásde un
incrementoen la dispersiónde los resultados.
La presenc¡a
del ditionitosódicono
pareceser la causade tal efecto. Por otro [ado, e[ llevar a cabo la reducción en
mediotampónácidocítrico/NaOH(0.06A4/0.16M, pH:6) no suponeuna mejora
del resultadofinal.
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VI¡1.Estudiode las Reacciones
Secundarias
en el Procesode Reducción
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Estudiode las ReaccionesSecundarias
en el Procesode Reducción
155
Vlll.1. lntroducción
Una vez establecidaslas condicionesde análisisde azocoloranteen el capítulo
anterior,se pretendióllevara cabo un estudiode las posiblesreacciones
secundarias
que pudieranproducirseparalelamente
a la reduccióndel grupoazo, dando especial
pudieran
que
importanciaa aquellas
teneralgunainfluenciasobreresultadofinal del
análisis.
Con estefin, se llevó a cabo un estudiode los compuestos
obtenidostrasla reducción
de un conjunto de azocolorantes,
observandosi dichoscompuestoseran los esperados
en basea su estructuramofecular.A continuación,se hizo hincapiéen el estudiode
y/o procesossecundarios
paralelosa la reducción,que pudierandar
ciertasreacciones
lugara algunade lasveintearilaminasprohibidas,y que por tanto,influyeransobreel
resultadofinal.
A continuaciónse indican los colorantesestudiados,cuyasestructuras
se recogenen el
capítuloXIV:
Colorantesinsolublesen medio acuoso:
Aldrich.
SolventYellow 2, SolventYellow 3, DisperseOrange 25, Disperse
Red 13, DisperseRed 1, SolventYellow14, SolventRed 24 y Solvent
Orange 7.
Colorantessolublesen medio acuoso:
Aldrichz
Robama:
Basf:
Acid Blue 29, Acid Orange'10,Acid Yellow'11,Acid Orange7, Acid
Red44, Acid Red4, Acid RedB, DirectViolet 51 y Acid Violet 5.
Acid Black168y Acid Creen114.
Acid Orange61, Acid Violet56, Acid Black82, Acid Blue 193 y Acid
Brown75 (BA).
Bayer:
Acid Brown83.
Acid Brown 75 (SA).
Sandoz:
Colorantes
Industriales. Acid Brown 75 (CD.
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156
Capítulo vlll
Parael desarrollode esteestudio,era imprescindible
la correctaidentificación
de todos
los fragmentosformadostras la reducciónde cada azocolorante.Por esta razón, se
utilizó la Cromatografíade Cases con detector de Espectrometría
de Masas como
técnica más apropiada, dada la gran selectividadque ofrece su detector en la
identificación
de loscompuestos.
Parala cuantificación
de la 2-naftilamina,
se utilizó la
ElectroforesisCapilar con detector UV-Visible,ya que dicha técnica es capaz de
separarla
satisfactoriamente
de su isómerola 1-naftilamina"
Vlll.2. Resultados
y D¡scusión
Vlll.2.1.Estudiode los Productos
de Reducción
deAzocolorante
Los procedimentos
de reducciónutilizadosparacadagrupode colorantes,
fueron los
siguientes:
Colorantesinsolublesen medio acuoso:
Entre 50 y 200 mg de colorante se disuelven en 30 ml de metanol y se calienta
hasta 70 oC, momento en el cual se agreganentre I y 2 g de ditionito sódico en
disalución acuosa (5% en peso) recién preparada, hasta que persista Ia
decoloración. 5i es necesario,se agregauna pequeñacantidadde agua para que la
disolución se aclare.5e matienen en agitaciónmagnéticadurante l5 minutos,se
corta y se enfría bajo el chorro de agua. El metanol se elimina burbuieando
nitrógeno y se extraecon cloroformo tras basificar hasta pH:10 - 11 con NaOH
2 M. La muestrase prepara segúnse establecióen el capítulo Vl, pero redisolviendo
en n-hexanolcloroformo,I /l .
Colorantessolublesen medio acuoso..
Entre5A y 200 mg de colorantese reducen segúnse estab/ecióen el capítulo Vll,
pero redisolviendola muestrufinal en n-hexano/cloroformo,I /1.
El procedimientoaplicadoa los colorantesinsolublesen medioacuosoestábasadoen
el utilizadopor Voyksnery col. dentrode su estudiosobrela identificación
de aminas
aromáticas
liberadas
trasreducciónquímicade azocolorantes
l2}4l.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Estudiode las ReaccionesSecundarias
en el Procesode Reducción
l57
En las TablasVlll.1 y Vlll.2 se indicanlos principales
fragmentos
obtenidostras la
reducciónde losazocolorantes
y solublesen aguarespectivamente.
insolubles
Tabla VIIl.l.
Productosobtenidos trasla reducciónde los azocolorantesinsolublesen agua.
Colorante
Productos de Reducción
SolventYellow 2
PM
N,Ndimetil-l,4diaminobenceno4" 136
Anilinaabd
93
TR
(Area %)
Iones
(m/2, abundancia rel ativa)
10.9(49) 136(100),135(5
61,121(501,120(34),94(2ol
7.1(38) 93(100),9204),66(43),65Q2),52(8)
..-......N,.N.{!n..eli!eg.t.¡.le#!*p..l.i.o-.....-...].f..8.....'....j.!..9.q.].)....-.].t9-|1.9p.).,1.*.7.!91'
Solvent
Yellow 3
Disperse
Orange 25
o.Toluidinaab
2-Metil-l,4diaminobencenoab
106
7.9(62.n 106(100),107(751,79(131,77(18),51(10)
122
2-Metil-l,3diaminobenceno
Anilinaa
122
(56),106(1
10.8(32.7) 122(100),121
2),94(21),78(14)
12.3(2.41 122(1OO)|121(4O),1O4en,94(21,,,78(14)
N-(cianoetil)-N-(etil)-1,4diaminobeneno0d
1,4-Diaminobencenoad
189
16.4(91.3)
108
174
!.?.1.,i...._.1.7.!!1.n,1..s2!n,E!J19.0),.1.95!1it.7.!211
N{cianoetil)-N-(etilFanilina
Disperse
Red13
N-(hidroxieti
l)-N-(etil)-1,2tdiaminobénceno
4-Amino-2-cloroani Iina"
2,.1.q,1?)...._.9p..(1..0.91,.9?.fl.?),.9.9ft.l
.6..f.f.¿........................
r 80
144
9.6(4.8)
I 89(35),1
49(t 00),121(161,120(531,
I 19(33),92(1
5)
108(100),107(29),81(15),80(35),54(13)
r s.1(50.2) 180(29),1
49(1001,120(44),119(26),93(141
6s(13)
11.8(4O.n 144(321,142(100),141(18),1
14(48),80(26)
!:ffhifiexjp.¡üN:.Leglled.li$--...-....1.q.i....-.....!?.19,2..Q....-..19..1f.f),Ll--4.í.9..qL.i.9.q
Disperse
Red 1
N-(hidroxietil)-N-(etil)-1,4Diaminobencenod
1,4-Diaminobenceno4d
t 80
15.2(75.41 180(30),149(100),120(46),1
19(29),93fi6)
10B
(r6),80(38),54(1
9.6(1
s.9) 108(100),1
07(28),81
3)
(*) La extracciónse llevó a cabo a pH :5. PM: PesoMolecular.m/z: Relaciónmasa./carga.
(a) ldentificaciónconfirmadacon patrón. (b) Productodetectadopor Voyksnery col. [204]
mediante HPLC/MS,empleando NarSrOoo SnCl, como agente reductor. (c) ldem a (b),
empleandosólo SnClr.(d) Productodetectadopor los mismosautores[205] medianteGCIMS,
empleandoSnCl,o HrlPdcomo agentereductor.(e) tdema (d),empleandosólo SnClr.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
158
c^rírurovill
Tabla VIII.2. Productosobtenidostrasla reducciónde losazocolorantesso/ublesen agua.
Colorante
Direct Black168
Acid Green114
Productosde Reducción
PM
TR
(Area /o)
lones
(m/2, abundancia relativa)
Anilina"
93
7.1(46) 93(100),92(14),66(41),6s(22)
4-Aminobifenilo"
169
15.7(4) 169fl00),168(201,167(13'),141(13),83(14)
2-Aminobifeniloa
169
13.9(5) 169(100),168(91),167(38),11s(11),83(19)
N-Fenilanilina" ..........._....1.-6.9...._.....1L¿19....4....-.L.q.gí..-0.91,..1.9p..€1.t,..1.9
Anilinaa
4-Aminobifen
iloa
2-Aminobifen
iloa
93
7.1(481 93(100),92(131,66(42),65(231
169
169
15-7(4)
13.9(5)
169(100),168(23'),167(13\,141(10),83(14)
169(100),168(91),167(40),11s(l0),83(20)
..l!.:.rsn!l.e.qilim1.. :!.-6.9...."......1f...2J.u......_.:'..g.gll.-0.9),..!.gp..Q.g),..!.g_zf?.1
Acid Blue29
Anilina"
1,3-Diaminobencenoa
2-Aminobifenilo"
4-Aminobifenilo"
N-Fenilanilina"
Acid Orange f 0
Anilinaaac
4-Aminobifeniloa
2-Aminobifen
iloa
93
108
169
169
169
184
93
169
169
't69
N-Fenilanilina"
Acid Yellow 11
Anilina"
4-Aminobifenilo¡
2-Aminobifenilo¡
N-Fenilanilina"
93
169
169
| 69
7.1(s4.sl
9.2(7.61
I 3.9(1.8)
15.7(0.5)
14.t(1)
93(100),92(13),66(40',),
65(2't)
t08(100),
81(26),
80(41),
5401),53(10)
169(100),1
68(901,167(401,1
I 5(11),83(1
B)
r 69(100),1
68(211,167(131,141(1
2),83(1
4)
t69(100),
168(621,
167(32),
141(7),
83(19)
1 6 . 5 ( 0 . 1 4 ) r 84(1
00).1
r82(1s),166(r),91(1
7.1(991
7.1(991
15.6(0.1)
13.9(0.1)
93(100),92(141,66(42),65(21')
93(100),
92(141,66(42),
65(21')
169(100),168(21),167(12r,141(1
2),83(15)
169(100),I 68(88),167(401,1
15(9),83(1
7)
9)
1L¿!0.,.q11.._.:¡..-6.9f
l.g.g)"!.gg.K.Ll,.1p.7.!1..1.t,171
7.2(74)
15.7(0.5)
13.8(1)
14.2(0.2)
93(100),92(14',),
66(441,65(221
169(100),168(231,167(131,'t41(11),83(14)
169(100),168(921,167(401,11s(8),83(20)
169(100).168(s8).167(3
r ).141(6).83(1
.As.!.d..9r.r!c-e-.Z.(:)......'...........].ánj.n.g--?:ngf-o..ll...............-....1.¡.9...."...1..s.'9.QI,l|...
Acid Red44
1-Naftilamina"
2-Naftilamina"
143
143
13.3(99.2) 143(100),116(23),115(42),89(5),
63(4)
13.4(0.421 143(100),116(231,115(s0),89(9),63(8)
123
8.84(93.s) 'r23(ss),
108(78),
80(100),
s3(26),65(11)
Acid Red4
o'Dianisidina"
2-Amino-l,4-naftoquinona
Acid RedI
173
16.7(1.61 I 73(100),146(41),105(58),104(2n,76(331
9.?......"....2.J.?f9....4....-.9.?.t19..9),..s..?f
.1.1,..9.9.p.2i"_qI(l.21......................
Anilinaa
2,4-Dimetilan
ilinaa
2,6-Dimetilanilina
12 1(100), 120(94),106(96),91(151,77(221
121(100),
120(6r),106(86),91(12\,77(14)
121
121
8.8(92.1)
9.1(0.6)
137
s3
9.9(16.41 137(621,122(1oO1,94(46),77(19)
7.1(3.e1 93(100),92(13),66(34),6s(19)
--]:i"."1,.;1;'*Till',';Tm;*1;:.:_-*:itjiii,.Ji:fi,i,;::.::
benceno
DirectViolet5l
2-Metoxi-5-metilanilina"
Anilina"
.._....u-1....".....9..,.q,\?,!......-.12-!.!g-2.).,.L?.?_!19.91.27!*9.,.7.1.1
144
2-Naftol
Acid Bfue193(*)
Acid Violet 5
2,2'-Hidroxi-1,1'-binaftaleno 286
1,1'-Sulfonilbisbenceno
Anilina"
amida"
218
93
150
r 2.9(30.9) 144(1001,
11s(6s),B9(11), 72(s),63(10)
28.2(29.'ll 286(100),257(20),239(18),120(24),115(12)
17.6(30.2) 218(30),125(100),
97(161,77(40\,
51(261
7.1(17.6) 93000),92(13),66(3s),
6s(17)
14.9(10.71 150(56).
I
r07(39).
80(24).43(1
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Estudiode /as ReaccionesSecundarias
en el Procesode Reducción
1s9
Tabla VIII.2. Productos obtenidos tras la reducción de los azocolorantessolublesen agua
(continuación).
Colorante
Productos de Reducción
PM
TR
(Area To)
lones
(m/2, abundancia relativa)
2?......_....7_,1t1.?n...-.9¡.f1.0.91,..9?f
!.2',,.9.6p.n,.9_1!1n.......................
2-Amino-4-clorofenol
143
Acid Violet 56(*)
5-Cloro-2-metoxianilina"
157
11.4(18.4)
Acid Black82(*)
2-Amino-4-clorofenol
143
t 1.9(49.8) 143(100),142(19),114(14),80(32),
51(g)
4-cloro-l,2-diaminobenceno
142
12.0(7.81 142(1OOl,
114(20),107(13),80(23)
Acid Brown 83
12.0(68.2) 143(100),142(2),114(19),so(44),5t(15)
157(54\,142(100),114(54), 7B(14)
.........'..........f*l9..t93l.i.|.i.ng:................'......1.?7.....-....9....9l13)....-.
Acid Brown 75
(CD
1,4-Diaminobencenoa
o4¡oroun¡¡¡n¿a{")
108
127
9.6(19.n
Acid Brown 75
(t{)
1,4-Diaminobencenoa
4{loroanilinaa(")
108
127
9.6(47.5)
108(100),107(30),S1fl6), B0(3S),53(13)
9.0
l0B(100),107(29D,
St(17),80(41).53(15)
9.0
*--li*- ;ii;í;-;;aó;;;ü6
i;;ft;;;;;--- ;;;:iifi;Íi;1i;;;'
ó;;;üñi;ó;;;a;;
(BA,
o-Toluidina"
'lO7
Bencidina¡(")
184
7.9(5.51
19.7
107(92),106(100),79(14),77(16'),51(Sl
(*) La extracciónse llevó a cabo a pH-5.(**) Compuesto
detectadoen modo SlM. PM: Peso
molecular. m/z: Relaciónmasa./carga.
(a) ldentificaciónconfirmadacon patrón. (b) Productodetectadopor Voyksnery col. l2O4l
medianteHPLC/MS,empleandoNarSrOoo SnCl,como agentereductor.(c) Productodetectado
por los mismosautores[205]medianteCCIMS,empleandosóloSnClr.
En los colorantesinsolublesen aguaSolventRed24 y SolventOrange7, no se detectó
perosí loscompuestos
la 1-amino-2-naftol,
y 2-naftoltrasuna
2-naftol-1,4-naftoquinona
segundaeÍtracciónen medioácido.Estehechoprobablemente
se debea la oxidación,
en medio básico,de la 1-amino-2-naftol
a la 2-naftol-l,4-naftoquinona
[251] la cual,
junto con el 2-naftol,permanecensin extraersecomo fenolatosen la faseacuosa.Con
el fin de evitaresteproblema,la extracciónde los colorantes
SolventYellow 14, Acid
y
pH
Orange 7 Acid Blue 193 se llevó a cabo a
5, detectándose
efectivamentela
y el 2-naftol.
1-amino-2-naftol
En general,se observaque los productosmayoritarios
formadostrasaplicarel proceso
de reduccióna cadacolorante,son los esperados
en basea la rupturadel grupo azo
segúnsuscorrespondientes
estructuras
moleculares.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
,60
c^rírrrovilt
No obstante,en ocasionesse detectancompuestosminoritarioscuyo origen debe
radicar en otro tipo de reaccionesy/o procesossecundarios,siendo los más
importantes:
Reduccióndel gruponitroa grupoamino.Estaes una reacciónapliamenteconocida
se compruebaen los colorantesDisperseRed 1, DisperseRed 13,
I2O4,2O5,2461y
DisperseOrange25,y AcidBlue29.
Productosformadostras la pérdida del grupo amino, como es el caso de los
colorantes DisperseOrange 25, DisperseRed 13, DisperseRed 1, Solvent
Yellow 14, Direct Violet 51, Acid Blue 193, Acid Violet 56 y Acid Black 82. En
todos ellos, se detectan compuestosque proceden de la desaminaciónde
fragmentos, normalmente liberados tras la reducción del grupo azo. La
desaminaciónrequierede la rupturadel enlace C-N, siendo ésta una reacción
descritaen granvariedadde casosÍ2521.
Compuestosformadostras la pérdida de grupos sulfónicosen su estructura.Este
hechose constataen los colorantes
Acid Orange61 y DirectViolet 51 en los que se
compruebala desulfonación
de determinados
fragmentosliberadostrasel análisis.
En la bibliografíasedescribenprocesos
del mismotipo [38,67,"128,199].
o Detecciónde 4-aminobifeniloen ciertoscolorantessintetizados
con anilina como
amina base de partida,como son el Direct Black 168, Acid Creen 114, Acid
Blue 29, Acid Orange 10 y Acid Yellow 11. La bibliografíarecogey estudia
suficientemente
estehecho138,67,20O,21
31.
sin embargo,no, se puede asegurarque en todos los casosla causapor la que se
detectanestoscompuestosseanreaccionesy/o procesossecundariosocurridosdurante
el análisisde los colorontes,descartandototalmentela posibilidadde que dichos
procesoshayantenido lugarduranteel procesode fabricaciónde los mismos,o que
ya presentes
talesespeciesse encuentren
en el colorantecomo impurezas.
Porejemplo,los supuestos
productosde desulfonación
detectados
trasel análisisde los
colorantesAcid Orange 61 y Direct Violet 51, podrían tratarsede contaminantes
presentes
en los productosde partidaempleadosen sussíntesis.
De hecho,en ciertos
estudiosse determinanaminastales como anilina [150-152],p-cresidina[149] o
2-naftilaminaí1321,
trasla extracciónde colorantes
alimentarios
sintetizados
a partirde
los correspondientes
derivadossulfonados.Bailey t1521 da como explicación la
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Estudiode /as ReaccionesSecundarias
en el Procesode Reducción
161
presenciade los compuestosdesulfonadosen las mismasmateriasprimas,o a su
formacióndurantela manufactura
del colorante.
H+
@-<it:!h,
or*0
*zCHz-Cl-ls
-cH2-cH2oH
DisperseRed1
Figura VIII.I.
Síntesisdel colorante Disperse Red l.
productosde desaminación
Por otro lado, los supuestos
detectados
tras el análisisde
ciertoscolorantes,
como por ejemploel DisperseRed1 y el SoventYelow 14, podrían
tratarsede materiaprimano agotadaempleadadurantela síntesis
de cadauno de ellos
(Figuras
Vlll.1 y Vlll.2).Estaposibilidadse reflejaen un estudiorealizadopor Lancaster
y col. [155],donde se determinandistintosintermediosno combinadosen colorantes
alimentarios
sintetizados
a partirde dichoscompuestos.
SolventYellow 14
FiguraVIII.2. Síntesisdel coloranteSolventYellow14.
En ocasionesse detectanespeciescuya existenciaes difícil de explicarsi no es
atribuyéndolasa contaminantes
del colorante,o a productossecundariosformados
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
durante su síntesis,ya que no es probablesu formacióncomo consecuenciadel
análisis.Estopuedecomprobarse
en lossiguientes
casos:
o
.
¡
o
o
¡
o
o
¡
.
Anilinay 2-metil-1,3-diaminobenceno
en el SolventYellow3.
o-Toluidina
en el SolventYellow14.
Anilinaen el Acid Red4 y Acid Víolet5.
2,6-Dimetilanilina
y 2,4-dimetilfenol
en el Acid RedB.
5-Cloro-2-metoxianilina
en el Acid Violet56.
y 2-naftalencarbonitrilo
2-Naftilamina
en el Acid Red44.
(43.1
ppm)y
4-Cloroanilina
4-cloro-1,2-diaminobenceno
en elAcid Brown83.
(31.1ppm)y bencidina(7.7ppm)en elAcid Brown75 Ct.
4-Cloroanilina
(7.5ppm)y bencidina(3.6ppm)en el Acid Brown75 SA.
4-Cloroanilina
(163.1ppm)y bencidina(9.2ppm)en el Acid Brown75 BA.
o-Toluidina
Lascantidades,indicadasentreparéntesis,
de las aminasprohibidasdetectadas
en los
cuatroúltimoscolorantes,
se determinaron
trassu análisismedianteHPLC/DADsegún
el procedimientoestablecido
en el capítuloVll.
Encuantoa la o-toluidinadetectadaen el SolventYellow 14,en CC/MSse inyectóuna
disolución de dicho colorantedetectándose,
ademásdel mismo, otro compuesto
menos abundanteen cuyo espectrode masasse observóla presenciade un ion
molecular(m/z:263) que podríacorresponder
al del colorantemás un gupo metilo.
Estohacepensarque la o-toluidinapodríaencontrarse
comocontaminante
en formade
azomolécula.
Asimismo,se llevó a cabo la extacciónlíquido-líquido,
con éter dietílicoy en medio
básico,del coloranteAcid Brown 83 y de los colorantesAcid Brown 75 de tres
procedencias
distíntas.En el Acid Brown83 se detectóla presencia
de 4-cloroanilina
y
de 4-cloro-2-nitroanilina,
la cual se transforma
en la 4-cloro-1,2-diaminobenceno
trasla
reducción.En los Acid Brown 75 Cly 54 se detectó,no sólo la 4-cloroanilína,
sino
tambiénla 4-cloronitrobenceno
que trasel análisisha de reducirsea la primeraamina.
Sin embargono se observópresenciade bencidina.En el Acid Brown 75 BA, no se
detectó ni o-toluidinani bencidina.Estosresultadosparecenindicarque la
4cloroanilinadetectadatrasel análisisde estoscolorantes,
puedeserdebidaen parte,a
su presenciacomo contaminante,o a la existenciade compuestosque la originen
duranteel análisis.Pagey col. [215] hacenreferenciaa la detecciónde 4-cloroanilina
trasel análisisde colorantesimpurificados
con presencia
de 4-cloronitrobenceno.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Estudíode las ReaccionesSecundariasen el Procesode Reducción
163
Porotro lado,el hechode que un mismocolorante,como el Acid Brown 75, de lugara
diferentesresultadossegún sea la casa comercial de la que proceda, pone de
manifiestohastaqué punto el procesode fabricacióndel colorantepuedeinfluir sobre
el resultadofinal de un análisis.
Con estosresultados,puedeafirmarseque la detecciónde compuestosno esperadosen
basea la reducciónde un colorantedado,puedetenercomo origenuna de la causas
siguientes
12121:
1.
2.
3.
4,
Calidaddeficientede lasmateriasprimasempleadas
en la síntesis
del colorante.
Presenciade materiaprima no agotadaen el colorante.
y/o procesos
Reacciones
secundarios
ocurridosen la síntesis
del colorante.
y/o procesossecundarios
Reacciones
ocurridosen el análisisdel colorante.
De tales compuestos,los que más relevanciatienen de cara al resultadofinal del
análisisson los que pudierancoincidircon algunade lasveintearilaminas
prohibidas
en la legislaciónalemana.Cuandola causaes el métodoanalítico,se estaríaante un
"falsopositivo"puestoque la aminaprohibidadetectadano se encontraría
presenteen
el colorantesino que se originaríaa consecuencia
del análisis.Cuando se produce
durantesu manufactura
o es un problemade calidaddeficientede las materiasprimas,
el resultadopositivoseríadel todo correctoya que la amina sí está presenteen el
colorante.
vlll,2.2. Detecciónde 4-Aminobifeniloen ColorantesBaseAnilina
Como se ha comprobadoen el apartadoanterior,existe un determinadotipo de
colorantesen los que se detecta la 4-aminobifenilotras su análisissín haberse
empleadoaparentemente
como productode partidaen su síntesis.El denominador
comúnde todosellosesel empleode anilinacomoaminabaseen su manufactura.
Puestoque no se dísponede informaciónacercade la calidadde la anilinacon que se
sintetizarontales colorantes,tampoco se puede preveer la posible existenciade
4-aminobifenilocomo contaminante
en la misma.No obstante,como dato indicativo
se analizó en CC/MS un patrón de anilina, de calidad para síntesis(Merck),sin
detectarsepresenciade 4-aminobifenilo.Tampoco se detectó bencidina u otros
posiblesproductos
de degradación
u oxidaciónde la anilina,como asíviene indicado
en varios trabajos1192,195,253,2541.
Además,se analizó anilina tras aplicarle el
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
procesode reducciónestablecido
en el capítuloVll, sin detectartampoconingunade
lasaminasmencionadas.
Enel apartado11.4.2
se hizo una revisiónbibliográfica
acercade lasposiblescausaspor
que
las
se detecta4-aminobifenilo
trasel análisisde estetipo de colorantes.
Tal como
se indicó, existenautoresque aluden al procesode síntesisdel colorantecomo el
causante de este fenómeno 1152,20o,2121,
mientras que otros lo hacen al
procedimientoanalítico f38,67,213,2147.
Ambas teoríasconducen a conclusiones
totalmenteenfrentadas,puesto que el resultadopositivo final del análisisestaría
propiciadopor el fabricanteo por el laboratorioque analiza,respectivamente.
El "falso
positivo"existiríasolamenteen el segundocaso.
Haciendoun repasode todoslos mecanismos
postulados,
se observaque en la posible
formaciónde 4-aminobifenilo,
tantoen el análisiscomo en la síntesis
del colorante,el
radicalfenilo juega siempreun papel decísivocomo íntermediodentro del proceso.
Porotro lado,es conocidoque dicho radicalfenilo,en presencia
de anilina,puededar
lugar a otras especies tales como: 2-aminobifenílo,N-fenilanilinay bifenilo
[234,241,2427.
N-fenilanilina
Bifenilo
H,N
-\
@-:N-Ar
Colorante Sintelizado
en BaseAnilina
+
4-Aminobifenilo
re
2-Aminobifenilo
Ar-N:N
/\
wN:N-Ar
4-Aminobifenilo Combinado
2-AminobifeniloCombinado
FiguraVIII.S" Colorante sintetizado a partir de anilina contaminado con N-feni/anilina,
bifenilo, 4-aminobifenilo libre y combinado, y 2-aminobifenilo Iibre y
combinado
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Estudiode las ReaccionesSecundariasen el Procesode Reducción
165
y 4-aminobifenilo
El posible2-aminobifenilo
formadosdurantela síntesis,
condensarían
con el agenteacoplanteen mediobásicoduranteel pasoposter¡ora la diazotaciónde
la anilina. Sín embargo,otrasespeciesque se forman paralelalmente,
como son la
N-fenilanilinao el bifenilo,debenencontrarse
libresen el coloranteal no presentaren
su estructuran¡ngúngrupoaminosusceptible
de serdiazotado.De serasí,el colorante
finaf sintetizadoa partirde anilinadeberíaestarcontaminado
con pequeñascantidades
de las cuatro aminas mencionadas,ademásde 2-aminobifeniloy 4-aminobifenílo
combinadasen forma de azomolécula(FiguraVlll.3). Con el fin de comprobarlo,se
llevó a cabo la extracciónde los colorantesen los que se habíadetectado4-aminobifenilo tras el análisís(Acid Green 114, Direct Black 169, Acid Blue 29, Acid
Orange10 y Acid Yellow 11),aplicandoel siguienteprocedimiento:
Extracciónde colorante (D
Se toman entre0.1 y 1.5 g de colorantey se disuelvenen 15 ml de agua caliente
con 3 gotas de NaOH 1 M. Se agrega la disolución a un cartucho "Extrelut 20",
dejando que el relleno se empape bien, y se lava con t 0 ml más de agua,
arrastrando todo el colorante hacia el interior del cartucho. IJna vez quede la
disolución bien retenida en el relleno, se agregan dos porciones de 25 ml
cloroformoesperando5 minutos.Posteriormente,
se agregandos porcionesmás de
ml,
25
recogiendoel disolventeen un matrazredondode 250 ml. Se concenta en
rotavapor a 45 oC y con leve vacío de trompa de agua, hasta I ml
aproximadamente.Se transvasaa un vaso de precipitadosde 50 ml, lavando el
matraz con éter dietílico. Posteriormente,la muestrase prepara tal y como se
estableció en el capítulo Vl, pero redisolviendo la muestra en la mezcla
hexanolcloroformo1/ 1"
En todos los casos,se observócomo resultadola presenciade N-fenilanilinay de
bifenilo, lo cual parecíaconfirmarlo postuladoen un principio.Además,siemprese
detectabacon mayorabundanciala primerade lasdos especies.
Teniendoen cuenta
esto, y con los precedentesanteriormentemencionados,se llevó a cabo la
determinacióncuantitativamediante CC/MS de los compuestos4-aminobifenilo,
y N-fenilanilina
2-aminobifenilo
paracadauno de los citadoscolorantes,
aplicándoles,
ademásde la extracción,lasdosexperiencias
siguientes:
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
166
c^pírurovttt
Reducción del colorante en medio ácido (A)
Se toman entre250 y 300 mg de colorantey se analizansegúnel procedimiento
establecidoen el capítulo Vll, pero redisolviendola muestraen Ia mezcla hexano
cloroformo 1/l .
Reduccióndel colorante en medio básico(B)
Se toman entre250 y 300 mg de colorantey se disuelvenen 45 ml de NaOH 1 M.
Se calienta la muestra bajo agitación magnética hastaB0 oC y se mantienea esa
temperaturadurante 30 minutos,al término de /os cualesse agregan250 mg de
ditionito sódico. 5e agita 30 minutos más y se enfría baio el chorro de agua. La
extraccióny preparaciónde la muestrase lleva a cabo igualque en la reducción en
medio ácido.
Parala realizacióndel estudio,se empleóel 2-nitrobifenilocomo patróninterno.Se
rehusóel usodel HPLC/DAD,al producirseuna interferencia
en la determinación
de la
4-aminobifenilo
cuandoéstase encontraba
en pequeñascantidades.
En la TablaVlll.3,
se recogenlos resultadosobtenidosexpresados
en mg/kgrespectoa pesode colorante
gu
analizado,observándose
Io si iente:
¡ Tras la extracciónde todos los colorantes,se detectala N-fenilanilinajunto con
pequeñascantidadesde 4-aminobifenilo
y 2-aminobifenilo,
lo cual pareceindicar
que en la mismasíntesis
ya tienenlugarlasreacciones
y/o procesos
secundarios
que
puedenoriginarlas.
Además,se observaque la cantidadde N-fenilanilina
es siempre
superiora las de 4-aminobifenilo
y 2-aminobifenilo.
Estotiene su explicación,
sabiendoque la 4-aminobifenilo
y la 2-aminobifenilo
puedencondensarcon el
agenteacoplan?edurantela síntesisdel colorante,mientrasque la N-fenilanilina
permaneceen estadolibre. Variosautorestambiéndeterminan4-aminobifeniloy
2-aminobifenilo,
tras realizarla extracciónde una seriede colorantesalimentarios
sintetizados
a partirde anilina[149-1521.
o Las cantidadesde 4-aminobifeniloy 2-aminobifeniloobtenidastras la reducción
tanto en medio ácido como en medio básico, aumentanconsiderablemente
respectoa fa extracción.Estotiene su explicacíón,ya que al estarambasamínas
combinadasen forma de azomolécula,sólo se liberancuandose rompe el grupo
azo. En la extracción,sólo se determinala pequeñacantidadque haya podido
quedarlibretrasla condensación
con el agenteacoplante.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Estudiode las ReaccionesSecundarias
en el Procesode Reducción
167
Tabla VIII.3. Cantidadesde 4-aminobifenilo,2-aminobifenilo y N-fenilanilina obtenidas para
Ios colorantes sintetizadosa partir de anilina, tras aplicarlesla extracción (E),
reducción en medio ácido (A) y reducciónen medio básico(B).
Arilamina
Colorante
(m{ks)
Experiencia
2-Aminobifenilo
Acid Green114
E
10.5
A
633.0
...........-B-..........
E
Direct Black168
Acid Blue29
Acid Orange10
*Aminobifenilo
10.1
320.3
282.9
......?i...?..............._
73.7
69.4
't5.1
17.7
80.5
A
642.7
82.5
312.4
B
338.4
28.0
323.6
E
A
B
E
A
10.0
72.6
6.5
418.0
82.4
208.5
232.3
36.9
188.4
PAcid Yellow 11
348.0
N-Fenilanilina
E
A
B
0.24
7.6
0.10
21.9
7.6
29.7
31.9
7.6
55.7
1.6
3.3
8.3
9.8
o.70
1s.6
36.8
28.5
69.5
o La N-fenilanilinadeterminadatras la reducciónen medio ácido es similar a la
trasreduciren condiciones
obtenidaen la extracción,mientrasque la determinada
alcalinasse mantieneo inclusodisminuye,como es el casode los tres primeros
lo cual no parecelógicoen un principio.Ante tal hecho,se llevó a cabo
colorantes,
de lastresaminastrasaplicarleslos procedimientos
un estudiode recuperación
de
para la N-fenilanilinaun 70.3 y
reducciónen medio ácido y básico,obteniéndose
y parala 4-aminobifenilo
79.8y 36.5o/o,
un 18.9%,parala 2-aminobifenilo
94.8y
respectivamente.
B5.0olo
En la Tabla Vlll.4 se muestranlos valoresobtenidosde aplicar dichos factoresde
indicadosen la TablaVlll.3.
recuperación
a los resultados
Se apreciaque la cantidadesde N-fenilanilinaobtenidastras la reduccióntanto en
medio ácido como en básico,experimentanun aumentoconsiderablerespectoa las
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
168
CapítuloVllt
obtenidasen la extracción.Esto parece indicar que durante el análisis,tanto en
condicionesácidascomo básicas,pueden producirselos procesossecundariosque
juntocon la 4-aminobifenilo
oríginanla N-fenilanilina
y la 2-aminobifenilo.
Tabla VIII.4. Cantidades corregidas de 4-aminobifenilo, 2-aminobifenilo y N-fenilanilina
obtenidas para los colorantessintetizadosa partir de anilina, tras aplicarlesla
extracción(E),reducciónen medio ácido (A) y reducciónen medio básico (B).
Arilamina
Colorante
2-Aminobifenilo
N-Fenilanilina
10.5
793.2
953.4
73.7
137.0
10.1
337.9
332.8
E
17.7
80.5
15.1
A
805.4
117.4
329.5
B
927.1
148.1
380.7
E
A
B
10.0
523.8
636.4
o.24
27.4
87.4
72.6
6.5
117.2
219.9
195.2
221.6
7.6
0.1
31.3
65.5
E
Acid Green114
Direct Black168
Acid Blue 29
A
E
Acid Orange10
A
B
Acid Yellow 11
(melks)
Experiencia
E
A
B
1.6
35.7
190.4
98.7
10.8
40.2
3.3
11.8
51.9
*Aminobifenilo
o.70
16.5
43.3
Por otro lado, las cantidadesde las tresaminasobtenidastras la reducciónen medio
básico,son similareso superiores
a lascorrespondiente
en medioácido, lo cual parece
que
indicar
lascondicionesalcalinasfavorecenel desarrollo,
duranteel análisis,de los
procesossecundariosque las originan.Estocoincide con varios trabajosdonde se
afirmaque unascondicionesde reducciónfuertemente
básicasfavorecenla aparición
de reacionessecundarias
no deseadas,
entreellasla formaciónde 4-aminobifenilo
tras
el análisis
de colorantes
derivados
de anilina138,67,1991.
Con el fin de comprobarla posibleformaciónde N-fenilanilina
trasel análisis,
se llevó
a cabo la extraccióny Ia reducciónen medioácido de los colorantesAcid Blue 29 y
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las ReaccionesSecundarias
en el Procesode Reducción
Acid Yellow 11 una vez purif¡cadostras disolverlosen dimetilformamidacalientey
filtrarlosposteriormente
[71]. La purificaciónse estimóen basea la relaciónentre los
coeficientesde extinción del colorante inicial y del purificado medidos en
absorbancia/g
de muestra,obteniéndose
valoresde 2.3 y 1.4 respectivamente.
En la
Tabla Vlll.s, se muestranlos resultadosobtenidosexpresadosen mglkg referido a
colorantepurificado.
TahlaVIII.S. Cantidadesde &aminobifenilo, 2-aminobifeniloy N-fenilanilina obtenidas para
Ios colorantesAcid Blue 29 y Acid Yellow t 1 sin purificar y purificados, tras
aplicarlesla extracción(E)y reducciónen medio ácido (A).
Colorante
Purificado
Acid
Blue29
Acid
Yellow l1
Arilamina
(me/ks)
Experiencia
2-Aminobifenilo
N-Fenilanilina
4-Aminobifenilo
E
A
7.2
794.5
4.7
44.7
ND
393.0
E
A
't54.7
ND
38.6
ND
65.3
o.4
ND: Compuestono detectado
Como puede apreciarse,
el procesode purificaciónrealizadoconsigueeliminar gran
partede las arilaminaspresentesinícialmenteen amboscolorantes.Por otro lado, la
N-fenilanilinadeterminada
trasla reducción,aumentaconsiderablemente
respectoa la
obtenidatras la extracción,pasandode 4.7 mgkg a 44.7 mg/kgparael Acid Blue 29, y
de no detectablea 38.6 mglkg para el Acid Yellow 11. Estosresultadosindican que
durante el. análisispueden tener lugar procesossecundariosoriginantesde la Nfeni lani Iina,ademásde 4-aminobifeni
lo y 2-aminobifen
ilo.
En definitiva, parececomprobarseque las reaccionesy/o procesossecundariosque
provocanla detecciónde la 4-aminobifenilo,
puedenocurrirtanto en la manufactura
proceso
del colorante como en el
de análisis.Sin embargo,resultacomplícado
cuantificarcuál es el gradode contribuciónde cadavía a la formaciónde dicha amina,
ya que la cantidadde éstaformadaduranteel análisispodríavenir influenciadapor el
procesoy lascondicionesen que se sintetizael coloranteen cuestión.
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170
Capítulo Vllt
Vlll.2.3. Detecciónde 2-Naftilamina
En el apartadoVlll.2.l, se ha comprobadoque trasel análisisdel coloranteAcid Red
44 se detecta la 2-naftilaminasin estarpresenteen su estructura.Por otro lado, la
bibliografíarecogecasosde colorantesque no se sintetizana partir de 2-naftilamina,
pero que tras su análisisse detecta presenciade dicha amina 138,67,200,2121"
Normalmente,estoscolorantessuelenfabricarsea partir de la l-naftilaminao de
derivadossulfonadosde la 2-naftilamina.
Los motivosque se aludenparaexplicartal
hecho,son los s¡guientes:
o Existencia
como impurezade pequeñascantidades
de 2-naftilamina
en compuestos
para
utilizados
la fabricaciónde colorantes,como son la 1-naftilamina[200] o
ciertosderivadossulfonados
de la 2-naftilamina
1149,2121.
.
Desulfonación
de derivadossulfonados
de la 2-naftilamina
como consecuencia
del
análisisde colorantessintetizados
a partirde dichoscompuestos
138,67,2121.
De cara al método analítico,el caso más problemátícoes el correspondiente
a la
desulfonacióndurante el análisis,ya que es el propio método el que provoca la
apariciónde la 2-naftilaminay el consiguienterechazode la muestraen caso de
superarse
el límite de 30 ppm. Se estaría,por tanto,ante un "falsopositivo".Por otro
lado, en el apartadoVllt.2.1 se ha comprobadola posibledesulfonaciónde ciertos
fragmentos
liberadostrasel análisisde los colorantes
Acid Orange61 y Direct Violet
51.
Con el fin de comprobarla existenciade 2-naftilamina
como contaminanteen la sal
sódicadel ácido 2-amino'1-naftalenosulfónico
empleadaen ocasiones
como
12OO,2121,
partida
arilamina de
en la fabricaciónde ciertos colorantes,se llevó a cabo su
extracciónlíquido-líquidocon éter dietílico (3x20 ml) de dos formas distintas:a
temperatura
ambiente,y trasmantenerla sala 70 oC durante15 minutosbajo agitación
magnética.La muestrafinal se analizópor CEIUV,determinándose
0.0196 y 0.0458
mdkg de 2-naftilaminalibre referidoa peso de compuestoextraído,respectivamente.
Se comprueba así que la amina prohibida se encuentraya en estado libre,
probablemente
debidoa que la sulfonación
de la misma,dentrode la síntesis
del ácido
(Figura11.21),
2-amino-1-naftalenosulfónico
no es del 100%.Además,la aplicaciónde
temperatura
favorecela desulfonación
de la sal.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Estudiode /as ReaccionesSecundarias
en el Procesode Reducción
171
Por otro lado, es presumiblela existenciade mayorcantidadde 2-naftilaminacomo
impureza,en derivadossulfonados
de la mismaempleadoscon finesindustriales
en la
síntesis
de colorantes.
o-8-o-*.*
ofiNH'N"'s'oo-@t*
2-Amino-l-naftalenosulfonato
sódico
2-Naftilamina
FiguraVII|.4. Desulfonación del 2-amino-l-naftalenosulfonatosódico, bajo condiciones de
reducción.
Con el fin de comprobarsi, bajo distintascondicionesde reducción,se favorecela
desulfonación
de la sal,y por tanto,la formaciónde 2-naftilamina
a causadel método
analítico(FiguraVlll.4),se llevarona cabo lasexperiencias
siguientes:
A:
Reducción según las condiciones establecidas en el capítulo Vll, pero
aplicando 2B oC de temperaturaen lugar de 70 oC.
B:
Reducciónsegún las condicionesestablecidasen el capítulo Vll.
cj
lgual que B, pero ajustandoel pH¡ del medio acuosoa 2.3, en lugar de S.
D: lgual que B, pero empleando50 ml de tampón ácido cítrico 0.06 M/NaOH
0.16.M (pH:6), en lugarde agua ajustadaa pH 5.
E: 30 mg de 2-amino-l-naftalenosulfonato
sódicose disue/veen 50 ml de NaOH
I M y se calientanbajo agitación magnética hastaB0 oc, manteniéndo.se
a esa
temperaturadurante 30 minutos.se agregan250 mg de ditionito sódico y se
agita 30 minutos más, tras lo cual se enfría bajo el chorro de agua. La
extracciónde las arilaminasy la preparaciónde la muestrase lleva a cabo igual
que en B.
F:
lgual que en E, pero a tomando 70 "C de temperaturaen lugar de B0 oC.
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capítulo vlll
I /¿
En la Tabla Vlll.6, se recogenlos resultadosobtenidosreferidosa peso de muestra
analizada.En primer lugar,se observaque la presenciadel ditionito sódicoa 28 oC
de la sal,ya que se obtieneuna cantidadde 2-naftilapenasprovocala desulfonación
g/kg)muy similara la obtenidaen la extracc¡ón
a temperatura
ambiente
amina(O.O2O7
(0.0196dkg). S¡nembargo,la presencia
de ditionitosódicoaTOoC sí da lugara un
aumentoapreciablede la desulfonaciónrespectoa la extraccióna 70 "C. obteniéndose
respectivamente.
Por tanto,son las condiciones
0.0458 y 5.464 g/kg de 2-naftilamina
presencia
y
de agente reductor lo que aumenta
conjuntas de temperatura
el gradode desulfonación.
considerablente
TablaVIII.6.
Desulfonacióndel 2-amino-l-naftalenosulfonatosódico, tras aplicarle distintas
condicionesde reducción.
Condicionesde
2-Naftilamina
Reducción
A
o.0207
B
5.464
c
6.390
D
E
3.581
F
0.4605
1.458
paraun mismovalorde pH¡,un aumentode la temperatura
de
Como puedeapreciarse,
Por
originandomayorcantidadde 2-naftilamina.
reducciónfavorecela desulfonación,
oC,
la desulfonación
se incrementaa
constantede 70
otro lado, parauna temperatura
pH másácidos,p,asándose
de una cantidadmínimade 0.4605g/kgen medioalcalino
de NaOH 1 M, a una máximade 6.390 dkg a pH':2.3. Es decir, el empleode
alcalinasen el análisisdisminuyeel gradode desulfonación.
condicionesfuertemente
en el apartadoanterior,el análisisen condiciones
Portanto,en contrade lo observado
parece
el efectoque provocaun procesosecundario,
contrarrestrar
fuertementebásicas
sobreel resultadofinal del mismo.Estopone de manifiestola
como la desulfonación,
de unascondicionesóptimasde trabajo,que
dificultadque entrañael establecimiento
y/o procesossecundarios
susceptibles
permitaneliminartodaslas posiblesreacciones
de producirseduranteel análisis.
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Estudiode las ReaccionesSecundariasen el Procesode Reducción
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173
Vlll.3. Conclusiones
De los resultados
obtenidosen el presentecapítulo,se puedendeducir las siguientes
conclusiones:
1. Los productos formadostras la reducción con ditionito sódico de una serie de
azocolorantes,tanto solubles como insolublesen agua son, en general, los
esperados
en un principiocomo consecuencia
de la rupturadel grupoazo.
2. En ocasiones,
trasel análisisde ciertoscolorantesse detectanalgunoscompuestos
no esperadosen base a la reduccióndel grupo azo. Estosson los casosde la
reduccióndel grupo nitro a grupo amino, la detecciónfragmentosoriginadostras
procesosde desaminacióno desulfonación,o la detección4-aminobifeniloen
colorantessintetizados
a partirde anilinacomo aminabase.
3. La presenciade 4-aminobifenílo
trasel análisisde ciertoscolorantessintetízados
a
partirde anilina,puedeserdebidatantoal procesode síntesis
de los mismoscomo
al propio métodoanalítíco.Respecto
a la posiblecontribucióncomo consecuencia
del análisis,parececomprobarseque unascondicionesde reducciónfuertemente
alcalinaspuedenfavorecerel desarrollode las reacciones
ylo procesossecundarios
que originanla aparición
de dichaamina.
4. En la sal sódicadel ácido 2-amino-l-naftalenosulfónico
se ha detectadola presencia
de 2-naftilaminacomo contaminante.Por otro lado, la reduccióncon ditionito
sódicode dicha sal provocala apariciónde la amina prohibidatrasdesulfonación
de la misma,favoreciéndose
esteprocesocuanto mayor es la temperaturay menor
pH
es el
de análisis.
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lX. Análisisde PielesTeñidas
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde PielesTeñidas
|X.1.Introducción
En el capítulo Vll se estudiaronlos factoresque influyen en la reducción de
azocolorantes
librescon ditionito sódicoy en qué medidaafectasu manipulaciónal
resultadofinal del análisis.Concluidoesto,el pasosiguienteconsistíóen la aplicación
de los resultados
obtenidosparaazocolorantes
al análisisde cuerosteñidos.
La bibliografíaexistentesobrela determinaciónde aminasaromáticas
en muestrasde
cuerosteñidoscon azocoloranteses muy escasa|196,200-202],siendo másfrecuentes
los trabajosrelacionados
con el análisisde materiales
textilesÍ199,2O7-21O,249-2SOI.
Estopuededebersea la mayorcomplejidadque presentael cueroen su composición,
necesitandode un tratamientoy/o procesomás específicode forma que se produzcan
lasmínimasinteferenciasposiblesen la posteriordeterminación
de lasarilaminas.
Paraabordarel estudio,se ha estructurado
ésteen los apartadossiguientes:
a
a
a
a
Ensayospreliminares
Establecimiento
del métodode análisis
Estudiode recuperaciónde las arilaminas.
Análisisde pie/espatrón
En fos ensayospreliminares,
se llevarona cabo unaseriede experiencias
previassobre
pieles teñidas,con el objeto de obtener las primerasconclusionesacerca de su
comportami
ento antedeterminadascondicionesde análisis.
En el establecimientodel método de análisis,y con la informaciónobtenida en el
apartadoanterior,se establecieron
lascondiciones
de análisissobrecuerosteñidoscon
el fin de determinarla mínimacantidadposiblede arilaminapresenteen ellos.paratal
fin, se hicieron uso de pieles patrón de concentracionesen azocolorantes
perfectamente
conocidas.
En el estudio de recuperaciónde las arilaminas,se pretendió estudiar la posible
influencia que tiene la aplicación del método establecidopara piel sobre el
azocolorantelibre, asícomo estudiarlas posiblescausaspor las que, en determinadas
condicíonesde análisis,no seobtienenlascantidades
de aminaesperadas.
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Por último,con el fin de comprobarla validezy reproducibilidad
del métodopuestoa
punto,se aplicó a un conjuntode pielespatrónpreparadas
con distintoscolorantesv
en distintasconcentraciones.
La técnica instrumentalempleada para la realizaciónde este estudio, fue la
Cromatografía
de Líquidosde Alta Resolucióncon detectorde FotodiodosUV-Visible.
1X.2.Materialesy Métodos
1X.2.1.
Reactivos
En estecapítulose han empleadolos siguientes
azocolorantes:
a
o
a
a
a
Negro P (Cromogenia)
NegroCarbón(Sandoz)
DirectBfue 35 (Robama)
Acid Red 114 (Sandoz\
Acid Red 128 (lCD
Negro P y Negro Carbón son los nombrescomercialesde dos colorantescuyas
estructurasmolecularesse desconocían,
y se ut¡l¡zaronen el apartadode ensayos
preliminares.Loscuatro últimosse emplearonen los apartadosde establecimiento
del
método de análisisy análisisde pielespatrón. En este estudio, puesto que no se
pretendíahallar los rendimientosde reducciónde los colorantes,no se consideró
necesarioestudiarla purezade todosellos.Portanto,como informaciónrespectoa la
misma,se empfeóla cromatografía
de capafina.En la FíguraIX.1,se muestrala TLCde
los colorantesNegro P y NegroCarbón,empleandola fasesuperiorobtenidacuando
se mezcla n-butanol/etanol/agua
en la proporción4/'l/5 l8,8-g},g2l.En ella puede
observarse
una Sransimilitudentrelos componentes
aparecidos
en amboscolorantes,
lo cual indica una gran semejanzaen sus composiciones.
La TLC de los otros tres
colorantes
ya se presentóen el capítuloVll (FiguraVll.1).
Seanalizaronlos productosde reducciónde los colorantesNegroCarbóny Negro p en
CC/MS,tras aplicarlesel métodoestablecidoen el capítuloVll, observándose
como
compuestomayoritarioen ambos casos la bencidina,junto con otros de menor
importanciacomo eran la anilinay la 4-aminobifenilo.
Respecto
a los tres colorantes
restantes,
los resultados
de esteanálisisseencuentran
en el apartadoV11.2.1.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
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Análisisde PielesTeñidas
179
<-
Frentedel eluvente
t
f¡f
*
o
o
a
b
I
+
Aplicaciónde lamuestta
Figura 1X.1. Cromatografíade capa fina de los colorantes(a) Negro Carbón y (b) Negro P,
empleandola fasesuperiorobtenida cuando se mezcla n-butanolletanollagua,en
Ia proporción 4/1/5.
Tabla IX.l .
Porcentajesde arilaminapresentesen los azocolorantesNegro P, Negro Carbón,
Acid Red 114, DirectBlue 35 y Acid Red 128.
Arilamina
(Y")
Colorante
Bencidina
NegroP
NegroCarbón
Acid Red114
o-Tolidina
o-Dianisidina
10.7 tO.4
3.4 + 0.1
0.28+ 0.02
11.1 t 0.3
Direct Blue 35
2 . 5! O . 2
Acid Red128
9.0 r 0.3
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En la Tabla lX.l se indican las arilaminasy las cantidadesen que se encuentran
presentes
en cada uno de los azocolorantes,
indicándose
el valor mediojunto con el
intervalode confianzaal 95o/oen basea un mínimo de diez determinaciones.
Los
valoresse expresanen tantopor cíentorespectoa pesode coloranteanalizado,siendo
el procedimiento
de análisis
empleadoel establecido
en el capítuloVll.
1X.2.2.PielesTeñidas
El procedimientoseguidoen la elaboraciónde las pielesteñidas(procesoen bombo),
expresandolascantidadesen tanto por ciento respectoa cantidadde piel en tripa, es el
que se indicaa continuación:
'
Lavadode Ia piel con un 150% de agua a 40 oC y posteriormente
con un 3% de
resinasintética.
o Neutralizacióncon un 0.8% de bicarbonatosódico, traslo cual se mantieneba¡o
agitación durante45 minutosy se escurreIa piel'
Adición de un 20% de amoniaco(10%) y de la cantidadde azocolorantedeseada.
trasIo cual se mantienebaio agitación duranteuna hora.
Adición de un 200% de agua a 60 oC y de un 20% de ácido fórmico (10%)
agitándoseposteriormente
durante dos horas,traslo cual se escurrela piet.
Adición de un 200% de agua a 60 oC, un 40% de aceite sintéticoclorado(10%)
agitandoseposteriormenteduranteuna hora,y un 10% de ácidofórmico (10%) tras
Io cual se vuelve a agitaruna horamá*
o Por último se lava la piel, se escure y se deia secara temperaturaambiente.
Siguiendoesteprocesode elaboración,se prepararonuna seriede pielesteñidaspara
cadauno de los apartadosindicadosen la introducción.En la Tabla1X.2,se muestran
laspiefesestudiadasen el apartadode ensayospreliminares.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tabla1X.2. Pielesteñidasestudiadas
en el apartadode ensayospreliminares.
Piel
Colorante
Teñida
Gramos
Gramos
Concentración
Colorante
Piel Seca
(%)
PTl
NegroP
0.2
78.6
0.25
PT2
NegroP
0.8
75.5
1.06
PT3
NegroP
1.7
83.8
2.O3
PT4
NegroP
3.5
88.9
3.94
PT5
NegroCarbón
0.2
88.2
0.23
PT6
NegroCarbón
0.9
100.5
0.90
PT7
NegroCarbón
1.9
8s.8
2.21
PT8
Carbón
3.6
94.0
3.83
De esteconjunto de pielesno se disponíande los bañosfinalestras el procesoen
bombo, por lo que no se pudieron estimar los rendimientosde fijación del
azocolorante
al cueroen basea la cantidadque hayapodido quedarlibre en el baño.
Por tanto, las concentraciones
de coloranteen cada piel se estimarona partirde las
cantidades
empleadas
de éste,referidas
a piel seca.
En la Tabla lX.3 se recogenlos datoscorrespondientes
a la preparaciónde las pieles
patrón empleadasen el restodel estudio.A diferenciade las pielesrecogidasen la
Tabla 1X.2,utilizadasen los ensayospreliminares,
de estospatronessí se disponíanlos
correspondientes
bañosfinalestrasel procesoen bombo,lo cual permitiócalcularcon
más fiabilidad la concentraciónfinal de arilaminapresenteen cada uno de ellos,
teniendo en cuenta la cantidadque haya podido quedaren el baño en forma de
azocolorantelibre.
Paralelamente
a estaseriede patrones,
se preparóuna piel blancoa la que se aplicó el
mismoprocesoen bomboque al restode pieles,exceptuando
el pasode la tinción.De
estaformase disponíade una muestracon todoslos componentes
de una piel acabada
a excepción del colorante, pudiendo así comprobar la posible existencia de
interferentesen la determinaciónde las aminas. También se disponía del
correspondiente
baño,de cuyo análisisse comprobóla inexistencia
de interferencias
significativas
a la horade analizarlosbañosdel restode patrones.
El agotamientode baño se determinóanalizandocada uno de ellos según el
procedimientode análisisestablecido
paraazocolorante
en el capítuloVll. A partir de
la cantidadde arilaminadetectada,
de los gramosde coloranteempleadosy de la
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
concentraciónde amina en cada colorantes(TablalX.1),es posibledeterminarqué
porcentajede colorantese ha fijadoal cueroen cadapatrón.Paralaspielesteñidascon
Acid Red 114, se indican dos valoresde agotamientode baño: el primero está
calculadoen base a la o-tolidína,la arilaminabasedel colorante,mientrasque el
segundolo estáen basea la bencidina.En cuantoal restode pieles,el único valor
indicadocorresponde
a la arilaminapresente
en cadacolorante.
Tabla 1X.3. Pieles patrón empleadasen /os apartadosde establecimientodel método de
análisis,estudiode recuperaciónde las arilaminasy análisisde pielespatrón.
Piel
Colorante
Gramos
G¡amos
Patrón
Colorante
Piel Seca
PPA
0.08
74.O
t_t9.
............9-'.!..!.................-.............9.9-
0.13
62.7
..............-0-'?.!.................-.............?.2.,..!
0.18
84.9
PPC
Acid Red114
Concent¡ación
(%)
Agotamiento de
o.21
Baño
g3.g(')
g6.g(..)
PPD
Acid Red114
0.72
72.4
0.99
92.gc)
gg.3(")
PPE
Acid Red114
1.37
63.9
2.14
g5.g(-)
-')
973'
PPF
Acid Red114
2.56
65.3
3.92
72.7(,
95.1(")
ffS- .....-D-irst..9Jys.-1i...
- ........1....0..8......-.........?_9,9.......
... .......L.,1._2..
rttl -o-irgi.Plys".ll...
- l:9-0-..................9-.1'9
'1.22
99.3
PPI
t_t_1.Acid Red128
(*)
(* *)
Acid Red128
1.52
97.6
1.25
95.2
62.8
2.42
95.0
Cálculohechoen basea la o-tolidina.
Cálculohechoen basea la bencidina.
Engeneral,se observaque losagotamientos
de bañosonsiempresuperiores
al 90%, lo
cual demuestraque la mayor partedel coloranteempleadoen la preparaciónde los
patronesquedafijado al cuero. El único casoen que apareceun valor inferior,es el
observadoen el patrónPPFreferidoa la o-tolidina,obteniéndose
un agotamientodel
72.701".
Estopuededeberseal hechode que el Acid Red114 no es un colorantepuroy
lasdos arilaminaspresentes
en él se puedenencontraren diferentes
azomoléculas,
con
lo cual loscomportamientos
en la tinciónde ambasno tienenpor qué seriguales.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde PielesTeñidas
183
1X.3.Resultados
y Discusión
1X.3.1.EnsayosPreliminares
Paralos ensayospreliminaresse escogióla piel PTSde las indicadasen la Tabla 1X.2,
con presenciade bencidinaen una concentración
estimad
a de 78.2mg/kg.Se llevaron
a cabo una seriede experiencias
con el fin de conocerel comportamiento
que la piel
presentabaante la variación de ciertos factorescomo son el pH y la temperatura,
ademásde observarel efectoque ello producíasobreel resultadofinal del análisis.Los
ensayospreliminares
efectuados
fueronlos siguientes:
Ensayopreliminar A:
Se humectan 2.5 gramos de piel desfibrada en 50 ml de agua bajo agitación
magnética.Se calientahasta60 oC y se agregan1.5 gramosde ditionitosódico (0.6
gramoslgramo piel). Tras mantener 20 minutos en agitación magnética a esa
temperatura,se enfría Ia muestrabajo el chorro de agua y se filtra a vacío en un
embudo de placa porosa (tamaño de poro: 2), lavando posteriormentecon agua
(4x10 ml). La extracciónde arilaminasy la preparaciónde la muestra para su
análisiscromatográficose llevana cabo tal y como se estab/ecióen el capítulo VI.
Ensayopreliminar B:
lgual que el ensayoA, pero con las siguientesdiferencias:
InicialmenteIa piel se humectaen 50 ml de aguaa los cualesse agregan0.4
mlde HCI I M.
LJia vez filuada la muestra,éstase lava con S0 ml HCt 0.0t M.
Ensayopreliminar C:
lgual que el ensayoB, pero humectandoinicialmentela piel en S0 ml de aguaa los
gue se agregan2 ml de HCI I M.
Ensayopreliminar D:
lgual que el ensayoC, pero realizadoa 70 "C.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
184
CapítulolX
Ensayopreliminar E:
lgual que el ensayoD, pero con la siguientesdiferencias:
a
a
lnicialmentela piel se humectaen 50 ml de aguaa los cualesse agregan0.5
ml de HCI I M.
El filtrado se lleva a cabo en caliente,no en frío.
una vez filtrada la muestra,éstase lava con 40 ml HCI 0.1 M seguidode 40
ml de agua.
Ensayopreliminar F:
lgual que el ensayoE, perorealizadoa B0 oC.
Ensayopreliminar G:
Se humectan 2.5 gramos de piel desfibrada en 50 ml de agua bajo agitación
magnética. Se agregan 2 ml de NaOH 4 M y se calienta la muestra hasta 70 oC
manteniéndola bajo agitación magnética durante 15 minutos, al término de los
cuales se neutraliza con 4 ml de HCI 2 M. Se agregan 1.5 gramosde ditionito
sódico (0.6 gramoslgramopiel) agitándosedurante20 minutot se añaden2.5 m! de
HCI 2 M y se filtra en caliente a vacío a través de un embudo de placa porosa
(tamaño de poro: 2). se lava con 40 ml de HCI 0.1 M seguidode 40 ml de agua.La
extracción de las arilaminas y la preparación de Ia muestra para su análisis
cromatográfico,se llevan a cabo taly como se estab/ecióen el capítulo vt.
En la FiguralX.2 se representa
la concentración
de bencidinaobtenida,expresadaen
mg/kg de muestráanalizada,tras aplicar a la piel PT5 cada uno de los ensayos
anteriores.
A la vistade ella,se puedenobtenerlasconclusiones
siguientes:
.
En primer lugar parece existir un ligero incrementoen la concentación de
bencidina obtenidaentre los ensayosB y C, cuando se acidificael medio de
reacción,pasandode obtener15.1a 20.6 mg/kgde amina.
.
El aumentode la temperatura
de reducciónen 10 oC,como ocurreentrelos ensayos
c y D por un lado (de 60 a7o oc) y entreE y F por otro (de 70 a B0 "c), provoca
tambiénun leveaumentoen el resultadofinal. En el primercasose pasade 20.6 a
26.1 mglkg,mientrasque en el segundose pasade 40.6 a 45.9mdkg.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde PielesTeñidas
185
r Sin embargo, hay dos factoresque provocan un ¡ncrementonotable en la
concentraciónfinal de bencidinaobtenida,QUeson: el filtrado de la muestraen
calientey el tratamientobásico previo a 70 "C con NaOH 4 M. En cuanto al
primerode ellos,entre los ensayosD y E se produceun aumentoen el resultado
final del 56%, pasandode 26.1 a 40.6 mglkg,mientrasque en el segundo,entrelos
ensayosF y C se produceun incrementoen el resultadodel 4B%, pasandode 45.9
a un 68.1 múke.
Ctt
+.
(tt
60
E
v50
ql
c
E40
ct
c
q30
t¡¡
o
c, 20
o
o= 10
(J
CDE
EnsayoPrelirninar
Figura 1X.2. Concentración de bencidina obtenida tras aplicar cada uno de los ensayos
preliminares,
sobrela piel teñidaPT 5 (0.23%en Negro Carbón).
Estosresultados
evidencianque la accesibilidad
del ditionitosódicoal colorantefijado
piel,
la
en
es un factorclavea la horade establecer
el métodoparala determinación
de
arilaminasen cueroteñido,ya que el tratamiento
previocon NaOH 4 M a 70 oC
produce un hinchamientoy/o disgregaciónparcial de las fibras de la piel y en
consecuencia
un aumentode la superficiede contactoentre el agentereductory la
muestra.El hechode que un aumentode la temperatura
contribuyatambiéna mejorar
los resultados,
concuerdacon estahipótesis.
Una vez realizadoslos ensayospreliminarescon la piel PT5 y tomando como
condicionesde trabajolas correspondientes
al ensayopreliminarC, se analizaronel
restode pielesque se recogenen la Tabla 1X.2.Los resultadosse muestranen las
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186
Capítulo IX
TablaslX.4 y 1X.5,donde se indicanlos valoresexperimentales
de arilaminajunto con
ef intervalode confianzaal95o/o,
y los valoresesperados,
expresados
ambosen mg/kg
sobre peso de piel analizada.El valor esperadose estimóteniendo en cuenta la
concentración
de coloranteen cada muestrade piel teñida(TablalX.2),junto con las
cantidades
de arilaminadeterminadas
en cadacolorantefabla lX.1).
Tabla 1X.4. Concentraciónde bencidina obtenida para las pielesPTt, PT2, PTJ y PT4, teñidas
con el coloranteNegro P, trasaplicar el ensayopreliminarC.
Piel
Bencidina
(ms/ks)
Teñida
PTl
276.9+ 7.7
267.5
PT2
1017.0+ 20.2
1134.2
PT3
1 9 8 9 . 3+ 3 5 . 1
2172.1
PT4
3930.8! 72.8
4215.8
Tabla1X.5. Concentraciónde bencidinaobtenida paralas pielesPTí, PT6,PT7 y PT|, teñidas
con el coloranteNegro Carbón, trasaplicar el ensayopreliminar C.
Piel
Bencidina
Teñida
(ne/ks)
PT5
68.1+ 2.3
78.2
PT6
3 1 7 . 4t 6 . 9
306.0
PT7
't7.8
665.4+
751.4
PT8
1261.Ot 28.6
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
'1302.2
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde PielesTeñidas
187
Paraambasseriesde muestras,
se puedeobservarque las recuperaciones
de bencidina
obtenidas son siempre similareso superioresal 9}o/o, independientemente
del
colorantey de su concentración
en la piel teñida"
Se ha de recordarque éstosson ensayospreliminares
y no se pretendecon ellos llevar
a cabo un estudioestadístico
de los resultados
obtenidos,máximeteniendoen cuenta
que se tratade pielesde lasque no se dísponíanlosbañostrasel procesoen bombo.
1X.3.2.Establecimiento
del Métodode Análisis
Tras los ensayospreliminaresy teniendo ya una idea de cuálesson los factoresy/o
que máspareceninfluiren el resultadofinaldel análisis,se pasóa estudiar
tratamientos
másdetenidamente
el métodoa establecer.
Paraello se trabajócon los patronesPPA,
PPC,PPGy PPl,de la seriemostradaen la Tabla1X.3.
Antes de abordarel estudio,se analizó la piel blanco con el fin de comprobarla
presenciade posiblesinterferentes
que pudierandificultarla posteriordeterminación
de las arilaminas.Por un lado, no se detectóla presenciade ningún compuestoque
pudiera interferiren la cuantificaciónde la o-tolidinani de la odianisidina. Sin
embargo,se detectóla presenciade un pico con un tp ligeramenteinferioral de la
bencidina,cuyo espectrose muestraen la Figura1X.3.En determinados
casos,dicho
pico podríadar lugar a problemasen la determinaciónde la bencidina,sobretodo
cuandoéstase encontrara
en pequeñas
cantidades.
0s2
l
0ffo
22000
2¿000
26000
2s080
nm
300s0
32000
3¡000
36000
Figura 1X.3. Espectroultravioletadel interterentede Ia bencidinaaparecidotras el análisisde la
pielblanco.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
A continuación,se exponenlos distintosexperimentos
a que se sometieronlas citadas
pielespatrón.
Método A:
Se humectan 2.5 gramos de piel desfibradaen 50 ml de agua bajo agikción
magnética. Se calienta la muestra hasta los 70 oC y se agregan1.5 g de ditionito
sódico (0.6 gramoslgramo piel)- Se mantiene Ia muestraen agitación magnética
durante 20 minutos, se añaden2.5 ml de HCI 2 M y se filtra en caliente con .rn
embudo de placa porosa(tamañode poro: 2), lavando posteriormentecon 40 ml de
HCI 0.1 M seguido de 40 ml de agua. La extracción de las arilaminas y la
preparación de la muestrapara su análisiscromatográficose realizan tal y como se
ha establecidoen el capítulo VI.
Método B:
lgual que el método A, pero utilizando 50 ml de tampón ácido cítrico 0.06
M/NaOH 0.16 M, (pH:6), en lugarde agua.
Método C:
lgual que el método A, pero previamentea la adición del ditionito sódico, se
añaden a Ia muestra 6 ml de NaoH 4 M y se agita durante 4s minutos a
temperaturaambiente (28 oC), tras los cualesse neuüaliza con 12 ml de HCI 2 M y
se calienta hastalos 70 oC.
Método D:
lgual que el método A, pero previamentea la adición del ditionito sódico, se
agregan2 ml de NaOH 4 M y se calientala muestrahastalos 70 oC, momento en
el cual se neutralizacon 4 ml de HCI 2 M.
Método E:
lgual que el método D, pero manteniendola muestrabaio agitación magnética
durante 15 minutos en medio básico y a 70 oC, antesde neutralizar con 4 ml de
HCI 2 M.
En lasFiguraslX.4y lX.5 se representan
lasrecuperaciones
de arilaminaobtenidaspara
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
189
Análisisde PielesTeñidas
tras la aplicaciónde cada uno de los métodos
las cuatro pieles patrón estudiadas,
se calcularonen baseal valor
Losvaloresde recuperación
expuestosanteriormente.
esperadode arilaminapara cada patrón,estimadoen función de la concentración
inicial de colorante y del agotamientode baño (Tabla lX.3), así como de la
paracadacolorante(TablalX.1).
de aminadeterminada
concentración
Fso
rÉ
E
'ü
E0
$
E
(u
itr40
:g
u
ileo
o.
=
fJ
ü
É,0
't00
-_3 Bo
E¡lg(J
60
E
t40
u
ru
deo
6D
iltÉtodo
W
o-Tolidina
N
Bencidina
de arilaminaobtenidastras aplicar cadauno de los métodossobre
Figura 1X.4. Recuperaciones
las pielespatrón (A) PPA (0.11% en Negro Carbón)y (B) PPC (0.21% en Acid
Red 1I4).
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Por lo que respectaal patrónPPA (0.11% en NegroCarbón),en la FíguralX.4.A se
observaque todos los métodosempleadosdan lugar a valores de recuperación
semejantes
en torno al 75olo,a excepcióndel métodoB que pasaa serdel 57.5"1o,lo
cual representra
una disminucióndel 23oi".Pareceexistir,por tanto, un ligero efecto
negativoen el resultadoanteel empleodel tampónácidocítrico/NaOH.Porotro lado,
la intensidadcon que se aplica el tratamientobásicocon NaOH 4 M previo a la
adicióndel ditionitosódico,no pareceserrelevante
de caraa la recuperación
final.
En la FiguralX.4.Bpuedeobservarse
que el patrónPPC(0.21%en Acid Red 114)
muestraun comportamientomuy distintoal anterior.En cuantoa la amina basedel
colorante,la o-tolidina,la recuparación
final aumentaprogresivamente
en los cinco
pasandode un 58.1olo
métodosempleados,
en el primeroa un 92.2o1"
en el último.Sin
embargo,la bencidinase recuperaen los dos primerosmétodosen torno al 75olo,
alcanzandovalorescercanosal 100% en lastresrestantes.
Portanto,cuantomayores
la intensidaddel tratamientobásicopreviocon NaOH 4 M, mayores la cantidadde
amina base obtenida,lo cual parececonfirmarque la etapa limitantedel proceso
vendríadada por la accesibilidad
del agentereductoral colorantefijado al cuero, ya
que cuantomásintensaes la hidrólisis
producidaen
aplicada,
mayores la disgregación
la piel.Sinembargo,la bencidinase recupera
forma
de
similarcon los métodosC, D y
E a pesarde variarlascondiciones
de dichahidrólisis.
No obstante,
convienerecordar
que éstase encuentracomo impurezaen el Acid Red 1 14, y su comportamiento
no
tienepor qué seranálogoal de la o-tolidina.
Por último,en los patronesPPGy PP¡(1.12olo
en DirectBlue35 y 1.25olo
en Acid Red
128 respectivamente),
las recuperaciones
finalesde la o-dianisidina
son prácticamente
las mismasen todos los métodos,observándose
una ligeradisminucióncuando se
emplea el tampón ácido cítrico/NaOH(métodoB). Así, para el patrón PPG (Figura
lX.s.A),todoslos valoresse encuentran
pasandoa ser
en tornoal 95% de recuperación
de un 86.4ol"cuandose empleael tampón,mientras
que en el PPI(FiguralX.5.B),los
valoresrondanel97o1"
pasando
a serdel 92.901"
cuandoseaplicael métodoB.
Todos estos resultadosdemuestranque, dependiendodel tipo de muestraque se
analice,en ciertoscasoses necesario
aplicaral cueroun tratamiento
básicopreviopara
obtenerlas máximasrecuperaciones,
mientrasque en otros,con tratamientos
menos
ya es suficiente.
drásticos
Por otro lado,cuandola hidrólisisbásicaes muy enérgica
(casodel método E), puede producirseuna disgregación
de las fibrasdel cuero
demasiadofuerte,cosa que tambiénpareceocurriren el casode muestras
textiles,
como asíindicanWagnery col. [199].Estehecho,provocaen ocasiones
problemas
de
filtradodebidosa obturaciones
en el embudode placaporosa.Portanto,se seleccionó
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t91
Análisisde PielesTeñidas
el proceso descrito en el método D, ya que ademásde obtenerserecuperaciones
suficientementealtas en todos los casos, existe menor riesgo de una excesiva
del cuero.
disgregación
,*
F
ñ
p
.9
E
100
ao
.51
o¡
o
o
E
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U
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c
ü0
40
n
o
ABCDE
l\¡létodo
Figura 1X.5. Recuperacionesde arilamina obtenidastras aplicar cadauno de los métodossobre
laspieles patrón(A) PPG (1.120Áen DirectBlue 35) y @) PH (1.25% en Acid
Red 128).
de arilamínaobtenidapara
experimental
En la Tabla1X.6,se muestrala concentración
cada patrón tras aplicar la metodologíaestablecidaanteriormente(método D), junto
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
192
Capítulo IX
con el intervalode confianzaal 95% en basea seisdeterminaciones.
Los valoresse
expresanen mg/kg respectoa peso de piel analizada.Asimismo,se indica entre
paréntesisel porcentajede recuperaciónreferidoa la cantidadde aminaesperada.
Tabla1X.6. Concentracionesexperimenta/esde arilamina para las pieles patrón PPA, PPC,
PPG y PPI, trasel análisissegúnel método establecido.
Piel
Arilamina
(me/ks¡
Patrón
Bencidina
PPA
27.6+ O.9
PPC
(76.s)
5.6+ 0.3
(e8.2)
o-Tolidina
o-Dianisidina
207.8+ 6.0
(e4.9)
275.O+ 11.8
(e8.e)
PPI
1061.7+ 20.7
(ee.1)
1X.3.3.Estudiode Recuperac¡ón
de lasArilaminas
En este apartado,se quiso comprobar si los resultadosanterioresobedecen a
variacionesdel propio sistemade análisis,o bien, a una falta de accesibilidaddel
agente reductoral colorantefijado en el cuero. Para ello, sobre las pieles patrón
empleadasen el apartadoanterior y sobre los colorantescorrespondientes,
se
realizaronlassiguientes
experiencias:
Reducciónde colorantesegúnel método establecido(RecuperaciónA).
Con esta experienciase compruebasi el colorantelibre sufrealguna alteraciónylo
destruccióncomo consecuenciadel procesode análisisestablecidopara pieles.
Reducción de colorante segun el método establecido, en presencia de piel
(RecuperaciónB).
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde PielesTeñidas
193
En estecasose repitela experienciaanteriorpero en presenciade piel teñida, con
el fin de simular efectomatriz y comprobar su influenciasobre la recuperaciónde
las aminas.
En la TablalX.7 se recogenlos resultados
correspondientes
ala recuperación
A. Enella
se muestrala concentraciónmediaexperimentalde arilaminaobtenida,junto con el
intervalode confianzaal 95%. Losvaloresse expresanen tanto por cíentorespectoa
pesode coloranteanalizado.
Tabla 1X.7.
Reducciónde los colorantesNegro Carbón,Acid Red t 14, Direct BIue 35 v Acid
Red 128,segúnel métodode análisisestablecidoparapieles.
Arilamina
Colorante
(%lo)
Bencidina
NegroCarbón
3.3 + 0.1
Acid Red114
0.28+ 0.01
o-Tolidina
o-Dianisidina
'12.3
tO.2
Direct Blue 35
2 . 5+ 0 . 1
Acid Red 128
8 . 9+ 0 . 1
En lasTablasfX.Ba |X.11se muestranlos resultados
obtenidossegúnla recuperación
B, expresados
en mg/kgrespectoa pesode piel reducida,en donde:
V:
E:
T:
Cantidadde aminadeterminada
experimentalmente.
cantidad de amina experímentaldebida al colorante añadido, obtenida
restandoa V la concentraciónencontradade amina para cada patrón
(TablalX.6)
Cantidadde aminaesperada
debidaal coloranteañadido,obtenidasegúnlas
de aminadeterminadas
concentraciones
en cadacolorante(TablalX.1).
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
194
C^pítuloIx
Tabla 1X.8. Reduccióndel coloranteNegro Carbón, según el método de análisisestablecido
parapieles,en presencia
del patrónPPA.
Cantidad de
Cantidad de
Bencidina
Piel Patrón
Colorante
(ms/ks)
PPA
Añadido
VET
2.52
TablalX.g.
1.95
51.9
24.3
26.3
Reduccióndel colorante Acid Red 114, según el método de análisis establecido
para pieles,en presenciadel patrón PPC.
Cantidad de
Cantidad de
Piel Patrón
Colorante
PPC
Añadido
o-Tolidina
(me/k*)
Bencidina
fug/kg)
VETVET
2.51
TablaIX.l0.
4.72
410.5
202.7
208.7
10.5
4.9
5.3
Reduccióndel colorante Direct Blue 35, segúnel método de análisisestablecido
para pieles,en presenciadel patrón PPG.
Cantidadde
Cantidad de
eDianisidina
PielPatrón
Colorante
(mdke)
PPG
Añadido
v
E
T
2.50
13.41
391.9
11 6 . 9
134.1
2.51
26.89
506.0
231.0
267.8
2.50
40.32
608.2
333.2
403.2
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde PielesTeñidas
TablalX.|l.
195
Reduccióndel colorante Acid Red 128, segúnel método de análisisestablecido
para pieles, en presenciadel patrónPPl.
Cantidad de
Cantidad de
o-Dianisidina
PielPatrón
Colorante
(ns/kg)
PPI
Añadido
v
E
T
2.50
14.17
1576.6
514.9
510.1
2.50
28.95
2091.3
1029.6
1042.2
2.51
44.16
2623.8
1562.1
1583.4
Las concentrac¡onesobtenidas para cada colorante en la recuperaciónA son
prácticamentelas mismas a las determinadastras analizar cada uno de ellos
(TablalX.1),lo cual compruebaque la aplicacióndel tratamientobásicoprevio con
NaOH 4 M sobreel colorantelibre no alterala recuperación
de lasaminas.
Por otro lado, los valoresobtenidosen la recuperaciónB representanrecuperaciones
de aminacomprendidas
entreel 85 y el 100o/o,
de lo cual se desprendeque la posible
provocado
por
de
matriz
existencia un efecto
la presenciade piel puede considerarse
prácticamente
despreciable.
Todosestosresultados
confírmanque el motivo principalpor el cual no se obtienen
recuperacionesde arilamina próximas al '100o/o,en ciertos patrones y para
determinadas
condicionesde análisis,es fundamentalmente
la falta de accesibilidad
del ditionitosódicoal colorantefijadoen la piel.
1X.3.4.Análisisde PielesPatrón
Una vez establecidala metodologíade análisis,se analízaronel resto de patrones
mostradosen la Tabla lX.3 con el fin de estudiarlas recuperaciones
de arilamina
obtenidasrespectoa la cantidadteóricaparacadapatrón.Dicho valorteóricose estimó
en función de la concentracióninicial de colorantey del agotamientode baño
(TablalX.3),así como de la concentración
de aminadeterminadaparacada colorante
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
(Tabla lX.1). Asimismo,se comprobó hastaqué punto el tipo de colorantey la
concentración
en que se encuentrapresenteen cadapiel patrón,puedeinfluirtantoen
la recuperaciónfinal de arilaminaobtenida,como en la dispersiónde los valores
experimentales.
Tabla 1X.12. ConcenÚaciónde amina obtenida para los patronesPPA y PPB, teñidos con
Negro Carbón, tras aplicarlesel método establecido(no de medidas2 6).
Bencidina
(ms/ks)
Piel
Patrón
Experimental
PPA
27.6+ O.9
36.'l
PPB
54.Ot't.2
69.3
Tabla 1X.13. ConcenÚación de amina obtenida para los patronesPPC, PPD, ppE y ppF,
teñidos con Acid Red 114, Üas aplicarles el método establecido (n" de
medidas26).
o-Tolidina
Bencidina
(ms/ks)
Piel
(nelke)
Patrón
al
Esperada
PPC
207.8+ 6.0
218.9
5 . 6r 0 . 3
5.7
PPD
1 0 2 5 . 0+ 3 8 . 6
1020.9
30.5r 2.0
27.5
PPE
2284.6+ 44.8
2275.6
60.9+ 2.9
58.3
PPF
3 2 5 1 . 6+ 1 0 4 . 9
3163.3
106.4! 5.4
104.4
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Análisisde PielesTeñidas
En las Tablas 1X.12a 1X.15,se muestranla concentraciónmedia experimentalde
arilaminaobtenidajunto con el intervalode confianzaal 95o/o,ademásdel valor
esperadoparacadapatrón,expresados
ambosen mg/kgsobrepesode piel analizada.
Tabla 1X.14. Concentraciónde amina obtenida para los patronesPPG y PPH, teñidos con
Direct BIue 35, tras aplicarlesel método establecido(no de medidas2 6).
o-Dianisidina
(ms/kd
Piel
Patrón
PPH
TablalX.lS.
2 7 5 . O+ 1 1 . 8
278.0
5 3 0 . 5+ 1 8 . 8
576.5
Concentración de amina obtenida para los patrones PPI y PPJ, teñidos con
Acid Red 128, tras aplicarlesel método establecido(no de medidas2 6).
o-Dianisidina
(mslkc)
Piel
Patrón
PPI
1061.7! 20.7
1071.O
PP'
1 9 6 5 . 9+ 3 9 . 0
2069.1
las recuperaciones
Como puedeobservarse,
de arilaminaobtenidasen la mayoríade
los patronesse encuentranpróximasal 100% respectola cantidadesperada,aunque
las pieles PPA y PPBcorrespondientes
al coloranteNegro Carbónpresentanvalores
respectivamente.
algo inferiores76.5y 77.9o1'
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Exceptuandolos datoscorrespondientes
la bencidinapara los patronesteñidoscon
Acid Red 114, la dispersiónrelativade los valoresexperimentales
estácomprendida
entreun 2 y un 4.3olo,locual puedeconsiderarse
como aceptablea la horade evaluar
fa reproducíbílídad
del método.Losdatosde la bencidinaanteriormente
mencionada,
muestranuna dispersiónrelativaalgo mayor,estandocomprendidaentreun 4.7 y un
6.6o1".
A pesarde ello, tampocodebe interpretarse
como una faltade reproducibilidad.
Hay que teneren cuentaque la bencídinaseencuentracomo impurezaen el colorante
Acid Red 114, por lo que su comportamiento
no tienepor qué sersimitaral restode
aminasbase.
Por otro lado, el empleode uno u otro colorante,así como la concentración
en que
éstese encuentrapresenteen el cuero,no pareceafectaral resultadofinal.
1X.4.Conclusiones
De los resultadosobtenidosen este capítulo se pueden deducir las conclusiones
siguientes:
1. Se ha comprobadoque la accesibilidad
del ditionitosódicoal colorantefijado en la
piel, es un factorclavea la horade establecer
la metodología
parala determinación
de arilaminasen cueroteñido,ya que la aplicaciónde temperatura
y el tratamiento
básico previo con NaOH 4 M a 70 oC incrementanla cantidadde arilamina
obtenidatrasel análisis.
2. El métodoestablecido
parala determinación
de aminasaromáticas
en cueroteñido
con azocolorante,
es la siguiente:
Se humectán2.5 gramosde piel desfibradaen 50 ml de agua bajoagitación
magnética.Se agregan2 ml de NaOH 4 M y se calientala muestrahasta70 oC,
momento en el cual se neutralizacon 4 ml de HCI 2 M y se agregan1.5 gramos
de ditionito sódico (0.6 gramoslgramode piel). Se mantienela muesta bajo
agitacióndurante20 minutosa esatemperatrJra,
se añaden2.5 ml de HCI 2 M y
se filtra en caliente con embudo de placa porosa(tamaño de poro: 2) lavando
posteriormente
con 40 ml de HCI 0.1 M seguidode 40 ml de agua.La extracción
de las arilaminasy Ia preparaciónde la muestraparasu análisiscromatográfico,
se llevan a cabo tal y como se ha establecidoen el capítulo Vl.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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Análisisde PielesTeñidas
199
3. El análisisde colorante,segúnel métodoestablecido
paracueroteñido,con y sin la
presenciade piel, da lugar a valoresde recuperaciónde arilaminacercanoso
superioresal 90% respectoa la cantidaddeterminadaen cada uno de ellos. Esto
parece indicar, por un lado, que no se producealteracióny/o destruccióndel
colorante libre tras la aplicación del proceso,y por otro, que el efecto rnatriz
provocadopor la presenciade piel puedeconsiderarse
practicamente
despreciable.
parece
Por tanto,
confirmarseque el factor determinantedentro del método de
análisis,es la accesibilidad
del ditionitosódicoal colorantefijadoen la piel.
4. Ni la naturalezadel coloranteni la concentración
en que se encuentrapresenteen
la piel, parecetener influenciaalgunasobre las recuperaciones
de las arilaminas
obtenidastrasel análisis.Porotro lado,dichasrecuperaciones
son siempresimilares
o superiores
al 90%, excepciónhechade los patronesPPAy PPB(0.11y 0.21% en
NegroCarbón)en los que seobtienenvaloresdel 76.5y 77.9o1"
respectivamente.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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'X.
EstudioComparativo
con la NormaDIN 53316
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EstudioComparativocon Ia Norma DIN 53316
203
X.1.Introducción
A la escasabibliografíaexistentereferentea la determinación
de arílaminasen cuero
teñido [196,200-202],se le une una falta de unificacíónde criteriosa la hora de
estableceruna metodologíade análisisdeterminada.De hecho, hasta fechas muy
recientes,
no existíalegislación
o normaalgunaque aunaralos procedimentos
en todos
los laboratoriosa la hora de realizarun análisisde estanaturaleza.
En el segundodecretomodificadorde la ley de alimentosy objetosde consumo,con
fecha 14 de julio de 1994, no se establecíaningún método analítico,así como
tampocose fijaba una concentración
máximade arilaminaen cueroa partirde la cual
una muestradebíaserrechazada.
Parasuplirestascarencias
de la legislación,en abril
de 1996se publicóen Alemaniaun proyectode normaDlN, que mástardedaríalugar
a la norma DIN 53316 [69], en la que se estableceuna metodologíapara la
determinación
de arilaminasen cueroteñidoindicandounaconcentración
límitede 30
melkg"
Una vez establecidas
lascondicionesde análisisde cueroteñidoen el capítuloanterior
(métodogeneral),se quiso llevara cabo un estudiocomparativocon la metodología
correspondiente
a la norma DIN 53316 (métodoDIN) para observarlos resultados
obtenidostrasaplicarambosprocedimientosa diferentesmuestrasde pielesteñidas.
El estudiono sólo se limitó a la comparación
de resultados
entreestosdos métodos(el
establecido
en el capítulolX y la normaDIN),sinoque ademásse pretendióunificaren
un tercer método alternativo (método mixto), las ventajas que ofrecían ambos
procedimientos.
Paraacometerel estudio,se ha estructurado
en los siguientesapartados:
a
a
a
Estudiode recuperaciónde las arilaminas.
Estudiocomparativosobre pielespatrón.
Estudiocomparativosobre pielesacabadas.
En el estudiode recuperaciónde las arilaminas,se hallaronlos valoresde recuperación
de cada una de las aminas, a excepción de la 2-amino-4-nitrotolueno
y la oaminoazotolueno,
tras aplicarleslos procedimientos
de los métodosDIN y mixto. El
estudioanálogocorrespondiente
al métodogeneral,se realizóen el apartadoVl1.3.7.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
En el estudiocomparativosobre pielespatrón,se realizóla comparaciónde resultados,
segúnlos métodosgeneral,DtN y mixto,sobreuna seriede pielespatrónya empleadas
en el capítuloanterior.
En el estudiocomparativosobre pielesacabadasse pretendióhacerlo mismo que en
casoanterior,pero empleandopielesa lasque se aplicanlos tratamientos
normalesde
acabadoa que se ve sometidotodo cuero antesde saliral mercadocomo productoya
terminado.De estaforma,se tiene en cuentalas posiblesinterferencias
a que puedan
dar lugar,en el análisis,los componentesprocedentesdef procesode acabado.En este
caso, al tratarsede pieles existentesen el mercado,no se conocíani el tipo ni la
concentración
de colorante.
Las técnícasínstrumentales
empfeadaspara la realizacíónde este estudio fueron
Cromatografía
Líquidade Alta Resolucióncon detectorde FotodiodosUV-Visiblev
Cromatografía
de Gasescon detectorde Espectrometría
de Masas.
X.2. Materialesy Métodos
X.2.1.Reactivos
Enestecapítulose han empleadolos siguientes
azocolorantes:
a
a
a
a
NegroCarbón(Sandoz)
DirectRed28 (Merck)
Acid Red 114 (Sandoz)
Acid Red 128 (lCD
Las arilaminasy las concentraciones
en que se encuentranpresentesen cada
azocolorante,
estánindicadasen la TablalX.'1.
X.2.2.PielesTeñidas
Las pieles empleadas en el estudio comparativosobre pieles patrón fueron las
siguientes:
a
a
PielpatrónPPA(0.11%en NegroCarbón)
PieltenidaPT6(0.90%en NegroCarbón)
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
con Ia NormaDIN 53316
a
a
a
a
a
a
PielpatrónPPC(0.21%en Acid Red114)
PielpatrónPPE(2.14o/oen Acid Red114)
PielpatrónPPG(1.12o/o
en DirectBlue35)
PielpatrónPPH(2.32'/.en DirectBlue35)
PielpatrónPPI(1.25o/,
en Acid Red128)
PielpatrónPPI(2.42"/.en Acid Red128)
Todosestospatronesya se utilizaronen el capítuloanteriorsobreel análisisde pieles
patrón. En él se pueden encontrar las cantidadesexactasde colorante y piel seca
parala preparación
empleadas
de cadapiel (Tablas1X.2y lX.3).Hay que reseñarque la
piel teñidaPT6es la únicade la que no se disponíasu bañode tincióndel procesoen
bombo. La razón por la que se escogióesta piel es el no disponerde otra de
concentraciónsimilar (alrededorde 1% en Negro Carbón)con su correspondiente
baño. De todas maneras,como ya se ha comentado en la introducción, para el
desarrollode esteestudiono es necesarioel conocimientode la concentración
exacta
en colorante de las pieles, ya que el objetivo principal no es el cálculo de
recuperaciones,
sino la comparación
de resultados
entredistintasmetodologías.
En cuanto al estudiocomparativosobre pieles acabadas,sé emplearonsiete muestras
que se referenciaron
como:
o
a
a
a
a
a
PielacabadaA-1.
PielacabadaA-2.
Piel acabadaA-3.
Piel acabadaA-4.
Piel acabadaA-5.
Piel A-6 con acabadode poliuretanosintetízadoen base al 2,4-toluendiisocianato(TDl)
Piel A-7 con acabadode poliuretanosintetizadoen base al 4,4'-metilendi(MDl)
fenilisocianato
X.2.3.MétodosparaAnálisisde Pieles
Sobre todas las pieles escogidasen este estudio, se aplicaron los siguientes
procedimientos:
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206
CapítuloX
Método general
Procedimientoestablecidopara análisisde pielteñida en el capítulo lX.
Método norma DIN
Procedimientoespecificado
en Ia normaalemanaDrN 533161691.
Método mixto
5e toma I gramo de piel y se humectacon 16 mlde NaOH 0.2 M precalentados
a
oC,
70
en un frascode 50 ml especificadoen Ia norma DrN 53316. Se mantiene
bajo agitación magnéticadurante 20 minutosen baño maría a 70 oC, con el frasco
abierto. La muestrase neutralizaañadiendo3 ml de HCI I M y se agregan0.6
gÍamos de ditionito sódico en forma sólida, agitando durante 20 minutos a esa
temperatura.Se cierra elfrasco y se enfríaal chorro de agua, extrayéndoseel medio
acuoso tal y como se especificaen Ia norma D/N. El terbutilmetiléterse concentra
hastaun volumen aproximado de 5 ml en rotavapor a 45 oC y con leve vacío de
trompa de agua, transvasándoloa un vaso de precipitados y lavando con éter
dietílico. La preparación de Ia muestrapara su análisiscromatográfico se lleva a
cabo igual que en el método general.
En el método mixto, se pretendeadaptaral método generalel procedimíentode
extracciónen fasesólidaempleadoen la normaDIN 53316con cartuchode tierrasde
por el filtrado en embudo de placa
diatomeas("Extrelut2O"-Merck-),
sustituyéndolo
porosa y la extracción líquido-líquidocon embudo de decantación,que en
determinadasocasionespuededar lugara ligerosproblemasde obturaciónde poro
con restosde piel hidrolizaday formaciónde emulsiones,
respectivamente.
y Discusión
X.3.Resultados
X.3.1.Estudiode Recuperac¡ón
de lasArilaminas
En el capítuloVll se presentaronlas recuperaciones
de cada una de las aminas,a
y la o-aminoazotolueno,
excepciónde la 2-amino-4-nitrotolueno
tras aplicarlesel
(TablaVll.5). En esteapartadose ha
procesode análisisestablecidoparaazocolorante
pretendido completar el estudio hallando la recuperaciónde las mismastras la
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EstudioComparativocon la Norma DIN 53316
207
aplicación de los métodos DIN y mixto, utilizando HPLC/DAD.
TablaX.l.
Porcentaiesde recuperaciónde las aminas tras el procesode reducción según
normaDIN ln" de medidas26).
Compuesto
Valor
Coeficiente de
Intervalode
Medio
Variación
Confianza
(%lo
214-Diaminotolueno
2' t.1
62.s
2,4-Diaminoanisol
al 95 Vo
40.9
14.8
+ 9.1
+ 7.9
Bencidina
92.1
3.3
t2.6
4-Aminofeniléter
90.2
2.3
o-Toluidina
4,4' -diaminodifenilmetano
54.7
39.9
t2.2
+ 14.7
92.2
4.2
4-Cloroanilina
80.9
11 . 3
! 4.1
+ 6.5
2-Metoxi-5-metilanilina
85.9
3.7
+ 3.4
o.Dianisidina
92.9
3.9
4,4'-Tiodianilina
92.6
1.8
+ 3.8
+ 1.8
o-Tolidina
92.6
5.7
2-Nattilamina
88.9
2.4
4-Cloro-2-metilanil
ina
85.7
11 . 5
t 5.6
+ 1.2
+ 6.3
2,4,5-TrimetilaniIi na
85.7
7.8
+ 4.2
3,3'-Dimetil4,4'diaminodifenilmetano
93.s
3.2
4-Aminobifenilo
93.3
2.4
+ 3.2
+ 2.3
3,3LDiclorobencidina
94.9
2.8
+ 2.3
4,4'-Metilenbis(2-cloroanilina)
96.6
2.8
+ 3.4
A continuaciónse exponen los procedimientosaplicadosa las aminas según los
métodosDIN y mixto:
Recuperaciónde las arilaminassegúnmétodo DIN
Se parte de una disolución de las aminas de concentración perfectamente
conocida, en 16 ml de tampón ácido cítrico 0.O6M|NaOH 0.16 M (pH:6)
precalentadosa 70 oC, y en un frascocerrado de 50 ml especificadoen norma DIN
53316. Se mantieneen agitaciónmagnéticadurante25 minutos en baño maría a
70 oC,a part¡rde los cualesse operasegúnIo indicadoen la norma DlN.
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208
CapítuloX
Recuperaciónde las arilaminassegúnmétodo mixto
Se parte de una disolución de las aminas de concentración perfectamente
conocida, en | 9 ml de agua ajustadaa pH 5 y prxalentada a 70 oC, en frasco
abiertode 50 ml especificadoen norma D/N 53316. Se mantienebajo agitación
magnética durante 20 minutosen baño maría a 70 oC,y se agregan0.6 gramosde
ditionito sódico en forma sólida, agitando la muestradurante 20 minutos a esa
temperatura.La extracciónde las aminasy la preparación de la muestra,se realiza
taly como se indica en el método mixto especificadoen el apartadoanterior.
TablaX.2.
Porcentaiesde recuperaciónde las aminas tras el procesode reducción según
método mixto (no de medidas2 6).
Valor
Coeficiente de
Intervalode
Compuesto
Medio
Variación
Confianza
2,4-Diaminoanisol
32.1
5.5
I 1.9
2,4-Diaminotolueno
76.1
4.5
!2.9
Bencidina
89.7
0.7
!0.7
4-Aminofeniléter
89.6
1.5
o-Toluidina
75.3
4,4'diaminodifenilmetano
91.1
7.O
't.3
t 1.5
+ 3.6
4-Cloroanilina
80.0
6.0
r 4.0
2-Metoxi-S-metilani
lina
82.5
2.4
!2.1
o-Dianisidina
88.4
0.9
r 0.8
4,4'-Tiodianilina
87.8
3.5
!3.2
o-Tolidina
94.1
1.4
2-Naftilamina
75.1
4.5
t 1.3
+ 2.3
4-Cloro-2-meti
laniIina
79.8
4-4
x2.3
2,4,5-Trimetilanili na
81.8
4.6
lmetano
3,3'-Dimetil-4r4'-diaminodifeni
93.1
0.8
!2.5
+ o.7
4-Aminobifenilo
92.4
o.7
+ o.7
3r3'-Diclorobencidina
95.4
1.1
r 1.0
96.4
2.1
+ 2.2
al 95 7o
f/.)
lina)
4,4'-Metilenbis(2-cloroani
f 1.3
En la aplicacióndel método mixto se prescindióde la hidrólisisbásicaprevia con
NaOH 4 M aplicadaa pieles,puestoque al tratarse
de unaetapapreviaa la reducción,
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
EstulioComparativocqn la Norma DIN 53316
209
lasarilaminasno estánpresentes
en la muestra.En lasTablasX.l y X.2, se recogenlos
resultados
obtenidosíndicandoel valor medio resultante,
el coeficientede variaciónv
el intervalode confianzaal 9S%.
En la TablaX.3, se reúnenlos resultados
mostrados
anteriormente
segúnlos métodos
junto
y
DIN
mixto,
con los correspondientes
al método generalobtenidosen el
apartadoV1|'.3.7,
indicandoel valor mediojunto con el intervalode confianzaal 95%,
ademásdel coeficientede variación.
TablaX.3.
Porcentaies
de recuperación
de las aminastrasel procesode reducciónsegúnlos
métodosgeneral,DIN y mixto.
Compuesto
General
Í *ts-
DIN
cv
Mixto
+ts^
7
x!
cv
2,4-Diaminoanisol
50.4t 2.O
3.8
21.1+ 9.1
40.9 3 2 . 1+ 1 . 9
5.5
2,4-Diaminotolueno
6 2 . 6X 1 . 1
1.6
62.5t 7.8
14.8
76.1t2.9
4.5
Bencidina
9 1 . 1! 1 . 2
2.5
9 2 . 1+ 2 . 6
3.3
89.7+ O.7 0.7
4-Aminofeniléter
8 9 . 7t 1 . 1
1.3
90.2X2.2
2.3
8 9 . 6+ 1 . 5
1.5
o-Toluidina
69.3+ 6.1
8.4
54.7X 14.7 39.9
75.3X3.6
7.O
4,4'diaminodifenilmetano
89.3r 2.0
2.2
92.2!.4.1
9 1 . 1+ 1 . 3
1.3
4.2
4"Cloroanilina
75.9t 4.9
6.1
8 0 . 9 + 6 . 5 1 1 . 3 80.0r 4.0
6.0
2-Metoxi-5-meti
lanitina
76.5+ 2.6
3.6
8 5 . 9+ 3 . 4
3.7
82.5+ 2.1
2.4
o-Dianisidina
9 0 . 0+ 0 . 9
1,7
9 2 . 9r 3 . 8
3.9
88.4+ 0.8
0.9
4,4'-Tiodianilina
9 0 . 9+ t . 1
1.3
9 2 . 6+ 1 . 8
1.8
87.8t 3.2
3.5
o-Tolidina
93.2l.0.6
1.2
9 2 . 6X 5 . 6
5.7
9 4 . 1+ 1 . 3
1.4
2-Naftilamina
7 9 . 5* . 0 . 6
1.0
8 8 . 9+ 1 . 2
2.4
7 5 . 1! . 2 . 3
4.5
4-Cloro-2-meti
lanilina
69.3+ 2.2
3.4
8 5 . 7 X 6 . 3 | 1 . 5 7 9 . 8X 2 . 3
4.4
2,{,5-Trimetilanilina
74.1t 4.7
6.1
8 5 . 7t 4 . 2
7.8
8 1 . 8* 2 . 5
4.6
3,3'-Dimetil-4,4'diaminodifenilmetano 92.9+ 1.9
2.O
93.5+ 3.2
3.2
93.1+ O.7 0.8
4-Aminobifenilo
92.4+ O.9
1.6
9 3 . 3+ 2 . 3
2.4
92.4+ Q-7 0,7
313'-Diclorobencidi
na
9 6 . 0+ 1 . 1
1.1
94.9+ 2.3
2.8
9 5 . 4+ 1 . 0
1.1
4,4'-Metilenbis(2<loroani
Iina)
96.0+ 0.6
0.7
96.6t 3.4
2.8
9 6 . 4t 2 . 2
2.1
de variación.
x: Valor medio.ts-: Intervalode confianzaal 95%.cv: Coeficiente
lasconclusiones
De estosresultados,
sedesprenden
siguientes:
¡ En ciertoscasos,pareceobservarse
que la aplícacióndel método DIN suponeun
aumentoen el valor mediorespectoal métodogeneralo mixto.Sin embargo,dicho
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
210
capítulo
x
aumentosuelevenir acompañado,
a su vez,de una mayordispersión
de losvalores.
.
La aplicacióndel método mixto en los derivadosde anilina,a excepciónde la
2,4-diaminoanisol,
provoca un ligero aumentoen la recuperaciónmedia y una
similar dispersiónen los valores,respectoal métodogeneral.Por tanto, en estos
casosla aplicacióndel método mixto, frenteal general,puede suponeruna leve
mejoraen los resultados.
o La 2-naftilaminaes el único caso en que la aplicacióndel método DIN parece
suponeruna mejoraen su recuperación
final frentea los otrosdos métodos,ya que
ademásde producirseun aumentoen el valor medio,la dispersiónresultante
no es
excesívamente
alta.
TablaX.4.
Resu/tadosdel test de Scheffépara la comparaciónpor paresde /os métodos
general(A), DIN (B) y mixto (Q, trassu aplicación sobrelas arilaminas.
Compuesto
2r4-Diaminoanisol
2,4-Diaminotolueno
Paresde Métodos Comparados
A.B
B.C
A.C
a
a
a'
a
a
a
Bencidina
4-Aminofeniléter
a
e.Toluidina
414'-diaminodifenilmetano
4-Cloroanilina
2-Metoxi-5-metilani
lina
a
a
a
a
o-Dianisidina
4,4'-Tiodianilina
o-Tolidina
2-Naftilamina
4-Cloro-2-meti
lanilina
a
a
2,4,5-Trimetilanilina
3r3'-Dimetil-4,4'-diaminodifenilmetano
4-Aminobifenilo
3,3'-Diclorobencidina
4,4'-Metilenbis(2-cloroani
Ii na)
(a)
Diferenciasignificativaentre los dos métodoscomparados
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a
a
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
EswdioComparativocon la Norma DIN 53316
211
Asimismo,se llevó a cabo un análisisANOVA de una vía y se aplicóel testde Scheffé
para la comparaciónde los tres métodossegún las tres combinacionesposiblespor
pares,obteniéndose
los resultados
mostrados
en la TablaX.4. Seapreciaque entre los
derivadosde anilina se concentranmayor númerode diferenciassignificativas,si bien
son excepcionesla 4-cloroanilinay la 2,4,5-trimetilanilina
que presentan,como se
observaen al Tabla X.3, mayor dispersiónde los valoresasí como recuperaciones
mediasmáspróximas.Porotro lado,en la mayoríade aminasde naturaleza
diarílicano
existen diferencias significativas,exceptuandola o-dianisidinay la 4,4'-tiodianilina
entrelos métodosDIN y mixto,en lasque la dispersiónque presentanlos valoreses lo
pequeñacomo para que la diferenciaentre ambos métodosresulte
suficientemente
significatíva,a pesarde no existirgrandistanciaentresusrecuperaciones
medias.
X.3.2. EstudioComparativosobrePielesPatrón
En las TablasX.5 a X.B, se muestranlos resultadosobtenidospor HPLC/DAD,tras
aplicar a cada una de las pielespatrón los métodosde análisisespecificados
en el
apartadoX.2.3. En ellasaparecenlas cantidadesmediasexperimentales
de arilamina
junto
obtenida,referidasa peso de piel analizada,
con el intervalode confianzaal
95%.
TablaX.5.
Resu/tadosobtenidos trasla aplicación de los metodosgeneral,DtN y mixto sobre
pieles lasPPAy PT6 teñidascon Negro Carbón(n" de medidas2 6).
Bencidina
Piel
Teñida
(ms/kg)
Valor
Esperado
Generaf
(*)
PPA
36.1
PT6
306.0
27.6xO.9
317.4! 6.9
D'N
Mixto
:*
253.7+ 4.9
261.2+ 10.9
ya que interfiereel compuestodetectadoen la piel blanco,con
No se puededeterminar
inferioral de la bencidína.
t* lígeramente
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212
CaDítulo x
Resu/tadosobtenidos tras la aplicaciónde los metodosgeneral,D/N y mixto sobre
las pielesPPCy PPEteñidascon Acid Red 114 (node medidas2 6).
TablaX.6:
Piel
Valor
Teñida Esperado
General
218.9
Bencidina
(me/ke)
o-Tolidina
(mg/kg
207.8X6.0
DIN
174.4t9.5
Mixto
General
DIN
Mixto
5.6110.3
*
*
190.8+t0.4
PPC
5.7
2275.6 | 2284.6!44.8 2097.3!43.7 2145.0+90.1
PPE
58.3
(*)
60.9t2.9 50.612.3
*
ya que interfiere
el compuestodetectado
No se puededeterminar
en la piel blanco,con
inferioral de la bencidina.
t* ligeramente
TablaX.7.
Resu/tadosobtenidos tras Ia aplicaciónde los metodosgeneral,D/N y mixto sobre
laspieles PPG y PPH teñidascon Direct BIue 35 (n" de medidas2 6).
o-Dianisidina
Piel
Teñida
(ms/kd
Valor
Esperado
General
DIN
Mixto
PPC
278.0
275.0+ 11.8
2 1 2 . 9+ 6 . 5
214.5x9.5
PPH
576.5
5 3 0 . 5+ 1 8 . 8
4 6 3 . 5+ 1 9 . 8
470.7! 18.3
En cuantoa los patronesteñidoscon NegroCarbón(TablaX.5),en los métodosDIN y
de la bencidina,ya mencionadoen el
mixto se observóla aparicióndel interferente
en el análisisde la piel blanco,haciendoimposiblela
capítuloanterioral detectarse
como es el
cuantificaciónde la aminacuandose encuentraen bajasconcentraciones
casodel patrónPPA.Sin embargo,en el métodogeneralno se produceinterferencia
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EstudioComparativocon Ia NormaDIN 53316
213
alguna.Porotro lado,lascantidades
de aminaobtenidaen la piel PT6cuandoseaplica
el métodogeneral(317.2mg/kg),es mayorque en los otrosdos procedimientos
(252.9
y 253.7 mdkg respectivamente).
TablaX.8.
Resu/tadosobtenidos trasIa aplicación de los metodosgeneral,D/N y mixto sobre
las pielesPPI y PPJteñidascon Acid Red 128 (n" de medidas2 6).
o-Dianisidina
Piel
tenrcIa
(mslke)
Valor
Esperado
General
DIN
Mixto
PPI
1071.O
1061.7+ 20.7
957.2+ 23.3
9 4 7 . 7t 2 5 . 3
PP'
2069.1
1965.9+ 39.0
1962.7+ 37.6
1962.8t 51.O
En las pielespatróncon Acid Red 1'14(TablaX.6), el comportamientoes similaral
anterior,puestoque en el métodogeneralse obtienesiempremayorcantidadtantode
la amina base,o-tolidina,como de bencidina,si bien es cierto que estadiferenciaes
menos acusadaen el casodel patrón PPEdonde la concentraciónde colorantees
mayor. Por otro lado, en el método DIN se obtienensiemprevaloresalgo inferiores
con respectoal método mixto, sobretodo el patrón PPCdonde la concentraciónde
colorantees menor.Al igualque ocurríacon el NegroCarbón,en los métodosDIN y
mixto apareceel interferente
de la bencidinaque haceimposiblela determinaciónde
éstaen los casosdonde se encuentraen pequeñascantidades.
Por último, en las pielesteñidascon Direct Blue 35 (TablaX.7) y con Acid Red 128
(TablaX.B),se observaque lascantidades
de o-dianisidina
obtenídassegúnel método
general,son siempreigualeso superioresa las obtenidastras aplicar los otros dos
procedimientos,
siendoestasúltimasdel mismo orden en todos los casos.Además,
cuanto menor es la cantidadesperadade amina, mayor es la diferenciaexistente,
hechoque tambiénocurríacon los patronesteñidoscon Acid Red114.
que la cantidadexperimental
En general,puedeafirmarse
de arilaminaresultante
trasla
aplicacióndel métodogeneral,es siempreigualo mayora la obtenidasegúnlos otros
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214
Capítulox
dos procedimientos,
tendiendoa igualarse
a medidaque la concentración
de colorante
en la piel aumenta.Porotro lado,el hechode que los patronescon Acid Red 114 sean
el único casoen que se obtenganen el métodoDIN resultados
ligeramente
inferiores
respectoal mixto,coincidecon lo apreciadoen el apartado1X.3.2del capítuloanterior,
ya que éstoseran los únicospatronesen los que se apreciaban
peoresrecuperaciones
cuandoel análisisse llevabaa cabo con tampónácido cítrico/NaOHy sin hidrólisis
previa,condicionesempleadas
en la normaDlN.
Por otro lado, puede observarseque la dispersiónrelativade los valoresobtenidosen
los tres métodosestácomprendidaentre un 2 y un 6%, no apreciándose
grandes
diferencias
entreellos,lo cual puedeconsiderarse
como aceptablea la horade evaluar
la reproducibítídad
de lostresprocedimientos.
Asimismo,trasaplicarsobrelas pielesteñidasmenosconcentradas
en cada colorante
(PT6,PPC,PPGy PPI),el análisisANOVA de una vía y el testde Schefféde la misma
forma que se hizo con la recuperación
de las arilaminas,se obtienenlos resultados
mostrados
en la TablaX.9.
TablaX.9.
Resultadosdel test de Scheffépara Ia comparación pot 'paresde los métodos
general (A), DIN (B) y mixto (Q, tras su aplicación sobrelas pie/es teñidas PT6,
PPC, PPGe PPI.
Piel Teñida
Paresde MétodosComparados
A-B
(a)
B-C
A-C
PT6
a
PPC
a
PPC
a
a
PPI
a
a
a
aa
Diferenciasignificativaentrelos dos métodoscomparados
De estosresultados
se deduceque, independientemente
de la arilaminapresenteen el
cuero, el método generalestablecidoen estamemoriaes significativamente
distinto
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lstuQloComparativocon Ia Norma DIN 53316
¿t5
tanto al métodoDIN como al métodomixto.Además,parael patrónteñido con Acid
Red 114 (PPC)existediferenciasignificativaentre los métodosDIN y mixto. Dichos
resultadoscoinciden con las afirmacionesanterioresderivadasde los datos mostrados
en lasTablasX.5 a XB, en cuantoque la cantidadexperimental
de arilaminaobtenida
trasaplicarel métodogeneral,es siempresimilaro mayora la obtenidasegúnlos otros
dos procedimientos.
Asimismo,el patrónPPCes el único casoen que la cantidadde
amina resultantetras la aplicacióndel método DlN, no sólo es inferior respectoal
métodogeneral,sino que tambiénlo es respectoal mixto,cosaque quedareflejadaen
la existenciade diferenciasignificativaentrelos métodosDIN y mixto paraestapiel.
X.3.2.EstudioComparativo
sobrePielesAcabadas
Una vez concluído el estudiocomparativosobre las pieles patrón,se completó el
trabajohaciendolo mismocon una seriede pielesdesconocidas,
pero tratadascon los
procesosa que se ve sometidotodo cuero que sale al mercadocomo producto ya
acabado.
Previamente,
se hizo un estudiocualitativocon GC/MSde los productosobtenidostras
la aplicacióndel métodogeneral,con el fin de identificarlas arilaminaspresentes
en
cada muestra,junto con otros compuestosmayoritarios.
De esta manera,en la piel
acabadaA-1 se detectóla presenciamayoritariade anilina,ademásde la o-toluidina.
En la piel A-2, se identificócomo compuestomayoritariola o-toluidina,acompañada
principalmentepor ácidosgrasose hidrocarburos.
En la piel A-3, la bencidinaera el
pico,
compuestocon mayoráreade
seguidode la anilina.En la piel A-4, se detectóla
presenciamayoritariade anilina, junto con o-tolidina y bencidina como aminas
prohibidasmás abundantes.Por último, en la piel acabadaA-5 la anilina era el
componenteprincipal,detectándose
además4-aminobífeni lo.
En la Tabla X.10, se muestranlos resultadosobtenidosen el análisiscuantitativo
medianteHPLC/DAD,trasaplicara cadapiel los métodosgeneral,DIN y mixto.En ella
se indica las cantidadesde arilaminaobtenidasen las dos determinaciones
hechas,
(R),
expresadas
en mg/kg referidoa peso de piel analizada
así como los valoresde
pureza del pico cromatográfico(P) y el grado de identificacióndel espectroen el
(4.
máximodel pico con respectoal espectrode la aminacorrespondiente
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216
Ca?ítuloX
TablaX.l0. Resu/tadosobtenidostras Ia aplicación de los metodos Ceneral, DtN y Mixto
sobrepie/es acabadas.
Metodo de AnálisisAplicado
Piel
Arilamina
General
DrN
Mixto
PresenteRPIRPIRPl
o-Toluidina
19.1
2.2
0.46 !
38.5
6.7
18.4
1.5
0.43 i
28.2
3.8
: 810.0
¡:
0.19 0.s9 i 943.0
0.25 0.43 i 937.3
Bencidinai285.1
i 282.3
0.09 0.15 i 201.4
0.17 0.13 i 218.9
1.2
o-Tolidinai
0.14
t.8
o-Toluidina 789.3
A-3
A-4
A-5
(Nl)
48.2
O.29
0.14
1.3
3.5
¡
38.3
1.9
1.4
i 784.2 0.11
0.61 | 856.2" 0.18
6.6
0.41
1.2
0.10 i 237.9
0.11 i 224.4
O.g2 O.23
1.1
O.12
6-2
o.7B
s.4
1.6
0.20 i. s7.3
0.16 0.16 i sz.g
g.¡
8.4
3.5 i
2.7
o.s4 : sB.B
0.47 isl.¿
4.6
6.0
i
tl.z
t6.t
Nl
8.s
4.2
2.9
9.9
3.3
4-Amino- ! ze.l
bifenilo i 27.4
5.7
2.9
41.4
7.7
4.O
i
34.9
5.1
2.9
3.6
1.4
3.5
i. 31.7
4.9
2.2
is1.1
Bencidinai a.z
i
34.6
6.8
No ldentificado
como la aminacorrespondiente.
El valor de pureza(P)se evalúaen funciónde la porciónde pico que sobrepasa
0.1
vecesla alturacomprendidaentre la líneabasey el máximode pico, estudiandoel
grado de variaciónque presentael espectroen todo el intervalode tiemposabarcado.
El valor de identificación(0 se evalúaen funciónde la diferenciaexistenteentre el
espectroen el máximode pico y el correspondiente
a la aminapura.En amboscasos,
por el valor cero,superándolo
la coincidenciatotalvendríarepresentada
cadavez más
grado
cuanto mayor seael
de variaciónespectralen el casode la pureza,y mayor sea
la diferenciaentreespectros
en el casode la identificación.
En la interpretación
de estosvaloresse tiene en cuentaun valor umbral(dependiente
de la línea base) establecidoen cada análisisy que normalmentese encuentra
comprendidoentre 1 y 1.5. El criterioseguidoes el siguiente:mientraslos valoresP e I
se encuentrenentre cero y el valor umbral determinado,se consideraaceptablela
pureza del compuestodetectadoy se toma como buena la asignacióndel mismo
respectivamente.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
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lstudio Comparativocon la NormaDIN 53316
217
En principio,el único casoen que se obtienemayorcant¡dadde amina segúnel
métodogenerales la piel acabadaA-3, mientrasque en el restode pielesse obtienen
mayorescantidades
de aminatrasaplicarlos métodosDIN y mixto.Sin embargo,si se
observaconjuntamentelos resultados
finalescon los datosde purezae identificación
de pico, se apreciaque los valoresde P e / obtenidosen los métodosDIN y mixto,son
similares
o superiores
a losdel métodogeneral,lo cual indicaque el incremento
en la
cantidadde aminadebeatribuirse
a la existencia
de impurezas
que interfieren
con la
provocando
misma,
un aumentodel áreade pico.
s
ht
o
Máxi mo de Picó'
".'t**....
U'
:':''-l----
O
H
=o
CL
-=o
:-"'"
Max¡.rrfá"lmnureea
.. - - --,i. .. .. ..,. .. .. .! .. .. .. ., .. .. ". ., .. ..
Is¡:ectrode la o-Toluidina
ff
bl
o
Máxima lmpuraz{"
"'"' " " "
......:.:....;''
FiguraX.l .
Erp ect ro cie la o-Tol u i d i rra
Pico cromatográficode la o-toluidinay especfroscorrespondientes
a/ máximo de
pico, a la máxima impurezay al patrón de la amina, obtenida tras aplicar los
métodos(A) generaly @) DIN sobreIa piel acabadaA-1.
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t, u
,uo,ru,o*
Se dan casos,como la piel A-1 analizadasegúnmétodomixto,o la piel A-4 analizada
segúnmétodoDlN, en que losvaloresP sonparecidos
e inclusomejoranlos obtenidos
según el método general,lo cual haría pensar,en principio, que existen menos
impurezasque interfierencon la amina. Sin embargo,esta interpretaciónno es
exactamente
correcta,ya que los valoresde / empeoranconsiderablemente,
lo que
significaque el máximode la impurezay el máximode la amina coincideno se
aproximanbastanteen el tiempo,dandolugara espectros
semejantes
a diferentes
ts del
pico perodistintos
al de Ia aminapura.
En las pieles A-1 y A-5, se puede comprobarhastaqué punto puede influir la
aplicaciónde uno u otro procedimiento
en el resultado
final del análisis.Mientrasque
en el métodogeneralno se superael límiteestablecido
en la normaalemanaDIN de
30 mg/kg,en los otros dos el resultadoseríapositivoy por tanto la piel deberíaser
rechazadapara su uso y venta. Sin embargo,realmentese estaríaante un "falso
positivo" como se acaba de comprobar,ya que la existenciade impurezasen la
muestraes lo que provocaesasuperacióndel límite.Por tanto,si el laboratorioque
analizano disponede información
adicionalsobrela purezae identificación
de pico,
la piel seríaerróneamente
rechazada
aplicandolos métodosDIN o mixto.
que los procedimientos
Engeneral,puedeafirmarse
DIN y mixtodan lugara muestras
con másproblemasde solapamiento
a la horade la cuantificación.
Estehechodebe
estarasociadoprobablemente
al procesode extracciónen fasesólidacon cartuchode
tierrade diatomeas("Extrelut20"-Merck-)
empleadoen ambosmétodos, ya que és la
únicadiferencia
existente
entreellosy el métodogeneral.
Estopuedeversegráficamente
en la FiguraX.1, donde se muestranlos espectrosdel
pico de la o-toluidinaobtenidosen la piel acabadaA-1 trasaplicarlos métodosgeneral
(A) y DIN (B). Se recogenlos espectroscorrespondientes
al máximo de pico, a la
y
patrón
que,segúnel método
máximaimpureza, al
de la o-toluidina.
Puedeapreciarse
DlN, el espectroen el máximode pico se diferenciamáscon respecto
al del patrón,
como consecuencia
de la mayor impurezaexistentea la derechadel máximo.El
aumentodel áreade pico provocadopor la presencia
de dichaimpureza,explicala
obtenciónde un resultado
mavor.
que en la figura
En las FigurasX.2 y X.3 se muestranla mismaseriede espectros
anterior,pero correspondientes
a la o-tolidinaobtenidaen la piel A-4 y a la 4-aminopiel
bifeniloobtenidaen la
A-5.Comoocurríacon la o-toluidina,
trasaplicarel método
DIN se observaque los espectros
resultantes
correspondientes
al máximode pico
presentanmayores diferenciasrespectoa los espectrosde las aminas puras, a
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
EstudioComparativocon la NormaDIN 53316
219
consecuencia
de lasimpurezas
aparecidas
a la izquierda
del máximo.
tl
o
(t)
o
-
1,Á
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b
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oo
tf
o
E
o
nm
FiguraX.2. Pico cromatográficode o-tolidina y espectroscorrespondientesa/ máximo de pico,
a la máximaimpurezay al patrón de la amina,obtenida tras aplicar los métodos
(A) generaly (B) DIN sobreIa pielacabadaA-4.
Por otro lado, en determinadostrabajosÍ67,199,200,2091
se hace mención a la
y 4,4'-diaminodifenilmetano,
formaciónde 2,4-diaminotolueno
tras el análisiscon
ditionitosódicode textileso cueroscon acabados
de poliuretanosintetizado
en baseal
TDI o al MDl. No obstante,
lascondiciones
en lasque se llevaa cabo el análisisson
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
en todoslos casos:30 minutosa reflujoen mediobásico(NaOH I M) Y
muy drásticas
otros30 minutosmása reflujocon ditionitosódico.Comoexplicación,algunosautores
aludena la reducción,duranteel análisis,de las moléculaslibresde TDI y
Í2OO,21gl
en el poliuretanocomo materiaprima no agotada.
MDI que pudieranestarpresentes
Oh y col. [200]afirmanque parala formaciónde lasaminasprohibidasa partirde TDI
y MDl, sólo es suficientela hidrólisisbásicaprovocadapor la fuertescondicionesdel
de llevara cabola reducción.
sin necesidad
análisis,
ó
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la
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ts¡
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b
o
AU
FiguraX.3.
al máximo
pico cromatográfico
y espectroscorrespondientes
de la 4-aminobifenilo
de pico, a Ia máximaimpureza y al patrónde la amina, obtenida tras aplicar los
métodos(A) generaly (B) DIN sobrela piel acabadaA'5'
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fstudio Comparativocon la Norma DIN 53316
221
Por otro lado, sewekow [64 plantea también la posiblidadde que el mismo
poliuretanose hidrolice en tales condiciones.En la Figura X.4, se muestranlas
estructuras
moleculares
de ambosisocianatos.
H3c\-lcNo
(o
\
TDI
o*.]Fil-.'
\-,z
CNO
2-\
'-\.f-"*o
MDI
FiguraX.4.
Estructurasmolecularesdel 2,4-toluendiisocianato(TDt), y del 4,4'-metilendifenilisocianato(MDI).
Con el fin de comprobarla posíbleformaciónde 2,44iu inotoluenoy 4,4'4iaminodifenilmetanoen cueroscon recubrimiento
de poliuretanosintetizados
a partirde TDI
par
pieles
o MDl, se analizaronun
de
con talesacabadosaplicándoleslos métodos
DIN y mixto. De estaforma,se comparanresultadosobtenidostrasla aplicaciónde dos
procesosde reduccióndistintos,pero manteniendoinvariableel procedimientode
extracciónde las aminas.La técnicaempleadaen el análisisfue el HPLC/DAD.El
resultadofue que en ningún casose detectaronlas arilaminasmencionadas,
lo cual
demuestraque, bajo lascondicionesde análisisempleadas,
es descartable
la formación
de las mismasen estetipo de cuerosacabados.Estopareceindicar,como asíse afirma
en varios trabajos[38,67,199,211,2151,
que el empleo de unas condicionesde
reduccióndemasiado
drásticas
en el análisispuededar lugara procesos
y/o reaccíones
secundarias
no deseadas.
X.3. Conclusiones
De los resultadosobtenidos en el presente capítulo, se pueden deducir las
conclusionessiguientes:
1. Tras aplicar sobre pielespatrón el método de análísisgeneralestablecidoen el
capítulolX, los resultados
obtenídosson similareso superiores
a los resultantes
de
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222
CapítuloX
aplicarelmétodoespec¡ficado
en la normaDIN 53316(métodoDIN) o el método
generaladaptandoel procedimientode extracciónen fasesólidacon cartuchode
tierrade diatomeas("Extrelut2j'-Merck-) indicadoen dicha norma(métodomixto).
Por otro lado,cuanto menores la concentración
esperadade arilaminaen la piel,
mayores la diferenciaexistenteentreel métodogeneraly los procedimientos
DtN y
mixto.
2. La aplicaciónsobre cuerosacabadosde los métodosDIN o mixto da lugar,en
general,a mayoresinterferencias
sobrela determinaciónde lasarilaminasrespectoa
la aplicación del método general. Esto puede deberse al procedimientode
extracciónen fasesólidacon "Extrelut20" empleadoen ambosmétodos,el cual
pareceextraerdel medio de reducciónmayor cantidadde interferentes
que la
extracción líquido-líquidoutilizada en el método general. Este hecho puede
provocarel rechazode muestrasque en realidadno superanel límite establecido
por la norma DIN 53316 de 30 mg/kgde arilaminaprohibidarespectoa pesode
cueroanalizado.
3 . Tras aplicar los métodosDIN y mixto a cuerosacabadoscon recubrimientode
poliuretanosintetizadosen base al 2,4-toluendiisocianato
fl-Dl) o en base al
(MDl),no se ha detectadopresenciade las arilaminas
4,4'-metilendifenilisocianato
2,4diaminotoluenoy 4,4'4iaminodifenilmetano
susceptibles
de formarsea partir
de TDI y MDI respectivamente.
4. En general,la aplicaciónsobrelasaminasdel métodogeneralo del métodomixto,
suponevaloresde recuperación
similareso ligeramenteinferioresa los obtenidos
tras aplicar la norma DlN, si bien la dispersiónde los valoreses menor en los
primerosdos métodos.
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Xl. Conclusiones
Generales
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Conc/usiones
Cenerales
225
Teniendo en cuenta los resultadosobtenidosen los capítulosprevios/se pueden
deducir lassiguientesconclusionesgenerales:
1. Se ha verificadoque la Cromatografía
de Casescon detectorde Espectrometría
de
(CC/MS)
Masas
es una técnicaadecuadaparala determinacióncualitativade las veinte
arilaminasprohibidaspor la legislaciónalemanaOabla 1.1),permitiendodetectarla
presenciao ausenc¡a
de las mismascon cantidades
que van desde
mlnimasdetectables
para
para
0.12 ng
\a2,4-diaminoanisol.
la o-toluidinahasta6.7 ng
2. Lascondicionescromatográficas
más adecuadasen Cromatografíade Líquidosde
Alta Resolucióncon detectorde FotodiodosUV-Visible(HPLC/DAD),parael análisis
(utilizando
prohibidas
de lasveintearilaminas
una columnaNucleosil120 C1B,5pm,
25 x O.46cm),son lassiguientes:
Como eluyente inicial, una mezcla de tampónlmetanollacetonitrilo55/35/10
duranteun tiempo de l3 minutos,trasel cual se estableceun gradientelinealde t 3
minutos hasta obtener una mezcla de composición 25167/8 gue se mantiene
durante 14 minutos.
A partir de estascondiciones,se han determinadolas ecuacionesde calibradopara
cadauna de lasaminas,encontrándose
estatécnicacomo la másidóneaparael análisis
cuantitativode lasmismas"
3. Mediante el uso combinado de ambas técnicas, ha sido posible separar
satisfactoriamente
como la anilinay los isómerosm-toluidina,p-toluidina,
compuestos
2-cloroanilina,3-cloroanilina,1-naftilaminay 2-aminobifenilo,resolviendoasí las
que su presenciapudieraproduciren la determinaciónde las
posiblesinterferencias
aminasprohibidas.
4. El procedimientode análisispara la determinacíónde aminas aromáticasen
es el siguiente:
azocolorantes,
Se disuelve una cantidad determinadade colorante en 50 ml de agua, ajustandoel
pH¡ a 5 con H2SO40.25 M. La disoluciónse calienta hasta7O oC bajo agitación
magnética y se agrcg,a el ditionito sódico en forma sólida (relación
ditionitolcolorantepuro, en peso, entre 2 y 15), agitándoseentre 15 y 20 minutos,
tras los cualesse enfría Ia muestra bajo el chorro de agua. La disolución acuosa
resultante,se a¡ustaa pH + l0-l I con NaOH 2 M y se extrae con éter dietílico
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226
CapítuloXt
(3x20 ml). La fase etérease concentra, sin llevar a sequedad,en una campana
extractoraburbuieando una corrientesuave de nitrógeno y adicionando alícuotas
del disolvente en que se lleva a cabo el análisiscromatográfico, evitando en la
medida de Io posible que la luz incida directamentesobrela muestra.
5. La estructuramolecularde un azocolorantedado no parece condicionar su
comportamientofrente a la reduccióncon ditionito sódico.Además,las cantidades
experimentalesmáximasde arilaminaobtenidase aproximanbastantebien a las
cantidadesteóricasestimadaspara cada azocolorante,lo cual parece indicar que la
rupturadel grupoazo con ditionitosódico,en lascondicionesde trabajoestablecidas,
presentaun rendimientocercanoal 100%.
6. Se ha comprobadoque la accesibilidad
del ditionitosódícoaf colorantefíjadoa la
piel, es un factordeterminante
a la horade establecer
el métodoparala determinación
de arilaminasen cuero teñido (métodogeneral)"
procedimiento
El
establecido,es el
siguiente:
Se humectan 2.5 gramos de piel desfibradaen 50 ml de agua bajo agitación
magnética. Se agregan2 ml de NaOH 4 M, y se calienta la muestra hasta70 oC,
momento en el cualse neutralizacon 4 ml de HCI 2 M y se agregan1.5 gramosde
ditionito sódico (0.6 gramoslgramode piel). Se mantienela muestrabajo agitación
durante 20 minutosa esatemperatura,se añaden2.5 ml de HCI 2M y se filta en
caliente con embudo de placaporosa (tamañode poro: 2), Iavando posteriormente
con 40 ml de HCI 0.1 M seguidode 40 ml de agua.La extracciónde las arilaminas
y la preparación de la muestra parasu análisiscromatográfico,se llevana cabo tal y
como se ha indicado en la conclusión4.
Tras el análisisde pieles patrón según este método, parece demostrarseque la
arilaminapresentéen la muestrase recuperacon valoressimilareso superiores
al B0o/o,
sin influirel tipo de colorante
o su concentración
en la piel.
7. Se ha propuesto un procedimientode análisis alternativo (método mixto),
consistenteen adaptaral método generalla extracciónen fasesólida empleadaen la
norma alemana DIN 53316 (método DIN) con cartuchode tierra de diatomeas
("Extref
ut 2O"-Merck-).
Así, se intentanevitarlos problemasde obturaciónde embudo
duranteel filtradoo de emulsiones
en la extracciónlíquido-líquido
que en ocasiones
se
producen.
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ConclusionesCenerales
227
No obstante,la aplicaciónde dicho procesode extracciónpuede producir mayor
númerode interferencias
en la determinaciónde las arilaminasy, en ocasiones,
tales
pueden provocarel rechazoerróneode cueros que en realidad no
interferencias
por la normaDIN de 30 mgikgreferidoa pesode muestra
superanel límiteestablecido
analizada.
8. Se han estudiadolas recuperaciones
de las arilaminasprohibidastrasaplicarleslos
procedimientosgeneral, DIN y mixto, exceptuandola 2-amino-4-nitrotolueno
y la
por producirse
o-aminoazotolueno
transformación
de lasmismas.Losresultados
fueron
los siguientes:
.
Segúnel método general,lasarilaminascon dos anillosaromáticosen su estructura
se recuperanentre un 89 f ufi 960lo,la 2-naftilamina
lo hace en un 79.5%,y los
derivadosde anilina,entreun 69 y un 77olo,
a excepcióndela2,44iaminoanisoly
la 2,44iaminotoluenoque se recuperanen un 5O.4y un 62.6o/orespectivamente,
extrayéndolas
con clorurode metilenoen lugarde éterdietílico.
o A excepciónde la 2-naftilamina,la aplicaciónsobre las aminasde los métodos
generaly mixto suponevaloresde recuperación
similareso ligeramente
inferioresa
los obtenidostrasaplicarla normaDlN. No obstante,la dispersiónde los valoreses
menoren los dos primerosprocedimientos.
9. Tras la aplicación de los métodos DIN y mixto sobre cueros acabadoscon
(TDl) o en base al
recubrimientode poliuretanoen base al 2, -toluendiisocianato
(MDl),
no se detectapresenciade 2,44iaminotoluenoo
4,4'-metilendifenilisocianato
4,4'-diaminodifenilmetano
susceptiblesde formarse a partir de TDI y MDI
respectivamente.
10. Losproductosformadostrasla reducciónde una seriede azocolorantes
segrlnlas
en la conclusión4 son,en general,los esperados
condicionesestablecidas
a raíz de la
rupturadel grupoazo.
No obstante,en ocasionesse detectancompuestos
cuyo origendebe radicaren otro
y/o procesossecundarios,
tipo de reacciones
como puedenser la reducciónde grupo
grupo
nitro a
amino, la desaminación,la desulfonación,o la detección4-aminoa partir de anilina.En todos los casos,no puede
bifenilo en colorantessintetizados
que la única causade la formaciónde tales productossea el método
asegurarse
otrasposiblesvíascomo son el procesode fabricación
analíticoseguido,descartando
del coloranteo la malacalidadde lasmateriasprimasempleadas
en el mismo.
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228
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CapítuloXl
11. Se ha comprobadoque la sal sódica del ácido 2-amino-1-naftalenosulfónico
presentacomo impurezala 2-naftilamina.
Por otro lado, bajo ciertascondicionesde
presencia
reduccíónen
de ditionitosódico,como es el empleode un pH ácido o de
puedefavorecerse
altastemperaturas,
la desulfonación
de la misma.
12. La detecciónde 4-aminobifenilo
trasel análisisde ciertoscolorantessintetizados
a
partirde anilina,puedeserdebidatantoal procesode síntesis
de los mismoscomo al
propio análisis.Respectoa la posiblecontribucióncomo consecuencia
del método
analítico, parece comprobarseque el empleo de unas condicionesfuertemente
y/o procesossecundarios
alcalinasfavoreceel desarrollode las reacciones
originantes
de la 4-aminobifenilo.En el futuro,se contemplala posibilidadde realizarestudios
sobrela propiasíntesis,
con el fin de aclararestaposiblevía de formación.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Xll. Bibliografía
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Xlll. Listadode Tablasy Figuras
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
List4dode Tablasy Figuras
243
Xlll.1. Listadode Tablas
Página
Tabla1.1.
prohibídaspor el segundodecreto
Listade lasveintearílaminas
modificadordel Decreto de Objetos de Consumo alemán
(BGV).
Tabla11.1.
Clasificación de los azocolorantessegún su potencial
carcinogénico.
2B
Calendariode la legislaciónalemana relativa al uso de
colorantesazoicos.
31
Tiempos de retención,iones seleccionadosy tiempos de
cambioparacadaarilamina,en modo SlM.
67
Listade compuestoscorrespondientes
al cromatogramade la
F i g u r aV . 1 .
69
Cantidades mínimas detectables y factorbs de respuesta
obtenidasen GC/MS,paracadauna de lasarilaminas.
75
No de referenciade las arilaminas estudiadaspara el
establecimientode las condiciones cromatográficasen
HPLC/DAD.
91
Parámetrosde las ecuaciones de calibrado y cantidades
mínimasdetectables
obtenidasen HPLC/DAD,para cada una
de lasarilaminas.
96
Valorescalculadosa partir de las ecuacionesde calibrado
obtenidasen HPLC/DAD,paracadaunade lasarilaminas.
97
Concentraciones reales y calculadas obtenidas con
y bencidina.
HPLC/DAD,parala mezcla4-aminofeniléter
99
Tabla11.2.
TablaV.1.
TablaV.2.
TablaV.3.
TablaV.4.
TablaV.5.
TablaV.6.
TablaV.7
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
TablaV1.1.
TablaVl.2
TablaV|.3.
TablaV|.4.
TablaV|.5.
TablaV!.6.
TablaVll.l
Tablavll.2.
TablaVll.3.
Recuperaciones
obtenidas para las arilaminas bencidina,
o-toluidina,o-dianisidina,o-tolidina,2-naftilamina,4-aminobifenilo y 3,3'-diclorobencidina,
según las condicionesde
preparación
indicadas.
108
Recuperacionesobtenidas para las veinte arilaminas
prohibidas,junto con la anilina,según las condicionesde
preparaciónde muestra(métodoC) (n" de medidas> 6).
109
Recuperaciones
obtenidas para las arilaminas bencidina,
o-toluidina,o-dianisidina,o-tolidina,2-naftilamina,4-aminobifenilo y 3,3'-diclorobencidina,
según las condicionesde
(métodos
extracciónde arilaminas
A y B).
112
Recuperaciones
obtenidas para las arilaminas bencidina,
o-toluidina,o-dianisidina,o-tolidina,2-naftilamina,4-aminobifenilo y 3,3'-diclorobencidina,
según las condicionesde
(métodoC).
extracciónde arilaminas
113
Recuperacionesobtenidas para las veinte . arilaminas
prohibidas,junto con la anilina,según las condicionesde
(métodoC) (n" de medidas> 6)
extracciónde arilaminas
114
Recuperaciones
obtenidaspara la 2,4-diaminoanisoly la
2,4-diaminotolueno
extraídascon diclorometano,según las
condicionesde extracciónde arilaminaC. (node medidas> 6)
115
Purezay contenidode aminabasede los colorantesDirect Red
2é, Acid Red 114, DirectBlue 35 y Acid Red t2B, segúnel
contenidode nitrógenoorgánicototal Kjeldhaly su análisis
termogravimétrico.
"t20
Valoresde pH¡ alcanzados
en la reduccióndel Direct Red 28,
paradiferentes
relaciones
dilcol y diferentes
pH,.Temperatura:
28 "C"
128
Estudiode las condicionesde reduccióna 70 oC de los
colorantes
Acid Red28,Acid Red114y DirectBlue35.
141
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Tablasy Figuras
245
Estudiode lascondicionesde reduccióna 7OoC del colorante
Acid Red128.
144
Porcentajesde recuperaciónde las aminastras el procesode
reducción(n" de medidas> 6)"
't46
TablaVll.6.
'
de la o-toluidinatras diferentestratamientos
Recuperación
de
reducción.
148
Tabta Vll.7.
Recuperaciónde la 4-cloroanilinatras diferentestratamientos
de reducción.
148
Recuperaciónde la 2,4,5-trimetilanilinatras diferentes
de reducción.
tratamientos
149
Productosobtenidostras la reducciónde los azocolorantes
en agua.
insolubles
157
Productosobtenidostras la reducciónde los azocolorantes
solubles
en agua.
158
TablaVll.4.
Tabla Vll.s.
TablaVtl.S.
TablaVlll.l.
TablaVlll.2.
TablaV¡11.3. Cantidadesde 4-aminobifenilo,2-aminobifeniloy N-fenilanilina obtenidaspara los colorantessintetizados
a partir de
(E),
reducciónen medio
anilina,tras aplicarlesla extracción
(A)y
(B).
reducción
en mediobásico
ácido
167
Cantidadescorregidasde 4-aminobifenilo,2-aminobifeniloy
obtenidasparaloscolorantes
sintetizados
N-fenilanilina
a partir
de anilina,trasaplicarlesla extracción(E),reducciónen medio
ácido (A)y reducciónen mediobásico(B).
168
TablaVlll.4.
,
y N-fenil2-aminobifenilo
TablaVl¡1.5. Cantidadesde 4-aminobífenilo,
para
los colorantesAcid Blue 29 y Acid
anilina obtenidas
purificar
y purificados,tras aplicarles la
sín
Yellow 11
extracción(E)y reducciónen medioácido(A).
169
sódico, tras
TablaVll¡.6. Desulfonacióndel 2-amino-1-naftalenosulfonato
aplicarled istintascondicionesde reducción.
172
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
246
Tabla1X.1.
capítulo xlll
Porcentajes
de arilaminapresentes
en los azocolorantes
Negro
P, Negro Carbón, Acid Red 114, Direct Blue 35 y Acid
Red128.
179
Pieles teñidas estudiadasen el apartado de ensayos
preliminares.
181
Pielespatrónempleadasen los apartadosde establecimiento
del método de análisis,estudio de recuperaciónde las
y análisis
arilaminas
de pielespatrón.
182
Concentración
de bencidinaobtenidaparalaspielesPT1,PT2,
PT3 y PT4,teñidascon el coloranteNegro P, tras aplicarel
ensayopreliminar
C.
186
Concentración
de bencidinaobtenidaparalaspielesPTs,PT6,
PT7y PT8,teñidascon el coloranteNegroCarbón,trasaplicar
el ensayopreliminar
C.
186
Concentraciones
experimentales
de arilaminapara las pieles
patrónPPA,PPC,PPGy PPl,trasel análisissegúnel método
estabf
ecido.
192
Reducciónde los colorantesNegro Carbón, Acid Red 114,
DirectBlue 35 y Acid Red 128, segúnel métodode análisis
parapieles.
establecido
193
Reduccióndel coloranteNegro Carbón,segúnel métodode
parapieles,en presencia
análisisestablecido
del patrónPPA.
194
Reduccióndel coloranteAcid Red 114, segúnel método de
parapieles,en presencia
análisisestablecido
del patrónPPC.
194
Tabla1X.10. Reduccióndel coloranteDirect Blue 35, segúnel métodode
parapieles,en presencia
análisisestablecido
del patrónPPG.
194
Tabla1X.11. Reduccióndel coloranteAcid Red 128, segúnel métodode
parapieles,en presencia
análisisestablecido
del patrónPPl"
195
Tabla1X.2.
Tabla1X.3.
TablafX.4.
Tabla1X.5"
Tabla1X.6.
Tabla 1X.7.
TablalX.B.
Tabla1X.9.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Tablasv Fisuras
247
Tabla1X.12. Concentraciónde amina obtenidapara los patronesPPA y
PPB, teñidos con Negro Carbón, tras aplicarles el método
(node medidas> 6).
establecido
196
Tabla1X.13. Concentracíón
de am¡naobtenidaparalos patronesPPC,PPD,
PPEy PPF,teñidoscon Acid Red 114,trasaplicarlesel método
establecido(node medidas) 6).
i96
Tabla1X.14. Concentraciónde amina obtenidapara los patronesPPG y
PPH, teñidoscon Direct Blue 35, tras aplicarlesel método
(node medidas> 6).
establecido
197
Tabla1X.15. Concentración
de aminaobtenidaparalos patronesPPIy PPf,
teñidos con Acid Red 128, tras aplicarles el método
(node medidas> 6).
establecido
197
TablaX.l.
TabtaX.2.
TablaX.3.
Tabla X.4.
TablaX.5.
TablaX.6.
Porcentajes
de recuperación
de las aminastras el procesode
reducciónsegúnnormaDIN (node medidas> 6).
2O7
Porcentajesde recuperaciónde las aminastras el procesode
reducciónsegúnmétodomixto (node medidas> 6).
2OB
Porcentajesde recuperaciónde las aminastras el procesode
reducciónsegúnlos métodosgeneral,DIN y mixto.
209
Resultadosdel test de Scheffépara la comparaciónpor pares
de los métodosgeneral (A), DIN (B) y mixto (C), tras su
aplicaciónsobrelasarilaminas.
21O
Resultados
obtenidostrasla aplicaciónde los metodosgeneral,
DIN y mixto sobre las pieles PPA y PT6 teñidascon Negro
Carbón(n" de medidas> 6).
211
Resultados
obtenidostrasla aplicaciónde los metodosgeneral,
y
mixto
DIN
sobre las pieles PPC y PPEteñ¡dascon Acid
Red 114 (node medidas) 6).
212
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tabla X.7.
TablaX.B.
TablaX.9.
TablaX.í0.
Resultados
obtenidostrasla aplicaciónde los metodosgeneral,
DIN y mixto sobre las pielesPPGy PPH teñidascon Direct
> 6).
Blue35 (node medidas
212
Resultados
obtenidostrasla aplicaciónde los metodosgeneral,
y
DIN mixto sobrelas pielesPPIy PPJteñidascon Acid Red
> 6).
128 (node medidas
2"t3
Resultadosdel test de Scheffépara la comparaciónpor pares
de los métodosgeneral(A), DIN (B) y mixto (C), tras su
aplicaciónsobrelaspielesteñidasPT6,PPC,PPGe PPl.
214
Resultadosobtenidos tras la aplicación de los metodos
Ceneral,DIN y Mixto sobrepielesacabadas.
216
Xlll.2. Listadode Figuras
Figura1.1.
Etapasseguidasen la determinación
de aminasaromáticasen
azocolorantes
o muestras
teñidascon éstos.
Figura11.1. Cortetransversal
de una piel vacunafresca.
4
I
Figura11.2. Esquemade la seccióntransversal
de la piel de un animal
adulto.
10
Figura11.3. Esquema
de fabricación
del cuero.
12
Figura11.4. Esquema
del posibleenlacecromo-colágeno.
15
Figura11.5. Clasificación
generalde loscolorantes.
17
Figura11.6. Clasificación
generalde loscolorantes
azoicos.
1B
Figura11.7. Agentes acoplantes más comunes en
azocolorantes.
19
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
la síntesis de
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Tablasy Figuras
Figurall.B.
Síntesis
de loscolorantes
Acid Orange7 y BasicOrange2.
249
21
Figura11.9. Oxidación metabólica de azocolorantes.C-Hidroxilación
aromática.
25
Figura11.10. Oxidación metabólica de azocolorantes.N-Hidroxilación
aromática.
25
Figura11.11. Reaccióndel compuestonitrenocon el DNA (guanosina)"
26
Figura11.12. Oxidaciónmetabólica
de azocolorantes.
Demetilación.
26
Figura11.13. Mecanismode la azorreducción
microsomal.
27
Figura11.14. Liberaciónde 4-cloroanílina,
trasel análisisdel PigmentRedB.
3B
Figura11.15. Liberacíón
de bencidina,
del Acid Blue150.
trasel análisis
38
Figura11.16. Liberaciónde ,4'4iaminodifenilmetano
tras el análisisde
materialesacabadoscon recubrimientode poliuretanoen base
al 4,4' -metilendifeni Iisocianato.
39
Figura11.17. Liberaciónde la 2-naftilamina
trasel análisisde azocolorantes
sintetizados
a partirdel ácido2-amino-1-naftalenosulfónico.
39
Figurall.1B. Liberaciónde arilaminatras el análisísde azocolorantes
con
amidasde ácidoacetacético.
40
Figura11.19. Liberaciónde arilaminatras el análisisde azocolorantes
con
heterociclosen su estructura.
40
Figura11.20. Formación de 4-amínobifeniloa partir de azocolorantes
derivadosde anilina,trassu reduccióncon ditionitosódico.
41
Figura11.21. Síntesis
del ácido2-amino-1-naftalenosulfónico.
43
Figura11.22. Síntesis
del coloranteDisperseBlack9.
43
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Figura1f.23. Formacióndel 4,4'-nitrobifenilo
a part¡rde la 4-nitroanilina,
durantela síntesis
del coloranteDisperseBlack9.
44
Figura 11.24. Especies
formadasa partirde la diazoanilinatrasla pérdidade
nitrógenosegúnrupturahomolíticay heterolítica.
44
Figura11.25. Procesode síntesis
del coloranteAcid Creen114"
45
Figura11.26. Formaciónde 4-aminobifenilo
durantela síntesis
del colorante
A c i dC r e e n1 1 4 .
46
Figurall.27. Formaciónde 4-aminobifenilo,
2-aminobifenilo,
N-fenilanilina
'1,3-difenilpartir
y bifenilo a
de la descomposición
del
triaceno.
47
FiguraV.1.
FiguraV.2.
FiguraV.3.
FiguraV.4.
FiguraV.5.
FiguraV.6.
Cromatograma(TlC)obtenido con CC/MS de la mezcla de
arilaminas
indicadaen la TablaV.2.
6B
(SlM)obtenidocon CC/MS de la mezcla de
Cromatograma
arilaminasindicadaen la Tabla V.2, (A) según método 1,
(B)segúnmétodo2V (Clsegúnmétodo3.
70
Espectros
de los iones seleccionados
en modo SIM para las
-meti
(A)
arilami nas
4,4'
Ienbis(2-cloroani Ii na), (B) o-dianisidi na
y (C)3,3'-diclorobencidina.
71
Espectros
de los iones seleccionados
en modo SIM para las
arilami nas(A) 4-cloro-2-meti
lani Ii na y (B)2,4,S-frimeti
lani Ii na.
72
Area de pico de cada una de las arilaminasindicadasen la
TablaV.1, frentea la cantidadde muestrainyectada.
74
(SlM)obtenidocon GC/MSde lasarilaminas(A)
Cromatograma
2-amino-4-nitrotolueno
y 4-amino1-naftilamina,
2-naftilamina,
bifenilo, (B) 2-cloroani
Iina, 3-cloroani
Ii na, 4-cloroani
Iina, o-to'
luidina,m-toluidinay p-toluidinay (C) las mismasque en B
pero con d iferentescondicionescromatográf
icas.
76
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Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Tablasy Figuras
FiguraV.7.
FiguraV.B.
FiguraV.9.
Variaciónde la relaciónentre el ion M*-1 (i06) y el ion
molecularM* (107)obtenidacon CC7MS,parala o-toluidina,
p-toluidinay m-toluidina.
7B
Variación (A) del factor de capacidady (B) del factor de
selectividadobtenidos con HPLCTDAD,en función del
porcentaje
de metanol.
B2
Variación (A) del factor de capacidady (B) del factor de
selectividadobtenidos con HPLCTDAD,en función del
porcentaje
de acetonitri
lo.
B4
FiguraV.10. Variacióndel factorde capacidadobtenidocon HPLC/DAD,
paradiferentes
en función de la relaciónmetanol/acetonitrilo
(B)48%y (C)55%.
porcentajes
de tampónfosfato:(A)32o1",
FiguraV.ll.
251
Variacióndel factorde capacidadobtenidocon HPLCTDAD,
para un
en función de la relación metanol/acetonitrilo
porcentaje
de tampónfosfatodel 55%.
B6
B7
FiguraV.12. Variaciónde la resolución
entrela 3,3'-diclorobencidina
y la
4,4'-metilenbis(2-cloroanilina)
obtenidacon HPLC/DAD,en
funcióndel tiempoy del tipo de gradiente.
B9
FiguraV.13. Cromatogramas
obtenidoscon HPLC/DADcorrespond¡entes
a
la mezclade lasarilaminas
indicadas
en la TablaV.4 (A)a 288
nm y (B) a 360 nm, en las siguientes
condiciones:mezcla
inicial de tampón/metanol/acetonitrilo
55/35/10durante 13
'13
minutos,y gradientelineal en
m¡nutoshastaobteneruna
composición
25/67/8,que semantiene
durante14 minutos.
90
FiguraV.14. Cromatogramas
obtenidoscon HPLODAD correspondientes
a
la mezclade las arilaminas
indicadas
en la TablaY.4 a 2BB
nm, en las mismascondiciones:que la FiguraV.13 pero
utilizandouna mezclainicialde tampón/metanol/acetonitrilo
(A)de s3/37110
y (B)de 55117128.
92
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
F i g u r aV . 1 5 . Variaciónobtenidacon HPLCTDAD(A) entre el porcentaje
relativode bencidinaparadiferentesmezclasde éstay 4-aminobifenilo en función de la relación de absorbancias
y (B) entreel porcentajede la 2-amino-4-ni(2}Bnm/240nm),
trotoluenoparadiferentesmezclasde éstay 2-metoxi-5-metilanilina, en función de la relación de absorbancias
(288nm/24On
m) y (288nm/250nm).
94
FiguraV.16. (A) Variaciónobtenidacon HPLC/DADde la altura de pico
medidaa 360 nm,
a la 2-amino-4-nitrotolueno
correspondiente
de ésta y
en función de la relaciónentre concentraciónes
(B)Relación
obtenidacon HPLC/DAD
2-metoxi-5-metilanilina.
entre la concentraciónreal y la calculadapara la 2-amino-4medidaa 360 nm.
nitrotolueno,
98
de capafina de los colorantes(a)DirectRed28,
F i g u r aV l l . 1 . Cromatografía
(b) Acid Red 114, (c) Direct Blue 35 y (d) Rcid Red 128,
empleando como eluyente la mezcla cloroformo/iso11311.
propanol/agua
121
FiguraVll.2" Variacióndel porcentajede bencidinafrente a la relación
ditionito/colorantepuro, para el colorante Direct Red 28,
partiendode los PHi (') 2.4, (t) 5.0, (r) B'0 y (r) 11'0'
TemPeratura:28
"C.
124
FiguraVll.3" Variación del porcentajede arilaminafrente a la relación
puro' PHi:5' Temperatura:28oC' (o)
ditionito/colorante
o-tolidina(Acid Red 114), (o) bencidina(Acid Red 114),
t l u e3 5 ) .
( r ) o - d i a n i s i d i n( D
a i r e cB
125
+-=-t>
izquierdo'
al eje de ordenadas
: Valorcorrespondiente
derecho'
al eje de ordenadas
: Valorcorrespondiente
FiguraVll.4. Variación del área normalizada(a.n.) frente a la relación
ditionito/colorantepuro, para el colorante Acid Red 114.
p H ¡ : 5 , T e m p e r a t u r a : 2o8C . ( ' ) a . n .d e o - t o l i d i nxa 1 0 - 6 , ( r )
a.n.debencidinax 10a,(o) a.n. del pico con tR36 minutosx
10-s.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
126
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Tablasv Figuras
253
FiguraVll.s. Influenciadel pHi sobreel porcentaje
de arilamina,para los
(A)
(B)
Acid Red 1 14, (C) Direct
colorantes Direct Red 28,
oC.
Blue35. Temperatura:28
130
FiguraVll.6. Variacióndel área normalizada(a.n.)frente al pH¡, para el
oC.(o) a.n.
coloranteAcid Red 1'14.pH¡:5, Temperatura:28
de o+olidinax 10{, (r) a.n. de bencidinax 10-s,(o) a.n. del
picocon ts 36 minutosx 10-6.
131
FiguraVll.7. Variacióndel pH de reduccióndel DirectRed28, partiendode
distintospH; y tomandolasrelaciones
dilcol (A) 24, (ü 2.a y
oC.
(C)1.4.Temperatura:28
132
FiguraVll.8. Variacióndel pH de reduccióndel Acid Red 114, (A)
empleando distintasrelacionesdit/col y (B) partiendo d e
oC.
pH'.Temperatura:28
distintos
133
FiguraVll.g. Variacióndel pH del medio acuosofrente al tiempo, en
presencia
de 500 mg de ditionitosódico,con y sin la adición
de 49.8 mg del coloranteDirectRedZg. Temperatura:28oC.
134
FiguraVll.10. Variación del porcentajede arilamina frente al tiempo.
Temperatura:28oC.(o) bencidina(DirectRed 2B),(o¡ o-tolidina (Acid Red 114), (.) bencidina(Acid Red 114), (r) o-dia(DirectBlue
nisidina(DirectBlue35, pH¡:5), (O)o-dianisidina
3 5 ,p H ' : 1 2 ) .
136
<--->
: Valorcorrespondiente
al eje de ordenadas
izquierdo.
: Valorcorrespondiente
al eje de ordenadas
derecho.
FiguraVll.11. Variacióndel área normalizada(a.n.)frente tiempo, para el
coloranteAcid Red 114, tomandocomo relacióndit/col (A)
1 3 . 8y ( B )3 4 . 5 .P H i - 5 , T e m p e r a t u r a : 2' 8C . ( o ) a . n . d e o - t o (r) a.n.debencidina
x 10-s,(o) a.n.del pico con tR
lidinax 10-s,
3 6 m i n u t o xs 1 0 - s .
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
137
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
FiguraVl¡.l2. Variacióndel porcentajede arilaminafrentea la temperatura.
(o) bencidina(Direct
Red28),(o)
pH¡:5, Tiempo: 15 minutos.
o-tolidina (Acid Red 114), (r) bencidina (Acid Red 114),
(r) o-dianisidina
(DirectBlue35).
<--+
139
al eje de ordenadasizquierdo'
: Valor correspondiente
al eje de ordenadasderecho.
: Valor correspondiente
frentea la relación
de o-dianisidina
FiguraVll.l3. Variacióndel porcentaje
dit/col, para el colorante Acid Red 128' PH¡:5,
temperatura:28oC.
143
FiguraVll.14. lnfluenciadel pH y del medio sobre el porcentajede odianisidina obtenido, para el colorante Acid Red 128.
TemPeratura:28oC-
143
Red1'
del coloranteDisperse
FiguraVlll.1. Síntesis
161
SolventYellow14'
del colorante
FiguraV¡11.2.Síntesis
161
FiguraVlll.3. Colorantesintetizadoa partir de anilina contaminadocon
libre y combinado,y
bifenilo,4-aminobifenilo
N-fenilanilina,
librey combinado
2-aminobifenilo
164
sódico, bajo
FiguraVlll.4. Desulfonacióndel 2-amino-1-naftalenosulfonato
condicionesreductivas
171
de capafina de los colorantes(a) Negro Carbón
Cromatografía
y (b) NegroP, empleandola fasesuperiorobtenidacuandose
en la proporción411/5.
mezclan-butanol/etanol/agua,
179
de bencidinaobtenidatrasaplicarcadauno de
Figura1X.2. Concentración
sobrela piel teñidaPT 5 (0.23%en
los ensayospreliminares,
NegroCarbón).
1Bs
de la bencidinaaparecido
ultravioletadel interferente
Figura1X.3. Espectro
de la piel blanco.
trasel análisis
187
Figura|X.1.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Volver al índice/Tornar a l'Index
Qstadode Tablasy Figuras
¿55
Figura1X.4. Recuperaciones
de arilaminaobtenidastras aplicarcada uno
de los métodossobre las pieles patrón (A) PPA (0.11% en
NegroCarbón)y(B)PPC(0.21o/.
en Acíd Red114).
189
Figura1X.5. Recuperaciones
de arilaminaobtenidastras aplicarcada uno
de los métodossobre las pieles patrón (A) PPG (1.12o1.
en
(B)
(1.25"1.
DirectBlue35)y
PPI
en Acid Red128).
191
FiguraX.1.
FiguraX.2.
FiguraX.3.
FiguraX.4.
Pico cromatográficode la o-toluidina y espectroscorrespondientesal máximode pico, a la máximaimpurezay al patrón
de la amina,obtenidatrasaplicarlos métodos(A) generaly (B)
DIN sobrela piel acabadaA-1.
217
Picocromatográficode o-tolidinay espectroscorrespondientes
al máximo de pico, a la máximaimpurezay al patrónde la
amina,obtenidatrasaplicarlos métodos(A) generaly (B) OtN
sobrela piel acabadaA-4.
219
Pico cromatogriáfico
de la 4-aminobifeniloy espectroscorrespondientesal máximo de pico, a la máxima impurezay al
patrón de la amina, obtenida tras aplicar los métodos (A)
generaly (B)DIN sobrela piel acabadaA-5.
22O
(TDl),y del
Estructuras
molecularesdel 2,4-toluendiisocianato
(MDl).
4,4'-metilendifenilisocianato
221
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
y Arilaminas
XlV. Listadode Azocolorantes
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
2s9
Listadode Azocolorantesv Arilaminas
XlV.1. Listadode Azocolorantes
A continuaciónse recogenlas estructurasmolecularesde todos los colorantesazoicos
empleadosen estamemoria.
Azocolorantesinsolublesen medio acuoso
J
@**-@q[
^\,
1F\_*rcH2-cH3
t-V-'*t"r,-"r,"*
**-{$-":*
\\-//
Orange25,11227
Cf: Disperse
(PM:326.36)
/
,4,
-J""
"zCHz-CHa
CHz-CHzOH
cl
Cl: DisperseRed13, 1 1 1 1 5
(PM:348.79)
,cH2-cH3
Cl: SolventYellow 14,12055
(PM:248.29)
Red1, 11110
Cl: Disperse
(PM:314.35)
-J"
cl-b
Cl: SolventYellow 3, 1'1660
(PM:225.30)
-'
*"-1S/-t:"-V-*'"r,-"r,o,
--t
1ll\-¡u¡rJf)\-¡¡t
VV
Cl: SofventYellow 2, 11620
(PM:225.30)
**-1S/-":
cFb
*\-
G-*+**Q
Cl: SolventRed24, 26105
(PM:380.45)
Oto
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
-¿n"
""\-
""{Q}*:'iQ
Cl: SolventOrange7, 1214A
(PM:276.34)
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
260
CapítuloXtV
Azocolorantessolublesen medio acuoso
SO3Na
Cl: Direct Red28, 22120
(PM:696.68)
Cl: Acid Red114, 23635
(PM:830.83)
SO3Na
Cf.: DirectBlue35, 24145
(PM:860.72)
Cl.:Acid Red128, 24125
(PM:862.80)
Cl: Direct Black168
(PM:899.76)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Azocolorantesy Arilaminas
zot
Cl: Acid Green114
(PM:884.75)
Cl: Acid Blue 29, 20460
(PM:616.5)
Cl: Acid Orange10,16230
(PM:452.38)
Cl:Acid Yellow11, 18820
(PM:380.36)
Cl: Acid Orange7, 15510
(PM:350.32)
SqNa
Cl: Acid Red44, 16250
(PM:502.44)
Cl: Acid Red4, 14710
(PM:380.36)
Ct: Acid RedB, 14900
(PM:480.43)
Cl: Acid Blue193, 15707
(PM:416.38)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Cl: Direct Violet 51, 2790s
(PM:719.711
Cl: Acid Violet 5,18125
(PM:678.63)
JI
(e!':-{O
",F
q
SQNa
Cf: Acid Orange61,19320
(PM:351.31)
Cl: Acid Violet 56, 16055
(PM:400.76)
Cl: Acid Black82, 20265
(PM:581.87)
/PH
oF{
,-\\
( ( ) )-N:N--íA-N:N
>/
/
Na03S
t(
t*oH )l
Cl: Acid Brown83, 20250
(PM:496.38)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
listado de Azocolorantesy Arilaminas
263
Cf: Acid Brown 75,34905
( P M :8 1 1 . 5 7 )
XlV.2. Listadode Arilaminas
A continuación se recogen las estructurasmolecularesde todas las arilaminas
empleadasen esta memoria, así como los espectrosUV-visible y de masas
correspondientes.
GAminobifenilo
(PM:169.22)
Abundancia
169
9000
700ü
ffi-*
I
I
5000
3000
170
1000
0
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
264
capíturoxtv
2-Aminobifenilo
(PM: 169.22)
2?000
210n0
t60lt0
?8000
nm
t0000
32000
340n0
36000
toJ
Abundancia
ntt\-
s000
QHO
7000
5000
3000
1000
0
tlu -1zs13s
41 !l
JE¡
155
Bencidina
(PM: 184.24)
220110 ?1000
26000
28000
nm
t0000
los ll1l7
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
32000
1 3 01 i [ 1
31000
360n0
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
265
Listadode Azocolorantesv Arilaminas
4-Cloro-2-meti lani li na
(PM:141.60)
22000
21000
26000
2s000
trm
300m
3?000
3¿000
36000
320m
3¿0!0
3ó000
2-Naftilamina
(Plvl¡143.18)
000
22000
2¿000
26000
28000
nm
30000
Abundancia
143
9000
ATtrNrL
7000
VV
5000
3000
1000
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
ralF
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
266
CaDítuIo XIV
1-Naftilamina
004
f
(PM: 143.18)
003
00?
0t¡l
,3ono
1{000
26000
?8000
nm
300.00
oó
12000
34000
36000
115
I
Ir
17
126
o-Aminoazotolueno
(PM:225.29)
21000
26000
28000
nm
30000
32000
31000
106
1000141 5J
0"-¡6
141153t65 1fl0 lss 29s
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
36000
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Azocolorantesv Arilaminas
267
2-Ami no-4-nitrotol ueno
(PM:152.19
22000
210fro
26000
28000
nm
30000
32000
3¿010
t6000
152
Abundancia
s000
oeN
7000
5000
3000
1000
0
4-Cloroanilina
FM:127.5h
720D0 2¡000
26000
28000 30000
fttfl
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
32000
3¿0!0
36000
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
3-Cloroanilina
0tt
(Pt\,+,
127.57)
? oro
0
288.7nm
0
220D0
l¿0n0
26000
?8000
nm
30000
3m00
3¿0¡0
3ó000
127
Abundancia
t'\-
(QF-*
3000
1000
0*--¡6
110
12O
130¡¡2
0
2-Cloroanilina
0r5
4
(PM:127.57)
olo
0I}5
--.-
000
00
260[0
2875nm
28000
nm
30000
3¿0!0
36000
127
Abundancia
9000
7000
5000
3000
1080
32000
¿ r a FV
0
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Azocolorantesv Arilaminas
269
I
2,4-Diaminoanisol
(PM:138.16)
3005nm
--"-*---r-
26000
28000
nm
30000
32000
3t000
36000
123
9000
8000
OCHs
6000
5000
3000
2000
1000
0
0
4,4t-Di ami nodi feni I metano
(PM:198.26)
22080
2a0l¡0
260!0
28000
nm
30000
320.00
3ür!0
36000
198
115 130 t+t17.2 lt8
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
140
160
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
.^^rtulo xlv
27n
313'-Diclorobencidina
(PM:253.l3)
2200{1 24000
26000
t80r0
nm
30000
320n0
31000
¡oono
320n0
31000
36000
o-Dianisidina
015
(PM:244.29J
? oro
005
000
22000
24000
260s0
28000
30000
TM
Abundancia
s000
7500
6000
4500
30ü0
1500
107
114
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Azocolorantesv Arilaminas
271
o-Tolidina
0t0
(PMr212.29)
0tt
010
005
000
26000
28000
nm
30000
32000
3¡000
3601t0
1f,!
11s 13013s 1154 r-se
3,3'-Dimetil-4,4'-diaminodifeniImetano
Ft* 225.s2j
t20I)0
2¡000
?ó000
28000
30000
t?000
J4000
M
Abundancia
3000
7000
l-bc
\-J
cFb
,cFb
rrÉ
226
"-{O*"-(QFy,
5000
30ü0
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
360!0
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
0¿0
2-Metoxi-5-meti
laniIi na
(PM:137.18)
015
0t0
005
?8T5nm
,--"-----\*
0
4, 4'-Meti lenbis(2-cloroaniIi na)
(P¡vt267.15
f0
220no
2¿000
2ó000
28000
nm
30000
32000
¿Jl
Abundancia
9000
7000
5000
300ü
I ?¡
1000
i95
II
t.
i94
0
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
214
3¿000
36000
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Azocolorantesy Arilaminas
273
0¡0
4-Aminofeniléter
(PM:200.24)
0J0
0r0
0t0
22000
2¿000
020
2ó000
28000
nm
52000
34000
36000
4,4'-Tiodianilina
(PM:216.30)
0I5
010
005
220n0
24000
2ó000
28000
nm
300110 12000
31000
Abúndancia
6000
4500
3000
1500
ÁE
41 52 6"3
0
40
60
1oB 1?4
'?o 171
|
| lso lqs
140
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
160
3ó000
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
274
CapítuloXtV
o-Toluidina
(PM:107.19
2816 nh
22000
2¡o!0
2é000
28000
nm
30000
520
3¡000
36000
106
_f'"
(Q)*n,
0¡0
m-Toluidina
(PM:107.15
030
0r0
0t0
000
22000
?¡oo0
2ó000
28000
300I!0
320f10
34000
360110
nm
Abundancia
*t\-
9000
(Q)'n,
7500
5000
4500
7i7s
1500
41
0
40
53
rl s s
6:65
86
.J
70
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
80
aq
-;
100
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Listadode Azocolorantesv Arilaminas
275
p-Toluidina
0
f
<
(PM:107.19
0r0
010
2975 nm
....,.'_
000
28000
nm
Abundancia
300It0
,*-(ol*,
7500
6000
4500
3000
1500
53
|155
63 66
73
040
2,4-Diaminotolueno
(PM:122.l6)
0
f,
(o
o20
0
22000
240[0
26000
28000
nm
10000
320n0
31000
3ó000
121
Abundancia
s000
7500
NHz
6000
4500
3000
1500
0
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
120
mtz
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
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276
c^oíruro
xrv
0r5
2, 4r5-Trimeti Iani I i na
(PM:135.20
? 0r0
005
000
2?0!0
2¿000
26000
280f)0
nm
cn00
fi000
3¡000
36000
3¿000
36000
120
Abundancia
s000
7000
5000
3008
1000
0
Anilina
(PM:93.12)
0¡0
0t0
220no
2$00
260n0
?8000
nm
3m$0
Abundancia
9000
@'*
7500
6000
4500
3000
1500
40 4F 54
0
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
320!0
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
XV. Abreviaturasy Nomenclatura
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998
Determinacion de Bencidina y otras aminas aromaticas de interes toxicologico... Francisco Planelles Tomás.
Abreviaturas v Nomenclatura
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y nomenclatura
A continuaciónse indicanlas abreviaturas
empleadas
en el texto,por
ordenalfabético.
Abreviaturas
CA
CE
DAD
DCA
ECD
ED
FD
FID
GC
HFB
HPIC
MDI
MS
NPD
PFP
PFPI
PM
SIM
TCD
TDf
TFA
T¡C
TLC
UV
Cloroacetamída
Electroforesis
capilar
Detectorde fotodiodosUV-Visible
Dicloroacetamida
Detectorde capturaelectrónica
Detecciónespectrofotométrica
Detecciónfluorimétrica
Detectorde ionizaciónde llama
Cromatografía
de gases
Heptafluorobutiramida
Cromatografía
de líquídosde altaresolución
4,4'-Metilendifenilisocianato
Detectorde espectrometría
de masas
Detectorespecífico
de nitrógenoy fósforo
Pentafluoropropionamida
ilimidazol
Pentafluoropropion
Pesomolecular
Detecciónmediante
MS con registro
de ionesselecionados
Detectorde conductividad
térmica
2,A-Toluendiisocianato
Trifluoroacetamida
DetecciónmedianteMS con registrode todoslos iones
de capafina
Cromatografía
DetecciónUV-Visible
Nomenclatura
Ab
Cl
cv
mlz
Absorbancia
Nombrey númerode Colorlndex
Coeficiente
de variación
Relaciónmasa,/carga
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1998